Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kvantifisering av sirkulerende grisespesifikt DNA i blodet av en Xenotransplantasjonsmodell

Published: September 22, 2020 doi: 10.3791/61579
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 1, 4, 1,5, 6, 7, 1
1Shenzhen Xenotransplantation Medical Engineering Research and Development Center, Institute of Translational Medicine, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Xianning Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Liver-biotechnology (Shenzhen) Co., Ltd., 4Department of Radiology, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 5Department of Life Sciences, University of Toronto, 6Jiangsu Key Laboratory of Xenotransplantation, Nanjing Medical University, 7Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital
* These authors contributed equally

Summary

I denne protokollen ble svinespesifikke primere designet, plasmider-inneholdende svinspesifikke DNA-fragmenter ble konstruert, og standardkurver for kvantitet ble etablert. Ved hjelp av artsspesifikke primere ble cpsDNA kvantifisert av qPCR i celletransplantasjonsmodeller for gris-til-mus og gris-til-ape arterie patch transplantasjon modeller.

Abstract

Xenotransplantasjon er en mulig metode for å behandle organsvikt. Men hvordan å effektivt overvåke immunavvisningen av xenotransplantasjon er et problem for leger og forskere. Dette manuskriptet beskriver en enkel og effektiv metode for å overvåke immunavvisning i gris-til-mus celletransplantasjon modeller og gris-til-ape arterie patch transplantasjon modeller. Sirkulerende DNA er en potensielt ikke-invasiv biomarkør for organskade. I denne studien ble sirkulerende grisespesifikt DNA (cpsDNA) overvåket under xenograft avvisning av kvantitativ sanntids-PCR (qPCR). I denne protokollen ble svinespesifikke primere designet, plasmider-inneholdende svinspesifikke DNA-fragmenter ble konstruert, og standardkurver for kvantitet ble etablert. Artsspesifikke primere ble deretter brukt til å kvantifisere cpsDNA av qPCR i celletransplantasjonsmodeller for gris-til-mus og gris-til-ape arterie patch transplantasjon modeller. Verdien av denne metoden antyder at den kan brukes som en enkel, praktisk, lav pris og mindre invasiv metode for å overvåke immunavvisningen av xenotransplantasjon.

Introduction

Organsvikt er en av de viktigste dødsårsakene1. Transplantasjon av celler, vev og organer er en effektiv måte å behandle organsvikt2på. Likevel begrenser mangelen på donororganer den kliniske anvendelsen av denne metoden3,4. Studier har vist at griser kan brukes som en potensiell kilde til menneskelige organer for klinisktransplantasjon 5,6. Organtransplantasjon på tvers av arter står imidlertid overfor farlig immunavvisning. Derfor er det avgjørende å overvåke immunavvisningen av xenotransplantation. For tiden avhenger klinisk overvåking av immunavvisning hovedsakelig av pasientens tegn og symptomer, samt laboratorietester (f.eks. biopsi, immunobiokjemisk analyse og ultralyd)7,8,9. Disse overvåkingsmetodene har imidlertid mange ulemper. Tegn og symptomer på immunavvisning hos pasienter vises vanligvissent 10, noe som ikke bidrar til tidlig deteksjon og tidlig intervensjon; biopsi har ulempen med å være invasiv11, noe som ikke er lett for pasienter å akseptere; immunobiokjemisk analyse mangler følsomhet eller spesifisitet, og ultralyd er ekstra og dyrt. Derfor er det presserende å finne en effektiv og praktisk metode for å overvåke immunavvisningen.

Sirkulerende DNA er en ekstracellulær type DNA som finnes i blod. Mandel og Metais12 rapporterte først tilstedeværelsen av sirkulerende DNA i perifert blod i 1948. Under normale fysiologiske forhold er sirkulerende DNA i blodet til friske mennesker relativt lav ved baseline. Men i noen patologier, som svulster, hjerteinfarkt, autoimmune sykdommer og transplantasjonsavvisning, kan nivået av sirkulerende DNA i blodet økesbetydelig 13,14 på grunn av den massive utgivelsen av sirkulerende DNA forårsaket av apoptose og nekrose. Opprinnelsen til sirkulerende DNA er forbundet med apoptose og nekrose15, som er karakteristiske for xenograft avvisning16.

Sirkulerende DNA har vist seg å være en minimal-invasiv biomarkør for å oppdage kreft17,18,19. Høy gjennom-sette sekvensering av donor-avledet sirkulerende DNA er pålitelig for påvisning av avvisning etterorgantransplantasjon 20,21. Denne metoden krever imidlertid en høy konsentrasjon og kvalitet på ekstrahert DNA. DNA-kravene i tillegg til høye kostnader og tidsforbruk gjør denne metoden ikke kvalifisert for rutinemessig klinisk bruk. Donoravledet sirkulerende DNA kan nøyaktig kvantifiseres ved kvantitativ sanntids-PCR (qPCR), som er både spesifikk og følsom. Kvantifisere svin sirkulerende DNA ved qPCR er derfor en mulig metode for å overvåke immunavvisning av xenotransplantasjon. Dette er mindre invasiv, svært følsom og spesifikk, lav pris og tidsbesparende. Griser og mennesker er genetisk separate med ganske forskjellige genomiske sekvenser (figur 1). Derfor kan sirkulerende svin DNA slippes ut i mottakerens blod etter xenotransplantasjon på grunn av xeno-avvisning. CpsDNA kan kvantifiseres nøyaktig av qPCR med artsspesifikke primere i mottakerens blod. Tidligere har vi demonstrert begrunnelsen og gjennomførbarheten av cpsDNA som biomarkør for xenotransplantation22,23. Her avslører vi mer eksperimentelle tips og detaljer. Eksperimentet består av følgende trinn. For det første ble svinespesifikke primere designet, og genomisk DNA ble isolert, som ble brukt til å verifisere spesifisiteten til primerne av vanlig PCR. For det andre, konstruere standard kurven av cpsDNA og isolere cpsDNA fra prøven blod. Til slutt ble det sirkulerende grisespesifikke DNA kvantifisert ved hjelp av qPCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter ble utført i samsvar med relevante retningslinjer og forskrifter fra Institutional Review Board of Shenzhen Second People's Hospital, First Affiliated Hospital of Shenzhen University.

1. Design svin spesifikke primere

  1. Utfør hele genom BLAST analyse for å identifisere svin spesifikke gener som var forskjellig fra de av mennesker, aper eller mus, ved hjelp av programvaren NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
  2. Design primere i henhold til 19 grisespesifikke gener (Tabell 1) ved hjelp av programvaren til Primer 5.

2. Isolere genomisk DNA

MERK: Det genomiske DNA-et (inkludert blod fra griser, aper, frivillige mennesker, aper med grisetransplantater og mus med svineceller) ble hentet ut ved hjelp av et kommersielt genomisk DNA-ekstraksjonssett (Table of Materials).

  1. Legg 500 μL av hele blodet av ovennevnte prøver i forskjellige mikrocentrifuge rør, henholdsvis.
  2. Tilsett 20 μL protease K og 500 μL lysisbuffer i de ovennevnte mikrocentrifugerørene, og rist og bland deretter grundig.
  3. Sett disse mikrocentrifuge rørene i et vannbad ved 56 °C i 10 min og rist 2-3 ganger i løpet av denne prosessen til løsningen blir klar.
  4. Sentrifuge kort for å fjerne de flytende perlene fra den indre veggen av rørdekslene. Tilsett 500 μL vannfri etylalkohol og rist grundig.
  5. Overfør blandingen til adsorpsjonskolonnen, sentrifuge ved 12 000 o/min (~13 400 x g)i 2 min.
  6. Legg til 800 μL skylleløsning i hver adsorpsjonskolonne; sentrifuge i 1 min ved 12 000 o/min ( ~13 400 x g). Plasser kolonnene ved romtemperatur i noen minutter for å tørke den gjenværende skylleløsningen.
    MERK: Skylleoppløsningen leveres av produsenten.
  7. Overfør adsorpsjonskolonnene til et annet rent sentrifugalrør, tilsett 50 μL elutionbuffer til midten av adsorpsjonsfilmene, og plasser dem ved romtemperatur i 2-5 min. Sentrifuge 6200 x g for 1 min 12 000 o/min (~13 400 x g).
    MERK: Elution-bufferen leveres av produsenten, men TE-bufferen, som inneholder 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) og 0,1 mM EDTA, kan også elute DNA.
  8. Oppbevar DNA-oppløsningen ved -20 °C.

3. Kontroller spesifisiteten til primerne

MERK: Arter spesifisiteter av de ovennevnte 19 primere ble bekreftet av PCR, som ble utført ved hjelp av polymerase (Table of Materials) og primere presentert i tabell 1.

  1. Klargjør den forhåndsblandet oppløsningen på 12,5 μL2x PCR premix ( Materialsekk), 1 μL av 5' primer (10 μM), 1 μL av 3' primer (10 μM) og 8,5 μL ddH2O. Klargjør blandingen med 2 ekstra prøver.
  2. Del 23 μL forhåndsblandet oppløsning i 0,2 ml mikrocentrifugerør, tilsett 2 μL genomisk DNA, og avsl rørene forsiktig. Bland og sentrifuger litt.
  3. Plasser 0,2 ml mikrocentrifuge rør i PCR-cycler og utføre følgende: Denaturation: 95 °C for 5 s; Annealing: 60 °C for 30 s; forlengelse: 72 °C for 30 s.
  4. Utfør agarose elektroforese som følger:
    1. Vei 1,2 g agarose i en kolbe som inneholder 100 ml 1x TAE og kok den i 5 min i mikrobølgeovnen. Tilsett 5 μL nukleinsyrefargestoff (Materialtabell) i kolben etter at den er avkjølt til ca. 70 °C. Hell den langsomt i platen langs kanten, og plasser den ved romtemperatur til den stivner i en gel.
    2. Tilsett 5 μL prøve og 2-Log DNA Ladder (0,1–10,0 kb) eller I (0,1–0,6 kb), som inneholder 1 μL 6x DNA-lastbuffer, i agarosegelen. Deretter elektroforese ved 120 mA til båndene er skilt.
    3. Visualiser agargelen som inneholder DNA-fragmenter med en ultrafiolett imager.
  5. Utfør agarose elektroforese for å isolere forsterkede DNA-fragmenter fra de ovennevnte prøvene, som ble visualisert i en ultrafiolett imager. Ved hjelp av PCR ble primerne som er spesifikke for forsterket svingenomisk DNA først identifisert (figur 2A). Videre ble visse artsspesifisiteter av disse primerne som spesielt forsterket gris DNA i kohorten av ape / human genomisk eller i kohorten av mus genomisk DNA bekreftet (figur 2B). Til slutt ble to arter-spesifisiteter primere ytterligere bevist å spesifikt forsterke gris DNA i gris-til-ape arterie patch og / eller gris-til-mus celle transplantasjon modeller, henholdsvis (Figur 2C)

4. Standard kurve av cpsDNA

  1. Forvandle pMD19-T plasmid som inneholder et fragment av svin DNA til DH5a, som kan forsterkes spesielt av primer #4 eller primer #11 (Tabell 1). Skjerm for positive bakterier ved bruk av 50 μg/ml ampicillin.
    Primer #4 i human / monkey kohort (fremover: 5′-TTCAATCCCA CTTCTTCTTCCACCTAA-3', omvendt: 5′-CTTCATTCCATCTTCATAATAAC CCTGT-3')
    Primer #11 for mus modell (fremover: 5′-TGCCGTGGTTTCC GTTGCTTG-3', omvendt: 5′-TCACATTTGATGGTCGTCGTCGTCGTC T-3')
    MERK: Detaljer om alle primere finnes i tabell 1.
  2. Høst de ovennevnte plasmidene etter protokollen nedenfor.
    1. Isoler en enkelt koloni fra en nystripete selektiv plate og inokuler en kultur på 1- 5 ml LB-medium som inneholder riktig selektivt antibiotika. Inkuber i 12-16 timer ved 37 °C med kraftig risting (300 o/min).
    2. Sentrifuge ved 10.000 x g i 1 minutt ved romtemperatur. Dekanter eller aspirerer og kast kulturmediene.
    3. Tilsett 250 μL oppløsning I/RNase A. Vortex eller pipet opp og ned for å blandes grundig. Fullstendig resuspensjon av cellepellet er avgjørende for å oppnå gode utbytter.
      MERK: RNase A må legges til løsning I før bruk.
    4. Overfør suspensjon til et nytt 1,5 ml mikrocentrifugerør. Tilsett 250 μL oppløsning II. Inverter og roter forsiktig røret flere ganger for å oppnå en klar lysate. En 2-3 minutters inkubasjon kan være nødvendig.
      MERK: Unngå kraftig blanding, da dette vil skjære kromosomalt DNA og lavere plasmid renhet. Ikke la lysisreaksjonen fortsette mer enn 5 minutter.
    5. Tilsett 350 μL oppløsning III. Umiddelbart invertere flere ganger til en flocculent hvit bunnform.
      MERK: Det er viktig at oppløsningen blandes grundig og umiddelbart etter tilsetning av løsning III for å unngå lokalisert nedbør.
    6. Sentrifuge ved maksimal hastighet (≥ 13 000 x g)i 10 minutter. En kompakt hvit pellet vil danne seg. Gå straks videre til neste trinn.
    7. Sett inn en DNA minikolonne i et 2 ml oppsamlingsrør.
    8. Overfør det fjernede supernatantet fra 4.2.7 ved å aspirere den forsiktig inn i DNA mini-kolonnen. Vær forsiktig så du ikke forstyrrer pelleten og at ingen cellulære rester overføres til DNA minikolonnen.
    9. Sentrifuge ved maksimal hastighet i 1 minutt. Kast filtratet og gjenbruk oppsamlingsrøret.
    10. Tilsett 500 μL HBC Buffer. Sentrifuge ved maksimal hastighet i 1 minutt. Kast filtrat- og gjenbruksrøret.
      MERK: HBC Buffer må fortynnes med 100 % isopropanol før bruk.
    11. Tilsett 700 μL DNA-vaskebuffer. Sentrifuge ved maksimal hastighet i 1 minutt. Kast filtratet og gjenbruk oppsamlingsrøret.
      MERK: DNA-vaskebufferen må fortynnes med 100 % etanol før bruk.
      1. Valgfritt: Gjenta for et nytt DNA-vaskebuffervasktrinn.
    12. Sentrifuger den tomme DNA minikolonnen i 2 minutter med maksimal hastighet for å tørke kolonnematrisen.
      MERK: Det er viktig å tørke DNA mini kolonne matrisen før elution. Gjenværende etanol kan forstyrre nedstrøms applikasjoner.
    13. Overfør DNA minikolonnen til et rent 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    14. Tilsett 30-100 μL elutionbuffer eller sterilt deionisert vann direkte til midten av kolonnemembranen.
      MERK: Effektiviteten ved å eluting DNA fra DNA Mini-kolonnen er avhengig av pH. Hvis du bruker sterilt deionisert vann, må du kontrollere at pH-en er rundt 8,5.
    15. La sitte ved romtemperatur i 1 minutt.
    16. Sentrifuge ved maksimal hastighet i 1 minutt.
      MERK: Dette representerer ca. 70 % av bundet DNA. En valgfri andre elution vil gi noen gjenværende DNA, men ved en lavere konsentrasjon.
  3. Kontroller de ovennevnte plasmidene ved hjelp av dobbel begrensningsenzymfordøyelse ved hjelp av EcoR I (15 U/μL) og Bam H1(15 U/μL)22.
    1. Utfør sminketrinnene på isen. Forbered reaksjonssystemet på 1 μL ecor I (15 U), 1 μL Bam H1 (15 U), 2 μL 10x Buffer, 1 μg plasmid; tilsett ddH2O til 20 μL totalt volum, bland godt. Inkuber i et vannbad ved 37 °C i 2 timer.
    2. Skill de fordøyde produktene med 1% agarose etterfulgt av elektroforese og utsett UV-lys som før.
  4. Fortynn konsentrert plasmid i 2 x 1011 kopier/ml for startstandardløsningen ved hjelp av ddH2O. Ta plasmid (P2) som inneholder et fragment av svin DNA for eksempel kopier som beregner:
    1. Beregn antall plasmider i 1 ml startstandardløsning: N = (2 x 1011)/ (6,02 x 1023) mol.
    2. Beregn den molekylære vekten av P2: M = 2810 bp x 650 D/bp = 2810 x 650 D (g/mol).
    3. Beregn massen av P2: m=N*M= (2 x 1011)/ (6,02 x 1023) mol x 2810 x 650 g/mol.
    4. Beregn volumet av P2: V = m/C = [(2 x 1011)/(6,02 x 1023) x 2810 x 650] g/C. (C er konsentrasjonen av P2 (ng/μL), som måles ved et spektrofotometer).
  5. Fortynn startstandardløsningen serielt 10 ganger i 2 x 1010 kopier/ml, 2 x 109 kopier/ml, 2 x 108 kopier/ml, 2 x 107 kopier/ml..., og 2 x 100 kopier/ml for standardløsning ved hjelp av ddH2O. Vortex grundig under fortynning.
  6. Etablere standardkurven.
    1. Klargjør reaksjonssystem for qPCR (alle trinnene er beskyttet mot lys): Tilsett den forhåndsblandete oppløsningen som inneholder 325 μL qPCR Mix (Materialsekktabell), 13 μL av 5' primer, 13 μL av 3' primer og 169 μL ddH2O i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, som deretter ble grundig blandet og litt sentrifugert.
    2. Del 40 μL over pre-blandet oppløsning i en 8-rørs stripe og tilsett 10 μL standard DNA av forskjellige konsentrasjoner. Cap forsiktig, bland og sentrifuge litt.
    3. Sett 8-rørsstrimmelen inn i qPCR-maskinen etter fremgangsmåten som vises i figur 3.

5. Isolere sirkulerende DNA fra blodprøvene

  1. Ved hjelp av EDTA rør, samle blodprøver på forskjellige tidspunkter i gris-til-ape arterie patch modeller og gris-til-mus celletransplantasjon modeller.
  2. Samle blodprøver av ca 400 μL (fra gris-til-ape arterie patch modeller) eller 100 μL (fra gris-til-mus celletransplantasjon modeller) og overføre til 1,5 ml mikrocentrifuge rør. Fjern blodcellene fra blodprøvene ved sentrifugering ved lav temperatur og høy hastighet (3000 x g, 4 °C, 5 min).
  3. Overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml mikrocentrifugerør og fjern celleavfallet ved sentrifugering ved 16 000 x g i 10 min.
  4. Overfør det overnaturante til et nytt 1,5 ml mikrocentrifugerør. Trekk ut det sirkulerende DNA-et fra ovennevnte supernatant ved hjelp av et kommersielt serum/sirkulerende DNA-ekstraksjonssett etter protokoll 2 i den isolerende genomiske DNA-produsentens protokoll.
  5. Kondenser volumet av sirkulerende DNA til 40 μL og oppbevar ved -20 °C.

6. Styrmengde av sirkulerende grisespesifikt DNA

  1. Klargjør den forhåndsblandet oppløsningen av 25 μL qPCR Mix (Materialsekk),1 μL av 5' primer, 1 μL av 3' primer, 10 μL prøve DNA og 13 μL ddH2O. Klargjør blandingen inkludert 2 ekstra prøver.
  2. Del den 40 μL forhåndsblandet oppløsningen i en 8-rørs stripe, og tilsett 10 μL prøve DNA, etterfulgt av forsiktig capping. Forbered to reaksjoner enn nødvendig.
  3. Sett 8-rørsstrimmelen inn i qPCR-maskinen etter samme prosedyre som standardkurven. Det er bedre å kjøre en standard først for å sikre at reaksjonen er kritisk for kvantifisering på forhånd. Prosedyren for reaksjonssystemet til qPCR ble vist i figur 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne protokollen ble svinespesifikke primere designet, plasmider-inneholdende svinspesifikke DNA-fragmenter ble konstruert, og standardkurver for kvantitet ble etablert (figur 4). Arter spesifisiteter av de 19 primere ble bekreftet av PCR. Artsspesifikke primere (primer #4 og primer #11) ble deretter brukt til å kvantifisere cpsDNA av qPCR i celletransplantasjonsmodeller for gris-til-mus og gris-til-ape arterie patch transplantasjon modeller.

Agarose elektroforese ble brukt til å isolere forsterkede DNA-fragmenter fra de ovennevnte prøvene, som deretter visualiseres i en ultrafiolett imager. Ved hjelp av PCR ble primerne som er spesifikke for forsterket svingenomisk DNA først identifisert (figur 2A). Videre ble visse artsspesifisiteter av disse primerne som spesifikt forsterket gris DNA i kohorten av ape / menneskelig genomisk eller i kohorten av mus genomisk DNA bekreftet (figur 2B). Til slutt ble to arter-spesifisiteter primere ytterligere bevist å spesifikt forsterke gris DNA i gris-til-ape arterie patch og / eller gris-til-mus celle transplantasjon modeller, henholdsvis (Figur 2C).

Figure 1
Figur 1: Genidentitet mellom gris (sus scrofa, ssc) og menneskelig (homo sapiens, har) eller ape (Macaca fascicularis, mfa). Gensekvensene fra tre forskjellige arter ble sammenlignet med BLAST-analyse. BLAST sekvensanalyse brukte genomisk merknadsinformasjon (mRNA-sekvensen) fra de tre artene lastet ned fra NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). MRNA-sekvensene av menneskelige, ape- og grisegener var henholdsvis 139116, 65927 og 71498. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 2: Vanlig PCR validerer spesifisitet av svinspesifikke primere. (A Grisgenomiske DNA-fragmenter ble forsterket av primere 1-19. (B)Det humane/ape-/mus genomisk DNA-fragmentet kunne ikke forsterkes av noen primere (primer #4 og #11). Stjernene (*) indikerer ingen forsterkninger i humant/apegenomisk DNA. Pundtegnet (#) indikerer ingen forsterkning i musgenomisk DNA. (C) De to art-spesifisiteter primere (primer #4 og #11) ble ytterligere bevist å spesifikt forsterke gris DNA i gris-til-ape arterie patch og / eller gris-til-mus celle transplantasjon modeller,henholdsvis 22. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 3: Fremgangsmåten for qPCR-reaksjonen22. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 

Figure 3
Figur 4: Etablering av standardkurven for absolutt kvantifisering. Forsterkningsplottene, smeltekurveplottene og standard kurvevisninger av (A) primer #4 og (B) primer #11 fra qPCR-maskinen (se Materials tabell) er utstilt. En god standard (R verdi nær 1, forsterkning effektivitet er innen 100% ±5%) kan brukes i opptil et halvt år22. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kvantifisering av svin sirkulerende DNA representerer en mulig tilnærming for å overvåke immunavvisningen av xenotransplantasjon. Gadi et al.24 fant at donoravledet sirkulerende DNA (ddcfDNA) innhold i blodet til pasienter med akutt avvisning var signifikant høyere enn for pasienter uten avvisning. Disse studiene tyder på at ddcfDNA kan være en vanlig biomarkør for overvåking av organtransplantatskade. De siste årene har qPCR i økende grad blitt brukt på analyse av nukleinsyrer på grunn av sin enkle drift, høy grad av automatisering, høy følsomhet, god spesifisitet og lave kostnader.

I denne studien ble svinespesifikke primere designet basert på resultatene av bioinformatikkanalyse. Deres spesifisitet ble verifisert av vanlig PCR. CpsDNA av blodprøvene av gris-til-ape arterie patch modeller og gris-til-mus celle transplantasjon modeller kan være nøyaktig kvantifisert av qPCR med artsspesifikke primere. De viktigste fordelene med tilnærmingen er som følger. For det første, basert på de svært spesifikke primere, er denne metoden for å kvantifisere DNA svært følsom og spesifikk. I tillegg er protokollen for tilnærmingen veldig enkel å utføre, som besto av design av spesifikke primere, isolering av DNA og qPCR-analyse på en arbeidsdag, som er tidsbesparende. Det er en ikke-invasiv metode som starter fra et lite volum serum eller plasmamateriale. I mellomtiden har vi vist at denne metoden er svært reproduserbar22. I motsetning til høy gjennomstrømning sekvensering og flymassespektrometri, er denne metoden lav pris.

Overvåking av immunavvisning ved kvantifisering av sirkulerende grisespesifikt DNA i blodet av gris-til-ape arterie patch modeller og gris-til-mus celletransplantasjon modeller ved hjelp av qPCR har lagt grunnlaget for grunnleggende forskning og klinisk anvendelse av svin-menneskelig xenotransplantasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne rapporterer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Key R&D Program of China (2017YFC1103704), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCYJ20170817172116272), Spesialfond for bygging av høyt nivå sykehus i Guangdong-provinsen (2019), Sanming Project of Medicine i Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Biowest, Barcelona, Spain 111860
BamHI-HF New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA R3136S
1.5 mL microcentrifuge tube Axygen Biosciences, Union City, CA, USA MCT-150-C
0.2 mL PCR tube Axygen Biosciences, Union City, CA, USA PCR-02-C
C57BL/6 Mice Medical Animal Center of Guangdong Province,  China 8~10 weeks
Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA Micro 21R
2-Log DNA Ladder New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA N3200S 0.1–10.0 kb
Marker I  Tiangen, Beijing, China MD101-02 0.1–0.6 kb
DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns) Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA DNACOL-01
DNA loading buffer Solarbio, Beijing, China D1010
E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA D6942
D6943
EcoR I Takara Bio, Shiga, Japan  1040S
Female Bama mini pigs BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China 2~4 months
Genomic DNA Extraction Kit ? Tiangen, Beijing, China DP304-02
SYBR Green Realtime PCR Master Mix Toyobo, Osaka, Japan QPK-201
Gel Doc XR Bio-Rad, Hercules, USA
Male cynomolgus monkeys Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China 8 years
Nucleic acid dye(Gelred) Biotium, Fremont, USA 42003
polymerase(Premix Taq) Takara Bio, Shiga, Japan RR901A
pMD19-T plasmid Takara Bio, Shiga, Japan D102A
qPCR machine Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA
Serum/Circulating DNA Extraction Kit Tiangen, Beijing, China DP339
TAE sangon Biotech, Shanghai, China B548101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buchman, T. Multiple organ failure. Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).
  2. Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. Organ donation after circulatory death: current status and future potential. Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).
  3. Lopez-Fraga, M., et al. A needed Convention against trafficking in human organs. Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).
  4. Sykes, M., Sachs, D. Transplanting organs from pigs to humans. Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).
  5. Reardon, S. New life for pig-to-human transplants. Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).
  6. Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation. BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).
  7. Chung, H., et al. CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation. Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).
  8. Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation. Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).
  9. Agbor-Enoh, S., et al. Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).
  10. Vito Dabbs, D., et al. Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation. Heart & Lung. 33 (6), 372-380 (2004).
  11. Miller, C. A., et al. Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection. Heart. 99 (7), 445-453 (2013).
  12. Mandel, P., Metais, P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l'homme. Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).
  13. Okkonen, M., et al. Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation. Critical Care. 15 (4), 196 (2011).
  14. Wagner, J. Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics. Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).
  15. Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
  16. Mohiuddin, M. M., et al. Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft. Nature Communications. 7, 11138 (2016).
  17. Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
  18. Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).
  19. Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).
  20. Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).
  21. De Vlaminck, I., et al. Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).
  22. Zhou, M., et al. Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection. Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).
  23. Huo, Q., et al. Circulating mi RNA or circulating DNA —Potential biomarkers for organ transplant rejection. Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).
  24. Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection. Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).

Tags

Biologi utgave 163 spesifikke primere sirkulerende grisespesifikt DNA qPCR xenotransplantasjon biomarkør immunavvisning
Kvantifisering av sirkulerende grisespesifikt DNA i blodet av en Xenotransplantasjonsmodell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deng, Y., Zhou, M., Lu, Y., Chen,… More

Deng, Y., Zhou, M., Lu, Y., Chen, J., Pu, Z., Yu, D., Dai, Y., Zhan, Y., Mou, L. Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model. J. Vis. Exp. (163), e61579, doi:10.3791/61579 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter