Summary
Bu protokolde, domuza özgü astarlar tasarlanmış, plazmid içeren domuz spesifik DNA parçaları inşa edilmiş ve nicellik için standart eğriler oluşturulmuştur. Türe özgü astarlar kullanılarak, domuzdan fareye hücre nakli modellerinde ve domuzdan maymuna arter yama transplantasyonu modellerinde cpsDNA qPCR ile ölçüldü.
Abstract
Xenotransplanttransplantorgan yetmezliği tedavisinde uygulanabilir bir yöntemdir. Ancak knenotransplantasyonun immün reddinin nasıl etkin bir şekilde izlenilen bir sorundur. Bu el yazması domuz-fare hücre nakli modelleri ve domuz-to-monkey arter yama transplantasyon modellerinde bağışıklık reddi izlemek için basit ve etkili bir yöntem açıklar. Dolaşımdaki DNA organ hasarı için potansiyel olarak non-invaziv bir biyobelirteçtir. Bu çalışmada, dolaşımdaki domuza özgü DNA (cpsDNA) kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) tarafından ksenogreft reddi sırasında izlendi. Bu protokolde, domuza özgü astarlar tasarlanmış, plazmid içeren domuz spesifik DNA parçaları inşa edilmiş ve nicellik için standart eğriler oluşturulmuştur. Türlere özgü astarlar daha sonra domuzdan fareye hücre nakli modellerinde ve domuzdan maymuna arter yama transplantasyonu modellerinde qPCR ile cpsDNA'yı ölçmek için kullanıldı. Bu yöntemin değeri, ksenotransplantasyonun immün reddini izlemek için basit, kullanışlı, düşük maliyetli ve daha az invaziv bir yöntem olarak kullanılabileceğini göstermektedir.
Introduction
Organ yetmezliği ölüm ana nedenlerinden biridir1. Hücre, doku ve organ nakli organ yetmezliği ni tedavi etmenin etkili bir yoludur2. Bununla birlikte, donör organların sıkıntısı bu yöntemin klinik uygulamasınırlar 3,4. Çalışmalar domuz klinik transplantasyon için insan organlarının potansiyel bir kaynak olarak kullanılabilir göstermiştir5,6. Ancak türler arası organ nakli tehlikeli bağışıklık reddi ile karşı karşıya. Bu nedenle knenotransplantasyonun immün reddini izlemek çok önemlidir. Şu anda, immün ret klinik izleme hastanın belirti ve semptomları, yanı sıra laboratuvar testleri (örneğin, biyopsi, immünobiyokimyasal analiz ve ultrason)7,8,9bağlıdır. Ancak, bu izleme yöntemleribirçok dezavantajları vardır. Hastalarda immün ret belirti ve belirtileri genellikle geç görünür10, erken teşhis ve erken müdahale için elverişli değildir; biyopsi invaziv olma dezavantajı vardır11, hangi hastalar için kabul etmek kolay değildir; immünobiyokimyasal analiz duyarlılık veya özgüllük yoksun, ve ultrason yardımcı ve pahalı. Bu nedenle, bağışıklık reddi izlemek için etkili ve uygun bir yöntem bulmak için acildir.
Dolaşımdaki DNA, kanda bulunan hücre dışı bir DNA türüdür. Mandel ve Metais12 ilk olarak 1948 yılında periferik kanda dolaşan DNA varlığını rapor ettiler. Normal fizyolojik koşullar altında, sağlıklı insanların kanında dolaşan DNA'nın taban çizgisi nispeten düşüktür. Ancak, tümörler, miyokard enfarktüsü, otoimmün hastalıklar ve nakil reddi gibi bazı patolojilerde, kandaki dolaşımdaki DNA düzeyi apopoz ve nekrozun neden olduğu dolaşımdaki DNA'nın büyük salınımı nedeniyle önemli ölçüde artabilir13,14. Dolaşan DNA'nın kökeni apoptoz ve nekroz ile ilişkilidir15, ksenogreft ret özelliği olan16.
Dolaşan DNA kanserleri tespit etmek için minimal-invaziv biyomarker olduğu kanıtlanmıştır17,18,19. Donör kaynaklı sirkülasyon DNA'nın yüksek yoluyla dizilişi organ nakli sonrası ret tespiti için güvenilirdir20,21. Ancak, bu yöntem yüksek konsantrasyon ve çıkarılan DNA kalitesi gerektirir. Yüksek maliyet ve zaman tüketimine ek olarak DNA gereksinimleri bu yöntemi rutin klinik kullanım için uygun hale getirememaktadır. Donör kaynaklı sirkülasyon DNA tam kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR), hem özel hem de hassas tarafından ölçülebilir. Bu nedenle, qPCR ile dolaşan domuz eti nin ölçülmesi ksenotransplantasyonun immün reddini izlemek için uygulanabilir bir yöntemdir. Bu daha az invaziv, son derece hassas ve özel, düşük maliyetli ve zaman tasarrufu sağlar. Domuzlar ve insanlar genetik olarak oldukça farklı genomik dizilerle ayrılırlar (Şekil 1). Bu nedenle, dolaşan domuz DNA kseno-reddi nedeniyle alıcının kan post-ksenotransplantasyon içine serbest bırakılabilir. CpsDNA, qPCR tarafından alıcının kanında türe özgü astarlarla kesin olarak ölçülebilir. Daha önce, biz kzsiztransplantasyon22,23için bir biyomarker olarak cpsDNA mantığı ve fizibilite göstermiştir. Burada, daha deneysel ipuçları ve ayrıntıları ifşa. Deneme aşağıdaki adımlardan oluşur. İlk olarak, domuz spesifik astarlar tasarlanmış ve genomik DNA izole edildi, hangi normal PCR tarafından astar özgüllüğünü doğrulamak için kullanıldı. İkinci olarak, cpsDNA standart eğrisi inşa ve örnek kan cpsDNA izole. Son olarak, dolaşan domuz özgü DNA qPCR kullanılarak ölçüldü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler Shenzhen Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi Shenzhen İkinci Halk Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu'nun ilgili yönergeleri ve yönetmeliklerine uygun olarak yapılmıştır.
1. Tasarım domuz özel astarlar
- NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) yazılımını kullanarak, insanların, maymunların veya farelerden farklı olan domuzlara özgü genleri belirlemek için tüm genom BLAST analizini yapın.
- Primer 5'in yazılımını kullanarak 19 domuza özgü gene(Tablo 1)göre astar tasarla.
2. Genomik DNA'yı yalıtma
NOT: Genomik DNA (domuz, maymun, gönüllü insan, domuz greftli maymunlar ve domuz eti hücreli farelerden alınan kan lar dahil) ticari genomik DNA çıkarma kiti(Tablo Malzemeler)kullanılarak çıkarıldı.
- Yukarıdaki örneklerin 500 μL'sini sırasıyla farklı mikrosantrifüj tüplere yerleştirin.
- Yukarıdaki mikrosantrifüj tüplerin içine 20 μL proteaz K ve 500 μL lysis tampon ekleyin ve iyice çalkalayın ve karıştırın.
- Bu mikrosantrifüj tüplerini 56 °C'de 10 dk su banyosuna koyun ve çözelti netleşene kadar bu işlem sırasında 2-3 kez sallayın.
- Tüp kapaklarının iç duvarından sıvı boncukları çıkarmak için kısaca santrifüj. 500 μL'lik susuz etil alkol ekleyin ve iyice çalkalayın.
- Karışımı 2 dk boyunca 12.000 rpm (~13.400 x g)ile santrifüj olan adsorpsiyon sütununa aktarın.
- Her adsorpsiyon sütununa 800 μL durulama çözeltisi ekleyin; 1 20.000 rpm (~ 13.400 x g)1 dakika için santrifüj . Kalan durulama çözeltisini kurutmak için kolonları birkaç dakika oda sıcaklığında yerleştirin.
NOT: Durulama çözeltisi üretici tarafından sağlanır. - Adsorpsiyon kolonlarını başka bir temiz santrifüj tüpe aktarın, adsorpsiyon filmlerinin ortasına 50 μL elüsyon tamponu ekleyin ve 2-5 dakika oda sıcaklığında yerleştirin. Santrifüj 6.200 x g için 1 dk 12.000 rpm (~13.400 x g).
NOT: Elüsyon tamponu üretici tarafından sağlanır, ancak 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) ve 0.1 mM EDTA içeren TE tamponu dna'yı da eritebilir. - DNA çözeltisini -20 °C'de saklayın.
3. Astarların özgüllüğünü doğrulayın
NOT: Yukarıdaki 19 astarın tür özellikleri PCR tarafından doğrulandı, bu da polimeraz(Malzeme Tablosu)ve Tablo 1'desunulan astarlar kullanılarak yapıldı.
- 12,5 μL 2x PCR premix(Malzeme Tablosu),1 μL 5' astar (10 μM), 1 μL 3' astar (10 μM) ve 8,5 μL ddH2O. Karışımı hazırlayın.
- Önceden karıştırılmış çözeltinin 23 μL'sini 0,2 mL mikrosantrifüj tüplerine bölün, 2 μL genomik DNA ekleyin ve tüpleri dikkatlice kaplayın. Sonra karıştırın ve biraz santrifüj.
- 0,2 mL mikrosantrifüj tüplerini PCR-cycler'a yerleştirin ve aşağıdakileri yapın: Denatürasyon: 5 s için 95 °C; Annelik: 60 °C 30 s; uzantısı:72 °C için 30 s.
- Agarose elektroforezini aşağıdaki gibi gerçekleştirin:
- 100 mL 1x TAE içeren bir şişe içine agarose 1.2 g tartın ve mikrodalga 5 dakika kaynatın. Yaklaşık 70 °C'ye soğuduktan sonra şişeye 5 μL nükleik asit boyası(Malzeme Tablosu)ekleyin. Yavaşça kenar boyunca plaka içine dökün ve bir jel içine katılaşmak kadar oda sıcaklığında yerleştirin.
- Agarose jelin içine 1 μL 6x DNA yükleme tamponu içeren 5 μL numune ve 2 Günlük DNA Merdiveni (0.1-10.0 kb) veya Marker I (0.1-0.6 kb) ekleyin. Daha sonra 120 mA'da elektroforse bantlar ayrılana kadar.
- Dna parçaları içeren agar jelini ultraviyole görüntüleyiciyle görselleştirin.
- Yukarıdaki örneklerden güçlendirilmiş DNA parçalarını izole etmek için agarose elektroforezi gerçekleştirin, bu da ultraviyole görüntüleyicide görselleştirildi. PCR kullanılarak, güçlendirilmiş domuz genomik DNA'sına özgü astarlar ilk olarak tanımlanmışlardır(Şekil 2A). Ayrıca, maymun/insan genomik kohortunda veya fare genomik DNA kohortunda domuz DNA'sını özel olarak güçlendiren bu astarların bazı tür özellikleri doğrulandı(Şekil 2B). Son olarak, iki tür özgüllük astarları daha özellikle domuz-to-maymun arter yama ve / veya domuz-to-fare hücre nakli modellerinde domuz DNA yükseltmek için kanıtlanmıştır, sırasıyla(Şekil 2C)
4. CpSDNA'nın standart eğrisi
- Domuz DNA'sı parçasını içeren pMD19-T plazmidini DH5a'ya dönüştürün, bu da özellikle astar #4 veya astar #11 ile güçlendirilebilir(Tablo 1). 50 μg/mL ampisilin kullanarak pozitif bakteriler için ekran.
Insan / maymun kohort astar #4 (ileri: 5′-TTCAATCCCA CTTCTTCCACCTAA-3′, ters: 5′-CTTCATTCCATCTTCATAATAAC CCTGT-3′)
Fare modeli için astar #11 (ileri: 5′-TGCCGTGGTTTCC GTTGCTTG-3′, ters: 5′-TCACATTTTGATGGGGTCGTTGTCGTC T-3′)
NOT: Tüm astarların ayrıntılarını Tablo 1'debulabilirsiniz. - Aşağıdaki protokolü izleyerek yukarıdaki plazmidleri hasat edin.
- Tek bir koloniyi yeni çizgili seçici plakadan izole edin ve uygun seçici antibiyotik içeren 1-5 mL LB ortamı kültürünü aşılamak. 37 °C'de 12-16 saat boyunca güçlü bir titreme ile (300 rpm) kuluçkaya yatırın.
- Oda sıcaklığında 1 dakika 10.000 x g santrifüj. Decant veya aspirate ve kültür medya atın.
- 250 μL Çözelti I/RNase A. Girdap veya boru yukarı ve aşağı iyice karıştırmak için ekleyin. Hücre peletinin tamamen yeniden askıya alınması iyi verim elde etmek için hayati önem taşır.
NOT: Kullanmadan önce I. Çözüme RNase A eklenmelidir. - Süspansiyonu yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın. 250 μL Çözelti II ekleyin. Ters çevirin ve yavaşça açık bir lysate elde etmek için tüp birkaç kez döndürün. 2-3 dakika kuluçka gerekebilir.
NOT: Bu kromozomal DNA ve düşük plazmid saflığı makas olacak gibi güçlü karıştırma kaçının. Lysis reaksiyonunun 5 dakikadan fazla devam etmesine izin vermeyin. - 350 μL Çözelti III ekleyin. Flocculent beyaz çökelti formları kadar hemen birkaç kez ters.
NOT: Lokalize yağıştan kaçınmak için çözeltinin iyice ve Çözelti III'ün eklenmesinden hemen sonra karıştırılması hayati önem taşımaktadır. - Maksimum hızda santrifüj (≥ 13.000 x g) 10 dakika. Kompakt beyaz bir pelet oluşacaktır. Hemen bir sonraki adıma geçin.
- 2 mL toplama tüpüne DNA mini bir sütun yerleştirin.
- Temizlenmiş süpernatant'ı 4.2.7'den DNA mini sütununa dikkatlice havalandırarak aktarın. Pelet rahatsız etmemeye dikkat edin ve hiçbir hücresel enkaz DNA mini sütuna aktarılır.
- 1 dakika maksimum hızda santrifüj. Filtronu atın ve toplama tüpünü yeniden kullanın.
- 500 μL HBC Arabellek ekleyin. 1 dakika maksimum hızda santrifüj. Filtronu atın ve toplama tüpünü yeniden kullanın.
NOT: HBC Tampon kullanmadan önce% 100 isopropanol ile seyreltilmelidir. - 700 μL DNA Yıkama Tamponu ekleyin. 1 dakika maksimum hızda santrifüj. Filtronu atın ve toplama tüpünü yeniden kullanın.
NOT: DNA Yıkama Tamponu kullanılmadan önce %100 etanol ile seyreltilmelidir.- İsteğe bağlı: İkinci bir DNA yıkama tampon yıkama adımı için tekrarlayın.
- Sütun matrisini kurutmak için boş DNA mini sütunu maksimum hızda 2 dakika santrifüj edin.
NOT: Dna mini kolon matrisinin elüsülasyondan önce kurutulması önemlidir. Artık etanol aşağı uygulamaları etkileyebilir. - DNA mini kolonu temiz 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın.
- 30-100 μL Elütion Tampon veya steril deiyonize su doğrudan sütun membran merkezine ekleyin.
NOT: DNA Mini sütunundan DNA eluting verimliliği pH bağlıdır. Steril deiyonize su kullanıyorsanız, pH'ın 8,5 civarında olduğundan emin olun. - 1 dakika oda sıcaklığında oturalım.
- 1 dakika maksimum hızda santrifüj.
NOT: Bu bağlı DNA'nın yaklaşık% 70'ini temsil eder. İsteğe bağlı ikinci bir elüsyon daha düşük bir konsantrasyonda olsa da, herhangi bir artık DNA verecektir.
- EcoR I (15 U/μL) ve Bam H1(15 U/μL)22kullanarak çift restriksiyon enzim sindirimi ile yukarıdaki plazmidleri doğrulayın.
- Buz üzerinde makyaj adımları gerçekleştirin. 1 μL EcoR I (15 U), 1 μL Bam H1 (15 U), 2 μL 10x Tampon, 1 μg plazmid reaksiyon sistemini hazırlayın; toplam hacmin 20 μL ddH2O ekleyin, iyice karıştırın. 37 °C'de 2 saat su banyosunda kuluçkaya yatırın.
- Sindirilmiş ürünleri %1 agarose ile ayırın ve ardından elektroforez ve uv ışığına daha önce olduğu gibi maruz k.
- DDH2O kullanarak başlangıç standart çözümü için konsantre plazmidi 2 x10 11 kopya/mL olarak seyreltin. Hesaplama kopyaları örneğin domuz DNA'sı bir parçası içeren plazmid (P2) atın:
- Başlangıç standart çözeltisinin 1 mL'deki plazmid sayısını hesaplayın: N = (2 x 1011)/(6,02 x 1023) mol.
- P2'nin molekül ağırlığını hesaplayın: M = 2810 bp x 650 D/bp = 2810 x 650 D (g/mol).
- P2 kütlesini hesaplayın: m=N*M= (2 x 1011)/(6,02 x 1023) mol x 2810 x 650 g/mol.
- P2 hacmini hesaplayın: V = m/C = [(2 x 10 11)/(6,02 x 1023) x 2810 x 650] g/C. (C, spektrofotometre ile ölçülen P2 (ng/μL) konsantrasyonudur.
- Başlangıç standart çözümlü 10 kat 2 x 1010 kopya/mL, 2 x 109 kopya/mL, 2 x 108 kopya/mL, 2 x 107 kopya/mL...ve 2 x 100 kopya/mL standart çözüm için ddH2O. Vortex'i iyice seyreltin.
- Standart eğriyi kurun.
- QPCR reaksiyon sistemini hazırlayın (tüm adımlar ışıktan korunur): 325 μL qPCR Mix(Malzeme Tablosu),13 μL 5' astar, 13 μL 3' astar ve 169 μL ddH2O içeren önceden karıştırılmış çözeltiyi 1,5 mL mikrosentrifuge tüpüne ekleyin, daha sonra iyice karıştırılır ve hafifçe santrifüj edilmiştir.
- Önceden karıştırılmış çözeltinin üzerindeki 40 μL'yi 8 tüplü bir şerit içine bölün ve farklı konsantrasyonlarda 10 μL standart DNA ekleyin. Kapak dikkatle, karıştırın ve biraz santrifüj.
- Şekil 3'tegösterilen prosedürü izleyerek 8 tüplü şeridi qPCR makinesine koyun.
5. Kan örneklerinden dolaşan DNA'yı izole etmek
- EDTA tüpleri kullanarak, domuz-to-maymun arter yama modelleri ve domuz-fare hücre nakli modelleri farklı zaman noktalarında kan örnekleri toplamak.
- Yaklaşık 400 μL (domuz-to-monkey arter yama modellerinden) veya 100 μL (domuz-fare hücre nakli modellerinden) kan örnekleri toplamak ve 1.5 mL mikrosantrifüj tüplere aktarın. Düşük sıcaklıkta ve yüksek hızda (3.000 x g, 4 °C, 5 dk) santrifüj ile kan örneklerinden kan hücrelerini çıkarın.
- Supernatant'ı yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın ve 10 dk için 16.000 x g'de hücre enkazını santrifüj ile çıkarın.
- Supernatant'ı yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın. İzole eden genomik DNA üreticileri protokolünün 2.protokolünü izleyerek ticari bir serum/sirkülasyon DNA çıkarma kiti kullanarak yukarıdaki süpernatanttan sirkülasyon DNA ayıklayın.
- Sirkülasyon dna hacmini 40°L'ye kadar yoğunlaştırın ve -20 °C'de saklayın.
6. Dolaşımdaki domuza özgü DNA'nın nicelliği
- 25 μL qPCR Mix(Malzeme Tablosu),1 μL 5' astar, 1 μL 3' astar, 10 μL Numune DNA'sı ve 13 μL ddH2O. 2 ekstra numune içeren karışımı hazırlayın.
- 40 μL önceden karıştırılmış çözeltiyi 8 tüplü bir şerit te bölün ve 10 μL numune DNA'sı ekleyin ve ardından dikkatli bir şekilde kaplayın. Gerekenden iki reaksiyon daha hazırlayın.
- Standart eğriyle aynı yordamı izleyerek 8 tüplü şeridi qPCR makinesine koyun. Reaksiyonun önceden sayısallaştırma için kritik olduğundan emin olmak için bir standart ilk çalıştırmak daha iyidir. QPCR reaksiyon sisteminin prosedürü Şekil 3'tegösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolde, domuza özgü astarlar tasarlanmış, plazmid içeren domuz spesifik DNA parçaları inşa edilmiş ve nicellik için standart eğriler oluşturulmuştur(Şekil 4). 19 astarın tür özellikleri PCR tarafından doğrulandı. Türlere özgü astarlar (astar #4 ve astar #11) daha sonra domuz-fare hücre nakli modelleri ve domuz-to-maymun arter yama transplantasyon modellerinde qPCR ile cpsDNA ölçmek için kullanıldı.
Agarose elektroforezi yukarıdaki örneklerden güçlendirilmiş DNA parçalarını izole etmek için kullanıldı, bu da daha sonra ultraviyole görüntüleyicide görüntülendi. PCR kullanılarak, güçlendirilmiş domuz genomik DNA'sına özgü astarlar ilk olarak tanımlanmışlardır(Şekil 2A). Ayrıca, maymun/insan genomik kohortunda veya fare genomik DNA kohortunda domuz DNA'sını özel olarak yükselten bu astarların bazı tür özellikleri doğrulandı(Şekil 2B). Son olarak, iki tür özgüllük astarları daha özellikle domuz-to-maymun arter yama ve / veya domuz-to-fare hücre nakli modellerinde domuz DNA yükseltmek için kanıtlanmıştır, sırasıyla(Şekil 2C).
Şekil 1: Domuz(sus scrofa, ssc) ve insan(homo sapiens, has) veya maymun(Macaca fasicularis, mfa) arasındaki gen kimliği. Üç farklı türdeki gen dizileri BLAST analizi ile karşılaştırıldı. BLAST dizi analizi, NCBI'den (www.ncbi.nlm.nih.gov) indirilen üç türden genomik ek açıklama bilgileri (mRNA dizisi) kullanılmıştır. Insan, maymun ve domuz genlerinin mRNA dizileri sırasıyla 139116, 65927 ve71498 idi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Düzenli PCR, domuza özgü astarların özgüllüğünü doğrular. (A Domuz genomik DNA parçaları astar 1-19 tarafından yükseltildi. (B) İnsan/maymun/farelerin genomik DNA parçası bazı astarlar (astar #4 ve #11) tarafından güçlendirilemedi. Yıldızlar (*) insan/maymun genomik DNA'sında amplifikasyon olmadığını gösterir. Pound işareti (#) fare genomik DNA'sında amplifikasyon olmadığını gösterir. (C) İki tür özgüllük leri astar (astar #4 ve #11) daha da özellikle domuz-to-monkey arter yama ve / veya domuz-fare hücre nakli modellerinde domuz DNA yükseltmek için kanıtlanmıştır, sırasıyla22. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: QPCR reaksiyonu için prosedür22. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Mutlak niceleme için standart eğrinin oluşturulması. Amplifikasyon çizimleri, erime eğrisi çizimleri ve (A) astar #4 ve (B) astar #11 qPCR makinesinden standart eğri görünümleri sergilenir (Bkz. Malzeme Tablosu)sergilenir. İyi bir standart (R değeri 1'e yakın, amplifikasyon verimliliği %100 içinde ±5%) yarım yıla kadar22için kullanılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Domuz dolaşan DNA'nın ölçülmesi, ksenotransplantasyonun immün reddini izlemek için uygulanabilir bir yaklaşımı temsil eder. Gadi ve ark.24, akut ret olan hastaların kanında donör kaynaklı dolaşım DNA (ddcfDNA) içeriğinin reddedilmeden hastalarınkinden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu buldular. Bu çalışmalar ddcfDNA'nın organ grefthasarının izlenmesinde ortak bir biyobelirteç olabileceğini düşündürmektedir. Son yıllarda qPCR, basit çalışması, yüksek otomasyon derecesi, yüksek hassasiyet, iyi özgüllük ve düşük maliyetli olması nedeniyle nükleik asitlerin analizine giderek daha fazla uygulanmaktadır.
Bu çalışmada, domuza özgü astarlar biyoinformatik analizi sonuçlarına göre tasarlanmıştır. Özgüllükleri düzenli PCR tarafından doğrulandı. Domuzdan maymuna arter yama modellerinin ve domuzdan fareye hücre nakli modellerinin kan örneklerinin cpsDNA'sı, türe özgü astarlarla qPCR tarafından tam olarak ölçülebilir. Yaklaşımın başlıca avantajları aşağıdaki gibidir. İlk olarak, son derece spesifik astarlar dayanarak, DNA ölçme bu yöntem son derece hassas ve spesifiktir. Buna ek olarak, belirli astarların tasarımı, DNA izolasyonu ve qPCR analizinden oluşan yaklaşımın protokolü nün gerçeklemesi çok basittir, ki bu da zaman kazandırır. Küçük bir serum veya plazma materyalinden başlayan non-invaziv bir yöntemdir. Bu arada, bu yöntemin son derece tekrarlanabilir olduğunu göstermiştir22. Yüksek iş çıkışlı sıralama ve uçuş kütle spektrometresi aksine, bu yöntem düşük maliyetlidir.
QPCR kullanılarak domuzdan maymuna arter yama modellerinin ve domuzdan fareye hücre nakli modellerinin kanlarında dolaşan domuza özgü DNA'nın kana göre ölçülmesi ile immün reddin izlenmesi, domuz-insan ksenotransplantasyonunun temel araştırma ve klinik uygulamasının temelini oluşturmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması bildirmez.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Temel Ar-Ge Programı (2017YFC1103704), Shenzhen Bilim ve Teknoloji Vakfı (JCYJ20170817172116272), Guang'daki Yüksek Düzeyli Hastanelerin İnşaatı Için Özel Fonlar tarafından desteklenmiştir. Dong Eyaleti (2019), Shenzhen Tıp Sanming Projesi (SZSM201412020), Shenzhen Yüksek Düzeyli Tıbbi Disiplin İnşaat Fonu (2016031638), Shenzhen Sağlık ve Aile Planlama Komisyonu Vakfı (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Biowest, Barcelona, Spain | 111860 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | R3136S | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | MCT-150-C | |
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | PCR-02-C | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province, China | 8~10 weeks | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA | Micro 21R | |
| 2-Log DNA Ladder | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | N3200S | 0.1–10.0 kb |
| Marker I | Tiangen, Beijing, China | MD101-02 | 0.1–0.6 kb |
| DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns) | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | DNACOL-01 | |
| DNA loading buffer | Solarbio, Beijing, China | D1010 | |
| E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | D6942 | |
| D6943 | |||
| EcoR I | Takara Bio, Shiga, Japan | 1040S | |
| Female Bama mini pigs | BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China | 2~4 months | |
| Genomic DNA Extraction Kit ? | Tiangen, Beijing, China | DP304-02 | |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | Toyobo, Osaka, Japan | QPK-201 | |
| Gel Doc XR | Bio-Rad, Hercules, USA | ||
| Male cynomolgus monkeys | Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China | 8 years | |
| Nucleic acid dye(Gelred) | Biotium, Fremont, USA | 42003 | |
| polymerase(Premix Taq) | Takara Bio, Shiga, Japan | RR901A | |
| pMD19-T plasmid | Takara Bio, Shiga, Japan | D102A | |
| qPCR machine | Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA | ||
| Serum/Circulating DNA Extraction Kit | Tiangen, Beijing, China | DP339 | |
| TAE | sangon Biotech, Shanghai, China | B548101 |
References
- Buchman, T. Multiple organ failure. Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).
- Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. Organ donation after circulatory death: current status and future potential. Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).
- Lopez-Fraga, M., et al. A needed Convention against trafficking in human organs. Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).
- Sykes, M., Sachs, D. Transplanting organs from pigs to humans. Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).
- Reardon, S. New life for pig-to-human transplants. Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).
- Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation. BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).
- Chung, H., et al. CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation. Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).
- Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation. Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).
- Agbor-Enoh, S., et al. Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).
- Vito Dabbs, D., et al. Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation. Heart & Lung. 33 (6), 372-380 (2004).
- Miller, C. A., et al. Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection. Heart. 99 (7), 445-453 (2013).
- Mandel, P., Metais, P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l'homme. Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).
- Okkonen, M., et al. Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation. Critical Care. 15 (4), 196 (2011).
- Wagner, J. Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics. Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
- Mohiuddin, M. M., et al. Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft. Nature Communications. 7, 11138 (2016).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).
- Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).
- De Vlaminck, I., et al. Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).
- Zhou, M., et al. Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection. Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).
- Huo, Q., et al. Circulating mi RNA or circulating DNA —Potential biomarkers for organ transplant rejection. Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).
- Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection. Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).
