Summary
이 프로토콜에서, 돼지 특이적 프라이머는 설계되었고, 플라스미드함유 돼지 특이적 DNA 단편이 시공되었고, 수량에 대한 표준 곡선이 확립되었다. cpsDNA는 종별 프라이머를 사용하여 돼지-마우스 세포 이식 모델 및 돼지-원숭이 동맥 패치 이식 모델에서 qPCR에 의해 정량화되었다.
Abstract
제노이식은 장기 부전을 치료하는 실현 가능한 방법입니다. 그러나, xeno이식의 면역 거부를 효과적으로 감시하는 방법은 의사와 연구원을 위한 문제입니다. 이 원고는 돼지 대 마우스 세포 이식 모델 및 돼지 - 투 - 원숭이 동맥 패치 이식 모델에서 면역 거부를 모니터링하는 간단하고 효과적인 방법을 설명합니다. 순환 DNA는 장기 손상을 위한 잠재적으로 비침습적인 바이오마커입니다. 이 연구에서는, 순환돼지 특이적 DNA(cpsDNA)는 정량적 실시간 PCR(qPCR)에 의해 제노이식 거부 중에 모니터링되었다. 이 프로토콜에서, 돼지 특이적 프라이머는 설계되었고, 플라스미드함유 돼지 특이적 DNA 단편이 시공되었고, 수량에 대한 표준 곡선이 확립되었다. 종별 프라이머는 돼지-마우스 세포 이식 모델 및 돼지-원숭이 동맥 패치 이식 모델에서 qPCR에 의해 cpsDNA를 정량화하는 데 사용되었다. 이 방법의 가치는 xeno이식의 면역 거부를 모니터링하기 위해 간단하고 편리하며 저렴한 비용 및 덜 침습적 인 방법으로 사용될 수 있음을 시사합니다.
Introduction
장기 실패는사망1의 주요 원인 중 하나입니다. 세포, 조직 및 장기의 이식은 장기 부전2를치료하는 효과적인 방법입니다. 그럼에도 불구하고, 기증자 기관의 부족은 이 방법의 임상 적용을제한3,4. 연구 결과에 따르면 돼지는 임상이식을위한 인간 장기의 잠재적 인 원천으로 사용될 수 있음을 보여 주었다5,6. 그러나, 종 간 장기 이식은 위험한 면역 거부에 직면. 따라서, xeno 이식의 면역 거부를 모니터링 하는 것이 중요 하다. 현재 면역 거부의 임상 모니터링은 주로 환자의 징후와 증상뿐만 아니라 실험실 테스트 (예를 들어, 생검, 면역 생화학 적 분석 및 초음파)7,8,9에의존한다. 그러나 이러한 모니터링 방법에는 많은 단점이 있습니다. 환자에 있는 면역 거부의 표시 그리고 현상은 일반적으로 조기 발견 및 조기 내정간섭에 도움이 되지 않는10의늦게 나타납니다; 생검은 환자가 받아들이기 쉽지 않은침습성 11의단점을 갖는다; 면역생화학적 분석은 민감성 또는 특이성이 부족하며 초음파는 보조적이고 비용이 많이 듭니다. 따라서 면역 거부를 모니터링하는 효과적이고 편리한 방법을 찾는 것이 시급하다.
순환 DNA는 혈액에서 찾아낸 DNA의 세포외 모형입니다. 만델과 메타이스12는 1948년에 말초 혈액에 있는 순환 DNA의 존재를 처음으로 보고했습니다. 정상적인 생리학적 조건하에서 건강한 사람들의 혈액에서 DNA를 순환하는 것은 기준선에서 상대적으로 낮습니다. 그러나, 종양, 심근 경색, 자가면역 질환 및 이식 거부와 같은 일부 병리학에서 혈액 내순환 DNA의 수준은 세포사멸 및 괴사증에 의한 순환 DNA의 대규모 방출로 인해13,14로 크게 증가할 수 있다. 순환 DNA의 기원은 자멸및괴사(15)와연관되며, 이는 이종이이식거부(16)의특징이다.
순환 DNA는 암 검출을 위한 최소침습바이오마커로 입증되었다17,18,19. 기증자 유래 순환 DNA의 높은 스루-풋 시퀀싱은 장기 이식 후 거부의 검출에 신뢰할 수있다(20,21). 그러나, 이 방법은 추출된 DNA의 고농도 및 질이 필요합니다. 높은 비용과 시간 소비 이외에 DNA 요구 사항은 이 방법을 일상적인 임상 사용을 위해 부적격하게 만듭니다. 기증자 유래 순환 DNA는 정량적 실시간 PCR(qPCR)에 의해 정확하게 정량화될 수 있으며, 이는 특이적이고 민감합니다. 따라서 qPCR에 의한 순환 하는 돼지 순환 DNA를 정량화하는 것은 xenotransplantation의 면역 거부를 모니터링하는 실현 가능한 방법입니다. 이것은 덜 침습적이고, 매우 민감하고, 구체적이고, 저렴한 비용 및 시간 절약입니다. 돼지와 인간은 유전적으로 아주 다른 게놈 서열(도1)으로분리된다. 따라서, 순환 하는 돼지 DNA 는 xeno 거부 때문에 수신자의 혈액 후 xeno이식으로 풀어 놓일 수 있다. CpsDNA는 수신자의 혈액에 있는 종 특정 프라이머로 qPCR에 의해 정확하게 정량화될 수 있었습니다. 이전에는, 우리는 xeno 이식에 대한 바이오 마커로서 cpsDNA의 근거및 타당성을 입증했다22,23. 여기에서 는 더 많은 실험적 팁과 세부 사항을 공개합니다. 실험은 다음 단계로 구성됩니다. 첫째, 돼지 특이적 프라이머가 설계되었고, 일반 PCR에 의해 프라이머의 특이성을 검증하는 데 사용되었던 게놈 DNA가 분리되었다. 둘째, cpsDNA의 표준 곡선을 구성하고 샘플 혈액으로부터 cpsDNA를 격리합니다. 마지막으로, 순환돼지 특이적 DNA는 qPCR을 사용하여 정량화되었다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 실험은 심천대학교 제1부산병원의 심천제병원 기관심사위원회의 관련 지침및 규정에 따라 수행되었다.
1. 디자인 돼지 특정 프라이머
- 소프트웨어 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)를 사용하여 인간, 원숭이 또는 마우스의 유전자와 다른 돼지 특정 유전자를 식별하기 위해 전체 게놈 BLAST 분석을 수행합니다.
- 프라이머 5의 소프트웨어를 사용하여 19개의 돼지 특이유전자(표 1)에따른 설계 프라이머.
2. 게놈 DNA 격리
참고: 게놈 DNA(돼지, 원숭이, 자원 봉사 인간, 돼지 이식편을 가진 원숭이, 돼지 세포를 가진 마우스 등)는 상업적게놈 DNA 추출키트(재료표)를사용하여 추출하였다.
- 위의 시료의 전체 혈액 의 500 μL을 각각 다른 미세 원심 분리 튜브에 놓습니다.
- 위의 미세 원심 분리기 튜브에 프로테아제 K 20 μL과 500 μL의 용액 버퍼를 추가한 다음 철저히 흔들고 섞습니다.
- 이러한 미세원심분리기 튜브를 56°C의 수조에 넣고 10분 동안 이 과정에서 2-3회 흔들어 용액이 명확해질 때까지 흔들어 줍니다.
- 원심분리기는 튜브 커버의 내부 벽에서 액체 구슬을 제거하기 위해 간단히 제거합니다. 무수성 에틸 알코올 500 μL을 넣고 철저히 흔들어 줍니다.
- 혼합물을 흡착 열, 원심분리기12,000rpm(~13,400 x g)으로2분 간 전달합니다.
- 각 흡착 열에 800 μL의 헹구는 용액을 추가합니다. 원심분리기 는 12,000 rpm (~13,400 x g)에서1분 동안 원심분리기. 기둥을 실온에 몇 분 간 배치하여 나머지 헹구는 용액을 건조시다.
참고: 헹구는 용액은 제조업체에서 제공합니다. - 흡착 컬럼을 다른 깨끗한 원심 튜브로 옮기고 흡착 필름 의 중간에 50 μL의 용출 버퍼를 추가하고 2-5 분 동안 실온에 놓습니다. 원심 분리기 6,200 x g 용 1 분 12,000 rpm (~13,400 x g).
참고: 용출 버퍼는 제조업체에 의해 제공되지만, 10m Tris-HCl(pH 8.0) 및 0.1 mM EDTA를 포함하는 TE 버퍼는 DNA를 엘로트할 수도 있다. - DNA 용액을 -20°C에 저장합니다.
3. 프라이머의 특이성 확인
참고: 상기 19프라이머의 종 특이성은 PCR에 의해 확인되었으며, 이는 제1표에제시된 폴리머라제(재료표)와 프라이머를 사용하여 수행되었다.
- 2x PCR프리믹스(재료표),5μM(1μM), 3μM(10μM)의 1μL, ddH2O의8.5 μL의 사전 혼합 용액을 준비한다.
- 사전 혼합 용액 의 23 μL을 0.2 mL 마이크로 센심 분리기 튜브로 분할하고, 게놈 DNA2 μL을 추가하고, 조심스럽게 튜브를 캡. 그런 다음 약간 혼합하고 원심분리기를 합니다.
- PCR-사이클러에 0.2 mL 마이크로원심분리기 튜브를 배치하고 다음을 수행합니다: 5s에 대한 95°C; 아닐링: 30초에 60°C; 연장:72°C 용 30s.
- 다음과 같이 아가로 성 전동을 수행하십시오.
- 아가로즈 1.2g을 1x TAE 100mL가 들어 있는 플라스크에 넣고 전자레인지에서 5분간 끓입니다. 약 70°C로 냉각된 후 플라스크에 핵산염료(재료표)의5μL을 넣습니다. 가장자리를 따라 접시에 천천히 붓고 젤로 고화될 때까지 실온에 놓습니다.
- 6x DNA 로딩 버퍼1μL을 포함하는 5μL 의 샘플 및 2-Log DNA 래더(0.1-10.0 kb) 또는 마커 I(0.1-0.6 kb)를 아가로즈 젤에 넣습니다. 그런 다음 밴드가 분리 될 때까지 120 mA에서 전기 phorese.
- 자외선 이이미와 DNA 단편을 포함하는 한천 젤을 시각화합니다.
- 상기 샘플에서 증폭된 DNA 단편을 분리하기 위해 아가로즈 전기포고를 수행하여 자외선 심조에서 시각화하였다. PCR을 이용하여, 증폭된 돼지 게놈 DNA에 특이적인 프라이머가 먼저확인되었다(도 2A). 또한, 원숭이/인간 게놈의 코호트 또는 마우스 게놈 DNA의 코호트에서 돼지 DNA를 구체적으로 증폭시킨 이들 프라이머의 특정 종 특이성이확인되었다(도 2B). 마지막으로, 2종 특이성 프라이머는 돼지-원숭이 동맥 패치 및/또는 돼지-마우스 세포 이식 모델에서 돼지 DNA를 구체적으로 증폭시키는 것으로 입증되었다(도2C)
4. cpsDNA의 표준 곡선
- 돼지 DNA의 단편을 함유한 pMD19-T 플라스미드를 DH5a로 변환하여 프라이머 #4 또는 프라이머#11(표 1)에의해 구체적으로 증폭될 수 있다. 50 μg/mL 암피실린을 사용하여 양성 박테리아를 위한 스크린.
인간 / 원숭이 코호트에서 프라이머 #4 (앞으로: 5′-TTCAATCCCA CTTCTTCCACCTAA-3′, 역: 5′-CTTCATTCCATTCATTCATAAC CCTGT-3′)
마우스 모델에 대한 프라이머 #11 (앞으로: 5′-TGCTGGTTTCC GTTGCTTG-3′, 역: 5′-TCACATTTGATGGTCGTGTTGTTCGTCGTC T-3′)
참고: 모든 프라이머의 세부 정보는 표 1에서찾을 수 있습니다. - 아래 의정서에 따라 위의 플라스미드를 수확하십시오.
- 갓 줄지어 있는 선택적 플레이트로부터 단일 콜로니를 분리하고 적절한 선택적 항생제를 함유하는 LB 배지의 1-5mL 배양을 접종한다. 37°C에서 12-16시간 동안 활발한 흔들림(300rpm)으로 배양합니다.
- 원심분리기는 실온에서 1분 동안 10,000 x g의 원심분리기. 문화 매체를 폐기하거나 흡인하거나 폐기하십시오.
- 250 μL의 용액 I/RNase A. 소용돌이를 추가하거나 파이프를 위아래로 사용하여 완전히 섞습니다. 세포 펠릿의 완전한 재현탁은 좋은 수확량을 얻는 데 필수적입니다.
참고: RNase A를 사용하기 전에 솔루션 I에 추가해야 합니다. - 새로운 1.5 mL 마이크로 센심 분리기 튜브로 서스펜션을 전송합니다. 솔루션 II의 250 μL을 추가합니다. 투명 한 lysate를 얻기 위해 튜브를 여러 번 반전 하 고 부드럽게 회전. 2-3분 배큐베이션이 필요할 수 있습니다.
참고: 염색체 DNA와 플라스미드 순도를 낮춥니까 격렬한 혼합을 피하십시오. 리시스 반응이 5분 이상 진행되도록 허용하지 마십시오. - 솔루션 III의 350 μL을 추가합니다. 플록스 화이트 침전물 형태가 형성될 때까지 즉시 여러 번 반전합니다.
참고: 현지화된 강수량을 피하기 위해 솔루션 III를 추가한 직후 솔루션이 철저히 혼합되는 것이 중요합니다. - 10분 동안 최대 속도(≥13,000 xg)의원심분리기. 컴팩트한 흰색 펠릿이 형성됩니다. 즉시 다음 단계로 진행합니다.
- DNA 미니 컬럼을 2mL 수집 튜브에 삽입합니다.
- DNA 미니 컬럼으로 조심스럽게 흡입하여 클리어된 상체를 4.2.7에서 전송합니다. 펠릿을 방해하지 않도록주의하고 세포 파편이 DNA 미니 컬럼으로 전송되지 않도록주의하십시오.
- 원심 분리기는 최대 속도로 1분 동안 입니다. 여과를 버리고 수집 튜브를 다시 사용합니다.
- HBC 버퍼 500 μL을 추가합니다. 원심 분리기는 최대 속도로 1분 동안 입니다. 여과를 버리고 수집 튜브를 재사용합니다.
참고: HBC 버퍼는 사용하기 전에 100% 이소프로파놀로 희석해야 합니다. - DNA 세척 버퍼 700 μL을 추가합니다. 원심 분리기는 최대 속도로 1분 동안 입니다. 여과를 버리고 수집 튜브를 다시 사용합니다.
참고: DNA 세척 버퍼는 사용하기 전에 100% 에탄올로 희석해야 합니다.- 선택 사항: 두 번째 DNA 세척 버퍼 세척 단계를 반복합니다.
- 빈 DNA 미니 컬럼을 최대 속도로 2분 동안 원심분리하여 컬럼 매트릭스를 건조시킵니다.
참고: 용해하기 전에 DNA 미니 컬럼 매트릭스를 건조하는 것이 중요합니다. 잔류 에탄올은 다운스트림 응용 프로그램을 방해할 수 있습니다. - DNA 미니 컬럼을 깨끗한 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브로 전송합니다.
- 30-100 μL의 용출 버퍼 또는 멸균 제산화된 물을 기둥 멤브레인의 중앙에 직접 넣습니다.
참고: DNA 미니 컬럼에서 DNA를 용출하는 효율은 pH에 따라 달라집니다. 멸균 된 물을 사용하는 경우 pH가 약 8.5인지 확인하십시오. - 실온에서 1분간 앉게 하십시오.
- 원심 분리기는 최대 속도로 1분 동안 입니다.
참고: 이것은 결합된 DNA의 대략 70%를 나타냅니다. 선택적 두 번째 용출은 낮은 농도에서 하지만 어떤 잔여 DNA를 산출 합니다.
- 에코R I(15 U/μL) 및 Bam H1(15 U/μL)22를사용하여 이중 제한 효소 소화를 사용하여 위의 플라스미드를 확인한다.
- 얼음 위를 화장하는 단계를 수행합니다. EcoR I(15 U), 밤 H1(15U)의 1μL, 10x 버퍼 2μL, 플라스미드 1μg의 반응 시스템을 준비한다. 총 부피의 20 μL에 ddH2O를 추가, 철저하게 혼합. 37°C에서 2시간 동안 수조에 배양합니다.
- 소화된 제품을 1% 아가로즈로 분리하고 전기전도가 선행되고 이전과 같이 UV 광에 노출됩니다.
- ddH2O를 사용하여 시작 표준 용액을 위해 농축 플라스미드를 2 x10 11 사본/mL로 희석합니다. 예를 들어, 돼지 DNA의 단편을 포함하는 플라스미드(P2)를 복용하십시오.
- 시작 표준 솔루션의 1mL에서 플라스미드 수를 계산합니다: N= (2 x 10 11)/(6.02 x 1023)mol.
- P2의 분자량을 계산: M = 2810 bp x 650 D/bp = 2810 x 650 D (g/mol).
- P2의 질량을 계산: m=N*M= (2 x 1011)/(6.02 x 1023)mol x 2810 x 650 g/mol.
- P2의 부피를 계산: V = m/C =[(2 x 10 11)/((6.02 x 1023)x 2810 x 650] g/C.(C는 분광계에 의해 측정되는 P2(ng/μL)의 농도입니다).
- 시작 표준 솔루션을 연속적으로 10배로 2 x 1010 카/mL, 2 x 109 카피/mL, 2 x 108 카피/mL, 2 x 107 카피/mL..., ddH2O. 소용돌이를 사용하여 표준 솔루션을 위한 2 x 100 사본/mL를 희석하십시오.
- 표준 곡선을 설정합니다.
- qPCR의 반응 시스템 준비(모든 단계는 빛으로부터 보호됨): qPCR 믹스 325 μL(재료표),5'프라이머의 13 μL, 3'프라이머의 13 μL, 169 μL 의 169 μL을 1.5mL 마이크로원심분리튜브에 넣고 약간 혼합하였다.
- 사전 혼합 용액 위의 40 μL을 8튜브 스트립으로 분할하고 서로 다른 농도의 표준 DNA 10 μL을 추가합니다. 조심스럽게 캡, 약간 혼합 하고 원심분리기.
- 도 3에표시된 절차에 따라 8튜브 스트립을 qPCR 기계에 넣습니다.
5. 혈액 샘플에서 순환 DNA를 분리
- EDTA 튜브를 사용하여 돼지 대 원숭이 동맥 패치 모델 및 돼지 대 마우스 세포 이식 모델의 다른 시점에서 혈액 샘플을 수집합니다.
- 약 400 μL(돼지-원숭이 동맥 패치 모델에서) 또는 100 μL(돼지-마우스 세포 이식 모델에서)의 혈액 샘플을 수집하고 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브로 이송한다. 낮은 온도 및 고속 (3,000 x g,4 °C, 5 분)에서 원심 분리에 의해 혈액 샘플에서 혈액 세포를 제거합니다.
- 새로운 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브로 상체를 옮기고 10분 동안 16,000 x g에서 원심분리로 세포 이물질을 제거합니다.
- 새로운 1.5 mL 마이크로 센심 분리기 튜브로 상체를 전송합니다. 분리게놈 DNA 제조업체의 프로토콜 2에 따라 상용 혈청/순환 DNA 추출 키트를 사용하여 상기 상피에서 순환 DNA를 추출한다.
- 순환 DNA의 부피를 40 μL로 응축시키고 -20°C에 저장합니다.
6. 순환 돼지 특이적 DNA의 양
- qPCR 믹스 25μL(재료표), 5'프라이머 의 1μL, 3'프라이머1μL, 샘플 DNA 10μL, ddH2O의13 μL의 사전 혼합 용액을 준비한다.
- 40 μL 사전 혼합 용액을 8튜브 스트립으로 분할하고 10μL의 샘플 DNA를 추가한 다음 조심스럽게 캡핑합니다. 필요한 것보다 두 가지 더 많은 반응을 준비합니다.
- 표준 곡선과 동일한 절차에 따라 8튜브 스트립을 qPCR 기계에 넣습니다. 반응이 사전에 정량화에 중요한지 확인하기 위해 먼저 표준을 실행하는 것이 좋습니다. qPCR의 반응 시스템의 절차는 도 3에도시되었다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
본 프로토콜에서, 돼지 특이적 프라이머가 설계되었고, 플라스미드 함유 돼지 특이적 DNA 단편이 시공되었고, 수량에 대한 표준 곡선이 확립되었다(도4). 19프라이머의 종 특이성은 PCR에 의해 확인되었다. 종별 프라이머(프라이머 #4 및 프라이머 #11)는 돼지-마우스 세포 이식 모델 및 돼지-원숭이 동맥 패치 이식 모델에서 qPCR에 의해 cpsDNA를 정량화하는 데 사용되었다.
아가로스 전기포광은 위의 샘플에서 증폭된 DNA 단편을 분리하는 데 사용되었으며, 이는 자외선 심조에서 시각화됩니다. PCR을 사용하여, 증폭된 돼지 게놈 DNA에 특이적인 프라이머가 먼저확인되었다(도 2A). 또한, 원숭이/인간 게놈의 코호트 또는 마우스 게놈 DNA의 코호트에서 돼지 DNA를 구체적으로 증폭시킨 이들 프라이머의 특정 종 특이성이확인되었다(도 2B). 마지막으로, 2종 특이성 프라이머는 돼지-원숭이 동맥 패치 및/또는 돼지-마우스 세포 이식 모델에서 돼지 DNA를 구체적으로 증폭시키는 것으로 입증되었다(도2C).
도 1:돼지(sus scrofa,ssc) 및 인간(호모사피엔스,있다) 또는원숭이(마카카 근막,mfa) 사이의 유전자 정체성. 세 가지 다른 종의 유전자 서열은 BLAST 분석에 의해 비교되었다. BLAST 서열 분석은 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 다운로드된 3종의 게놈 성모 정보(mRNA 서열)를 사용했다. 인간, 원숭이 및 돼지 유전자의 mRNA 서열은 각각22개인139116, 65927 및 71498이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 일반 PCR은 돼지 특정 프라이머의 특이성을 검증합니다. (돼지 게놈 DNA 단편은 프라이머 1-19에 의해 증폭되었다. (B)인간/원숭이/마우스 게놈 DNA 단편은 일부 프라이머(프라이머 #4 및 #11)에 의해 증폭될 수 없었다. 별(*)은 인간/원숭이 게놈 DNA의 증폭을 나타내지 않습니다. 파운드 기호 (#)는 마우스 게놈 DNA에 증폭을 나타내지 않습니다. (C)2종 특이성 프라이머(프라이머 #4 및 #11)는 돼지-원숭이 동맥 패치 및/또는 돼지-마우스 세포 이식 모델에서 돼지 DNA를 구체적으로 증폭시키는 것으로입증되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: qPCR반응(22)에대한절차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 절대 정량화를 위한 표준 곡선의 확립. 증폭 플롯, 용융 곡선 플롯 및 표준 곡선뷰(A)프라이머 #4 및(B)qPCR 기계로부터의 프라이머 #11(재료표 참조)가 전시된다. 좋은 표준(R값 1에 가깝고 증폭 효율은 100% ±5% 이내) 최대 반년 동안 사용할 수있습니다 22. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
발신 순환 DNA를 정량화하는 것은 xenotransplantation의 면역 거부를 감시하는 실행 가능한 접근법을 나타냅니다. Gadi외. 24 급성 거부 환자의 혈액에서 기증자 유래 순환 DNA (ddcfDNA) 함량은 거부없이 환자의 함량이 상당히 높다는 것을 발견했다. 이 연구 결과는 ddcfDNA가 기관 이식 손상을 감시하기 위한 일반적인 biomarker일 지도 모르다는 것을 건의합니다. 최근에는 간단한 작동, 높은 수준의 자동화, 높은 민감도, 좋은 특이성 및 저비용 때문에 qPCR이 핵산 분석에 점점 더 많이 적용되고 있다.
이 연구에서, 돼지 특정 프라이머는 생물 정보학 분석의 결과에 따라 설계되었습니다. 그들의 특이성은 일반 PCR에 의해 확인되었습니다. 돼지-원숭이 동맥 패치 모델및 돼지-마우스 세포 이식 모델의 혈액 샘플의 cpsDNA는 종별 프라이머를 사용하여 qPCR에 의해 정확하게 정량화될 수 있다. 접근 방식의 주요 장점은 다음과 같습니다. 첫째, 매우 구체적인 프라이머에 기초하여, DNA를 정량화하는 이 방법은 매우 민감하고 특이하다. 또한, 접근의 프로토콜은 특정 프라이머의 설계, DNA의 격리 및 qPCR 분석으로 구성된 수행이 매우 간단하며, 이는 시간 절약입니다. 소량의 혈청 또는 혈장 물질로부터 시작하는 비침습적 방법입니다. 한편, 우리는이 방법이 매우 재현 할 수 있음을입증했다 22. 높은 처리량 시퀀싱 및 비행 질량 분석법과는 달리 이 방법은 저렴한 비용입니다.
qPCR을 이용한 돼지-원숭이 동맥 패치 모델 및 돼지-마우스 세포 이식 모델의 혈액에서 돼지 특이적 DNA를 순환하여 면역 거부를 모니터링하는 것은 돼지-인간 제노이식의 기본 연구 및 임상 적용의 토대를 마련했다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이해 상충을 보고합니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 국립핵심R&D 프로그램(2017YFC103704), 심천과학기술재단(JCYJ20170817171116272), 광동성 고원병원 건립 특별기금(JCYJ2017171116272) 보조금으로 지원되었다. 2019), 심천의학의 산명 프로젝트(SZSM201412020), 심천 의 고수준 의료분야 건설 기금(2016031638), 심천보건가족기획위원회(SZXJ2017021) , SZXJ2018059).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Biowest, Barcelona, Spain | 111860 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | R3136S | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | MCT-150-C | |
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | PCR-02-C | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province, China | 8~10 weeks | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA | Micro 21R | |
| 2-Log DNA Ladder | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | N3200S | 0.1–10.0 kb |
| Marker I | Tiangen, Beijing, China | MD101-02 | 0.1–0.6 kb |
| DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns) | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | DNACOL-01 | |
| DNA loading buffer | Solarbio, Beijing, China | D1010 | |
| E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | D6942 | |
| D6943 | |||
| EcoR I | Takara Bio, Shiga, Japan | 1040S | |
| Female Bama mini pigs | BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China | 2~4 months | |
| Genomic DNA Extraction Kit ? | Tiangen, Beijing, China | DP304-02 | |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | Toyobo, Osaka, Japan | QPK-201 | |
| Gel Doc XR | Bio-Rad, Hercules, USA | ||
| Male cynomolgus monkeys | Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China | 8 years | |
| Nucleic acid dye(Gelred) | Biotium, Fremont, USA | 42003 | |
| polymerase(Premix Taq) | Takara Bio, Shiga, Japan | RR901A | |
| pMD19-T plasmid | Takara Bio, Shiga, Japan | D102A | |
| qPCR machine | Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA | ||
| Serum/Circulating DNA Extraction Kit | Tiangen, Beijing, China | DP339 | |
| TAE | sangon Biotech, Shanghai, China | B548101 |
References
- Buchman, T.
- Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. Organ donation after circulatory death: current status and future potential. Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).
- Lopez-Fraga, M., et al. A needed Convention against trafficking in human organs. Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).
- Sykes, M., Sachs, D. Transplanting organs from pigs to humans. Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).
- Reardon, S. New life for pig-to-human transplants. Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).
- Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation. BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).
- Chung, H., et al. CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation. Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).
- Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation. Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).
- Agbor-Enoh, S., et al. Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).
- Vito Dabbs, D., et al. Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation. Heart & Lung. 33 (6), 372-380 (2004).
- Miller, C. A., et al. Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection. Heart. 99 (7), 445-453 (2013).
- Mandel, P., Metais, P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l'homme. Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).
- Okkonen, M., et al. Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation. Critical Care. 15 (4), 196 (2011).
- Wagner, J. Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics. Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
- Mohiuddin, M. M., et al. Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft. Nature Communications. 7, 11138 (2016).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).
- Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).
- De Vlaminck, I., et al. Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).
- Zhou, M., et al. Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection. Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).
- Huo, Q., et al. Circulating mi RNA or circulating DNA —Potential biomarkers for organ transplant rejection. Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).
- Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection. Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).
