Summary
Suite à une infection virale, le rein abrite un nombre relativement important de cellules CD8+ T et offre la possibilité d’étudier les lymphocytes TRM non muqueux. Ici, nous décrivons un protocole pour isoler les lymphocytes rénaux de souris pour l’analyse de cytométrie de flux.
Abstract
La cellule T de mémoire de tissu-résident(RMT)est un domaine rapidement croissant de recherche d’immunologie. Isoler les lymphocytes T de divers tissus non lymphoïdes est l’une des étapes clés pour étudier lesRMT. Il existe de légères variations dans les protocoles d’isolement des lymphocytes pour différents organes. Le rein est un organe non lymphoïde essentiel avec de nombreuses infiltrations de cellules immunitaires, surtout après l’exposition aux pathogènes ou l’activation auto-immune. Ces dernières années, plusieurs laboratoires, y compris le nôtre ont commencé à caractériser les cellules CD8 + Trésidentes rénales dans divers milieux physiologiques et pathologiques chez la souris et chez l’homme. En raison de l’abondance des lymphocytes T, le rein représente un organe modèle attrayant pour étudierles RMTdans les tissus non muqueux ou non-barrière. Ici, nous allons décrire un protocole couramment utilisé dans les laboratoires axéssurla RM T pour isoler les cellules CD8+ T des reins de souris à la suite d’une infection virale systémique. En bref, à l’aide d’un modèle aigu d’infection par le virus de la chorioméningite lymphocytique (LCMV) chez les souris C57BL/6, nous démontrons l’étiquetage intravasculaire des lymphocytes CD8+ T, la digestion enzymatique et la centrifugation du gradient de densité pour isoler et enrichir les lymphocytes des reins de souris afin de préparer les échantillons à l’analyse subséquente de la cytométrie du débit.
Introduction
Les cellules T de mémoire tissulaire(RMT)représentent l’une des populations de cellules T les plus abondantes chez les souris humaines adultes et infectées. Lescellules T RM fournissent la première ligne de défense immunitaire et sont impliquées de façon critique dans divers processus physiologiques et pathologiques1,2,3,4,5. En comparaison avec les cellules T circulant, les cellules TRM portent des marqueurs de surface distincts avec des programmes de transcription uniques6,7,8. L’élargissement de nos connaissancesen biologie de la RMT est la clé pour comprendre les réponses des cellules T, ce qui est essentiel au développement futur de vaccins et d’immunothérapies à base de cellules T.
En plus des marqueurs moléculaires couramment partagés de TRMdans tous les tissus non lymphoïdes, l’accumulation de preuves suggère que les dispositifs tissulaires spécifiques sont un composant central de labiologie de RM9de T. Rein abrite de nombreuses cellules immunitaires, y comprisles cellules RM T après l’infection et offre une excellente occasion d’étudier la biologiedes cellules RM T dans un tissu non muqueux. L’infection aiguë de LCMV (virus lymphocytique de choriomeningitis) par voie intraperitoneal est un modèle systémique bien établi d’infection pour étudier des réponses antigène-spécifiques de cellule T chez les souris. L’infection est généralement résolue en 7-10 jours chez les souris de type sauvage et laisser un grand nombre de cellules T mémoire spécifiques au LCMV dans une variété de tissus, y compris le rein10. Les souris transgéniques P14 TCR (récepteur des lymphocytes T) portent des lymphocytes CD8+ T reconnaissent l’un des épitopes immuno-dominants du LCMV présentés par la molécule H2-D B de la molécule H2-Dde classe I (complexe d’histocompatibilité majeure de classe I) chez les souris C57BL/6. Combinant le transfert adoptif de cellule T de P14 agréablement marqué et l’infection de LCMV chez les souris, CD8 + effecteuret cellules de T de mémoire sont suivis, y compris la différenciation et l’homéostasie de RM de T.
Dans certains tissus de barrière, tels que le compartiment intraepithelial intestinal de lymphocytes (IEL) et les glandes salivaires, la procédure établie d’isolement de lymphocyte donne le pourcentage élevé descellules de RM de T avec la contamination minimale de cellule T par sang dans le modèle11de souris de LCMV. Cependant, dans les tissus non barrière, tels que le rein, le réseau vasculaire dense contient un grand nombre de cellules CD8+ T circulant. Il a été bien documenté que même la perfusion réussie ne peut pas supprimer efficacement toutes les cellules CD8+ T en circulation. Pour surmonter cet obstacle technique, la coloration intravasculaire d’anticorps a été établie comme l’une des techniques les plus couramment employées dans leslaboratoires de RM de T12. En bref, 3-5 minutes avant l’euthanasie, 3 anticorps anti-CD8 μg/souris (pour étiqueter les lymphocytes CD8+ T) sont livrés par voie intraveineuse. La paroi intacte des vaisseaux sanguins empêche la diffusion rapide de l’anticorps dans ce court laps de temps (c.-à-d. 3-5 minutes) et seules les cellules intravasculaires sont étiquetées. Suivant le protocole standard d’isolement de lymphocyte, les cellules intravasculaires contre extravascular peuvent être facilement distinguées utilisant la cytométrie de flux.
Ici, nous allons décrire un protocole standard couramment utilisé dans les laboratoires TRM pour effectuer l’étiquetage intravasculaire, l’isolement des lymphocytes et l’analyse de cytométrie du flux des cellules rénales CD8+ T à l’aide d’une souris C57BL/6 qui a reçu des lymphocytes T CD45.1+ P14 et l’infection par le LCMV 30 joursavant 13. Le même protocole peut être utilisé pour étudier à la fois les cellules T effectrices et de mémoire dans le rein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les expériences sur les animaux réalisées à la suite de ce protocole doivent être approuvées par le Comité institutionnel respectif de soins et d’utilisation des animaux (IACUC). Toutes les procédures décrites ici ont été approuvées par IACUC UT Health San Antonio.
1. Transfert adoptif des cellules T P14 dans les receveurs de C57BL/6 et infection par le LCMV
- Utilisez des souris P14 à l’âge de 6 à 12 semaines. Assurez-vous que le sexe de la souris transgénique P14 TCR donneuse doit correspondre au sexe des souris receveurs de C57BL/6. Dans le cas contraire, les cellules telles que les cellules T mâles se transférant chez les souris femelles entraîneront le rejet immunisé-médiatisé des cellules T de donneur circulant dans environ 12jours 14.
- Purifier les cellules CD8+ T naïves de la rate et des ganglions lymphatiques d’une souris transgénique P14 TCR à l’aide du kit de purification des cellules T CD8+ T de souris suivant le protocole du fabricant.
- Brièvement, disséquer la rate et les ganglions lymphatiques, écraser les échantillons pour générer une suspension cellulaire unique.
- Pour enrichir les lymphocytes T naïfs, ajoutez de l’anticorps biotine-anti-CD44 lors de la première étape d’incubation desanticorps 13.
REMARQUE : La trousse commerciale de sélection négative utilisée à cette étape contient deux composantes majeures pour deux étapes d’incubation (c.-à-d. incubation du mélange biotine-anticorps et incubation de perles magnétiques streptavidines).
- Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules et injecter de 1 000 à 10 000 cellules T P14 purifiées dans 200 μL de PBS dans chaque récepteur C57BL/6 correspondant au sexe par l’intermédiaire de la veine de la queue.
REMARQUE : Le protocole détaillé d’injection de veine de queue est décrit dans l’étape 2. - Le lendemain, tous les bénéficiaires du C57BL/6 reçoivent 2 x 10 LCMV Armstrong de5 pfu dilués en 200 μL de PBS par un itinéraire intraperitoneal.
2. Étiquetage intravasculaire des cellules CD8+ T
REMARQUE : Selon les intérêts de recherche, différents points de temps peuvent être choisis après l’infection. Un exemple de jour 30 post-infection (jour 30 après l’étape 1.4) est démontré, qui est souvent considéré comme un point de temps de mémoire précoce pour la réponse des lymphocytes T CD8.
- Diluer l’anticorps biotine anti-CD8α à 15 μg/mL dans PBS. Assurez-vous que chaque souris reçoit 200 μL de PBS contenant 3 μg d’anticorps.
REMARQUE : L’anticorps anti-CD8 biotine est utilisé ici afin qu’il soit plus flexible pour concevoir le panneau de coloration final FACS. L’anticorps fluorescent étiqueté colorant peut être utilisé directement. Cependant, il est important d’utiliser différents clones d’anticorps monoclonaux pour l’étiquetage intraveineux par rapport à la coloration FACS. - Chauffer correctement la veine de la queue des souris avec une lampe thermique aérienne pendant 5-10 min pour dilater les veines.
REMARQUE : Il faut prendre des précautions supplémentaires pour éviter la surchauffe des animaux. Réduisez le feu ou retirez la lampe thermique si les souris s’arrêtaient pour se déplacer. - Dessinez 200 μL d’anticorps anti-CD8α prédiluté dans une seringue à insuline 100 U (28G) et éliminez les bulles d’air en déplaçant le piston de haut en bas. Pliez l’aiguille pour créer un angle de 150° entre l’aiguille et la seringue, biseauter vers le haut, de sorte que l’aiguille sera parallèle à la veine.
- Retenez la souris avec un restrainer de rongeur de taille appropriée et vaporisez la queue avec 70% d’éthanol pour rendre la veine clairement visible.
REMARQUE : La durée de la retenue doit être maintenue au minimum. - Tenez la queue à l’extrémité distale avec le pouce et les doigts du milieu de la main non dominante. Placez l’index sous le site où l’aiguille sera insérée.
- Tenez la seringue avec la main dominante et insérez l’aiguille dans la veine en parallèle vers la direction du cœur.
REMARQUE : Lorsque vous vous placez correctement, l’aiguille doit se déplacer en douceur dans la veine. - Injectez lentement 200 μL d’anticorps anti-CD8α par la veine de la queue.
REMARQUE : S’il y a une résistance ou si une zone blanche est vue au-dessus de l’aiguille sur la queue, l’aiguille n’est pas à l’intérieur de la veine. Commencez l’injection initiale près de la pointe de la queue. Si nécessaire, avancez vers le bas de la queue pour les injections subséquentes. - Retirer l’aiguille et appliquer délicatement la compression jusqu’à ce que le saignement s’arrête.
- Retourner la souris dans la cage et euthanasier la souris après 3-5 min.
REMARQUE : Les souris doivent être euthanasiées par chambre d’isoflurane suivie de la dislocation cervicale. D’autres méthodes, telles quel’inhalation de CO 2, prennent jusqu’à 5 minutes et peuvent introduire une variation inutile du temps d’étiquetage intraveineux des anticorps. - Disséquer le rein à l’aide de ciseaux, transférer le rein entier à 1,5 mL de tubes de microcentrifugeuse et laisser les échantillons sur la glace jusqu’à ce que le traitement ultérieur.
REMARQUE : Le rein entier intact peut être stocké en toute sécurité sur la glace pendant quelques heures avant le traitement et la digestion subséquents.
3. Digestion enzymatique du rein
- Préparer 6 plaques de puits contenant 3mL de la solution de digestion (RPMI/2% FCS/1 mg/ml de Collagène B) pour chaque souris, conserver sur la glace.
REMARQUE : La solution de collagène B à concentration plus élevée (p. ex., 20 x) peut être préparée et stockée à -20 °C ou moins. La solution de travail doit être préparée fraîchement. Veuillez consulter le tableau 1 pour les recettes de toutes les solutions/tampons utilisés dans le protocole actuel. - Ajouter 300 μL de solution de digestion dans les tubes d’échantillon de microcentrifugeuse de 1,5 mL et hacher les échantillons de rein à l’aide d’un ciseaux à ressort droit.
REMARQUE : Le tissu rénal doit être émincé en morceaux même dont la taille ne doit pas avoir plus de 1,5 mm de diamètre. Aucune étape de décapsulation n’est requise. - Transférer les échantillons de rein hachés dans 6 plaques de puits contenant la solution de digestion
REMARQUE : 6 plaques de puits ne sont utilisées pour plus de commodité que lorsqu’il y a plusieurs échantillons à traiter. - Incuber les échantillons à 37 °C avec un basculement doux (environ 60 rpm) pendant 45 min.
- Après digestion, écraser le tissu avec la bride de piston d’une seringue de 3 mL directement à l’intérieur du plat, et transférer dans des tubes coniques de 15 mL.
REMARQUE : Habituellement, la filtration à travers une passoire cellulaire n’est pas nécessaire à cette étape parce que la centrifugation du gradient de densité est effectuée à côté de purifier les lymphocytes vivants. - Faites tourner les échantillons à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Resuspendez la pastille en 3 mL de RPMI/10% FCS.
4. Centrifugation de gradient de densité pour enrichir des lymphocytes du rein digéré
- Faites tourner l’échantillon à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Retirez le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire avec 5 mL de mélange Percoll/RPMI de 44% (44% Percoll + 56% RPMI sans FBS).
- Placez la pointe d’une pipette de 3 mL contenant 3 mL de 67% Percoll/PBS (67% Percoll + 33% PBS) directement au fond de chaque tube, et relâchez lentement la solution de sorte que la solution lourde (67% Percoll/PBS) forme une couche distincte au fond et la solution légère (44% Percoll/RPMI) est soulevée. Ensemble, des couches de cocktails se formeront.
REMARQUE : Pour le milieu de gradient de densité nouvellement arrivé du fournisseur, ajoutez 1/10 volume de 10x PBS stérile à la bouteille, mélangez bien et considérez le milieu de gradient de densité équilibré par PBS comme solution de 100 %. - Faites tourner les échantillons à 900 x g pendant 20 min à température ambiante avec un réglage réduit de l’accélérateur et des freins.
REMARQUE : Pour les centrifugeuses avec réglages d’accélérateur et de frein (sur une échelle de 1 à 9 (1 signifie minimum et 9 moyens maximum)), utilisez 6 pour l’accélérateur et 4 pour le frein. - Retirer soigneusement les tubes de la centrifugeuse sans déranger les couches;
REMARQUE : Une couche claire de lymphocyte est identifiée entre la couche rose de RPMI de couleur et la couche incolore de PBS. - Retirer la couche supérieure à l’l’insurma de transfert sans toucher la couche lymphocyte.
- Transférer la couche de lymphocytes dans un nouveau tube de 15 mL, remplir le tube de PBS/5% fcs et mélanger en inversant le tube 4-6x lentement pour assurer un mélange suffisant.
REMARQUE : Cette étape est importante pour laver tout Percoll résiduel. - Faites tourner les échantillons à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Retirer le supernatant et suspendre à nouveau la pastille cellulaire avec 500 μL de milieu RPMI complet. Les cellules sont prêtes pour la coloration de cytométrie d’écoulement.
5. Coloration et analyse de cytométrie de flux
REMARQUE : Veuillez suivre le protocole standard de coloration de cytométrie d’écoulement pour des lymphocytes de T.
- Prenez environ 1 x 106 cellules pour chaque coloration FACS.
REMARQUE : Utilisez une plaque de puits U-bottom 96 pour la coloration FACS. Toutefois, si seulement un nombre limité d’échantillons sont impliqués, des tubes FACS de 5 mL peuvent également être utilisés. - Faites tourner les cellules à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnatant.
- Resuspendez chaque échantillon dans 50 μL de tampon FACS contenant 10 μg/mL de bloqueur FCR 2.4G2 (un anticorps monoclonal anti-CD16/32 pour bloquer l’interaction entre l’anticorps FACS ajouté avec fcr). Incuber sur la glace pendant 15 min.
- Sans centrifugation supplémentaire, ajouter 50 μL de mélange d’anticorps colorant de surface pour chaque échantillon de sorte que le volume final de coloration soit de 100 μL/chaque échantillon. Incuber sur la glace pendant 30 min dans l’obscurité.
REMARQUE : Inclure la streptavidine étiquetée fluorescente (2 μg/mL ou suivre la recommandation du fabricant) dans le mélange d’anticorps pour étiqueter les lymphocytes CD8α+ INTRAvasculaire CD8+ T et utiliser des anticorps anti-CD8β étiquetés fluorescents pour étiqueter toutes les lymphocytes T CD8. Le mélange d’anticorps est fait en ajoutant les quantités désirées d’anticorps intéressés dans le tampon FACS. - Lavez les échantillons avec PBS deux fois. Pour chaque lavage, remplir les puits de 96 plaques de puits avec du PBS froid, tourner à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnatant.
- Resuspendez les cellules dans 100 μL/puits de colorant vivant/mort dilué. Incuber sur la glace pendant 30 min dans l’obscurité.
NOTE : Même avec le spin moyen de gradient de densité, l’étape enzymatique de digestion induit souvent la mort significative de cellules dans les cellules T tissue-resident dues à la signalisation d’ARTC2.2/P2RX715. La coloration de colorant vivant/mort est fortement recommandée avant fixation. Nanocorps anti-ARTC2 peut être administré dans les souris avant l’euthanasie pour prévenir la mort cellulaire induite par l’isolement cellulaire. - Lavez les échantillons avec le tampon FACS deux fois. Pour chaque lavage, remplissez les puits de la plaque de 96 puits avec tampon FACS froid, tournez à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et jetez le supernatant.
- Resuspendez les cellules en tampon de fixation de 100 μL/puits. Incuber à 37 °C pendant 10 min.
REMARQUE : La fixation du tampon est faite fraîchement en diluant le formaldéhyde avec le PBS à une concentration finale de formaldéhyde de 2 %. - Lavez les échantillons avec le tampon FACS deux fois. Pour chaque lavage, remplir les puits de 96 plaques de puits avec un tampon FACS froid, tourner à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le supernatant.
- Resuspendez les cellules en tampon FACS de 250 μL/puits. Sceller la plaque, la conserver à 4 °C et la protéger de la lumière jusqu’à l’analyse facs.
REMARQUE : Avant l’analyse facs, filtrer les échantillons à travers un maillage en nylon de 70 μM pour éliminer les grappes cellulaires possibles qui peuvent obstruer la machine FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le protocole décrit ici est résumé dans un diagramme de flux (Figure 1A). Au jour 30 infection de poteau de LCMV, nous avons exécuté l’étiquetage intravasculaire des cellules CD8+ T. 5 minutes plus tard, les deux reins de l’animal ont été disséqués, hachés finement et soumis à la digestion des collagènes. Les lymphocytes ont été purifiés à partir des échantillons digérés par centrifugation percoll et analysés par cytométrie d’écoulement. Comme le montre la figure 1B,même après l’enrichissement des lymphocytes à médiation centrifugeuse de densité, il était très courant de voir une grande partie des non-lymphocytes dans le produit final. Cependant, après avoir pignonné sur les lymphocytes vivants, il était facile d’identifier les lymphocytes CD8+ T. Nous pourrions distinguer les cellules INTRAvascular vs extravascular CD8+ T. En raison du modèle d’expression très corrélatif de CD8α et CD8β sur les cellules CD8+ T, on s’attend à ce que les cellules intravasculaires CD8+ T présentent un modèle diagonal sur le profil CD8α-CD8β FACS. Comme prévu, seuls les phénotypes T rm extravasculaires CD8+ Tont acquis efficacement, tels que la reréglementation du CD69 et la downregulation de Ly6C (Figure 1B). Dans nos expériences, nous nous sommes intéressés aux lymphocytes T P14 donneurs avec marqueur congénique CD45.1. En utilisant le même protocole, les cellules CD8+ T dérivées de l’hôte endogène peuvent également être examinées. Contrairement aux souris infectées, la grande majorité des lymphocytes CD8+ T isolés de jeunes souris naïves logées dans les installations du FPS ont été étiquetés avec de l’anticorps i.v. CD8α et, par conséquent, appartenaient au compartiment intravasculaire (figure 1C).
Figure 1 : Résultats représentatifs.
(A) Flowchart du protocole. (B) Au jour 30 post-infection, les lymphocytes rénaux ont été analysés par cytométrie d’écoulement. Les profils des FACS représentatifs et la stratégie de gating sont affichés. Les chiffres indiquent le pourcentage de sous-ensembles fermés dans leur population parentale. (C) Profil représentatif facs des cellules rein CD8+ T isolées d’une souris naïve. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Réactif | Recette | Note |
| 100% Percoll | 9 volumes de Percoll + 1 volume de 10xPBS | |
| 44% Percoll/RPMI | 44% Vol de 100% Percoll + 56% Vol sérum libre RPMI | Fait frais à partir de 100% Percoll |
| 67% Percoll/PBS | 67% Vol de 100% Percoll + 33% Vol PBS | Fait frais à partir de 100% Percoll |
| Tampon de digestion | RPMI + 2% FCS + 1mg/ml collagène B | Fabriqué frais à partir de bouillon de collagène |
| Tampon de lavage PBS/5% FCS | PBS + 5% FCS | |
| Tampon FACS | PBS + 2% FCS + 0,02% NaN3 | Stocké à 4°C |
| Correction du tampon | PBS + formaldéhyde 2% | Stocké à RT et protégé de la lumière |
Tableau 1 : Liste des recettes pour toutes les solutions et tampons utilisés dans le protocole actuel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Comme l’immunité spécifique aux tissus est un domaine de recherche en expansion rapide, l’accumulation de preuves suggère que les cellules immunitaires, en particulier la population de lymphocytes peuvent être identifiés dans presque tous les organes chez les souris adultes humaines ou infectées ou immunisées. Le modèle d’infection de souris de LCMV est un modèle bien établi pour étudier la réponse de cellule T antigène-spécifique, l’effecteur et la différenciation de cellule T de mémoire comprenantla biologie de RM de T à travers les tissus multiples. Ici, nous avons décrit un protocole pour analyser les cellules CD8+ T dans le rein. Ce protocole est largement adapté à partir de publications axées sur TRM12. Vraisemblablement dû à l’expression P2RX7 de haut niveau et à la mort cellulaire induite par digestion enzymatique15,le rendement des lymphocytes du protocole actuel est le mieux adapté à l’analyse phénotypique immédiate. Cependant, avec le protocole établi pour inhiber la mort cellulaire induite par P2RX716,il est concevable que le protocole actuel puisse être facilement modifié (par exemple, avec l’ajout d’inhibiteurs pour bloquer la signalisation P2RX7) afin d’augmenter la survie cellulaire et d’être adapté à d’autres tests fonctionnels à long terme. Des groupes de contrôle appropriés devraient être inclus pour s’assurer que les inhibiteurs du P2RX7 n’interfèrent pas avec les analyses fonctionnelles intéressées.
Les cellules rein CD8+ TRM sont largement générées en réponse à l’infection ou aux antigènes environnementaux. Nous avons utilisé le protocole intravasculaire d’étiquetage pour analyser directement les cellules rénales CD8+ T isolées des souris naïves C57BL/6 de 5-6 semaines. Conformément aux résultats publiés17, il n’y a presque pas de lymphocytes CD8+ T extravasculaires chez ces souris « propres » (figure 1C). Une étude élégante a démontré que la majorité de la mémoire CD8+ lymphocytes T identifiés dans les tissus non lymphoïdes sont TRM10. En revanche, en utilisant un système d’infection similaire, nous détectons souvent une population significative de CD69- cellules (très probablement représentent leslymphocytes T EM ou CD69- lymphocytes T RM) même dans le compartiment extravasculaire. L’écart peut être dû au fait que 1) différentes techniques sont utilisées, c’est-à-dire la cytométrie microscope vs débit; 2) les points de temps de mémoire tôt vs tardif sont concentrés et 3) CD69 n’est pas un marqueur parfait pour identifier TRM. La digestion enzymatique et la cytométrie d’écoulement sous-estimeront considérablement le nombre total delymphocytes T RM. Cependant, comme protocole commode et non-laborieux, il est toujours généralement accepté dans la plupart des études de RMde T.
L’étalon-or pour identifier définitivement les cellules TRM est d’effectuer une expérience de parabiose. Bien que le protocole décrit ici fournit un moyen pratique d’identifier les cellules T résidentes dans le rein, les résultats de ce protocole ne font que prouver qu’au moment où les souris sont euthanasiées, les cellules T résident en dehors des vaisseaux sanguins dans le rein. Ce protocole à lui seul ne fournit aucune information sur l’histoire migratoire des cellules T.
En plus des infections, tous les reins ciblant les réponses immunitaires, y compris les réponses auto-immunes peuvent induire la différenciation d’un sous-ensemble important de cellules T résidentes dans le rein peuvent être étudiés en utilisant un protocole similaire. En outre, comme décrit avant12, ce protocole peut être facilement modifié pour utiliser des anticorps anti-CD45 (pour étiqueter toutes les cellules hématopoïétiques) pour étudier d’autres cellules immunitaires résidentes dans le rein. Ensemble, nous avons démontré un moyen relativement pratique d’isoler et d’analyser leslymphocytes CD8 + T du rein, qui peuvent être adaptés à divers modèles, y compris l’infection et l’auto-immunité.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont pas de divulgation financière pertinente.
Acknowledgments
Ces travaux sont soutenus par des subventions des NIH AI125701 et AI139721, le programme CLIP de l’Institut de recherche sur le cancer et la subvention de l’American Cancer Society RSG-18-222-01-LIB à N.Z. Nous remercions Karla Gorena et Sebastian Montagnino du Flow Cytometry Facility. Les données générées dans le Flow Cytometry Shared Resource Facility ont été appuyées par le Centre des sciences de la santé de l’Université du Texas à San Antonio (UTHSCSA), la subvention des NIH/NCI P30 CA054174-20 (Clinical and Translational Research Center [CTRC] à l’UTHSCSA) et UL1 TR001120 (Clinical and Translational Science Award).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 431470 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| 37C incubator | VWR | ||
| Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Insulin Syringe | BD | 329424 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
| overhead heat lamp | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Solid Brass Mouse Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Swing Bucket Centrifuge with refrigerator | Thermofisher | ||
| Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |
References
- Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence. Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).
- Mueller, S. N., Mackay, L. K. Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence. Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).
- Park, C. O., Kupper, T. S. The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease. Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).
- Schenkel, J. M., et al. T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses. Science. 346, 98-101 (2014).
- Thome, J. J., Farber, D. L. Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans. Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).
- Mackay, L. K., et al. Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes. Science. 352, 459-463 (2016).
- Mackay, L. K., et al. T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate. Immunity. 43, 1101-1111 (2015).
- Milner, J. J., et al. Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours. Nature. 552, 253-257 (2017).
- Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells. Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance. Cell. 161, 737-749 (2015).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).
- Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation. Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).
- Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477, 216-219 (2011).
- Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets. Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).
- Fernandez-Ruiz, D., et al. Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection. Immunity. 45, 889-902 (2016).
- Beura, L. K., et al. Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice. Nature. 532, 512-516 (2016).
