Etter virusinfeksjon, nyre havner et relativt stort antall CD8+ T celler og tilbyr en mulighet til å studere ikke-slimhinne TRM celler. Her beskriver vi en protokoll for å isolere mus nyrelymfocytter for flytcytometrianalyse.
Tissue-resident memory T celle (TRM) er et raskt voksende felt av immunologi forskning. Isolere T-celler fra ulike ikke-lymfoide vev er en av de viktigste trinnene for å undersøke TRMs. Det er små variasjoner i lymfocyttisolasjonsprotokoller for forskjellige organer. Nyre er et viktig ikke-lymfoid organ med mange immuncelleinfiltrasjon, spesielt etter patogeneksponering eller autoimmun aktivering. I de senere årene har flere laboratorier, inkludert våre egne, begynt å karakterisere nyrebosatte CD8+ T-celler i ulike fysiologiske og patologiske innstillinger i både mus og menneske. På grunn av overflod av T-lymfocytter representerer nyre et attraktivt modellorgan for å studere TRMs i ikke-slimhinne- eller ikke-barrierevev. Her vil vi beskrive en protokoll som vanligvis brukes i TRM-fokusertelaboratorier for å isolere CD8+ T-celler fra musenyre etter systemisk virusinfeksjon. Kort, ved hjelp av en akutt lymfatisk choriomeningitt virus (LCMV) infeksjon modell i C57BL/6 mus, viser vi intravaskulær CD8+ T celle merking, enzymatisk fordøyelse, og tetthet gradient sentrifugasjon for å isolere og berike lymfocytter fra mus nyrer for å gjøre prøver klar for den påfølgende flyt cytometri analyse.
Tissue-resident minne (TRM) T celler representerer en av de mest tallrike T cellepopulasjoner i voksne mennesker og infiserte mus. TRM-celler gir den første linjen av immunforsvar og er kritisk involvert i ulike fysiologiske og patologiske prosesser1,2,3,4,5. Sammenligner med sirkulerende T-celler, TRM celler bære distinkte overflatemarkører med unike transkripsjonsprogrammer6,7,8. Å utvide vår kunnskap om TRM biologi er nøkkelen til å forstå T celleresponser som er avgjørende for fremtidig utvikling av T-cellebaserte vaksiner og immunterapier.
I tillegg til vanlige delte molekylære markører av TRMs på tvers av alle ikke-lymfoide vev, akkumulerende bevis tyder på at vev-spesifikke funksjoner er en sentral komponent i TRM biologi9. Nyre havner mange immunceller inkludert TRM celler etter infeksjon og gir en flott mulighet til å studere TRM cellebiologi i en ikke-slimhinnevev. Akutt LCMV (lymfatisk choriomeningittvirus) infeksjon via intraperitoneal rute er en veletablert systemisk infeksjonsmodell for å studere antigenspesifikke T-celleresponser hos mus. Infeksjonen er vanligvis løst i 7-10 dager i vill type mus og la et stort antall LCMV-spesifikke minne T-celler i en rekke vev, inkludert nyre10. P14 TCR (T cellereseptor) transgene mus bærer CD8+ T-celler gjenkjenner en av de immundominerende epitopene til LCMV presentert av MHC-I (klasse I store histokompatibilitetskompleks) molekyl H2-Db i C57BL/6 mus. Ved å kombinere congenically merket P14 T celle adoptivoverføring og LCMV infeksjon hos mus, CD8+ effector og minne T celler spores, inkludert TRM differensiering og homeostase.
I noen barrierevev, som intestinal intraepithelial lymfocytter (IEL) rom og spyttkjertler, etablerte lymfocytt isolasjon prosedyre gir høy prosentandel av TRM celler med minimal blodbåren T celleforurensning i mus LCMV modell11. Men i ikke-barriere vev, som nyrene, inneholder tett vaskulært nettverk et stort antall sirkulerende CD8+ T-celler. Det har blitt godt dokumentert at selv vellykket perfusjon ikke effektivt kan fjerne alle sirkulerende CD8+ T-celler. For å overvinne denne tekniske hindringen, intravaskulær antistoff farging har blitt etablert som en av de mest brukte teknikker i TRM laboratorier12. Kort sagt, 3-5 minutter før eutanasi, leveres 3 μg/mus anti-CD8 antistoff (for å merke CD8+ T-celler) intravenøst. Intakt blodkarvegg forhindrer rask diffusjon av antistoffet innen denne korte tidsperioden (det vil at 3-5 minutter) og bare intravaskulære celler er merket. Etter standard lymfocytt isolasjonsprotokoll, intravaskulær versus ekstravaskulære celler kan lett skilles ved hjelp av flytcytometri.
Her vil vi beskrive en standardprotokoll som vanligvis brukes i TRM-laboratorier for å utføre intravaskulær merking, lymfocyttisolering og strømningscytometrianalyse av nyre-CD8+ T-celler ved hjelp av en C57BL/6-mus som har mottatt CD45.1+ P14 T-celler og LCMV-infeksjon 30 dager før13. Samme protokoll kan brukes til å studere både effector og minne T-celler i nyrene.
Som vevsspesifikk immunitet er et raskt voksende forskningsområde, akkumulerende bevis tyder på at immunceller, spesielt lymfocytter befolkningen kan identifiseres i nesten alle organer i voksne mennesker eller infiserte eller immuniserte mus. LCMV mus infeksjon modell er en veletablert modell for å studere antigen-spesifikk T celle respons, effektor og minne T celle differensiering inkludert TRM biologi på tvers av flere vev. Her beskrev vi en protokoll for å analysere CD8+ T-celler i nyrene. …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet støttes av NIH tilskudd AI125701 og AI139721, Cancer Research Institute CLIP program og American Cancer Society gi RSG-18-222-01-LIB til N.Z. Vi takker Karla Gorena og Sebastian Montagnino fra Flow Cytometry Facility. Data generert i Flow Cytometry Shared Resource Facility ble støttet av University of Texas Health Science Center i San Antonio (UTHSCSA), NIH/NCI-stipend P30 CA054174-20 (Clinical and Translational Research Center [CTRC] ved UTHSCSA) og UL1 TR001120 (Clinical and Translational Science Award).
1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-130 | |
15 ml Conical Tubes | Corning | 431470 | |
3 ml syringe | BD | 309657 | |
37C incubator | VWR | ||
Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
Insulin Syringe | BD | 329424 | |
Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical | RS 5692 | |
Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
overhead heat lamp | Amazon | B00333PZZG | |
PBS | |||
Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
rocker | VWR | ||
RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
Solid Brass Mouse Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
Swing Bucket Centrifuge with refrigerator | Thermofisher | ||
Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |