בפרוטוקול זה, פריימרים ספציפיים porcine תוכננו, פלסמידים המכילים פלסמידים ספציפיים ל-DNA רסיס נבנו, ועיקולים סטנדרטיים עבור כמות הוקמו. באמצעות פריימרים ספציפיים למינים, cpsDNA היה לכמת על ידי qPCR במודלים השתלת תא חזיר לעכבר ומודלים השתלת תיקון עורק חזיר אל קוף.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
כימות של DNA ספציפי חזיר במחזור בדם של מודל xenotransplantation
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
השתלת קסנו-השתלה היא שיטה אפשרית לטיפול בכישלון איברים. עם זאת, כיצד לפקח ביעילות על דחיית החיסון של xenotransplantation היא בעיה עבור רופאים וחוקרים. כתב יד זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה כדי לפקח על דחייה חיסונית במודלים של השתלת תאי חזיר לעכבר ומודלים להשתלת תיקון עורק חזיר לקוף. במחזור הדנ"א הוא סמן ביולוגי לא פולשני לנזק לאיברים. במחקר זה, במחזור DNA ספציפי לחזיר (cpsDNA) היה במעקב במהלך דחיית xenograft על ידי PCR בזמן אמת כמותית (qPCR). בפרוטוקול זה, פריימרים ספציפיים porcine תוכננו, פלסמידים המכילים פלסמידים ספציפיים ל-DNA רסיס נבנו, ועיקולים סטנדרטיים עבור כמות הוקמו. פריימרים ספציפיים למינים שימשו לאחר מכן לכמת cpsDNA על ידי qPCR במודלים השתלת תא חזיר לעכבר ומודלים השתלת תיקון עורק חזיר אל קוף. הערך של שיטה זו מצביע על כך שניתן להשתמש בה כשיטה פשוטה, נוחה, בעלות נמוכה ופחות פולשנית כדי לפקח על הדחייה החיסונית של xenotransplantation.
מבוא
כשל איברים הוא אחד הגורמים העיקרייםלמוות 1. השתלת תאים, רקמות ואיברים היא דרך יעילה לטיפול אי ספיקתאיברים 2. אף על פי כן, המחסור באיברים תורמים מגביל את היישום הקליני שלשיטה זו 3,4. מחקרים הראו כי חזירים יכולים לשמש כמקור פוטנציאלי של איברים אנושיים להשתלהקלינית 5,6. עם זאת, השתלת איברים בין מינים עומדת בפני דחייה חיסונית מסוכנת. לכן, זה קריטי כדי לפקח על הדחייה החיסונית של xenotransplantation. כיום, ניטור קליני של דחייה חיסונית תלוי בעיקר סימנים ותסמינים של המטופל, כמו גם בדיקות מעבדה (למשל, ביופסיה, נית....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות של ועדת הביקורת המוסדית של בית החולים העם השני בשנזן, בית החולים המזוהה הראשון של אוניברסיטת שנזן.
1. עיצוב פריימרים ספציפיים לפורסין
- לבצע ניתוח BLAST של הגנום כולו כדי לזהות גנים ספציפיים לפורצ'ין שהיו שונים מאלה של בני אדם, קופים או עכבר, באמצעות התוכנה NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
- עיצוב פריימרים על פי 19 גנים ספציפיים לחזיר (טבלה 1) באמצעות התוכנה של פריימר 5.
2. בידוד דנ"א גנומי
הערה: ה-DNA הגנומי (כולל דם מחזירים, קופים, בני אדם מתנדבים, קופים עם שתלי חזיר, ועכברים עם תאי חזיר) חולצו באמצעו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בפרוטוקול זה תוכננו פריימרים ספציפיים לפורצ'ין, ונבנו שברי דנ"א ספציפיים המכילים פלסמידים, וקימורים סטנדרטיים לכמויות הוקמו(איור 4). מפרטי המינים של 19 פריימר אושרו על ידי PCR. פריימרים ספציפיים למינים (פריימר #4 ו-primer #11) שימשו לאחר מכן לכמת cpsDNA על ידי qPCR במודלים של השתלת תאי חזיר-לעכב ומודלים להשתלת תיקון עורק חזיר אל קוף.
אלקטרופורזה Agarose שימש כדי לבודד שברי DNA מוגבר מהדגימות לעיל, אשר לאחר מכן הוא חזותי בתמונה אולטרה סגול. באמצעות PCR, פריימרים ספ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כימות הדי.אן.איי במחזור ה-DNA מייצג גישה אפשרית כדי לפקח על הדחייה החיסונית של xenotransplantation. גדי ואח '24 מצא כי תוכן DNA נגזר תורם (ddcfDNA) בדם של חולים עם דחייה חריפה היה גבוה באופן משמעותי מזה של חולים ללא דחייה. מחקרים אלה מראים כי ddcfDNA עשוי להיות סמן ביולוגי נפוץ לניטור נזק שתל איברים. בשנים האחרונות, qPCR הוחל יותר ויותר על ניתוח של חומצות גרעין בגלל הפעולה הפשוטה שלה, רמה גבוהה של אוטומציה, רגישות גבוהה, ספציפיות טובה, ועלות נמוכה.
במחקר זה, פריימרים ספ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מדווחים שאין ניגודי עניינים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתכנית המחקר ודם המרכזית הלאומית של סין (2017YFC1103704), קרן שנג'ן למדע וטכנולוגיה (JCYJ20170817172116272), קרנות מיוחדות לבניית בתי חולים ברמה גבוהה בגואנגדונג מחוז (2019), פרויקט סנמינג לרפואה בשנזן (SZSM201412020), קרן לבניית משמעת רפואית ברמה גבוהה של שנזן (2016031638), קרן שנג'ן לבריאות ותכנון משפחה הוועדה (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Agarose | Biowest, ברצלונה, ספרד | 111860 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs, איפסוויץ', מסצ'וסטס, ארה"ב | R3136S | |
| 1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה | Axygen Biosciences, יוניון סיטי, קליפורניה, ארה"ב | MCT-150-C | |
| 0.2 מ"ל צינור PCR | Axygen Biosciences, יוניון סיטי, קליפורניה, ארה"ב | PCR-02-C | |
| C57BL/6 עכברים | מרכז בעלי חיים רפואיים במחוז גואנגדונג, סין | 8 ~ 10 שבועות | |
| צנטריפוגה | תרמו פישר Scientific, Walt-ham, MA, ארה"ב | Micro 21R | |
| 2-Log DNA Ladder | New England Biolabs, איפסוויץ', מסצ'וסטס, ארה"ב | N3200S | 0.1– 10.0 kb |
| סמן I | טיאנגן, בייג'ינג, סין | MD101-02 | 0.1– 0.6 kb |
| DNA מיני עמודה (HiBind DNA Mini Columns) | אומגה ביו-טק, נורקרוס, ג'ורג'יה, ארה"ב | DNACOL-01 | |
| מאגר טעינת DNA | Solarbio, בייג'ינג, סין | D1010 | |
| E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I ו- E.Z.N.A. פלסמיד DNA מיני ערכה II | אומגה ביו-טק, נורקרוס, ג'ורג'יה, ארה"ב | D6942 | |
| D6943 | |||
| EcoR I | Takara ביו, שיגה, יפן | 1040S | |
| נקבת במה מיני חזירים | BGI Ark ביוטכנולוגיה, שנזן, סין | 2 ~ 4 חודשים | |
| ערכת מיצוי DNA גנומי | טיאנגן, בייג'ינג, סין | DP304-02 | |
| SYBR ירוק בזמן אמת PCR מאסטר מיקס | טויובו, אוסקה, יפן | QPK-201 | |
| ג'ל Doc XR | Bio-Rad, הרקולס, ארה"ב | ||
| קופי cynomolgus זכר | גואנגדונג לנדאו ביוטכנולוגיה, גואנגג'ואו, סין | 8 שנים | |
| צבע חומצת גרעין (ג'לרד) | ביוטיום, פרמונט, ארה"ב | 42003 | |
| פולימראז (Premix Taq) | Takara ביו, שיגה, יפן | RR901A | |
| pMD19-T פלסמיד | Takara ביו, שיגה, יפן | D102A | |
| qPCR מכונת | Applied Biosystems QSDx, וולת'אם, ארה"ב | ||
| ערכת מיצוי DNA סרום/מחזור | טיאנגן, בייג'ינג, סין | DP339 | |
| TAE | sangon Biotech, שנחאי, סין | B548101 |
מקורות
- Buchman, T. Multiple organ failure. Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).
- Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. Organ donation after circulatory death: current status and future potential. Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
