Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

כימות של DNA ספציפי חזיר במחזור בדם של מודל xenotransplantation

Published: September 22, 2020 doi: 10.3791/61579
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 1, 4, 1,5, 6, 7, 1
1Shenzhen Xenotransplantation Medical Engineering Research and Development Center, Institute of Translational Medicine, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Xianning Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Liver-biotechnology (Shenzhen) Co., Ltd., 4Department of Radiology, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 5Department of Life Sciences, University of Toronto, 6Jiangsu Key Laboratory of Xenotransplantation, Nanjing Medical University, 7Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital
* These authors contributed equally

Summary

בפרוטוקול זה, פריימרים ספציפיים porcine תוכננו, פלסמידים המכילים פלסמידים ספציפיים ל-DNA רסיס נבנו, ועיקולים סטנדרטיים עבור כמות הוקמו. באמצעות פריימרים ספציפיים למינים, cpsDNA היה לכמת על ידי qPCR במודלים השתלת תא חזיר לעכבר ומודלים השתלת תיקון עורק חזיר אל קוף.

Abstract

השתלת קסנו-השתלה היא שיטה אפשרית לטיפול בכישלון איברים. עם זאת, כיצד לפקח ביעילות על דחיית החיסון של xenotransplantation היא בעיה עבור רופאים וחוקרים. כתב יד זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה כדי לפקח על דחייה חיסונית במודלים של השתלת תאי חזיר לעכבר ומודלים להשתלת תיקון עורק חזיר לקוף. במחזור הדנ"א הוא סמן ביולוגי לא פולשני לנזק לאיברים. במחקר זה, במחזור DNA ספציפי לחזיר (cpsDNA) היה במעקב במהלך דחיית xenograft על ידי PCR בזמן אמת כמותית (qPCR). בפרוטוקול זה, פריימרים ספציפיים porcine תוכננו, פלסמידים המכילים פלסמידים ספציפיים ל-DNA רסיס נבנו, ועיקולים סטנדרטיים עבור כמות הוקמו. פריימרים ספציפיים למינים שימשו לאחר מכן לכמת cpsDNA על ידי qPCR במודלים השתלת תא חזיר לעכבר ומודלים השתלת תיקון עורק חזיר אל קוף. הערך של שיטה זו מצביע על כך שניתן להשתמש בה כשיטה פשוטה, נוחה, בעלות נמוכה ופחות פולשנית כדי לפקח על הדחייה החיסונית של xenotransplantation.

Introduction

כשל איברים הוא אחד הגורמים העיקרייםלמוות 1. השתלת תאים, רקמות ואיברים היא דרך יעילה לטיפול אי ספיקתאיברים 2. אף על פי כן, המחסור באיברים תורמים מגביל את היישום הקליני שלשיטה זו 3,4. מחקרים הראו כי חזירים יכולים לשמש כמקור פוטנציאלי של איברים אנושיים להשתלהקלינית 5,6. עם זאת, השתלת איברים בין מינים עומדת בפני דחייה חיסונית מסוכנת. לכן, זה קריטי כדי לפקח על הדחייה החיסונית של xenotransplantation. כיום, ניטור קליני של דחייה חיסונית תלוי בעיקר סימנים ותסמינים של המטופל, כמו גם בדיקות מעבדה (למשל, ביופסיה, ניתוח חיסוני,ואולטרסאונד) 7,8,9. עם זאת, שיטות ניטור אלה יש חסרונות רבים. הסימנים והתסמינים של דחייה חיסונית בחולים מופיעיםבדרך כלל מאוחר 10, אשר אינו מועיל גילוי מוקדם והתערבות מוקדמת; ביופסיה יש את החיסרון שללהיות פולשנית 11, וזה לא קל לחולים לקבל; ניתוח חיסוני חסר רגישות או ספציפיות, אולטרסאונד הוא עזר ויקר. לכן, דחוף למצוא שיטה יעילה ונוחה כדי לפקח על הדחייה החיסונית.

מחזור DNA הוא סוג extracellular של DNA נמצא בדם. מנדל ומטאיס12 דיווחו לראשונה על נוכחות של דנ"א במחזור בדם היקפי בשנת 1948. בתנאים פיזיולוגיים נורמליים, במחזור ה-DNA בדם של אנשים בריאים הוא נמוך יחסית בבסיס. עם זאת, בכמה פתולוגיות, כגון גידולים, אוטם שריר הלב, מחלות אוטואימוניות, ודחיית השתלה, רמת ה-DNA במחזור בדם יכול להיות גדל באופןמשמעותי 13,14 בשל שחרור מסיבי של DNA במחזור שנגרם על ידי אפופטוזיס ונמק. המקור של ה-DNA במחזור קשור אפופטוזיס ונמק15, אשר אופייניים של דחיית xenograft16.

במחזור DNA הוכח להיות סמן ביולוגי פולשנית לגילויסרטן 17,18,19. רצף גבוה של דנ"א במחזור נגזר תורם הוא אמין לזיהוי דחייה לאחר השתלתאיברים 20,21. עם זאת, שיטה זו דורשת ריכוז גבוה ואיכות של דנ"א שחולץ. דרישות ה-DNA בנוסף לעלות הגבוהה וצריכת זמן להפוך שיטה זו לבלתי זכאית לשימוש קליני שגרתי. ניתן לכמת במדויק את ה-DNA הנגזר מתורם על ידי PCR כמותי בזמן אמת (qPCR), שהוא גם ספציפי וגם רגיש. לכן, כימות ה-DNA במחזור porcine על ידי qPCR היא שיטה אפשרית כדי לפקח על הדחייה החיסונית של xenotransplantation. זה פחות פולשני, רגיש מאוד וספציפי, בעלות נמוכה וחיסכון בזמן. חזירים בני אדם נפרדים גנטית עם רצפים גנומיים שונים לגמרי(איור 1). לכן, במחזור DNA porcine יכול להשתחרר לתוך הדם של הנמען לאחר השתלת קסנו בגלל דחיית קסנו. CpsDNA יכול להיות בדיוק לכמת על ידי qPCR עם פריימרים ספציפיים למינים בדם של הנמען. בעבר, הוכחנו את הרציונל והיתכנות של cpsDNA כסמן ביולוגי עבור xenotransplantation22,23. כאן, אנו חושפים טיפים ופרטים ניסיוניים נוספים. הניסוי מורכב מהצעדים הבאים. ראשית, פריימרים ספציפיים porcine תוכננו, ו-DNA גנומי היה מבודד, אשר שימשו כדי לאמת את הייחודיות של פריימרים על ידי PCR רגיל. שנית, בניית העקומה הסטנדרטית של cpsDNA וביוד cpsDNA מהדם המדגם. לבסוף, ה-DNA הספציפי לחזיר במחזור היה מכמת באמצעות qPCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות של ועדת הביקורת המוסדית של בית החולים העם השני בשנזן, בית החולים המזוהה הראשון של אוניברסיטת שנזן.

1. עיצוב פריימרים ספציפיים לפורסין

  1. לבצע ניתוח BLAST של הגנום כולו כדי לזהות גנים ספציפיים לפורצ'ין שהיו שונים מאלה של בני אדם, קופים או עכבר, באמצעות התוכנה NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
  2. עיצוב פריימרים על פי 19 גנים ספציפיים לחזיר (טבלה 1) באמצעות התוכנה של פריימר 5.

2. בידוד דנ"א גנומי

הערה: ה-DNA הגנומי (כולל דם מחזירים, קופים, בני אדם מתנדבים, קופים עם שתלי חזיר, ועכברים עם תאי חזיר) חולצו באמצעות ערכת חילוץ DNA גנומית מסחרית(טבלת חומרים).

  1. מקום 500 μL של כל הדם של דגימות לעיל לתוך צינורות microcentrifuge שונים, בהתאמה.
  2. להוסיף 20 μL של פרוטאז K ו 500 μL של מאגר lysis לתוך צינורות microcentrifuge לעיל, ולאחר מכן ביסודיות לנער ולערבב.
  3. לשים צינורות microcentrifuge אלה באמבט מים ב 56 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולנער 2-3 פעמים במהלך תהליך זה עד הפתרון מתבהר.
  4. צנטריפוגה לזמן קצר כדי להסיר את החרוזים הנוזליים מהקיר הפנימי של מכסה הצינור. מוסיפים 500 μL של אלכוהול אתיל anhydrous ולנער ביסודיות.
  5. מעבירים את התערובת לעמודת הספסוף, צנטריפוגה ב-12,000 סל"ד (כ-13,400 x גרם)למשך 2 דקות.
  6. הוסף 800 μL של פתרון שטיפה לכל עמודת ספיגת מודעות; צנטריפוגה למשך דקה אחת ב-12,000 סל"ד ( כ-13,400 x גרם). מניחים את העמודות בטמפרטורת החדר למשך מספר דקות כדי לייבש את תמיסת שטיפה הנותרת.
    הערה: פתרון שטיפה מסופק על-ידי היצרן.
  7. להעביר את עמודות הספסוף לצינור צנטריפוגלי נקי אחר, להוסיף 50 μL של חוצץ חוצץ באמצע סרטי הספחה, ולמקם אותם בטמפרטורת החדר במשך 2-5 דקות. צנטריפוגה 6,200 x גרם למשך דקה אחת 12,000 סל"ד (כ-13,400 x גרם).
    הערה: מאגר ההתחכות מסופק על-ידי היצרן, אך מאגר TE, המכיל 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) ו- 0.1 mM EDTA, יכול גם לתחמק מה- DNA.
  8. אחסן את תמיסת הדנ"א ב-20°C.

3. אמת את ספציפיות הפרימרים

הערה: מפרטי מינים של 19 פריימרים לעיל אושרו על ידי PCR, אשר בוצע באמצעות פולימראז (טבלת חומרים) פריימרים שהוצגו בטבלה 1.

  1. הכן את הפתרון מראש מעורב של 12.5 μL של 2x PCR premix (טבלתחומרים),1 μL של פריימר 5 ' (10 μM), 1 μL של 3' פריימר (10 μM), ו 8.5 μL של ddH2O. להכין את התערובת כולל 2 דגימות נוספות.
  2. לפצל 23 μL של פתרון מעורב מראש לתוך 0.2 mL microcentrifuge צינורות, להוסיף 2 μL של DNA גנומי, בזהירות לכסות את הצינורות. לאחר מכן מערבבים וצנטריפוגה מעט.
  3. מקם את צינורות המיקרוצנטריפוגה 0.2 מ"ל לתוך מחזור PCR ולבצע את הפעולות הבאות: Denaturation: 95 °C עבור 5 s; חיה: 60 °C עבור 30 s; הרחבה: 72 °C עבור 30 שניות.
  4. בצע אלקטרופורזה agarose כדלקמן:
    1. לשקול 1.2 גרם של agarose לתוך בקבוקון המכיל 100 מ"ל של 1x TAE ולהרתיח אותו במשך 5 דקות במיקרוגל. מוסיפים 5 μL של צבע חומצה גרעין(טבלת חומרים)לתוך הבקבוקון לאחר שהוא מתקרר כ 70 מעלות צלזיוס. יוצקים אותו לתוך הצלחת לאורך הקצה לאט, ומציבים אותו בטמפרטורת החדר עד שהוא מתגבש לתוך ג'ל.
    2. הוסף 5 μL של מדגם ו 2-יומן DNA סולם (0.1-10.0 kb) או מרקר I (0.1–0.6 kb), אשר מכילים 1 μL של 6x מאגר טעינת DNA, לתוך ג'ל agarose. ואז אלקטרופורזה ב 120 mA עד הלהקות מופרדות.
    3. דמיינו את הג'ל של אגר המכיל שברי דנ"א עם דימוי אולטרה סגול.
  5. לבצע אלקטרופורזה agarose כדי לבודד שברי DNA מוגבר מהדגימות לעיל, אשר היה חזותי בתמונה אולטרה סגול. באמצעות PCR, פריימרים ספציפיים עבור DNA גנומי porcine מוגבר זוהה לראשונה(איור 2A). יתר על כן, מינים מסוימים ספציפיים של פריימרים אלה אשר הגבירו במיוחד DNA חזיר בחבורה של קוף / הגנומי האנושי או בחבורה של ה-DNA הגנומי של העכבר אושרו(איור 2B). לבסוף, שני פריימרים ספציפיים למינים הוכחו עוד יותר כדי להגביר באופן ספציפי את ה-DNA חזיר במדבקת עורק חזיר לקוף ו / או מודלים השתלת תא חזיר לעכבר,בהתאמה (איור 2C)

4. עקומה סטנדרטית של cpsDNA

  1. להפוך את pMD19-T plasmid המכיל שבר של DNA porcine DH5a, אשר יכול להיות מוגבר במיוחד על ידי פריימר #4 או פריימר #11(טבלה 1). מסך לחיידקים חיוביים באמצעות 50 μg / מ"ל אאמפיצילין.
    פריימר #4 ב אדם / קוף קוהורטה (קדימה: 5′-TTCAATCCCA CTTCTTCCACCTAA-3′, הפוך: 5′-CTTCATTCCTCTTCATAAC CCTGT-3′)
    פריימר #11 מודל העכבר (קדימה: 5′-TGCCGTGGTTTCC GTTGCTTG-3′, הפוך: 5′-TCACATGATGATGGTCGTGGTCGTC T-3′)
    הערה: ניתן למצוא פרטים על כל הפרימרים בטבלה 1.
  2. לקצור את הפלסמידים לעיל בעקבות הפרוטוקול שלהלן.
    1. בודדו מושבה אחת מצלחת סלקטיבית טרייה ומשובצת וחסנו תרבות של 1-5 מ"ל של מדיום LB המכילה את האנטיביוטיקה הסלקטיבית המתאימה. דגירה במשך 12-16 שעות ב 37 °C עם רעד נמרץ (300 סל"ד).
    2. צנטריפוגה ב 10,000 x גרם לדקה אחת בטמפרטורת החדר. Decant או לשאוף ולהיפטר התקשורת התרבות.
    3. הוסף 250 μL של פתרון I/RNase A. מערבולת או צינור למעלה ו למטה כדי לערבב ביסודיות. שיפוץ מלא של כדורי התא חיוני להשגת תשואות טובות.
      הערה: יש להוסיף את RNase A לפתרון I לפני השימוש.
    4. העבר את המתלים לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל. הוסף 250 μL של פתרון II. הפוך וסובב בעדינות את הצינור מספר פעמים כדי להשיג תסה ברור. ייתכן שיהיה צורך בהדירה של 2-3 דקות.
      הערה: הימנע מערבוב נמרץ כמו זה יהיה גיהו DNA כרומוזומלי וטוהר פלסמיד נמוך יותר. אין לאפשר לתגובת הליזה להימשך יותר מ-5 דקות.
    5. הוסף 350 μL של פתרון III. מיד להפוך מספר פעמים עד משקע לבן flocculent נוצר.
      הערה: חיוני כי הפתרון מעורב ביסודיות ומיד לאחר התוספת של פתרון III כדי למנוע משקעים מותאמים אישית.
    6. צנטריפוגה במהירות מרבית (≥13,000 x גרם)למשך 10 דקות. כדור לבן קומפקטי ייווצר. המשך מיד לשלב הבא.
    7. הכנס עמודת די.אן.איי מיני לצינור אוסף של 2 מ"ל.
    8. להעביר את supernatant פינה מ 4.2.7 על ידי שגם בזהירות אותו לתוך עמודת מיני DNA. היזהרו לא להפריע לדור ושפסולת תאית לא מועברת לעמודת הדנ"א המיני.
    9. צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך דקה אחת. בטל את הסינון והשתמש מחדש בצינור האוסף.
    10. הוסף 500 μL של מאגר HBC. צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך דקה אחת. בטל את צינור הסינון והשתמש מחדש באוסף.
      הערה: יש לדלל את מאגר HBC עם 100% isopropanol לפני השימוש.
    11. הוסף 700 μL של מאגר שטיפה DNA. צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך דקה אחת. בטל את הסינון והשתמש מחדש בצינור האוסף.
      הערה: מאגר שטיפה DNA יש לדלל עם 100% אתנול לפני השימוש.
      1. אופציונלי: חזור על הפעולה עבור שלב שטיפה נוסף של מאגר DNA.
    12. צנטריפוגה בעמודת ה-DNA הריקה למשך 2 דקות במהירות מרבית כדי לייבש את מטריצת העמודה.
      הערה: חשוב לייבש את מטריצת עמודת המיני DNA לפני ההתמהמהות. שאריות אתנול עלול להפריע ליישומים במורד הזרם.
    13. העבר את עמודת ה-DNA מיני לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי של 1.5 מ"ל.
    14. הוסף 30-100 μL של מאגר אלגנטיות או מים deionized סטרילי ישירות למרכז קרום העמודה.
      הערה: היעילות של עילת ה-DNA מעמודת ה-DNA Mini תלויה ב- pH. אם אתם משתמשים במים סטריליים, ודאו שה-pH הוא בסביבות 8.5.
    15. נותנים לשבת בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.
    16. צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך דקה אחת.
      הערה: זה מייצג כ 70% של ה-DNA המאוגד. תסה שנייה אופציונלית תניב כל דנ"א שיורית, אם כי בריכוז נמוך יותר.
  3. ודא את הפלסמידים לעיל באמצעות עיכול אנזימים הגבלה כפולה באמצעות EcoR I (15 U/μL) ו באם H1 (15 U/μL)22.
    1. בצע את שלבי ההתווים על הקרח. להכין את מערכת התגובה של 1 μL של EcoR I (15 U), 1 μL של באם H1 (15 U), 2 μL של 10x מאגר, 1 μg של פלסמיד; להוסיף ddH2O כדי 20 μL של נפח כולל, לערבב ביסודיות. דגירה באמבט מים ב 37 ° C במשך 2 שעות.
    2. להפריד את המוצרים המעוכלים על ידי 1% agarose ואחריו אלקטרופורזה ולחשוף אור UV כמו בעבר.
  4. תדלל את הפלסמיד המרוכז ל- 2 x 1011 עותקים/מ"ל עבור הפתרון הסטנדרטי ההתחלתי באמצעות ddH2O. קח את הפלסמיד (P2) המכיל שבר של DNA porcine למשל של עותקים מחשב:
    1. חשב את מספר הפלסמידים ב- 1 מ"ל של פתרון סטנדרטי התחלתי: N = (2 x 1011)/ (6.02 x 1023) מול.
    2. חשב את המשקל המולקולרי של P2: M = 2810 bp x 650 D/bp = 2810 x 650 D (g/mol).
    3. חשב את המסה של P2: m=N*M= (2 x 1011)/ (6.02 x 1023) מול x 2810 x 650 גרם/מול.
    4. חשב את נפח הנפח של P2: V = m/C = [((2 x10 11)/(6.02 x10 23) x 2810 x 650] g/C. (C הוא הריכוז של P2 (ng/μL), הנמדד על-ידי ספקטרופוטומטר).
  5. לדלל את הפתרון הסטנדרטי ההתחלתי באופן סדרתי 10-fold לתוך 2 x10 10 עותקים / מ"ל, 2 x10 9 עותקים / מ"ל, 2 x 108 עותקים / מ"ל, 2 x10 7 עותקים / מ"ל..., ו 2 x 100 עותקים / מ"ל עבור פתרון סטנדרטי באמצעות DdH2O.
  6. צור את העקומה הסטנדרטית.
    1. להכין את מערכת התגובה של qPCR (כל השלבים מוגנים מפני אור): הוסף את הפתרון טרום מעורב המכיל 325 μL של qPCR לערבב(טבלת חומרים),13 μL של פריימר 5' , 13 μL של פריימר 3' , ו 169 μL של ddH2O לתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge, אשר היה אז מעורב ביסודיות וקצת צנטריפוגה.
    2. לפצל את 40 μL מעל פתרון מעורב מראש לתוך רצועת 8 צינור ולהוסיף 10 μL של DNA סטנדרטי של ריכוזים שונים. מכסים בזהירות, מערבבים וצנטריפוגה מעט.
    3. לשים את רצועת 8-צינור לתוך מכונת qPCR בעקבות ההליך המוצג איור 3.

5. לבודד את ה-DNA במחזור מדגימות הדם

  1. באמצעות צינורות EDTA, לאסוף דגימות דם בנקודות זמן שונות במודלים תיקון עורק חזיר-לקוף ואת מודלים השתלת תא חזיר לעכבר.
  2. לאסוף דגימות דם של כ 400 μL (מדגמי תיקון עורק חזיר לקוף) או 100 μL (מן מודלים השתלת תא חזיר לעכבר) ולעבור 1.5 מ"ל microcentrifuge צינורות. הסר את תאי הדם מדגימות הדם על ידי צנטריפוגציה בטמפרטורה נמוכה ובמהירות גבוהה (3,000 x g, 4 °C, 5 דקות).
  3. להעביר את supernatant לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל ולהסיר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב 16,000 x g במשך 10 דקות.
  4. העבר את הסופרנטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל. לחלץ את ה-DNA במחזור מן supernatant לעיל באמצעות סרום מסחרי / ערכת הפקת DNA במחזור בעקבות פרוטוקול 2 של פרוטוקול יצרני DNA גנומי מבודד.
  5. לנטר את נפח ה-DNA במחזור ל 40 μL ולאחסן ב -20 °C.

6. כמות של DNA ספציפי לחזיר במחזור

  1. הכינו את הפתרון המעורב מראש של 25 μL של qPCR Mix(טבלת חומרים ), 1 μL של פריימר 5' , μL אחד של פריימר 3' , 10 μL של DNA מדגם, ו 13 μL של ddH2O. להכין את התערובת כולל 2 דגימות נוספות.
  2. לפצל את הפתרון 40 μL מראש מעורבב לרצועה 8 צינור, ולהוסיף 10 μL של DNA מדגם, ואחריו כתר זהיר. הכן שתי תגובות יותר מהצורך.
  3. לשים את רצועת 8-צינור לתוך מכונת qPCR בעקבות אותו הליך כמו העקומה הסטנדרטית. עדיף להפעיל קודם כל תקן כדי לוודא שהתגובה קריטית לכמת מראש. ההליך של מערכת התגובה של qPCR הוצג איור 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בפרוטוקול זה תוכננו פריימרים ספציפיים לפורצ'ין, ונבנו שברי דנ"א ספציפיים המכילים פלסמידים, וקימורים סטנדרטיים לכמויות הוקמו(איור 4). מפרטי המינים של 19 פריימר אושרו על ידי PCR. פריימרים ספציפיים למינים (פריימר #4 ו-primer #11) שימשו לאחר מכן לכמת cpsDNA על ידי qPCR במודלים של השתלת תאי חזיר-לעכב ומודלים להשתלת תיקון עורק חזיר אל קוף.

אלקטרופורזה Agarose שימש כדי לבודד שברי DNA מוגבר מהדגימות לעיל, אשר לאחר מכן הוא חזותי בתמונה אולטרה סגול. באמצעות PCR, פריימרים ספציפיים עבור DNA גנומי porcine מוגבר זוהה לראשונה(איור 2A). יתר על כן, מינים מסוימים ספציפיים של פריימרים אלה כי הגבירו במיוחד DNA חזיר בחבורה של קוף / הגנומי האנושי או בחבורה של ה-DNA הגנומי של העכבר אושרו(איור 2B). לבסוף, שני פריימרים ספציפיים מינים הוכחו עוד יותר כדי להגביר באופן ספציפי DNA חזיר תיקון עורק חזיר לקוף ו / או מודלים השתלת תא חזיר לעכבר, בהתאמה(איור 2C).

Figure 1
איור 1: זהות גנטית בין חזיר(sus scrofa, ssc) ואדם(הומו סאפיינס,יש) אוקוף (Macaca fascicularis,mfa). רצפי הגנים משלושה מינים שונים הושוו על ידי ניתוח BLAST. ניתוח רצף BLAST השתמש במידע ביאור גנומי (רצף ה-mRNA) משלושת המינים שהורדו מ-NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). רצפי ה-mRNA של גנים אנושיים, קופים וחזירים היו 139116, 65927 ו-71498,בהתאמה 22. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 2: PCR רגיל מאמת ספציפיות של פריימרים ספציפיים לפורצין. (שברי הדנ"א הגנומיים של החזיר הוגדלו על ידי פריימרים 1-19. (ב)לא ניתן היה להגביר את שבר הדנ"א הגנומי של בני האדם/קוף/עכברים על ידי פריימרים מסוימים (#4 #11). הכוכבים (*) מצביעים על אין כל הגדלה בדנ"א גנומי אנושי/קוף. סימן הפאונד (#) מציין שאין כל הגדלה בדנ"א גנומי של העכבר. (ג)שני פריימרים ספציפיים למינים (פריימר #4 ו-#11) הוכחו עוד יותר כדי להגביר באופן ספציפי את הדנ"א של החזיר במדבקת עורק החזיר לקוף ו/או מודלים להשתלת תאי חזיר לעכבר,בהתאמה 22. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 3: ההליך עבור תגובת qPCR22. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. 

Figure 3
איור 4: הקמת העקומה הסטנדרטית לכמת מוחלט. קווי ההגדלה, קווי העיקול המסתים ותצוגות העקומה הסטנדרטיות שלפריימר (A)#4 ו- (B) פריימר #11 ממכונה qPCR (ראה טבלת חומרים)מוצגים. תקן טוב (ערך R קרוב ל- 1, יעילות ההגדלה היא בטווח של 100%±5%) יכול לשמש עד חצי שנה22. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

שולחן 1 . אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כימות הדי.אן.איי במחזור ה-DNA מייצג גישה אפשרית כדי לפקח על הדחייה החיסונית של xenotransplantation. גדי ואח '24 מצא כי תוכן DNA נגזר תורם (ddcfDNA) בדם של חולים עם דחייה חריפה היה גבוה באופן משמעותי מזה של חולים ללא דחייה. מחקרים אלה מראים כי ddcfDNA עשוי להיות סמן ביולוגי נפוץ לניטור נזק שתל איברים. בשנים האחרונות, qPCR הוחל יותר ויותר על ניתוח של חומצות גרעין בגלל הפעולה הפשוטה שלה, רמה גבוהה של אוטומציה, רגישות גבוהה, ספציפיות טובה, ועלות נמוכה.

במחקר זה, פריימרים ספציפיים porcine תוכננו בהתבסס על התוצאות של ניתוח ביואינפורמטיקה. הייחודיות שלהם אומתה על ידי PCR רגיל. CPSDNA של דגימות הדם של מודלים תיקון עורק חזיר לקוף ואת מודלים השתלת תא חזיר לעכבר יכול להיות בדיוק לכמת על ידי qPCR עם פריימרים ספציפיים למין. היתרונות העיקריים של הגישה הם כדלקמן. ראשית, בהתבסס על פריימרים ספציפיים מאוד, שיטה זו של כימות ה-DNA הוא רגיש מאוד וספציפי. בנוסף, הפרוטוקול של הגישה הוא פשוט מאוד לביצוע, אשר כללה עיצוב של פריימרים ספציפיים, בידוד של DNA, וניתוח qPCR ביום עבודה אחד, וזה זמן החוסך. זוהי שיטה לא פולשנית שמתחילה מנפח קטן של סרום או חומר פלזמה. בינתיים, הוכחנו כי שיטה זו היא מאוד לשחזור22. בניגוד לתפוקה גבוהה וספקטרומטריה מסת טיסה, שיטה זו היא בעלות נמוכה.

ניטור דחייה חיסונית על ידי כימות של DNA ספציפי חזיר במחזור בדם של מודלים תיקון עורק חזיר אל קוף מודלים השתלת תא חזיר לעכבר באמצעות qPCR הניח את היסודות למחקר הבסיסי ואת היישום הקליני של xenotransplantation חזיר-אנושי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מדווחים שאין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתכנית המחקר ודם המרכזית הלאומית של סין (2017YFC1103704), קרן שנג'ן למדע וטכנולוגיה (JCYJ20170817172116272), קרנות מיוחדות לבניית בתי חולים ברמה גבוהה בגואנגדונג מחוז (2019), פרויקט סנמינג לרפואה בשנזן (SZSM201412020), קרן לבניית משמעת רפואית ברמה גבוהה של שנזן (2016031638), קרן שנג'ן לבריאות ותכנון משפחה הוועדה (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Biowest, Barcelona, Spain 111860
BamHI-HF New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA R3136S
1.5 mL microcentrifuge tube Axygen Biosciences, Union City, CA, USA MCT-150-C
0.2 mL PCR tube Axygen Biosciences, Union City, CA, USA PCR-02-C
C57BL/6 Mice Medical Animal Center of Guangdong Province,  China 8~10 weeks
Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA Micro 21R
2-Log DNA Ladder New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA N3200S 0.1–10.0 kb
Marker I  Tiangen, Beijing, China MD101-02 0.1–0.6 kb
DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns) Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA DNACOL-01
DNA loading buffer Solarbio, Beijing, China D1010
E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA D6942
D6943
EcoR I Takara Bio, Shiga, Japan  1040S
Female Bama mini pigs BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China 2~4 months
Genomic DNA Extraction Kit ? Tiangen, Beijing, China DP304-02
SYBR Green Realtime PCR Master Mix Toyobo, Osaka, Japan QPK-201
Gel Doc XR Bio-Rad, Hercules, USA
Male cynomolgus monkeys Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China 8 years
Nucleic acid dye(Gelred) Biotium, Fremont, USA 42003
polymerase(Premix Taq) Takara Bio, Shiga, Japan RR901A
pMD19-T plasmid Takara Bio, Shiga, Japan D102A
qPCR machine Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA
Serum/Circulating DNA Extraction Kit Tiangen, Beijing, China DP339
TAE sangon Biotech, Shanghai, China B548101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buchman, T. Multiple organ failure. Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).
  2. Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. Organ donation after circulatory death: current status and future potential. Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).
  3. Lopez-Fraga, M., et al. A needed Convention against trafficking in human organs. Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).
  4. Sykes, M., Sachs, D. Transplanting organs from pigs to humans. Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).
  5. Reardon, S. New life for pig-to-human transplants. Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).
  6. Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation. BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).
  7. Chung, H., et al. CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation. Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).
  8. Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation. Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).
  9. Agbor-Enoh, S., et al. Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).
  10. Vito Dabbs, D., et al. Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation. Heart & Lung. 33 (6), 372-380 (2004).
  11. Miller, C. A., et al. Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection. Heart. 99 (7), 445-453 (2013).
  12. Mandel, P., Metais, P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l'homme. Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).
  13. Okkonen, M., et al. Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation. Critical Care. 15 (4), 196 (2011).
  14. Wagner, J. Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics. Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).
  15. Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
  16. Mohiuddin, M. M., et al. Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft. Nature Communications. 7, 11138 (2016).
  17. Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
  18. Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).
  19. Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).
  20. Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).
  21. De Vlaminck, I., et al. Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).
  22. Zhou, M., et al. Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection. Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).
  23. Huo, Q., et al. Circulating mi RNA or circulating DNA —Potential biomarkers for organ transplant rejection. Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).
  24. Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection. Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).

Tags

ביולוגיה גיליון 163 פריימרים ספציפיים במחזור DNA ספציפי לחזיר qPCR xenotransplantation סמן ביולוגי דחייה חיסונית
כימות של DNA ספציפי חזיר במחזור בדם של מודל xenotransplantation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deng, Y., Zhou, M., Lu, Y., Chen,… More

Deng, Y., Zhou, M., Lu, Y., Chen, J., Pu, Z., Yu, D., Dai, Y., Zhan, Y., Mou, L. Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model. J. Vis. Exp. (163), e61579, doi:10.3791/61579 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter