Summary
在该协议中，设计了猪特异性底剂，构建了含质粒的猪特异性DNA片段，并建立了定量标准曲线。使用物种特异性底法，cpsDNA在猪对小鼠细胞移植模型和猪对猴子动脉贴片移植模型中通过qPCR进行量化。
Abstract
异种移植是治疗器官衰竭的可行方法。然而，如何有效地监测异种移植的免疫排斥是医生和研究人员面临的一个问题。本手稿介绍了一种简单有效的方法来监测猪对老鼠细胞移植模型和猪对猴子动脉贴片移植模型中的免疫排斥。循环DNA是一种潜在的非侵入性生物标志物，用于器官损伤。在这项研究中，通过定量实时PCR（qPCR）监测猪特异性DNA（cpsDNA） 在异种移植排斥过程中。在该协议中，设计了猪特异性底剂，构建了含质粒的猪特异性DNA片段，并建立了定量标准曲线。然后，在猪对小鼠细胞移植模型和猪对猴子动脉贴片移植模型中，使用物种特异性底剂通过 qPCR 对 cpsDNA 进行量化。该方法的价值表明，它可以作为一种简单、方便、低成本、侵入性较小的方法来监测异种移植的免疫排斥。
Introduction
器官衰竭是导致1人死亡的主要原因之一。细胞、组织和器官移植是治疗器官衰竭的有效方法。然而，捐赠器官的短缺限制了这种方法的临床应用3，4。研究表明，猪可以作为人体器官的潜在来源进行临床移植5，6。然而，跨物种器官移植面临危险的免疫排斥。因此，监测异种移植的免疫排斥至关重要。目前，免疫排斥的临床监测主要取决于患者的体征和症状，以及实验室测试（如活检、免疫生化分析和超声波）7、8、9。但是，这些监视方法有许多缺点。患者免疫排斥的体征和症状通常晚10晚出现，不利于早期发现和早期干预;活检有侵入性11的缺点，患者不容易接受;免疫生物化学分析缺乏敏感性或特异性，超声波是辅助的，而且价格昂贵。因此，寻找一种有效、方便的方法来监测免疫排斥是当务之急。
循环DNA是一种在血液中发现的细胞外DNA。曼德尔和梅泰斯12号在1948年首次报告了周围血液中存在循环DNA。在正常的生理条件下，健康人血液中的循环DNA在基线上相对较低。然而，在一些病理，如肿瘤，心肌梗死，自身免疫性疾病，移植排斥，循环DNA水平在血液中可以显著增加13，14由于大量释放循环DNA引起的凋亡和坏死因子。循环DNA的起源与凋亡和坏死15有关，这是异种移植排斥16的特征。
循环DNA已被证明是一种微创生物标志物，用于检测癌症17，18，19。供体衍生循环DNA的高直通测序是检测器官移植20、21后排斥的可靠方法。然而，这种方法要求高浓度和中提取的DNA质量。除了高昂的成本和时间消耗外，DNA要求使这种方法没有资格用于常规临床应用。供体衍生的循环DNA可以通过定量实时PCR（qPCR）精确量化，它既具体又敏感。因此，通过qPCR量化猪循环DNA是监测异种移植免疫排斥的可行方法。这具有较少的侵入性、高度敏感和特异性、低成本和节省时间。猪和人类在基因上是分开的，基因组序列完全不同（图1）。因此，循环的猪DNA可以释放到接受者的血液后异种移植由于异种排斥。CpsDNA 可以通过 qPCR 精确量化，在接受者血液中使用物种特异性底剂。此前，我们已经论证了cpsDNA作为异种移植22，23的生物标志物的理由和可行性。在这里，我们披露更多的实验技巧和细节。实验由以下步骤组成。首先，设计了猪特异性底剂，分离了基因组DNA，用于通过常规PCR验证底源剂的特异性。其次，构建cpsDNA的标准曲线，将cpsDNA与样本血隔离。最后，使用qPCR对循环猪特异性DNA进行量化。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有实验都是按照深圳市第二人民医院、深圳市第一附属医院机构审查委员会的有关指导意见和规定进行的。
1. 设计猪专用底剂
- 使用软件NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）进行全基因组爆炸分析，以识别与人类、猴子或小鼠不同的www.ncbi.nlm.nih.gov。
- 使用底像5的软件根据19个猪特异性基因（表1）设计底像。
2. 隔离基因组DNA
注：基因组DNA（包括猪、猴子、志愿者、移植猪的猴子和有猪细胞的小鼠）是使用商业基因组DNA提取试剂盒（材料表）提取的。
- 将上述样品的500μL全部放入不同的微离心管中。
- 将20 μL蛋白酶K和500μL的解液缓冲液加入上述微离心管中，然后彻底摇动和混合。
- 将这些微离心管在56°C的水浴中10分钟，并在这个过程中摇动2-3次，直到溶液变得清晰。
- 短暂离心，从管盖内壁上取出液体珠子。加入500μL的无水乙醇，彻底摇动。
- 将混合物转移到吸附柱中，在 12，000 rpm （±13，400 x g）下离心 2 分钟。
- 在每个吸附柱中加入800μL的冲洗溶液;在 12，000 rpm （+13，400 x g） 下离心机 1 分钟。将柱在室温下放置几分钟，以干燥剩余的冲洗溶液。
注：冲洗溶液由制造商提供。 - 将吸附柱转移到另一根干净的离心管中，在吸附膜中间加入 50 μL 的洗脱缓冲液，并将其放在室温下 2-5 分钟。离心机 6，200 x g， 转速为 1 分钟 12，000 rpm （±13，400 x g）。
注：洗脱缓冲液由制造商提供，但包含 10 mM Tris-HCl （pH 8.0） 和 0.1 mM EDTA 的 TE 缓冲液也可以洗脱 DNA。 - 将DNA溶液储存在-20°C。
3. 验证底向剂的特异性
注：上述19个底注的物种特异性由PCR确认，PCR使用聚合酶（材料表）和表1所示的底 注进行。
- 制备 12.5 μL 2x PCR 预混料（材料表），1 μL 5' 底像 （10 μM），1 μL 的 3' 底像 （10 μM） 和 8.5 μL 的 ddH 2 O. 准备混合，包括2个额外的样品。
- 将23μL预混合溶液分成0.2 mL微离心管，加入2μL的基因组DNA，并小心地盖住管。然后稍微混合和离心。
- 将0.2 mL微离心管放入PCR循环器中，执行以下操作：变性：95°C，为5秒;退火：60°C，30 s;延长：72 °C，30 s.
- 执行阿加罗斯电泳，如下所示：
- 将 1.2 g 的阿加罗斯重放入含有 100 mL 1x TAE 的烧瓶中，并在微波炉中煮 5 分钟。将5μL的核酸染料（材料表）加入烧瓶，冷却至约70°C。 沿着边缘慢慢倒入板中，在室温下放置，直到凝固成凝胶。
- 将 5 μL 样品和 2-Log DNA 梯子（0.1±10.0 kb）或标记 I（0.1±0.6 kb）加入，其中含有 1 μL 的 6 倍 DNA 加载缓冲液，加入 agarose 凝胶。然后在120 mA电泳，直到带子分离。
- 使用紫外线成像器可视化含有 DNA 片段的汞凝胶。
- 执行阿加罗斯电泳，从上述样品中分离放大的DNA片段，这些片段在紫外线成像器中可视化。使用PCR，首先识别了用于放大猪基因组DNA的底基因（图2A）。此外，这些底基因在猴子/人类基因组群或小鼠基因组DNA群中专门放大猪DNA的某些物种特异性得到确认（图2B）。最后，进一步证明两种物种特异性底法在猪到猴子动脉贴片和/或猪对老鼠细胞移植模型中分别专门放大猪DNA（图2C）
4. cpsDNA 的标准曲线
- 将含有猪DNA片段的pMD19-T质粒转换为DH5a，该质像或底#4（表1）可#11放大。使用 50 μg/mL 安西林筛查阳性细菌。
人类/#4队列中的底像（转发：5°-TTCATCCCA CTTCTCTCCTAA-3°，反向：5°-CTCCATCTCTCATATAAC CCTGT-3°）
鼠标#11（转发：5+-TGCCGTGTTTTC-3+，反向：5°-TCACATTTTTGTCTTGTCTTCTTCTTCTGTCTTCT3+）
注：所有底像的详细信息见表1。 - 按照以下协议收获上述质粒。
- 将单个菌落从新鲜条纹的选择性板中分离，并接种含有适当选择性抗生素的 1-5 mL LB 培养基。在37°C下孵育12-16小时，剧烈摇晃（300 rpm）。
- 在室温下以 10，000 x g 离心 1 分钟。丢弃或吸气并丢弃文化媒体。
- 加入250μL溶液 I/RNase A. 涡流或上下移液，彻底混合。细胞颗粒的完全再彭化对于获得良好的产量至关重要。
注意：使用前必须将 RNase A 添加到解决方案 I 中。 - 将悬浮液转移到新的 1.5 mL 微离心管中。添加 250 μL 溶液 II。反转并轻轻地旋转管几次，以获得一个清晰的利酸盐。可能需要2-3分钟的孵育。
注：避免剧烈混合，因为这将剪切染色体DNA和降低质粒纯度。不要让解解反应继续超过 5 分钟。 - 加入 350 μL 溶液 III。立即反转几次，直到絮凝的白色沉淀形成。
注：在添加溶液 III 后，必须立即彻底混合溶液，以避免局部降水。 - 以最高速度（≥13，000 x g）离心10分钟。将形成一个紧凑的白色颗粒。立即执行下一步。
- 将 DNA 迷你柱插入 2 mL 收集管中。
- 将清除的上清液从4.2.7转移至DNA迷你柱中。注意不要打扰颗粒，并且没有细胞碎片被转移到DNA迷你柱上。
- 以最高速度离心1分钟。丢弃滤物并重复使用收集管。
- 添加 500 μL 的 HBC 缓冲液。以最高速度离心1分钟。丢弃滤物并重复使用收集管。
注：使用前必须用100%异丙醇稀释HBC缓冲液。 - 加入700μL的DNA洗涤缓冲液。以最高速度离心1分钟。丢弃滤物并重复使用收集管。
注：使用前必须用100%乙醇稀释DNA洗涤缓冲液。- 可选：重复第二个DNA洗涤缓冲液洗步。
- 以最大速度将空的DNA迷你柱离心2分钟，以干燥柱基。
注：在洗脱之前干燥DNA迷你柱基质非常重要。残留乙醇可能会干扰下游应用。 - 将 DNA 迷你柱转移到干净的 1.5 mL 微离心管中。
- 将 30-100 μL 的洗脱缓冲液或无菌脱氧水直接添加到柱膜的中心。
注：从DNA迷你柱中检测DNA的效率取决于pH值。如果使用无菌去化水，请确保 pH 约为 8.5。 - 让我们在室温下坐1分钟。
- 以最高速度离心1分钟。
注：这表示大约70%的束缚DNA。可选的第二次洗脱将产生任何残留的DNA，尽管在浓度较低。
- 使用 EcoR I （15 U/μL） 和 Bam H1 （15 U/μL）22使用双限制性酶消化验证上述质粒。
- 在冰上执行化妆步骤。制备1μL的EcoR I（15U）、1μL的Bam H1（15U）、2μL的10x缓冲液、1μg质粒的反应系统;将 ddH2O 添加到总体积的 20 μL，彻底混合。在37°C的水浴中孵育2小时。
- 将消化的产品分开 1% 的 agarose，然后由电泳分离，并像以前一样暴露在紫外线下。
- 使用 ddH2O 将浓缩质粒稀释为 2 x10 11拷贝/mL，用于起始标准溶液。以含有猪DNA片段的质粒（P2）为例，计算副本：
- 计算起始标准溶液1 mL中的质粒数：N = （2 x 1011）/ （6.02 x 1023） mol。
- 计算P2的分子量：M = 2810 bp x 650 D/bp = 2810 x 650 D （g/mol）。
- 计算 P2 的质量：m=N*M= （2 x 1011）/ （6.02 x 1023） mol x 2810 x 650 g/mol。
- 计算 P2： V = m/C = [（2 x 1011） /（6.02 x 1023） x 2810 x 650° g/C. （C 是 P2 （ng/μL） 的浓度，用分光光度计测量）。
- 将起始标准溶液连续稀释 10 倍，分为 2 x10 10 10 份/mL、2 x 109 份/mL、2 x 108 份/mL、2 x 107 份/mL...和 2 x 100 拷贝/mL，用于标准溶液，在稀释过程中使用 ddH2O. Vortex 彻底使用。
- 建立标准曲线。
- 准备 qPCR 的反应系统（所有步骤均防止光线）：将含有 325 μL qPCR 混合（材料表）、13 μL 5' 底转、13 μL 3' 底转和 169 μL ddH2O 的预混合溶液加入 1.5 mL 微离心机管中，然后彻底混合并稍微离心。
- 将预混合溶液上方的 40 μL 分割成 8 管条，并加入 10 μL 不同浓度的标准 DNA。小心盖，稍微混合和离心。
- 按照图 3所示步骤将 8 管条放入 qPCR 机器中。
5. 从血液样本中分离循环DNA
- 使用EDTA管，在猪到猴子动脉贴片模型和猪对老鼠细胞移植模型中的不同时间点采集血液样本。
- 收集约400μL（从猪到猴子动脉贴片模型）或100μL（从猪到老鼠细胞移植模型）的血液样本，并转移到1.5 mL微离心管。在低温和高速（3，000 x g，4 °C，5分钟）下离心，从血液样本中去除血细胞。
- 将上流液转移到新的 1.5 mL 微离心管中，以 16，000 x g 离心去除细胞碎屑 10 分钟。
- 将上流液转移到新的 1.5 mL 微离心管中。按照分离基因组DNA制造商协议2，使用商业血清/循环DNA提取试剂盒从上述上流水中抽取循环DNA。
- 将循环DNA的体积压缩至40μL，储存在-20°C。
6. 循环猪特异性DNA的定量
- 制备25μL的qPCR混合预混合溶液（材料表），1μL的5'底数，1μL的3'底数，10μL的样品DNA，和13μL的ddH2O. 准备混合包括2个额外的样品。
- 将 40 μL 预混合溶液拆分为 8 管条，并加入 10 μL 的样本 DNA，然后小心封盖。准备两个比需要多的反应。
- 按照与标准曲线相同的步骤，将 8 管条放入 qPCR 机器中。最好先运行一个标准，以确保反应对提前量化至关重要。图3显示了qPCR反应系统 的程序。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在该协议中，设计了猪特异性底剂，构建了含有质粒的猪特异性DNA片段，并建立了定量标准曲线（图4）。19种底数的物种特异性得到PCR的确认。然后，在猪对小鼠细胞移植模型和猪对猴子动脉贴片移植模型中，使用物种特异性底像（底像#4和底像#11）通过qPCR对cpDNA进行量化。
Agarose电泳用于从上述样品中分离放大的DNA片段，然后在紫外线成像器中可视化。使用PCR，首次识别了用于放大猪基因组DNA的底剂（图2A）。此外，这些底基因在猴子/人类基因组群或小鼠基因组DNA组中专门放大猪DNA的某些物种特异性得到确认（图2B）。最后，进一步证明两种物种特异性底法在猪到猴动脉贴片和/或猪对老鼠细胞移植模型中分别专门放大了猪的DNA（图2C）。
图1：猪（苏斯克罗法，ssc）和人类（智人，有）或猴子（马卡法斯卡，mfa）之间的基因识别。通过S被炸分析比较了三个不同物种的基因序列。BLAST序列分析使用从NCBI（三个物种）下载的三个物种的基因组注释信息（mRNA www.ncbi.nlm.nih.gov）。人类、猴子和猪基因的mRNA序列分别是139116、65927和71498，分别是22。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：常规PCR验证猪特异性特异性。（猪基因组DNA片段被底像1-19放大。（B） 人/猴子/小鼠基因组DNA片段不能被一些底像（底#4和#11）。星体（*） 表示人类/猴子基因组DNA没有扩增。磅号 （#） 表示小鼠基因组 DNA 中没有扩增。（C） 两种特异性底剂（底像#4和#11）被进一步证明在猪对猴子动脉贴片和/或猪对老鼠细胞移植模型中分别特别放大猪DNA。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：qPCR反应22的过程。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：建立绝对量化标准曲线。展出了 qPCR 机器的放大图、熔体曲线图和 （A） 底像 #4 和 （B） 底像 #11 的标准曲线视图（参见材料表）。良好的标准（R 值接近 1，放大效率在 100% ±5%）可用于长达半年22。请单击此处查看此图的较大版本。
表1.请点击这里下载此表。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
量化猪循环DNA是监测异种移植的免疫排斥的可行方法。Gadi等人24 日发现，急性排斥患者血液中的供体衍生循环DNA（ddcfDNA）含量明显高于无排斥患者的血液中。这些研究表明，ddcfDNA可能是监测器官移植损伤的常见生物标志物。近年来，qPCR由于操作简单、自动化程度高、灵敏度高、特异性好、成本低，在核酸分析中应用日益深入。
本研究中，根据生物信息学分析的结果设计了猪专用底剂。其特异性由常规PCR验证。猪到猴动脉贴片模型的血液样本和猪对小鼠细胞移植模型的cpsDNA可以通过qPCR用物种特异性底法精确量化。该方法的主要优点如下。首先，基于高度特异性的底基因，这种DNA量化方法具有高度敏感和特异性。此外，该方法的协议执行起来非常简单，包括特定底向器的设计、DNA的分离和一天中的qPCR分析，这都是节省时间的。它是一种非侵入性的方法，从少量的血清或血浆材料开始。同时，我们已经证明，这种方法是高度可重复的22。与高通量测序和飞行质谱法相比，该方法成本低。
利用qPCR对猪与猴动脉贴片模型和猪对小鼠细胞移植模型的血液循环猪特异性DNA进行定量监测免疫抑制，为猪-人类异种移植的基础研究和临床应用奠定了基础。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者报告没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家重点研发项目（2017YFC1103704）、深圳市科技基金会（JCJ20170817172116272）、广东省高水平医院建设专项资金的资助。 （2019年），深圳市三明医药工程（SZSM201412020），深圳市高级医疗学科建设基金（2016031638），深圳市卫生计发委（SZXJ2017021）， SZXJ2018059）.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Biowest, Barcelona, Spain | 111860 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | R3136S | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | MCT-150-C | |
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | PCR-02-C | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province, China | 8~10 weeks | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA | Micro 21R | |
| 2-Log DNA Ladder | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | N3200S | 0.1–10.0 kb |
| Marker I | Tiangen, Beijing, China | MD101-02 | 0.1–0.6 kb |
| DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns) | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | DNACOL-01 | |
| DNA loading buffer | Solarbio, Beijing, China | D1010 | |
| E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | D6942 | |
| D6943 | |||
| EcoR I | Takara Bio, Shiga, Japan | 1040S | |
| Female Bama mini pigs | BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China | 2~4 months | |
| Genomic DNA Extraction Kit ? | Tiangen, Beijing, China | DP304-02 | |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | Toyobo, Osaka, Japan | QPK-201 | |
| Gel Doc XR | Bio-Rad, Hercules, USA | ||
| Male cynomolgus monkeys | Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China | 8 years | |
| Nucleic acid dye(Gelred) | Biotium, Fremont, USA | 42003 | |
| polymerase(Premix Taq) | Takara Bio, Shiga, Japan | RR901A | |
| pMD19-T plasmid | Takara Bio, Shiga, Japan | D102A | |
| qPCR machine | Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA | ||
| Serum/Circulating DNA Extraction Kit | Tiangen, Beijing, China | DP339 | |
| TAE | sangon Biotech, Shanghai, China | B548101 |
References
- Buchman, T.
- Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. Organ donation after circulatory death: current status and future potential. Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).
- Lopez-Fraga, M., et al. A needed Convention against trafficking in human organs. Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).
- Sykes, M., Sachs, D. Transplanting organs from pigs to humans. Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).
- Reardon, S. New life for pig-to-human transplants. Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).
- Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation. BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).
- Chung, H., et al. CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation. Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).
- Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation. Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).
- Agbor-Enoh, S., et al. Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).
- Vito Dabbs, D., et al. Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation. Heart & Lung. 33 (6), 372-380 (2004).
- Miller, C. A., et al. Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection. Heart. 99 (7), 445-453 (2013).
- Mandel, P., Metais, P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l'homme. Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).
- Okkonen, M., et al. Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation. Critical Care. 15 (4), 196 (2011).
- Wagner, J. Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics. Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
- Mohiuddin, M. M., et al. Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft. Nature Communications. 7, 11138 (2016).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).
- Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).
- De Vlaminck, I., et al. Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).
- Zhou, M., et al. Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection. Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).
- Huo, Q., et al. Circulating mi RNA or circulating DNA —Potential biomarkers for organ transplant rejection. Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).
- Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection. Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).
