Summary
وفي هذا البروتوكول، صُممت شظايا أحماض البورسين المحددة، وأنشئت شظايا محددة من البورسين تحتوي على البلازميدات، ووضعت منحنيات قياسية للكمية. باستخدام ال التمهيديات الخاصة بالأنواع ، تم تحديد حجم cpsDNA بواسطة qPCR في نماذج زراعة الخلايا من الخنزير إلى الفأر ونماذج زرع ترقع الشريان من الخنزير إلى القرد.
Abstract
زراعة Xenotransplantation هي طريقة مجدية لعلاج فشل الجهاز. ومع ذلك، كيفية مراقبة فعالة رفض المناعة من زراعة xenotransation مشكلة للأطباء والباحثين. تصف هذه المخطوطة طريقة بسيطة وفعالة لمراقبة الرفض المناعي في نماذج زرع الخلايا من الخنزير إلى الفأر ونماذج زرع ترقع الشريان من الخنزير إلى القرد. الحمض النووي المتداول هو علامة حيوية غير الغازية المحتملة لتلف الأعضاء. في هذه الدراسة، تم رصد الحمض النووي الخاص بالخنزير (CPsDNA) أثناء رفض xenograft بواسطة PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR). وفي هذا البروتوكول، صُممت شظايا أحماض البورسين المحددة، وأنشئت شظايا محددة من البورسين تحتوي على البلازميدات، ووضعت منحنيات قياسية للكمية. ثم تم استخدام القرائية الخاصة بالأنواع لتحديد cpsDNA بواسطة qPCR في نماذج زراعة الخلايا من الخنزير إلى الفأر ونماذج زرع ترقع الشريان من الخنزير إلى القرد. تشير قيمة هذه الطريقة إلى أنه يمكن استخدامها كطريقة بسيطة ومريحة ومنخفضة التكلفة وأقل توغلًا لمراقبة الرفض المناعي لمعالجة زراعة الخلايا.
Introduction
فشل الجهاز هو أحد الأسباب الرئيسية للوفاة1. زرع الخلايا والأنسجة والأعضاء هو وسيلة فعالة لعلاج فشل الجهاز2. ومع ذلك، فإن نقص الأعضاء المانحة يحد من التطبيق السريري لهذه الطريقة3،4. وقد أظهرت الدراسات أن الخنازير يمكن استخدامها كمصدر محتمل للأعضاء البشرية لزرع السريرية5,6. ومع ذلك ، فإن زرع الأعضاء عبر الأنواع يواجه رفضًا مناعيًا خطيرًا. ولذلك، فمن الأهمية بمكان لرصد رفض المناعة من زراعة xenotransation. حاليا، الرصد السريري للرفض المناعي يعتمد أساسا على علامات المريض وأعراضه، فضلا عن الاختبارات المخبرية (على سبيل المثال، خزعة، التحليل المناعي الكيميائي، والموجات فوق الصوتية)7،8،9. ومع ذلك، هذه الطرق الرصد لها العديد من العيوب. عادة ما تظهر علامات وأعراض الرفض المناعي في المرضى المتأخرين10، وهو أمر لا يؤدي إلى الكشف المبكر والتدخل المبكر ؛ خزعة لديه عيب يجري الغازية11، والتي ليس من السهل على المرضى لقبول; يفتقر التحليل المناعي الكيميائي إلى الحساسية أو التحديد ، والموجات فوق الصوتية هي مساعدة ومكلفة. لذلك ، من الملح العثور على طريقة فعالة ومريحة لمراقبة الرفض المناعي.
الحمض النووي المتداول هو نوع خارج الخلية من الحمض النووي وجدت في الدم. ماندل وميتايس12 أول من أبلغ عن وجود الحمض النووي المتداول في الدم المحيطي في عام 1948. في ظل الظروف الفسيولوجية العادية ، فإن الحمض النووي المتداول في دم الأشخاص الأصحاء منخفض نسبيًا عند خط الأساس. ومع ذلك ، في بعض الأمراض ، مثل الأورام ، احتشاء عضلة القلب ، أمراض المناعة الذاتية ، ورفض الزراعة ، يمكن زيادة مستوى الحمض النووي المتداول في الدم بشكل كبير13،14 بسبب الإطلاق الهائل للحمض النووي المتداول الناجم عن موت الخلايا المبرمجة والناخر. ويرتبط أصل الحمض النووي المتداول مع المبرمج والناخر15، والتي هي سمة من الرفض xenograft16.
وقد ثبت أن الحمض النووي المتداولة هي علامة حيوية طفيفة التوغل للكشف عن السرطانات17,18,19. عالية من خلال وضع تسلسل من المانحة المستمدة من الحمض النووي المتداولة موثوق بها للكشف عن الرفض بعد زرع الأعضاء20,21. ومع ذلك، تتطلب هذه الطريقة تركيزًا عاليًا وجودة الحمض النووي المستخرج. متطلبات الحمض النووي بالإضافة إلى التكلفة العالية واستهلاك الوقت تجعل هذه الطريقة غير مؤهلة للاستخدام السريري الروتيني. يمكن تحديد الحمض النووي المتداول المشتق من المانحين بدقة بواسطة PCR الكمي في الوقت الحقيقي ( qPCR ) ، وهو محدد وحساس على حد سواء. ولذلك، فإن قياس الحمض النووي المُوزّع بالحمض النووي المُوزّع بالحمض النووي من خلال qPCR هو طريقة مجدية لرصد الرفض المناعي لمعالجة زراعة الزان. هذا أقل الغازية، حساسة للغاية ومحددة، وانخفاض التكلفة، وتوفير الوقت. الخنازير والبشر منفصلة وراثيا مع تسلسل الجينوم مختلفة تماما (الشكل 1). ولذلك، يمكن أن يطلق الحمض النووي porcine تعميم في دم المتلقي بعد xenotransplantation بسبب xeno-رفض. ويمكن تحديد قنينة اخصائية اخصائية محددة بدقة بواسطة qPCR مع ال التمهيديات الخاصة بالأنواع في دم المتلقي. سابقا ، لقد أظهرنا الأساس المنطقي والجدوى من cpsDNA باعتبارها علامة بيولوجية لxenotransplantation22،23. هنا، ونحن نكشف المزيد من النصائح والتفاصيل التجريبية. تتكون التجربة من الخطوات التالية. أولاً، تم تصميم الورم الأوليات الخاصة بالبورسين، وعزل الحمض النووي الجينومي، الذي استخدم للتحقق من خصوصية الـ PRIMERS من قبل PCR العادية. ثانيا ، بناء منحنى القياسية من cpsDNA وعزل cpsDNA من عينة الدم. وأخيراً، تم تحديد كمية الحمض النووي الخاص بخنزير المتداولة باستخدام qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد اجريت جميع التجارب وفقا للاسوجية واللوائح ذات الصلة لمجلس المراجعة المؤسسية لمستشفى شنتشن الشعبى الثانى ، المستشفى الاول التابع لجامعة شنتشن .
1. تصميم porcine التمهيدي محددة
- إجراء تحليل الانفجار الجينوم الكامل لتحديد الجينات محددة porcine التي كانت مختلفة عن البشر أو القرود أو الماوس، وذلك باستخدام البرمجيات NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
- تصميم التمهيدي وفقا ل 19 الجينات خنازير محددة (الجدول 1) باستخدام برنامج التمهيدي 5.
2- عزل الحمض النووي الجينومي
ملاحظة: تم استخراج الحمض النووي الجينومي (بما في ذلك الدم من الخنازير والقرود والبشر المتطوعين والقرود مع ترقيع الخنازير والفئران مع خلايا الخنزير) باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الجينومية التجارية(جدول المواد).
- ضع 500 ميكرولتر من الدم كله من العينات أعلاه في أنابيب مختلفة microcentrifuge، على التوالي.
- إضافة 20 ميكرولتر من بروتياز K و 500 ميكرولتر من عازلة تحلل في أنابيب microcentrifuge أعلاه، ثم يهز جيدا ومزيج.
- وضع هذه الأنابيب microcentrifuge في حمام مائي في 56 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وتهز 2-3 مرات خلال هذه العملية حتى يصبح الحل واضحا.
- جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة لإزالة الخرز السائل من الجدار الداخلي لأغطية أنبوب. أضف 500 ميكرولتر من كحول الإيثيل اللامائية وارتجف جيدًا.
- نقل الخليط إلى عمود الامتزاز، الطرد المركزي في 12،000 دورة في الدقيقة (~ 13،400 × ز)لمدة 2 دقيقة.
- إضافة 800 μL من محلول الشطف لكل عمود الامتزاز؛ أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 12،000 دورة في الدقيقة ( ~ 13400 س ز). ضع الأعمدة في درجة حرارة الغرفة لبضع دقائق لتجفيف محلول الشطف المتبقي.
ملاحظة: يتم توفير حل الشطف من قبل الشركة المصنعة. - نقل أعمدة الامتزاز إلى آخر أنبوب الطرد المركزي نظيفة، إضافة 50 ميكرولتر من عازلة elution إلى منتصف الأفلام الامتزاز، ووضعها في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-5 دقيقة. جهاز طرد مركزي 6,200 x ز لمدة دقيقة 12,000 دورة في الدقيقة (~ 13,400 x ز).
ملاحظة: يتم توفير العازلة elution من قبل الشركة المصنعة، ولكن المخزن المؤقت TE، الذي يحتوي على 10 mM تريس-HCl (pH 8.0) و 0.1 mM EDTA، يمكن أيضا أن تُولّ الحمض النووي. - تخزين حل الحمض النووي في -20 درجة مئوية.
3. التحقق من خصوصية التمهيديات
ملاحظة: تم تأكيد خصوصيات الأنواع من الـ 19 التمهيدية المذكورة أعلاه بواسطة PCR، والتي تم تنفيذها باستخدام البوليميراز(جدول المواد)والمطبوعات التمهيدية المعروضة في الجدول 1.
- إعداد محلول ما قبل مختلطة من 12.5 ميكرولتر من 2x PCR بريميكس(جدول المواد)،1 ميكرولتر من 5' التمهيدي (10 ميكرومتر)، 1 ميكرولتر من 3' التمهيدي (10 ميكرومتر)، و 8.5 ميكرولتر من ddH2O. إعداد المزيج بما في ذلك 2 عينات إضافية.
- تقسيم 23 ميكرولتر من محلول ما قبل المختلطة إلى أنابيب ميكروسنتر 0.2 مل، إضافة 2 ميكرولتر من الحمض النووي الجينومي، وغطاء بعناية الأنابيب. ثم مزيج والطرد المركزي قليلا.
- وضع أنابيب 0.2 مل microcentuge في دورة PCR وتنفيذ ما يلي: Denaturation: 95 درجة مئوية لمدة 5 s; الوَحن: 60 درجة مئوية لمدة 30 س؛ التمديد: 72 درجة مئوية لمدة 30 s.
- قم بإجراء الأكروز الكهربائي على النحو التالي:
- تزن 1.2 غرام من agarose في قارورة تحتوي على 100 مل من 1x TAE ويغلي لمدة 5 دقائق في الميكروويف. إضافة 5 ميكرولتر من صبغة حمض النووي(جدول المواد)في القارورة بعد أن يبرد إلى حوالي 70 درجة مئوية. صب في لوحة على طول الحافة ببطء، ووضعها في درجة حرارة الغرفة حتى يتوطد في هلام.
- أضف 5 ميكرولتر من العينة وسلم الحمض النووي 2-Log (0.1-10.0 kb) أو علامة I (0.1-0.6 kb) ، والتي تحتوي على 1 ميكرولتر من 6x الحمض النووي العازلة ، في هلام agarose. ثم الكهرباء في 120 مابيرا حتى يتم فصل العصابات.
- تصور هلام أجار الذي يحتوي على شظايا الحمض النووي مع صورة فوق البنفسجية.
- إجراء الأزهرة الكهربائية لعزل شظايا الحمض النووي تضخيم من العينات المذكورة أعلاه، والتي كانت تصور في التصوير فوق البنفسجي. باستخدام PCR، تم تحديد الـ التمهيديات الخاصة بالحمض النووي الجينومي المضخم(الشكل 2A). وعلاوة على ذلك، تم تأكيد بعض أنواع الخصائص من هذه التمهيديات التي تضخيم الحمض النووي خنزير على وجه التحديد في مجموعة من القرد / الجينوم البشري أو في مجموعة من الحمض النووي الجينومية الماوس(الشكل 2B). وأخيرا، ثبت كذلك اثنين من الخصوصيات الأنواع التمهيدية لتضخيم الحمض النووي على وجه التحديد الخنزير في التصحيح الشريان من الخنزير إلى القرد و / أو نماذج زرع الخلايا من الخنزير إلى الفأر، على التوالي (الشكل 2C)
4. منحنى قياسي من cpsDNA
- تحويل psmid pMD19-T التي تحتوي على جزء من الحمض النووي porcine إلى DH5a، والتي يمكن أن تضخّم على وجه التحديد من قبل التمهيدي #4 أو التمهيدي #11 (الجدول 1). فحص البكتيريا الإيجابية باستخدام 50 ميكروغرام / مل أمبيسيلين.
التمهيدي #4 في الفوج الإنسان / (إلى الأمام: 5′-TTCAATCCCA CTTCTTCCACCTATAA-3′, عكس: 5′-CTTCATCTCTCTATAAC CCTGT-3')
التمهيدي #11 لنموذج الماوس (إلى الأمام: 5′-TGCCGTGGTTCC GTTGCTTG-3′، عكس: 5′-TCACATTTGATGGTCGTCGTCGTC T-3')
ملاحظة: يمكن العثور على تفاصيل كافة التمهيديات في الجدول 1. - حصاد البلازميدات أعلاه بعد البروتوكول أدناه.
- عزل مستعمرة واحدة من لوحة انتقائية مُلَكَّمة حديثًا وتطعيم ثقافة 1- 5 مل من وسط LB تحتوي على المضاد الحيوي الانتقائي المناسب. احتضان لمدة 12-16 ساعة في 37 درجة مئوية مع اهتزاز قوي (300 دورة في الدقيقة).
- جهاز طرد مركزي عند 10000 x غم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. decant أو التعرق وتجاهل وسائل الإعلام الثقافة.
- إضافة 250 μL من الحل I/ RNase A. دوامة أو الأنابيب صعودا وهبوطا لخلط دقيق. إعادة النياة الكاملة من بيليه الخلية أمر حيوي للحصول على عوائد جيدة.
ملاحظة: يجب إضافة RNase A إلى الحل الأول قبل الاستخدام. - نقل التعليق إلى أنبوب جديد 1.5 مل microcentrifuge. إضافة 250 μL من الحل الثاني. عكس وبلطف تدوير الأنبوب عدة مرات للحصول على lysate واضح. قد يكون من الضروري حضانة 2-3 دقائق.
ملاحظة: تجنب الاختلاط القوي لأن هذا سوف القص الحمض النووي الكروموسومات وانخفاض نقاء البلازميد. لا تسمح لتفاعل التحلل بالمضي قدما أكثر من 5 دقائق. - إضافة 350 μL من الحل الثالث. عكس فورا عدة مرات حتى شكل الترسبات البيضاء flocculent.
ملاحظة: من المهم أن يتم خلط الحل بشكل شامل وفوريا بعد إضافة الحل الثالث لتجنب هطول الأمطار المحلية. - أجهزة الطرد المركزي بالسرعة القصوى (≥ 13000 x ز)لمدة 10 دقائق. وسوف تشكل بيليه بيضاء مدمجة. انتقل إلى الخطوة التالية على الفور.
- أدخل عمودًا صغيرًا من الحمض النووي في أنبوب جمع 2 مل.
- نقل فائقة مسح من 4.2.7 عن طريق الطامح بعناية في العمود مصغرة الحمض النووي. يجب الحرص على عدم إزعاج بيليه وأنه يتم نقل أي حطام الخلوية إلى العمود مصغرة الحمض النووي.
- جهاز طرد مركزي في السرعة القصوى لمدة 1 دقيقة. تجاهل الترشيح وإعادة استخدام أنبوب جمع.
- إضافة 500 μL من HBC العازلة. جهاز طرد مركزي في السرعة القصوى لمدة 1 دقيقة. تجاهل أنبوب جمع الترشيحات وإعادة الاستخدام.
ملاحظة: يجب تخفيف HBC Buffer مع isopropanol 100٪ قبل الاستخدام. - إضافة 700 μL من الحمض النووي غسل العازلة. جهاز طرد مركزي في السرعة القصوى لمدة 1 دقيقة. تجاهل الترشيح وإعادة استخدام أنبوب جمع.
ملاحظة: يجب تخفيف الحمض النووي غسل العازلة مع 100٪ الإيثانول قبل استخدامها.- اختياري: كرر لخطوة غسيل العازلة الثانية للحمض النووي.
- الطرد المركزي العمود مصغرة الحمض النووي فارغة لمدة 2 دقيقة في السرعة القصوى لتجفيف مصفوفة العمود.
ملاحظة: من المهم تجفيف مصفوفة العمود المصغر للحمض النووي قبل elution. قد يتداخل الإيثانول المتبقي مع تطبيقات المصب. - نقل العمود مصغرة الحمض النووي إلى أنبوب 1.5 مل صغيرة صغيرة.
- إضافة 30-100 μL من عازلة Elution أو المياه المعقمة deionized مباشرة إلى مركز غشاء العمود.
ملاحظة: تعتمد كفاءة استخلاص الحمض النووي من عمود DNA Mini على رقم الH. إذا كان استخدام المياه المعقمة deionized، تأكد من أن درجة الH حوالي 8.5. - اسمحوا الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
- جهاز طرد مركزي في السرعة القصوى لمدة 1 دقيقة.
ملاحظة: هذا يمثل حوالي 70٪ من الحمض النووي المربوط. سوف يعطي الـ (غلو) الثاني الاختياري أي حمض نووي متبقي، وإن كان بتركيز أقل.
- تحقق من البلازميدات أعلاه باستخدام ضعف تقييد الهضم الانزيم باستخدام EcoR I (15 U/μL) وH1 بام (15 U/μL)22.
- قم بإجراء خطوات المكياج على الجليد. إعداد نظام التفاعل من 1 ميكرولتر من EcoR I (15 U)، 1 ميكرولتر من بام H1 (15 U)، 2 ميكرولتر من 10x العازلة، 1 ميكروغرام من plasmid؛ إضافة ddH2O إلى 20 ميكرولتر من الحجم الإجمالي، مزيج شامل. احتضان في حمام مائي في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- فصل المنتجات المهضمة بنسبة 1٪ agarose تليها الكهرباء وفضح للأشعة فوق البنفسجية كما كان من قبل.
- تخفيف البلازميد المركزة إلى 2 × 1011 نسخة / مل الحل القياسي البداية باستخدام ddH2O. خذ البلازميد (P2) الذي يحتوي على جزء من الحمض النووي البورسين على سبيل المثال من النسخ التي تحسب:
- حساب عدد البلازميدات في 1 مل من الحل القياسي البداية: N = (2 × 1011)/(6.02 x 1023) مول.
- حساب الوزن الجزيئي للP2: M = 2810 bp x 650 D/bp = 2810 x 650 D (g/mol).
- حساب كتلة P2: m =N*M = (2 × 1011)/(6.02 x 1023)مول x 2810 × 650 غ/مول.
- حساب حجم P2: V = م / C = [(2 × 10 11)/(6.02 x 1023) x 2810 x 650] ز/C. (C هو تركيز P2 (نانوغرام/ميكرولتر)، الذي يقاس بمقياس الطيف).
- تخفيف الحل القياسي بدءاً 10 مرات تسلسلياً إلى 2 ×10 10 نسخة / مل، 2 × 109 نسخ / مل، 2 × 108 نسخ / مل، 2 × 107 نسخ / مل...، و 2 × 100 0 نسخة / مل للحل القياسي باستخدام ddH2O. Vortex بشكل كامل خلال التخفيف.
- إنشاء منحنى قياسي.
- إعداد نظام التفاعل من qPCR (جميع الخطوات محمية من الضوء): إضافة محلول ما قبل المختلطة الذي يحتوي على 325 ميكرولتر من مزيج qPCR(جدول المواد)،13 ميكرولتر من 5'التمهيدي، 13 ميكرولتر من 3'التمهيدي، و 169 ميكرولتر من ddH2O في أنبوب microcentuge 1.5 مل، والتي كانت ثم مختلطة تماما وطاردة قليلا.
- تقسيم 40 μL فوق محلول ما قبل مختلطة إلى شريط 8 أنبوب وإضافة 10 ميكرولتر من الحمض النووي القياسية من تركيزات مختلفة. كاب بعناية، مزيج وطاردة مركزية قليلا.
- وضع الشريط 8 أنبوب في آلة qPCR بعد الإجراء المبين في الشكل 3.
5. عزل الحمض النووي المتداولة من عينات الدم
- باستخدام أنابيب EDTA، جمع عينات الدم في نقاط زمنية مختلفة في نماذج التصحيح الشريان من الخنزير إلى القرد ونماذج زرع الخلايا من الخنزير إلى الفأر.
- جمع عينات الدم من حوالي 400 ميكرولتر (من نماذج التصحيح الشريان من الخنزير إلى القرد) أو 100 ميكرولتر (من نماذج زرع الخلايا من الخنزير إلى الفأر) ونقلها إلى أنابيب ميكروcentuge 1.5 مل. إزالة خلايا الدم من عينات الدم عن طريق الطرد المركزي في درجة حرارة منخفضة وسرعة عالية (3000 × ز، 4 درجة مئوية ، 5 دقائق).
- نقل سوبراتانت إلى أنبوب جديد 1.5 مل microcentruge وإزالة حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي في 16000 × ز لمدة 10 دقيقة.
- نقل سوبرنات إلى أنبوب جديد 1.5 مل microcentrifuge. استخراج الحمض النووي المتداولة من المُندفع أعلاه باستخدام مصل تجاري/مجموعة استخلاص الحمض النووي المتداولة بعد البروتوكول 2 لبروتوكول مصنعي الحمض النووي الجينومي المعزول.
- تكثيف حجم الحمض النووي تعميم إلى 40 ميكرولتر وتخزينها في -20 درجة مئوية.
6. كمية من الحمض النووي المحددة خنازير متداولة
- إعداد محلول ما قبل مختلطة من 25 ميكرولتر من مزيج qPCR(جدول المواد)،1 ميكرولتر من 5'التمهيدي، 1 ميكرولتر من 3'التمهيدي، 10 ميكرولتر من الحمض النووي عينة، و 13 ميكرولتر من ddH2O. إعداد المزيج بما في ذلك 2 عينات إضافية.
- تقسيم 40 ميكرولتر محلول ما قبل مختلطة إلى شريط 8 أنبوب، وإضافة 10 ميكرولتر من الحمض النووي عينة، تليها تغطية دقيقة. إعداد اثنين من ردود الفعل أكثر من اللازم.
- ضع الشريط الذي ينبوب 8 في جهاز qPCR باتباع نفس الإجراء مثل المنحنى القياسي. فمن الأفضل لتشغيل معيار أولا للتأكد من رد فعل أمر بالغ الأهمية لتحديد كم مقدما. وقد تم عرض إجراء نظام التفاعل من qPCR في الشكل 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وفي هذا البروتوكول، صُممت أقواس أولية محددة من البورسين، وشيدت شظايا محددة من البورسين تحتوي على البلازميدات، وأنشئت منحنيات قياسية للكمية(الشكل 4). وقد أكدت PCR خصوصيات الأنواع في الـ 19 من ال التمهيديات. ثم استخدمت التمهيديات الخاصة بالأنواع (#4 التمهيدي واوبراي #11) لقياس cpsDNA بواسطة qPCR في نماذج زرع الخلايا من الخنزير إلى الفأر ونماذج زرع ترقع الشريان من الخنزير إلى القرد.
تم استخدام Agarose electrophoresis لعزل شظايا الحمض النووي المضخمة من العينات المذكورة أعلاه ، والتي يتم تصورها بعد ذلك في صورة فوق البنفسجية. وباستخدام PCR، تم تحديد الـ التمهيديات الخاصة بالحمض النووي الجينومي المسامي المضخم(الشكل 2A). وعلاوة على ذلك، تم تأكيد بعض الخصوصيات الأنواع من هذه التمهيدية التي تضخيم الحمض النووي خنزير على وجه التحديد في مجموعة من القرد / الجينوم البشري أو في مجموعة من الحمض النووي الجينومية الماوس(الشكل 2B). وأخيراً، ثبت كذلك أن اثنين من الخصوصيات الأنواع التمهيدية لتضخيم الحمض النووي على وجه التحديد الخنزير في التصحيح الشريان الخنزير لقرد و / أو الخنازير إلى الفأر نماذج زرع الخلايا، على التوالي (الشكل 2C).
الشكل 1: هوية الجينات بين الخنزير (سوس scrofa، ssc) والإنسان (الإنسان العاقل، لديه) أو القرد (Macaca fascicularis، mfa). تمت مقارنة تسلسلات الجينات من ثلاثة أنواع مختلفة من خلال تحليل BLAST. استخدم تحليل تسلسل BLAST معلومات التعليقات الجينية (تسلسل مرنا) من الأنواع الثلاثة التي تم تنزيلها من NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). وكانت تسلسلات مرنا من الجينات البشرية، قرد، والخنزير 139116، 65927، و 71498، على التوالي22. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: PCR العادية يؤكد خصوصية التمهيديات محددة porcine. (أ تم تضخيم شظايا الحمض النووي الجينومي للخنزير من قبل التمهيديات 1-19. (ب)لا يمكن تضخيم جزء الحمض النووي الجينومي البشري/القرد/الفئران من خلال بعض القرّاءات (#4 التمهيدي #11). تشير النجوم (*) إلى عدم وجود تضخيمات في الحمض النووي الجينومي للإنسان/القرد. علامة الجنيه (#) تشير إلى عدم وجود تضخيم في الحمض النووي الجينومي للماوس. (C) تم إثبات أن الـ 2 من نوعي الخصائص التمهيدية (#4 التمهيدي #11) تضخيم الحمض النووي للخنازير على وجه التحديد في رقعة الشريان من الخنزير إلى القرد و / أو زرع خلية الخنزير إلى الفأر ، على التوالي22. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الإجراء الخاص برد فعل qPCR22. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: إنشاء المنحنى القياسي للكمية المطلقة. يتم عرض مخططات التضخيم ، والمؤامرات المنحنى الذائب ، وإطلالات المنحنى القياسية لـ (A) التمهيدي #4 و (B) التمهيدي #11 من آلة qPCR (انظر جدول المواد). مستوى جيد (قيمة R قريبة من 1، كفاءة التضخيم هو في حدود 100٪ ±5٪) يمكن استخدامها لمدة تصل إلى نصف سنة22. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1- الانبعاثات 1000 الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمثل قياس الحمض النووي المُتداول في البورcine نهجًا عمليًا لرصد الرفض المناعي لمعالجة زراعة الزان. وجد غادي وآخرون24 أن محتوى الحمض النووي المتداول المشتق من المانحين (DdcfDNA) في دم المرضى الذين يعانون من الرفض الحاد كان أعلى بكثير من محتوى المرضى الذين لا ينفضون. وتشير هذه الدراسات إلى أن DdcfDNA قد تكون علامة حيوية مشتركة لرصد تلف الجسم الكسب غير المشروع. في السنوات الأخيرة، وقد تم تطبيق QPCR على نحو متزايد لتحليل الأحماض النووية بسبب عملية بسيطة، ودرجة عالية من التشغيل الآلي، وحساسية عالية، وخصوصية جيدة، ومنخفضة التكلفة.
في هذه الدراسة، تم تصميم التمهيديات بورسين محددة على أساس نتائج تحليل المعلوماتية الحيوية. وتم التحقق من خصوصيتها عن طريق نظام PCR العادي. ويمكن تحديد كمية النماذج cpsDNA لعينات الدم من نماذج تصحيح الشريان من الخنزير إلى القرد ونماذج زرع الخلايا من الخنزير إلى الفأر بدقة من قبل qPCR مع التمهيديات الخاصة بالأنواع. وتتمثل المزايا الرئيسية للنهج فيما يلي. أولاً، استناداً إلى الأحرف التمهيدية المحددة للغاية، هذه الطريقة في قياس الحمض النووي حساسة للغاية ومحددة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن بروتوكول النهج بسيط جدًا ، والذي يتكون من تصميم أوليات محددة ، وعزل الحمض النووي ، وتحليل qPCR في يوم عمل واحد ، وهو توفير الوقت. وهو أسلوب غير الغازية التي تبدأ من حجم صغير من المصل أو مادة البلازما. وفي الوقت نفسه، لقد أثبتنا أن هذا الأسلوب هو استنساخه للغاية22. وعلى النقيض من التسلسل عالي الإنتاجية وقياس الطيف الكتلي للطيران، فإن هذه الطريقة منخفضة التكلفة.
رصد الرفض المناعي عن طريق القياس الكمي للحمض النووي الخاص بخنزير في دم نماذج تصحيح الشريان من الخنزير إلى القرد ونماذج زرع الخلايا من الخنزير إلى الفأر باستخدام qPCR قد وضعت الأساس للبحوث الأساسية والتطبيق السريري لزراعة الزانونة البوشين البشري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يبلغ المؤلفان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2017YFC1103704)، ومؤسسة شنتشن للعلوم والتكنولوجيا (JCYJ2017081717216272)، والصناديق الخاصة لبناء مستشفيات عالية المستوى في مقاطعة قوانغدونغ (2019)، مشروع سانمينغ للطب في شنتشن (SZSM201412020)، صندوق بناء الانضباط الطبي عالي المستوى في شنتشن (2016031638)، مؤسسة شنتشن لهيئة الصحة وتنظيم الأسرة (SZXJ2017021 ، SZXJ2018059).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Biowest, Barcelona, Spain | 111860 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | R3136S | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | MCT-150-C | |
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | PCR-02-C | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province, China | 8~10 weeks | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA | Micro 21R | |
| 2-Log DNA Ladder | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | N3200S | 0.1–10.0 kb |
| Marker I | Tiangen, Beijing, China | MD101-02 | 0.1–0.6 kb |
| DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns) | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | DNACOL-01 | |
| DNA loading buffer | Solarbio, Beijing, China | D1010 | |
| E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | D6942 | |
| D6943 | |||
| EcoR I | Takara Bio, Shiga, Japan | 1040S | |
| Female Bama mini pigs | BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China | 2~4 months | |
| Genomic DNA Extraction Kit ? | Tiangen, Beijing, China | DP304-02 | |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | Toyobo, Osaka, Japan | QPK-201 | |
| Gel Doc XR | Bio-Rad, Hercules, USA | ||
| Male cynomolgus monkeys | Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China | 8 years | |
| Nucleic acid dye(Gelred) | Biotium, Fremont, USA | 42003 | |
| polymerase(Premix Taq) | Takara Bio, Shiga, Japan | RR901A | |
| pMD19-T plasmid | Takara Bio, Shiga, Japan | D102A | |
| qPCR machine | Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA | ||
| Serum/Circulating DNA Extraction Kit | Tiangen, Beijing, China | DP339 | |
| TAE | sangon Biotech, Shanghai, China | B548101 |
References
- Buchman, T.
- Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. Organ donation after circulatory death: current status and future potential. Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).
- Lopez-Fraga, M., et al. A needed Convention against trafficking in human organs. Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).
- Sykes, M., Sachs, D. Transplanting organs from pigs to humans. Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).
- Reardon, S. New life for pig-to-human transplants. Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).
- Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation. BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).
- Chung, H., et al. CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation. Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).
- Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation. Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).
- Agbor-Enoh, S., et al. Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).
- Vito Dabbs, D., et al. Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation. Heart & Lung. 33 (6), 372-380 (2004).
- Miller, C. A., et al. Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection. Heart. 99 (7), 445-453 (2013).
- Mandel, P., Metais, P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l'homme. Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).
- Okkonen, M., et al. Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation. Critical Care. 15 (4), 196 (2011).
- Wagner, J. Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics. Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
- Mohiuddin, M. M., et al. Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft. Nature Communications. 7, 11138 (2016).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).
- Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).
- De Vlaminck, I., et al. Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).
- Zhou, M., et al. Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection. Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).
- Huo, Q., et al. Circulating mi RNA or circulating DNA —Potential biomarkers for organ transplant rejection. Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).
- Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection. Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).
