Summary
I detta protokoll utformades porcin specifika primers, plasmider-innehållande svin specifika DNA-fragment konstruerades, och standard kurvor för kvantisering fastställdes. Med hjälp av artspecifika primers, var cpsDNA kvantifieras av qPCR i gris-till-mus cell transplantation modeller och gris-till-apa artär patch transplantation modeller.
Abstract
Xenotransplantation är en genomförbar metod för att behandla organsvikt. Hur man effektivt övervaka immunavstötning av xenotransplantation är dock ett problem för läkare och forskare. Detta manuskript beskriver en enkel och effektiv metod för att övervaka immun avstötning i gris-till-mus cell transplantation modeller och gris-till-apa arteriell patch transplantation modeller. Cirkulerande DNA är en potentiellt icke-invasiv biomarkör för organskador. I denna studie, cirkulerande gris-specifika DNA (cpsDNA) övervakades under xenograft avslag av kvantitativa realtid PCR (qPCR). I detta protokoll utformades porcin specifika primers, plasmider-innehållande svin specifika DNA-fragment konstruerades, och standard kurvor för kvantisering fastställdes. Artspecifika primers användes sedan för att kvantifiera cpsDNA av qPCR i gris-till-mus cell transplantation modeller och gris-till-apa gatan patch transplantation modeller. Värdet av denna metod tyder på att det kan användas som en enkel, bekväm, låg kostnad, och mindre invasiv metod för att övervaka immun avstötning av xenotransplantation.
Introduction
Organsvikt är en av de främsta dödsorsakerna1. Transplantation av celler, vävnader och organ är ett effektivt sätt att behandla organsvikt2. Trots detta begränsar bristen på donatororgan den kliniska tillämpningen av denna metod3,4. Studier har visat att svin kan användas som en potentiell källa till mänskliga organ för klinisk transplantation5,6. Men, cross-species organtransplantation ansikten farliga immun avstötning. Därför är det avgörande att övervaka immunavstötningen av xenotransplantation. För närvarande beror klinisk övervakning av immunavstötning främst på patientens tecken och symtom, samt laboratorietester (t.ex. biopsi, immunbiokemisk analys, och ultraljud)7,8,9. Dessa övervakningsmetoder har dock många nackdelar. Tecknen och symtomen på immunavstötning hos patienter visasvanligtvis sent 10, vilket inte är gynnsamt för tidig upptäckt och tidiga insatser; biopsi har nackdelen att vara invasiv11, vilket inte är lätt för patienter att acceptera; immunobiokemisk analys saknar känslighet eller specificitet, och ultraljud är hjälp och dyrt. Därför är det angeläget att hitta en effektiv och bekväm metod för att övervaka immunavstötningen.
Cirkulerande DNA är en extracellulär typ av DNA som finns i blod. Mandel och Metais12 rapporterade först förekomsten av cirkulerande DNA i perifert blod 1948. Under normala fysiologiska förhållanden är cirkulerande DNA i blodet hos friska människor relativt lågt vid baslinjen. Men i vissa patologier, såsom tumörer, hjärtinfarkt, autoimmuna sjukdomar, och transplantation avstötning, kan nivån av cirkulerande DNA i blodet ökasbetydligt 13,14 på grund av den massiva frisättningen av cirkulerande DNA som orsakas av apoptos och nekros. Ursprunget till cirkulerande DNA är associerad med apoptos och nekros15, som är karakteristiska för xenograft avstötning16.
Cirkulerande DNA har visat sig vara en minimalinvasiv biomarkör för att upptäcka cancer17,18,19. Hög genom-sätta sekvensering av givare-härledda cirkulerande DNA är tillförlitlig för detektering av avstötning efter organtransplantation20,21. Denna metod kräver dock en hög koncentration och kvalitet av extraherat DNA. DNA-kraven utöver de höga kostnaderna och tidsåtgången gör denna metod icke valbar för rutinmässig klinisk användning. Donor-derived cirkulerande DNA kan exakt kvantifieras genom kvantitativ realtid PCR (qPCR), som är både specifika och känsliga. Därför är kvantifiera svin cirkulerande DNA genom qPCR en genomförbar metod för att övervaka immun avstötning av xenotransplantation. Detta är mindre invasiv, mycket känslig och specifik, låg kostnad, och tidsbesparande. Grisar och människor är genetiskt åtskilda med helt olika genomiska sekvenser (Figur 1). Därför cirkulerande svin DNA kan släppas ut i mottagarens blod post-xenotransplantation på grund av xeno-avstötning. CpsDNA skulle kunna kvantifieras exakt av qPCR med artspecifika primers i mottagarens blod. Tidigare har vi visat den logiska grunden och genomförbarheten av cpsDNA som en biomarkör för xenotransplantation22,23. Här avslöjar vi mer experimentella tips och detaljer. Experimentet består av följande steg. För det första utformades porcinspecifika primers, och genomiskt DNA isolerades, som användes för att kontrollera specificiteten hos primers av vanlig PCR. För det andra, konstruera standardkurvan för cpsDNA och isolera cpsDNA från provet blodet. Slutligen kvantifierades det cirkulerande grisspecifika DNA med hjälp av qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med de relevanta riktlinjer och förordningar av den institutionella granskningsnämnden i Shenzhen Second People's Hospital, First Affiliated Hospital i Shenzhen University.
1. Design porcine specifika grund- och primrar
- Utför hela genom BLAST analys för att identifiera svin specifika gener som var annorlunda än de hos människor, apor eller mus, med hjälp av programvaran NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
- Designprimrar enligt 19 grisspecifika gener (Tabell 1) med hjälp av programvaran för Primer 5.
2. Isolerande genomiskt DNA
OBS: Det genomiska DNA (inklusive blod från svin, apor, frivilliga människor, apor med svintransplantat, och möss med svinceller) extraherades med hjälp av en kommersiell genomisk DNA-extraktionssats (Table of Materials).
- Placera 500 μL av helblodet av ovan nämnda prover i olika mikrocentrifugrör, respektive.
- Tillsätt 20 μL proteas K och 500 μL lysbuffert i ovanstående mikrocentrifugrör, och skaka och blanda sedan noggrant.
- Sätt dessa mikrocentrifugrör i ett vattenbad vid 56 °C i 10 min och skaka 2-3 gånger under denna process tills lösningen blir klar.
- Centrifug kort för att avlägsna vätskepärlorna från innerväggen på rörskydden. Tillsätt 500 μL vattenfri etylalkohol och skaka ordentligt.
- Överför blandningen i adsorptionskolumnen, centrifugera vid 12 000 varv /min (~13 400 x g) i 2 min.
- Tillsätt 800 μL sköljlösning till varje adsorptionskolumn; centrifug i 1 min vid 12 000 varv/min ( ~13 400 x g). Placera kolonnerna i rumstemperatur i några minuter för att torka den återstående sköljlösningen.
OBS: Sköljlösningen tillhandahålls av tillverkaren. - Överför adsorptionskolumnerna till ett annat rent centrifugalrör, tillsätt 50 μL elutionsbuffert till mitten av adsorptionsfilmerna och placera dem i rumstemperatur i 2-5 min. Centrifugera 6 200 x g i 1 min 12 000 varv /min (~13 400 x g).
OBS: Elueringsbufferten tillhandahålls av tillverkaren, men TE-bufferten, som innehåller 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) och 0.1 mM EDTA, kan också elera DNA:t. - Förvara DNA-lösningen vid -20 °C.
3. Kontrollera primers specificitet
OBS: Artsegenaliteter hos ovanstående 19 grundämnen bekräftades av PCR, som utfördes med hjälp av polymeras (Table of Materials) och primers som presenteras i tabell 1.
- Bered den färdigblandade lösningen på 12,5 μL av 2x PCR-premix (Tabell över material), 1 μL av 5' primer (10 μM), 1 μL av 3' primer (10 μM), och 8,5 μL av ddH2O. Förbered blandningen inklusive 2 extra prover.
- Dela 23 μL av förblandad lösning i 0,2 mL mikrocentrifugrör, tillsätt 2 μL genomiskt DNA och försiktigt kapa rören. Blanda sedan och centrifug något.
- Placera 0,2 mL mikrocentrifugrören i PCR-cyclern och utför följande: Denaturation: 95 °C för 5 s; Glödgning: 60 °C för 30 s; förlängning:72 °C för 30 s.
- Utför agaroselektrofores enligt följande:
- Väg in 1,2 g agaros i en kolv som innehåller 100 mL 1x TAE och koka den i 5 min i mikrovågsugnen. Tillsätt 5 μL nukleinsyrafärgämne (Tabell av material) i kolven efter att den svalnat till ca 70 °C. Häll den i plattan längs kanten långsamt, och placera den i rumstemperatur tills den stelnar till en gel.
- Tillsätt 5 μL prov och 2-Log DNA Ladder (0.1–10.0 kb) eller Markör I (0.1–0.6 kb), som innehåller 1 μL 6x DNA-lastningsbuffert, i agarosgeln. Därefter elektroforser vid 120 mA tills banden är separerade.
- Visualisera agargeln som innehåller DNA-fragment med en ultraviolett imager.
- Utför agaroselektrofores för att isolera amplifierade DNA-fragment från ovanstående prover, som visualiserades i en ultraviolett imager. Med hjälp av PCR identifierades först de primers som är specifika för amplifierat porcint genomiskt DNA (Figur 2A). Vidare bekräftades vissa art-specifika faktorer hos dessa grund- och primrar som specifikt amplifierade gris-DNA i kohorten av apa/humangenomisk eller i kohorten av musgenomiskt DNA (Figur 2B). Slutligen, två art-specificities primers bevisades ytterligare att särskilt förstärka gris DNA i gris-till-apa artär patch och / eller gris-till-mus cell transplantation modeller, respektive (Figur 2C)
4. Standardkurva för cpsDNA
- Omvandla pMD19-T plasmid som innehåller ett fragment av svin DNA till DH5a, som skulle kunna särskilt förstärkas genom primer #4 eller primer #11 (Tabell 1). Skärm för positiva bakterier med hjälp av 50 μg/mL ampicillin.
Primer #4 i människa/apa kohort (framåt: 5′-TTCAATCCCA CTTCTTCCACCTAA-3′, omvänd: 5′-CTTCATTCCATCTTCATAATAAC CCTGT-3′)
Primer #11 för mus modell (framåt: 5′-TGCCGTGGTTTCC GTTGCTTG-3′, omvänd: 5′-TCACATTTGATGGTCGTCTTGTCGTC T-3′)
OBS: Uppgifter om alla grund- och primrar finns i tabell 1. - Skörda ovanstående plasmider som följer nedanstående protokoll.
- Isolera en enda koloni från en nyligen streckad selektiv platta och inokulera en kultur av 1- 5 mL lb medium som innehåller den lämpliga selektiva antibiotikum. Inkubera i 12-16 timmar vid 37 °C med kraftig skakning (300 rpm).
- Centrifugera vid 10 000 x g i 1 minut vid rumstemperatur. Dekantera eller aspirera och kassera kulturmedierna.
- Tillsätt 250 μL lösning I/RNase A. Vortex eller pipet upp och ner för att blanda ordentligt. Fullständig återfpension av cellpellet är avgörande för att få god avkastning.
OBS: RNase A måste läggas till i Lösning I före användning. - Överför suspension till ett nytt 1,5 mL mikrocentrifugrör. Tillsätt 250 μL lösning II. Invertera och rotera försiktigt röret flera gånger för att få en tydlig lysate. En 2-3 minuters inkubation kan vara nödvändig.
OBS: Undvik kraftig blandning eftersom detta kommer att skjuvning kromosomal DNA och lägre plasmid renhet. Låt inte lysreaktionen fortsätta mer än 5 minuter. - Tillsätt 350 μL lösning III. Omedelbart invertera flera gånger tills en flocculent vit fällning former.
OBS: Det är livsviktigt att lösningen blandas ordentligt och omedelbart efter tillsats av Lösning III för att undvika lokaliserad nederbörd. - Centrifugera med maxhastighet (≥13 000 x g) i 10 minuter. En kompakt vit pellet kommer att bildas. Fortsätt omgående till nästa steg.
- Sätt in en DNA-minikolonn i ett 2 mL uppsamlingsrör.
- Överför den rensade supernatanten från 4.2.7 genom att försiktigt aspirera den i DNA-minikolonnen. Var försiktig så att inte pelleten störs och att inget cellulärt skräp överförs till DNA-minikolonnen.
- Centrifugera med maxhastighet i 1 minut. Kassera filtratet och återanvänd uppsamlingsröret.
- Tillsätt 500 μL HBC Buffer. Centrifugera med maxhastighet i 1 minut. Kassera filtratet och återanvänd uppsamlingsröret.
OBS: HBC Buffer måste spädas med 100% isopropanol före användning. - Tillsätt 700 μL DNA-tvättbuffert. Centrifugera med maxhastighet i 1 minut. Kassera filtratet och återanvänd uppsamlingsröret.
OBS: DNA Tvättbuffert måste spädas med 100% etanol före användning.- Valfritt: Upprepa för en andra DNA-tvätt buffert tvätt steg.
- Centrifugera den tomma DNA-minipelaren i 2 minuter vid maximal hastighet för att torka kolonnmatrisen.
OBS: Det är viktigt att torka DNA-minikolonnens matris före eluering. Restanol kan störa applikationer nedströms. - Överför DNA minikolonnen till ett rent 1,5 mL mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 30-100 μL Elution Buffer eller sterilt avjoniserat vatten direkt till kolonnmembranets mitt.
OBS: Effektiviteten hos eluering av DNA från DNA Mini-kolonnen är beroende av pH. Om du använder sterilt avjoniserat vatten, se till att pH-värdet är runt 8,5. - Låt sitta i rumstemperatur i 1 minut.
- Centrifugera med maxhastighet i 1 minut.
OBS: Detta motsvarar cirka 70% av bundet DNA. En valfri andra eluering kommer att ge någon kvarvarande DNA, men vid en lägre koncentration.
- Verifiera ovanstående plasmider med hjälp av dubbel begränsning enzym matsmältning med ecor I (15 U/μL) och Bam H1(15 U/μL)22.
- Utför make-up steg på isen. Preparera reaktionssystemet av 1 μL av EcoR I (15 U), 1 μL av Bam H1 (15 U), 2 μL av 10x Buffert, 1 μg av plasmid; tillsätt ddH2O till 20 μL av total volym, blanda noggrant. Inkubera i ett vattenbad vid 37 °C i 2 timmar.
- Separera de smälta produkterna med 1% agaros följt av elektrofores och utsätta för UV-ljus som tidigare.
- Späd den koncentrerade plasmiden i 2 x 1011 kopior/mL för startstandardlösningen med ddH2O. Ta plasmiden (P2) som innehåller ett fragment av porcine DNA för exempel av kopierar beräkna:
- Beräkna antalet plasmider i 1 mL startstandardlösning: N = (2 x 1011)/ (6,02 x 1023) mol.
- Beräkna molekylvikten för P2: M = 2810 bp x 650 D/bp = 2810 x 650 D (g/mol).
- Beräkna massan av P2: m=N*M= (2 x 1011)/ (6,02 x 1023) mol x 2810 x 650 g/mol.
- Beräkna volymen av P2: V = m/C = [(2 x 1011)/(6.02 x 1023) x 2810 x 650] g/C. (C är koncentrationen av P2 (ng/μL), som mäts med en spektrofotometer).
- Späd startstandardlösningen seriellt 10-faldig till 2 x10 10 kopior/mL, 2 x 109 kopior/mL, 2 x 108 kopior/mL, 2 x 107 kopior/mL..., och 2 x 100 kopior/mL för standardlösning med ddH2O. Vortex grundligt under utspädning.
- Upprätta standardkurvan.
- Preparera reaktionssystem av qPCR (alla steg skyddas från ljus): Tillsätt den förblandade lösningen som innehåller 325 μL qPCR Mix (Table of Materials), 13 μL av 5' primer, 13 μL av 3' primer, och 169 μL av ddH2O i ett 1,5 mL mikrocentrifugrör, som sedan var noggrant blandat och något centrifugerat.
- Dela upp 40 μL ovanför förblandad lösning i en 8-ub-remsa och tillsätt 10 μL av standard-DNA av olika koncentrationer. Cap försiktigt, blanda och centrifug något.
- Sätt 8-rörslisten i qPCR-maskinen efter det förfarande som visas i figur 3.
5. Isolera cirkulerande DNA från blodproverna
- Med hjälp av EDTA-rör samlar du in blodprover vid olika tidpunkter i artärplåstrets modeller och celltransplantationsmodellerna från gris mot mus.
- Samla in blodprov på ca 400 μL (från artärplåstretsmodellerna gris till apa) eller 100 μL (från modellerna för celltransplantation från gris till mus) och överför till 1,5 mL mikrocentrifugrör. Avlägsna blodkropparna från blodproven genom centrifugering vid låg temperatur och hög hastighet (3 000 x g, 4 °C, 5 min).
- Överför supernatanten till ett nytt 1,5 mL mikrocentrifugrör och avlägsna cellskräpet genom centrifugering vid 16 000 x g i 10 min.
- Överför supernatanten till ett nytt 1,5 mL mikrocentrifugrör. Extrahera det cirkulerande DNA:t från ovanstående supernatant med hjälp av ett kommersiellt serum/cirkulerande DNA-extraktionskit efter protokoll 2 i det isolerande genomiska DNA-tillverkarnas protokoll.
- Kondensera volymen av cirkulerande DNA till 40 μL och förvara vid -20 °C.
6. Kvantisering av cirkulerande grisspecifikt DNA
- Bered den förblandade lösningen av 25 μL av qPCR Mix (Table of Materials), 1 μL av 5' primer, 1 μL av 3' primer, 10 μL av Prov-DNA, och 13 μL av ddH2O. Förbered blandningen inklusive 2 extra prov.
- Dela upp den 40 μL förblandade lösningen i en 8-ub-remsa och tillsätt 10 μL prov-DNA, följt av noggrant tak. Förbered två fler reaktioner än vad som behövs.
- Sätt 8-rörslisten i qPCR-maskinen enligt samma procedur som standardkurvan. Det är bättre att köra en standard först för att se till att reaktionen är avgörande för kvantifiering i förväg. Förfarandet för reaktionssystemet av qPCR visades i figur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta protokoll konstruerades porcinspecifika grundfärger, plasmiderinnehållande porcinspecifika DNA-fragment konstruerades, och standardkurvor för kvantisering fastställdes (Figur 4). Artens särdrag av de 19 primersna bekräftades av PCR. Artspecifika primers (primer #4 och primer #11) användes sedan för att kvantifiera cpsDNA av qPCR i gris-till-mus cell transplantation modeller och gris-till-apa gatan patch transplantation modeller.
Agaros elektrofores användes för att isolera amplifierade DNA-fragment från ovanstående prover, som sedan visualiseras i en ultraviolett imager. Med hjälp av PCR identifierades först de grund- och grund- och primrar som är specifika för amplifierat porcint genomiskt DNA (Figur 2A). Vidare bekräftades vissa art-specifika faktorer hos dessa grund- och grundor som specifikt förstärkt gris-DNA i kohorten av apa/humant genomiskt eller i kohorten av musgenomiskt DNA (Figur 2B). Slutligen, två art-specificiteter primers bevisades ytterligare att särskilt förstärka gris DNA i gris-till-apa artär patch och / eller gris-till-mus cell transplantation modeller, respektive (Figur 2C).
Figur 1: Genidentitet mellan gris (sus scrofa, ssc) och human (homo sapiens, har) eller apa (Macaca fascicularis, mfa). Gensekvenserna från tre olika arter jämfördes genom BLAST-analys. BLAST-sekvensanalys använde genomisk anteckningsinformation (mRNA-sekvensen) från de tre arter som hämtats från NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). MRNA-sekvenserna av mänskliga, apa och grisgener var 139116, 65927 och 71498, respektive22. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Vanlig PCR validerar specificitet hos porcinspecifika grund- och primrar. (A De grisgenomiska DNA-fragmenten förstärktes av primers 1-19. (B) Det genomiska DNA-fragmentet för människa/apa/möss kunde inte förstärkas av vissa primers (primer #4 och #11). Stjärnorna (*) anger inga förstärkningar i humant/apagenomiskt DNA. Pundstecknet (#) indikerar ingen förstärkning i musgenomiskt DNA. (C) De två art-specificiteterna primers (primer #4 och #11) bevisades ytterligare att särskilt förstärka gris DNA i gris-till-apan artär patch och/ eller gris-till-mus cell transplantation modeller,respektive 22. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Förfarandet för qPCR-reaktionen22. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Upprättande av standardkurvan för absolut kvantifiering. Förstärkningsritningarna, ritplan för smältkurvan och standardkurvavyerna av (A) primer #4 och (B) primer #11 från qPCR-maskinen (se Tabell of Materials) ställs ut. En bra standard (R-värde nära 1, förstärkningseffektivitet är inom 100%±5%) skulle kunna användas i upp till ett halvt år22. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Tabell 1. Vänligen klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvantifierande svin cirkulerande DNA representerar en genomförbar metod för att övervaka immun avstötning av xenotransplantation. Gadi et al.24 fann att givarhärledd cirkulerande DNA -halt (ddcfDNA) innehåll i blodet hos patienter med akut avstötning var signifikant högre än för patienter utan avstötning. Dessa studier tyder på att ddcfDNA kan vara en vanlig biomarkör för övervakning av organ moderplantor skador. Under de senaste åren har qPCR alltmer tillämpats på analys av nukleinsyror på grund av dess enkla drift, hög grad av automatisering, hög känslighet, god specificitet, och låg kostnad.
I denna studie, svin specifika primers utformades baserat på resultaten av bioinformatik analys. Deras specificitet kontrollerades av vanlig PCR. CPSDNA av blodproven på artärplåstermodellerna för gris till apa och modellerna för celltransplantation från gris till råtta kunde kvantifieras exakt av qPCR med artspecifika primers. De största fördelarna med tillvägagångssättet är följande. För det första, baserat på de mycket specifika primers, denna metod för att kvantifiera DNA är mycket känslig och specifik. Dessutom är protokollet för tillvägagångssättet mycket enkel att utföra, som bestod av design av specifika primers, isolering av DNA, och qPCR analys i en arbetsdag, vilket är tidsavföring. Det är en icke-invasiv metod som utgår från en liten volym av serum eller plasmamaterial. Under tiden har vi visat att denna metod är mycket reproducerbara22. I motsats till sekvensering med hög genomströmning och flygmasspektrometri är denna metod låg kostnad.
Övervakning immun avstötning genom kvantifiering av cirkulerande gris-specifika DNA i blodet av gris-till-apa artär patch modeller och gris-till-mus cell transplantation modeller med hjälp av qPCR har lagt grunden för den grundläggande forskningen och den kliniska tillämpningen av porcine-human xenotransplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna rapporterar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från National Key R&D Program of China (2017YFC1103704), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCYJ20170817172116272), Special Funds for the Construction of High Level Hospitals in Guangd segen (2019), Sanming Project of Medicine i Shenzhen (SZSM201412020), Fonden för medicinsk disciplinkonstruktion på hög nivå i Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Biowest, Barcelona, Spain | 111860 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | R3136S | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | MCT-150-C | |
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | PCR-02-C | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province, China | 8~10 weeks | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA | Micro 21R | |
| 2-Log DNA Ladder | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | N3200S | 0.1–10.0 kb |
| Marker I | Tiangen, Beijing, China | MD101-02 | 0.1–0.6 kb |
| DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns) | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | DNACOL-01 | |
| DNA loading buffer | Solarbio, Beijing, China | D1010 | |
| E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | D6942 | |
| D6943 | |||
| EcoR I | Takara Bio, Shiga, Japan | 1040S | |
| Female Bama mini pigs | BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China | 2~4 months | |
| Genomic DNA Extraction Kit ? | Tiangen, Beijing, China | DP304-02 | |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | Toyobo, Osaka, Japan | QPK-201 | |
| Gel Doc XR | Bio-Rad, Hercules, USA | ||
| Male cynomolgus monkeys | Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China | 8 years | |
| Nucleic acid dye(Gelred) | Biotium, Fremont, USA | 42003 | |
| polymerase(Premix Taq) | Takara Bio, Shiga, Japan | RR901A | |
| pMD19-T plasmid | Takara Bio, Shiga, Japan | D102A | |
| qPCR machine | Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA | ||
| Serum/Circulating DNA Extraction Kit | Tiangen, Beijing, China | DP339 | |
| TAE | sangon Biotech, Shanghai, China | B548101 |
References
- Buchman, T.
- Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. Organ donation after circulatory death: current status and future potential. Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).
- Lopez-Fraga, M., et al. A needed Convention against trafficking in human organs. Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).
- Sykes, M., Sachs, D. Transplanting organs from pigs to humans. Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).
- Reardon, S. New life for pig-to-human transplants. Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).
- Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation. BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).
- Chung, H., et al. CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation. Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).
- Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation. Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).
- Agbor-Enoh, S., et al. Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).
- Vito Dabbs, D., et al. Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation. Heart & Lung. 33 (6), 372-380 (2004).
- Miller, C. A., et al. Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection. Heart. 99 (7), 445-453 (2013).
- Mandel, P., Metais, P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l'homme. Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).
- Okkonen, M., et al. Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation. Critical Care. 15 (4), 196 (2011).
- Wagner, J. Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics. Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
- Mohiuddin, M. M., et al. Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft. Nature Communications. 7, 11138 (2016).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).
- Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).
- De Vlaminck, I., et al. Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).
- Zhou, M., et al. Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection. Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).
- Huo, Q., et al. Circulating mi RNA or circulating DNA —Potential biomarkers for organ transplant rejection. Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).
- Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection. Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).
