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Biology

Sammlung von Skelettmuskelbiopsien aus dem Superior-Fach des menschlichen Musculus Tibialis Anterior für mechanische Bewertung

Published: September 27, 2020 doi: 10.3791/61598
Automatic Translation
1,4, 1,2, 3
1Faculty of Sport Science, Human Movement Science, Ruhr University Bochum, 2School of Human Movement and Nutrition Sciences, The University of Queensland, 3Faculty of Sport Science, Sports Medicine and Sports Nutrition, Ruhr University Bochum, 4Institute of Physiology II, University of Muenster

Summary

Dieser technische Bericht beschreibt eine Variation der modifizierten Bergström-Technik für die Biopsie des Musculus tibialis anterior, die Faserschäden begrenzt.

Abstract

Die mechanischen Eigenschaften der Kontraktion von Skelettfasern sind entscheidende Indikatoren für die allgemeine Muskelgesundheit, Funktion und Leistung. Menschliche Skelettmuskelbiopsien werden oft für diese Bemühungen gesammelt. Es liegen jedoch relativ wenige technische Beschreibungen von Biopsieverfahren außerhalb des häufig verwendeten Musculus vastus lateralis vor. Obwohl die Biopsie-Techniken oft an die Eigenschaften der einzelnen untersuchten Muskeln angepasst werden, teilen nur wenige technische Berichte diese Veränderungen an die größere Gemeinschaft. So wird Muskelgewebe von menschlichen Teilnehmern oft verschwendet, wenn der Bediener das Rad neu erfindet. Die Erweiterung des verfügbaren Materials auf Biopsien aus einer Vielzahl von Muskeln kann den Vorfall von fehlgeschlagenen Biopsien reduzieren. Dieser technische Bericht beschreibt eine Variation der modifizierten Bergström-Technik auf dem Musculus tibialis vorder, die Faserschäden begrenzt und Faserlängen bereitstellt, die für eine mechanische Auswertung geeignet sind. Die Operation ist ein ambulanter Eingriff, der in einer Stunde abgeschlossen werden kann. Die Erholungsphase für dieses Verfahren ist sofort für leichte Aktivität (d.h. Gehen), bis zu drei Tage für die Wiederaufnahme der normalen körperlichen Aktivität, und etwa eine Woche für die Wundversorgung. Das extrahierte Gewebe kann für mechanische Kraftexperimente verwendet werden und hier stellen wir repräsentative Aktivierungsdaten vor. Dieses Protokoll eignet sich für die meisten Sammelzwecke, möglicherweise an andere Skelettmuskeln anpassbar und kann durch Änderungen an der Sammelnadel verbessert werden.

Introduction

Die Untersuchung der menschlichen Muskelphysiologie für klinische oder Forschungszwecke erfordert oft Muskelbiopsien. Eine große Herausforderung in der menschlichen Muskelphysiologie und Biomechanik besteht beispielsweise darin, die verschiedenen Anpassungen der Muskelleistung an das Training zu unterscheiden und zu verstehen. Leistungsanpassungen umfassen nicht nur strukturelle Anpassungen (z. B. Veränderungen der kontraktilen Proteine, Muskelarchitektur), sondern auch neuronale Anpassungen1, die sehr schwer, wenn nicht gar unmöglich sind, getrennt zu beurteilen, wenn sie intakte menschliche Muskeln in situ testen. Faser-Level-Experimente entfernen diese höherwertigen Komponenten und ermöglichen eine direktere Bewertung der Muskelkontraktion und können über Biopsietechniken gesammelt werden. Muskelbiopsien wurden seit mindestens 1868gesammelt 2. Heute ist die vorherrschende Technik, Um Muskelbiopsien zu sammeln, die modifizierte Bergström-Technik3,4,5, obwohl andere Techniken verfügbar sind, einschließlich der Verwendung eines Weil-Blakesley-Conchotoms6 oder der sogenannten Feinnadel7,8. Alle diese Techniken verwenden spezielle nadelähnliche Instrumente, die entworfen wurden, um in den Muskel zu gelangen und ein Stück Gewebe zu schneiden. Insbesondere verwendet die modifizierte Bergström-Technik eine große modifizierte Nadel (hier 5 mm Nadelgröße; Abbildung 1) die ein Fenster in der Nähe der Nadelspitze und einen kleineren internen Trokar hat, der sich nach oben und unten bewegt und den Muskel beim Passieren des Nadelfensters schneidet. Innerhalb dieses heiligen Trokars befindet sich ein Ramrod, der sich den Schaft des Trokars auf und ab bewegt und die Biopsie in Richtung Nadelfenster schiebt. Um den Muskel in das Nadelfenster zu ziehen, wird ein Saugschlauch befestigt, der Luft aus der Nadel saugt und den Muskel über Unterdruck in das Nadelfenster zieht.

Muskelbiopsien werden oft erworben, um Veränderungen im Proteingehalt, genexpression oder Morphologie, die durch Krankheit oder in einer Reaktion auf ein Übungsprogrammverursachtwerden, zu untersuchen 1,9,10,11. Ein weiterer kritischer Einsatz für Muskelbiopsien sind mechanische Experimente wie die Messung von Faserkontraktilenkraft, Muskelfasersteifigkeit und geschichtsabhängigen Muskeleigenschaften12,13,14,15,16. Die Einzelfaser- oder Faserbündelmechanik wird durch Anbringen von Fasern zwischen einem Längenmotor und einem Kraftwandler auf speziellen Bohrständen gemessen, die die Faserlänge steuern und gleichzeitig die Kraft messen. Durch permeabilisierende (z.B. Enthäutung) von Fasern wird die Sarcolemma-Membran für Chemikalien in der Badlösung durchlässig, was eine Aktivierungskontrolle durch unterschiedliche Kalziumkonzentration ermöglicht. Darüber hinaus kann die Wirkung kontraktiler Eigenschaften auf Chemikalien/Pharmazeutika/andere Proteine leicht bewertet werden, indem das betreffende Reagenz der Badlösung hinzugefügt wird. Während diese Technik in anderen Tiermodellen sehr stark verwendet wird, führten deutlich weniger Studien mechanische Tests an gehäuteten Fasern aus menschlichen Muskelbiopsien17,18,19durch. Ein Grund dafür ist, dass die Biopsiewerkzeuge und -protokolle so konzipiert sind, dass sie so viel Muskelgewebe wie möglich entfernen, wobei die Höhe der strukturellen Schäden, die während der Gewebeextraktion erlitten werden, geringer ist. In der Tat, ein aktuelles Biopsie-Protokoll schlägt vor, die Biopsienadel in den Muskel zu treiben und 2-4 Stücke von Muskel3zu sammeln. Der Prozess selbst verursacht wenig Schaden an der DNA oder dem Proteinmaterial, zerstört aber oft Faser- und sarkomische Strukturen so, dass die Aktivierung von Muskelfasern instabil oder unmöglich wird. Darüber hinaus ist die relative Länge der Fasern innerhalb der Biopsie in der Regel kurz (<2 mm) und nicht leicht für mechanische Tests zu handhaben. Für mechanische Prüfungen sind ideale Fasern lang (3-5 mm) und nicht strukturell beschädigt.

Fortschrittlichere Gewebeextraktionstechniken können verwendet werden, um Faserschäden zu begrenzen. So nutzte eine Gruppe20 die zuvor geplanten "offenen Operationen" von Unterarmen (z.B. Knochenbruchreparatur), bei denen die Muskeln vollständig exponiert waren und ein Chirurg die Muskelstruktur visualisieren und relativ große und strukturell unbeschädigte Proben von Muskelgewebe (15 mm x 5mm x 5 mm) sorgfältig sezieren konnte. Diese "offene Biopsie"-Technik wird bevorzugt, wenn die Teilnehmer ein zuvor geplantes Verfahren durchlaufen, und schränkt so den Pool potenzieller Teilnehmer ein, insbesondere für gesunde Erwachsene, wo sonst keine Operationen stattfinden würden. So werden viele Zu Forschungszwecken durchgeführte Biopsien als ambulantes Verfahren durchgeführt und die Einschnittstelle wird so klein wie möglich gehalten, um das Infektionsrisiko, Narbenbildung und Heilungszeit zu begrenzen. Daher werden die meisten Biopsien blind gesammelt (d.h. der Bediener kann die Sammelnadel nicht sehen, wenn sie durch die Faszie in den Muskel gelangt). Dies impliziert, dass die Qualität der Biopsie fast ausschließlich auf den Fähigkeiten und Erfahrungen des Bedieners basiert. Jeder Muskel hat seine eigenen Schwierigkeiten beim Sammeln von Gewebe, wie Risiken, Nerven und Blutgefäße zu verletzen, Auswahl einer idealen Sammlungstiefe und -position, und die Entscheidung über eine geeignete Körperposition, um den Muskel so locker wie möglich zu halten. Leider sind die meisten muskelspezifischen Fähigkeiten nicht aufgeschrieben und so muss jeder Arzt "das Rad neu erfinden", wenn er Biopsien an Muskeln durchführt, die für sie neu sind. Dieser Mangel an Erfahrung führt in der Regel zu mehreren Sammlungen mit geringer Qualität, bis der Arzt die besten Praktiken für Biopsien auf diesem Muskel identifiziert. Anfänger lernen das Können oft durch Gespräche mit ihren erfahreneren Kollegen, aber es gibt relativ wenige informative und begutachtete Texte zu diesem Thema, insbesondere für Muskeln, die traditionell nicht für die Biopsiesammlung verwendet werden. Betrachtet man die oben genannten Informationen, zusammen mit der Schwierigkeit, menschliche Freiwillige für Biopsien zu rekrutieren, ist es klar, dass mehr Lehrinformationen benötigt werden, die die Erfolgschancen für jeden Teilnehmer maximieren.

So war der Zweck dieses Papiers, eine Muskelbiopsie-Technik zu präsentieren, die Protokolle für die erfolgreiche Sammlung von Muskelbiopsien mit langen, unbeschädigten Faserfragmenten für mechanische Tests bereitstellt. Menschliche Muskelbiopsien werden in der Regel durchgeführt, und der Großteil des Biopsie-Trainingsmaterials ist auf, der Musculus vastus lateralis. Seine relativ große Muskelgröße und oberflächliche Lage relativ zur Haut ermöglicht die Sammlung von angemessenem Muskelgewebe, während die Minimierung von Patientenbeschwerden und körperlichen Trauma1,21. Allerdings gibt es einige Einschränkungen bei der Verwendung der vastus lateralis für Längsinal-Training-Studien. Beispielsweise müssen die Teilnehmer während experimenteller Protokolle, die ein Schulungsprogramm enthalten, für einen Zeitraum von oft 2-6 Monaten auf eine zusätzliche Ausbildung außerhalb der Studie verzichten. Für Sportler ist dies oft nicht möglich, da der vastus lateralis in der Regel bei typischen Übungen (z.B. Kniebeugen, Sprünge) trainiert wird oder in der Regel für den Sport (z.B. Laufen, Radfahren) verwendet wird. Diese getrennten Trainingserfahrungen abseits des Studienziels können Muskelanpassungen bewirken, die Muskelmechanik, Architektur und Physiologie so verändern, dass es schwierig oder unmöglich ist, die wahre Wirkung des experimentellen Protokolls der Studie auf die Muskeleigenschaften zu kennen. Für diese Art von Studien wäre es ideal, einen Zielmuskel auszuwählen, der oft nicht im Mittelpunkt der Ausbildung von Regimentern steht. Der musculus tibialis anterior (TA) ist ein idealer Zielmuskel, der die oben genannten Anforderungen erfüllt. Darüber hinaus können Trainingsinterventionen mit kontrollierbaren Ansätzen, wie z.B. mit einem Dynamometer, auf die TA ausgerichtet werden. Es gibt fast kein Trainingsmaterial zu einer TA-Muskelbiopsie. Daher haben wir ein modifiziertes Protokoll entwickelt, um relativ unbeschädigte Muskelbiopsien aus der TA zu sammeln.

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Protocol

HINWEIS: Im Folgenden skizzieren wir ein Protokoll zur Ernte mechanisch unbeschädigter Fasern aus der TA von Freiwilligen, die in einer separaten laufenden Studie eingeschrieben waren. Dieses Protokoll ähnelt dem von Shanely et al.3, die die modifizierte Bergström-Technik in vastus lateralis beschrieben haben. Die hier vorgestellten Informationen wurden von unserer Forschungsgruppe verfeinert, sind aber möglicherweise nicht für alle Laborgruppen oder Organisationseinrichtungen ideal. Wir geben nur Richtlinien und legen dringend nahe, dass Laboratorien, die neu in der Biopsiesammlung sind, erfahrene Laborgruppen konsultieren, bevor sie Versuche am Menschen versuchen.

Alle in diesem Beitrag durchgeführten Studien wurden von der Ethikkommission der Fakultät für Sportwissenschaft der Ruhr-Universität Bochum genehmigt. Die Teilnehmer erteilten vor der Teilnahme an der Studie ihre kostenlose schriftliche Einwilligung in Kenntnis der Sachlage.

1. Experimentelle Zubereitung

  1. Bewerten Sie die Ausschlusskriterien, während Sie während der Konsultation des Teilnehmers die detaillierte Krankengeschichte des Teilnehmers berücksichtigen (siehe unten).
    1. Teilnehmer ausschließen, wenn sie in den 6 Wochen vor der Biopsie eine Verletzung des Zielmuskels erlitten haben. Stellen Sie sicher, dass die Teilnehmer im Allgemeinen gesund sind, sich keiner Muskel- oder Gerinnungsstörungen bewusst sind und derzeit keine Medikamente einnehmen, die eine Blutverdünnung verursachen (z. B. Aspirin).
      HINWEIS: Hier haben wir Teilnehmer ausgewählt, die mäßig aktiv waren, und sie angewiesen, mindestens 3 Tage vor der Biopsie auf intensive oder ungewohnte Beinübungen zu verzichten. Bei anderen Forschungsfragen können sich diese Kriterien jedoch ändern.
  2. Befolgen Sie Sterilisationund aseptische Techniken, wie sie nach deutschem Recht und gängiger Praxis geregelt und vom Teamarzt22,23überwacht werden. Dieses Verfahren kann oft als "Bett"-Verfahren oder in einer ambulanten chirurgischen Suite durchgeführt werden. Wenden Sie sich an die örtliche Regulierungsstelle, um Eine Orientierungshilfe zu erhalten.
  3. Komponieren Sie das Biopsie-Team. Wir schlagen vor, dass das Biopsie-Team 4 Personen umfasst. Ein Arzt (oder ausgebildeter Mensch in der Biopsiesammlung), ein medizinischer Assistent, der mit dem Arzt arbeitet, ein Assistent, der den Teilnehmer überwacht und mit ihm interagiert, und ein Assistent, der die Muskelbiopsie unmittelbar nach der Extraktion behandelt. Mit diesen Zahlen kann eine schnelle Patientenversorgung durchgeführt werden, wenn während des Eingriffs ein medizinischer Notfall eintritt. Wenn sie sich mit dem Eingriff wohlfühlen, könnte das Team nur aus zwei Personen bestehen: dem Arzt und der medizinischen Assistentin, die gemeinsam die Patientenversorgung und die Gewebeverarbeitung übernehmen würden.
  4. Lassen Sie den Teilnehmer mit dem Projektleiter/Arzt zusammentreffen, um das Benutzereinverständnisformular zu überprüfen, zu diskutieren und zu unterschreiben. Nehmen Sie eine detaillierte Krankengeschichte (Allergien, Verletzungen oder Operationen an der unteren Extremität und TA) und schließen Sie den Teilnehmer aus, wenn sie eines der Ausschlusskriterien erfüllen. Besprechen Sie gründlich die Erholungs- und Schnitthygiene.
    1. Erklären Sie dem Teilnehmer, dass er so laut wird, aber unmittelbar nach dem Eingriff herumlaufen kann; Zu Fuß Hänge oder Treppen ist oft unbequem für die ersten 48 Stunden, mit voller Aktivität in der Regel nach 72 Stunden zurückkehren. Erklären Sie schließlich, dass die Einschnittstelle zur Begrenzung von Infektionen und mechanischen Abschürfungen mindestens 1 Woche lang bandagiert und sauber gehalten werden sollte.

2. Visualisieren Sie den vorderen Tibialis mit B-Modus Ultraschall

  1. Weisen Sie den Teilnehmer an, sich in einer bequemen Supine-Position zu legen und die Beinmuskulatur so weit wie möglich zu entspannen. Verwenden Sie ein maßgeschneidertes Gerät (siehe unten) oder lassen Sie den Assistenten den Knöchel in einer leicht dorsiflexierten Position halten, um das zu imitieren, was während der Biopsie getan wird.
    HINWEIS: Es ist wichtig, dass der Teilnehmer eine entspannte TA hat, so dass er die Muskeleigenschaften während des Eingriffs repliziert. Bitten Sie den Teilnehmer während der Prüfung, sich zu ziehen und den Muskel zu entspannen, damit die Veränderungen in der Muskelarchitektur festgestellt werden können.
  2. Verwenden Sie eine Ultraschallsonde, um die oberflächlichen und tiefen Fächer der TA zu visualisieren, um die Muskelarchitektur zu vermessen und über die Einfügetiefe und den Nadelwinkel des Angriffs zu entscheiden (Abbildung 2A-B). Geben Sie Markierungen auf der Haut an.
    1. Besondere Aufmerksamkeit gilt der Auswahl eines Zielbereichs, der große Venen, Arterien oder Nerven vermeidet.
    2. Bewerten Sie den Querschnitt des Muskels, mit dem Ziel, die zentrale Aponeurose innerhalb des TA-Muskelbauchs zu identifizieren (ca. 1/3 des Beins, distal bis zum Knie und 2 cm seitlich des Tibialkamms) (Abbildung 2B). Zeichnen Sie die Lage und Tiefe der zentralen Aponeurose (in der Regel 1,5-3 cm) auf, so dass darauf geachtet werden kann, dass die Sammelnadel (Bergström) nicht an diesem Punkt vorbeifährt.
    3. Positionieren Sie die Ultraschallsonde in der proximal-distalen Ausrichtung über der Zielposition und visualisieren Sie die Faszikel-Pennation und Muskeldicke (Abbildung 2A). Verwenden Sie diese Informationen, um die Sammelnadel erfolgreich (blind) in den Muskelbauch zu treiben. Speichern Sie Bilder der Zielstelle in beiden Ebenen für zukünftige Referenzen während des chirurgischen Eingriffs.
  3. Erstellen Sie mit diesen Informationen einen Plan für die Nadelbewegung in Richtung Zielbereich.
    1. Planen Sie, den Schnitt 1-3 cm distal aus dem Zielbiopsiebereich zu machen. Nachdem die Nadel in den Muskel übergeben wurde, drehen Sie die Nadel in einen Winkel von 45 % auf die Haut entlang der langen Achse der Gliedmaße und fahren Sie dann proximal in Richtung des Biopsiebereichs. Diese Strategie begrenzt die Wahrscheinlichkeit, die Nadel in die zentrale Aponeurose zu treiben, wenn die Nadel zu stark gedrückt wird. Darüber hinaus kann die Nadel je nach Handkraft des Nadelbedieners distal oder proximal angetrieben werden.

3. Biopsieverfahren

  1. Weisen Sie den Teilnehmer an, die Suppe auf den Operationstisch zu legen und die Beinmuskulatur zu entspannen. Stellen Sie sicher, dass die Sichtlinie des Teilnehmers zur Biopsiestelle durch einen Vorhang blockiert ist.
    1. Entfernen Sie passive Spannung aus dem Muskelbauch, indem Sie die Gliedmaße des Teilnehmers in ein Gerät legen, das den Knöchel in eine leicht dorsiflexierte Position fixiert (0-5° von neutral; Abbildung 3). Fragen Sie den Patienten, ob er seinen Muskel noch entspannen kann, da zu viel Dorsiflexion es möglicherweise schwierig machen kann, sich zu entspannen.
      HINWEIS: Wir haben festgestellt, dass das Sammeln von Biopsien von einem dorsiflexierten Fuß, nicht mehr als 5° neutral (d. h. die Sohle des Fußes senkrecht zum Schaft) konsistentere und größere Biopsien erzeugt als mehr pflanzgebeugte Knöchelwinkel. Das Gerät, das den Knöchel dorsiflexed hält, ist ein maßgeschneidertes Gerät. Es können jedoch belieum (billige) Geräte hergestellt werden, die immer noch das gewünschte Ergebnis erzielen.
  2. Rasieren, reinigen und desinfizieren Sie den ausgewählten Schnittbereich, wie nach Densit-Praktiken24.
    HINWEIS: Der "saubere" Bereich des Teilnehmers beträgt ca. 20 cm proximal-distal und 10 cm medial-lateral der vorgeschlagenen Einschnittstelle. Konsultieren Sie jedoch immer die und/oder die nationalen Vorschriften (falls vorhanden) der Institution zu diesem Thema. Das Desinfektionsprotokoll umfasst das Reinigen der Haut und die anschließende Desinfektion viermal mit dem liberalen Einsatz von medizinischem Desinfektionsspray. Wenn der Teilnehmer aus irgendeinem Grund den Tisch verlässt, muss das Desinfektionsprotokoll neu gestartet werden.
  3. Verabreichen Sie eine suprafasziale Injektion von 1,5 ccm von 2% Xylocitin mit Epinephrin an der Biopsiestelle, die als Lokalanästhetikum und Vasokonstriktor fungiert. Warten Sie auf die zugeteilte Affektzeit von 20-30 min.
    HINWEIS: Diese Medikamente sind myotoxisch und dürfen daher niemals in den Muskel injiziert werden, nur das Unterhautgewebe. Als Reaktion auf die Vasokonstriktion kann der Bereich der Injektionsstelle weiß (bei helleren Hauttönen) oder grau (dunklere Hauttöne) werden.
  4. Bestätigen Sie die Arzneimittelwirkung mit Hautpech und sanften Pokes mit einem sterilen Skalpell.
  5. Machen Sie an der zuvor markierten Biopsiestelle einen 1 cm proximal-distalen Schnitt mit einem sterilen Skalpell, das die Haut und die Faszien durchschneidet und den Muskelbauch freilegt. Achten Sie darauf, die Faszien vollständig zu schneiden, da die Nadel stumpf ist und nicht durch die Faszien geht.
  6. Schieben Sie die Biopsienadel 0,5-1,0 cm mit einer hautsenkrechten Ausrichtung in den Muskel (Abbildung 2C, 2E).
    HINWEIS: Der Bediener spürt eine Änderung der Spannung, die erforderlich ist, um die Nadel durch die verschiedenen Gewebetypen zu treiben. Das Fettgewebe ist einfach, die Faszie ist die härteste, und der Muskel ist dazwischen (kann aber variabel sein, basierend auf dem Teilnehmer).
  7. Richten Sie die Nadel entlang der langen Achse des Beins an einer Position von 45° Winkel auf die Haut aus(Abbildung 2D, 2F). Drücken Sie die Nadel noch 1-2 cm in den Muskel, bis sich die Nadelspitze an der Zielposition innerhalb des Muskels befindet.
    HINWEIS: Der Arzt sollte die gespeicherten Ultraschallbilder nutzen, um individuelle Variationen der Muskeldimensionen zu berücksichtigen. Da der Schnitt nur groß genug ist, um die Nadel einzufügen, treibt der Arzt die Nadel blind durch die Haut. Es gibt ein "Gefühl", das der Biopsie-Betreiber mit Erfahrung gewinnt. Ein Anfänger muss die Fähigkeiten von einem ausgebildeten Biopsie-Operator erlernen (mehr dazu in der Diskussion).
  8. Befestigen Sie die 100 ml Spritze und den Schlauch an der Biopsienadel (Abbildung 1G). Tragen Sie die Bergström-Nadel auf, indem Sie den Kolben der Spritze um ca. 15-20 ml ziehen, um einen Unterdruck in der Nadel zu erzeugen und das Muskelgewebe in das Nadelfenster zu saugen. Dann verbrauchen Sie den Muskel durch einen schnellen Druck(en) des Trokars über das Nadelfenster.
    HINWEIS: Vor und während der Absaugung ist es manchmal hilfreich, lichtdurchdrungen eingliederten Druck auf die Haut direkt über dem Nadelfenster zu setzen, um den Muskel in die Nadel zu schieben.
  9. Entfernen Sie vorsichtig die Nadel vom Bein und drehen Sie sich langsam. Es sollte nur Lichtwiderstand beim Extrahieren der Nadel geben. Wenn es mehr Widerstand gibt, kann dies auf einen partiellen Biopsieschnitt hinweisen. Dies geschieht, die Notwendigkeit an den Zielspeicherort zurückgeben und die Gewebesammlung erneut versuchen.
  10. Schieben Sie das ausgeschnittene Gewebe mit dem inneren Ramrod in Richtung Nadelfenster.
  11. Entfernen Sie die Probe vorsichtig von der Nadel.
    HINWEIS: Das Untertauchen der Nadel in die Sammellösung (siehe Faservorbereitungsabschnitt) löst häufig die Biopsie von der Nadel. Zusätzlich kann die Spritze verwendet werden, um Luft durch die Nadel zu treiben und die Probe herauszuschieben. Diese Techniken beseitigen die Notwendigkeit, die Biopsie physisch mit einer Pinzette zu berühren und reduziert die Möglichkeit von Schäden. Wenn Werkzeuge, Hände (gehandicapt oder nicht) oder nicht-sterile Lösungen mit der Nadel in Berührung kommen, kann die Nadel während des Eingriffs nicht weiterverwendet werden. Wenn also eine zweite sofortige Biopsie erforderlich ist, muss eine neue sterile Nadel verwendet werden. Dies tritt häufig auf, so ist es eine bewährte Methode, mehrere sterile Nadeln in Reserve zu halten.
  12. Identifizieren Sie das Gewebe als Muskel und nicht Fett- oder Bindegewebe. Muskelgewebe ist leicht aus anderen Geweben wegen seiner tiefroten Farbe zu identifizieren (Abbildung 4A). Manchmal ist das gesammelte Gewebe nicht Muskel, sondern Fett oder Bindegewebe.
    1. Wenn eine ausreichende Menge an Muskelgewebe gesammelt wird, setzen Sie das Protokoll fort. Wenn es nicht genug Muskeln gibt, versuchen Sie die Biopsie erneut.
    2. Wenn eine zweite Biopsie benötigt wird, überwachen Sie den Teilnehmer sorgfältig, da ein zweiter Nadelstich den Teilnehmer gelegentlich unangenehmer macht als der erste.
  13. Waschen Sie Muskelproben sofort in einer Sammellösung und bereiten Sie sich auf einzelne Faserexperimente vor (siehe Handhabung und Lagerung der Muskelbiopsie).
    1. Lassen Sie einen erfahrenen Assistenten die Probenqualität überprüfen (siehe unten) und bewerten Sie die Notwendigkeit, eine zweite Biopsie durchzuführen. Ein separater Assistent nimmt die Biopsie zur Verarbeitung, während der Rest des Teams mit dem Teilnehmer weitermacht.
  14. Schließen Sie die Einschnittstelle.
    1. Schließen Sie die Schnittwunde mit sterilem Leukostreifenband. Verwenden Sie ein oder mehrere Stücke, um die Kanten der Einschnittstelle zu verbinden, indem Sie sie senkrecht zur langen Achse des Einschnitts legen, und legen Sie dann weitere Streifen in einem sternförmigen Muster, um vor multidirektionaler Belastung zu schützen.
      HINWEIS: Die richtige Handhabung dieses Schritts reduziert die Narbenbildung. Das Verheilen der Wunde kann getan werden, ist aber nicht notwendig. Weitere Optionen sind Wundkleber.
    2. Sterile Wundverbände (z.B. Leucomed T plus) zum Schutz vor Infektionen über die Einschnittstelle legen.
    3. Wickeln Sie das Bein mit zusammenhängenden elastischen Bandagen (z. B. Unihaft), um die anfängliche Blutung zu begrenzen und vor äußeren mechanischen Stößen zu schützen.
    4. Wickeln Sie das Bein mit acrylastischen Kompressionsverbänden, um Blutungen zu verhindern und die tieferen Bandagen vor losem oder zerstörtem Schutz zu schützen.

4. Postbiopsie-Pflege

  1. Bitten Sie den Teilnehmer, unmittelbar nach dem Eingriff herumzulaufen. Es wird lokalisierte Schmerzen geben. Weisen Sie den Teilnehmer an, so normal wie möglich zu gehen.
  2. Weisen Sie den Teilnehmer an, die Bandagen nicht zu entfernen oder Wasser die Bandagen einweichen zu lassen. Sie müssen mindestens für: ein Tag für den acrylastischen Verband, drei Tage für den kohäsiven elastischen Verband und sieben Tage für den Wundverband gehalten werden. Informieren Sie den Teilnehmer, dass er bei Bedarf wieder bandagiert werden kann.
    1. Passen Sie die Postbiopsiepflege eines Teilnehmers an die Bedürfnisse des Einzelnen an. Lassen Sie einen ausgebildeten Assistenten oder Arzt den Teilnehmer bewerten und einen geeigneten Pflegeplan nach der Biopsie erstellen. Für dieses Verfahren schlagen wir vor, dass alle weiteren in vivo neuromuskulären Tests der TA durch mindestens eine Woche von der Biopsie getrennt sind.

5. Muskelbiopsie Handhabung und Lagerung

  1. Nach der Gewebeextraktion das Gewebe sofort in eine 5 ml-Durchstechflasche mit Rigor-Sammlungslösung (in mM: Tris (50), KCl (2), NaCl (100), MgCl2 (2), EGTA (1), Protease-Hemmer-Tablette (1), pH 7,0) und leicht schütteln für 4-6 min, um Blut auszuwaschen.
  2. Die Rigor-Lösung gegen frische Strenge tauschen, leicht schütteln für 4-6 min, und dann bei 4 °C für 4-6 h lagern, um den Austausch von Protease-Hemmer-Speicherlösung und Blut zu ermöglichen.
  3. Austausch Rigor Lösung für Nacht Strenge (in mM: Tris (50), KCl (2), NaCl (100), MgCl2 (2), EGTA (1), Protease-Hemmer Tablette (1), 50:50 Glycerin, pH 7,0), und lagern bei 4 °C für 12-18 h.
  4. Über Nacht strenge für 50:50 Sammelrig: Glycerin und gelagert bei -20 °C für bis zu 3 Monate oder ein Jahr in einem -80 °C Gefrierschrank.
    HINWEIS: Dieser Prozess durchdringt die Fasermembran, die eine manuelle Zugabe von Kalzium in und aus der Zelle ermöglicht. Dieser Prozess braucht Zeit und kann zwischen verschiedenen Muskeln und Arten unterschiedlich sein.

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Representative Results

Die gesamte Zeitverpflichtung für einen Teilnehmer betrug etwa eine Stunde (10 min Beratung, 10 min Ultraschall, 20 min Chirurgische Vorbereitung und Anästhesie, 10 min Operation und 10 min Erholung). Oft aktivierten die Teilnehmer unbewusst ihre TA und benötigten konsistente Erinnerungen, um den Muskel so entspannt wie möglich zu halten. Wenn sich die Biopsienadel im Muskel befand, berichteten die Teilnehmer in der Regel von einem einzigartigen "Druck"-Gefühl im Bereich um die Biopsienadel, mit gelegentlichen Perioden von moderaten bis intensiven Beschwerden. Einmal verkrampften die Zehen eines Teilnehmers während des Eingriffs leicht, hielten aber sofort an, nachdem die Nadel entfernt worden war. Biopsie-Größen waren in der Regel 50-100 mg (nasse Masse). Die Reaktionen der Teilnehmer auf das Verfahren waren oft unvorhersehbar. Manchmal erwartete der Teilnehmer, während des Eingriffs nicht betroffen zu sein, zeigte dann aber Anzeichen von Ohnmacht, während andere nervös, aber während des Eingriffs völlig unbeeindruckt waren. Daher fanden wir es als gute Praxis, den Teilnehmer mit einem Gespräch beschäftigt zu halten oder sie ihr Handy benutzen zu lassen, so dass ihre volle Aufmerksamkeit nicht auf das laufende Verfahren gerichtet war. Der Assistent, der mit dem Teilnehmer sprach, überwachte sie auch auf Anzeichen von Not, Schmerzen oder Ohnmacht. Manchmal enthielt eine Biopsie nur Fett- oder Bindegewebe (identifiziert durch eine blassweiße Farbe des Gewebes, Abbildung 4A). In diesen Fällen wurde sofort eine zweite Biopsie durchgeführt (nach Genehmigung durch den Teilnehmer). In der Regel wird eine erfolgreiche Biopsie >80% Muskelgewebe ergeben (Abbildung 4A).

Nach der Op, die meisten Teilnehmer fühlten Sichunge nach dem Eingriff, der 3-5 Tage dauerte. Die Teilnehmer berichteten, dass die TA-Schmerzen ähnlich waren, wie man sie nach einem Wandertag mit steilen Hängen erwarten würde. Es sollte kein mechanischer Druck auf die Einschnittstelle für mindestens 5 Tage ausgeübt werden, oder es könnte wieder geöffnet werden. Die Teilnehmer wurden in der Regel mit einer kleinen Narbe zurückgelassen, aber wir haben keine erhöhten oder anderweitig abnormalen Veränderungen der Haut beobachtet. Auch entwickelten keine Teilnehmer Infektionen.

Die Biopsien wurden 6 Wochen lang in einer Glycerinlösung (1:1 Mischung aus Glycerin: Rigor-Lösung) permeabilisiert (d.h. gehäutet) und am Tag der Experimente für mechanische Tests vorbereitet. Die Glycerinpermeabilisierung von Fasern ermöglicht die Diffusion der Badlösung in die Fasern, was dem Forscher eine Aktivierungskontrolle gibt und auch eine Möglichkeit bietet, den Muskel Pharmazeutika oder anderen Chemikalien zu unterwerfen. Darüber hinaus fungiert Glycerin als Frostschutzmittel, so dass der Muskel bei kalten Temperaturen für die langfristige Lagerung platzen kann, mit begrenzten Schäden. Allerdings ist einige Zeit erforderlich, um das Glycerin in die Proben eindringen zu lassen, und so ist es zunächst sinnvoll, Biopsieproben über Nacht bei 4 °C (idealerweise auf einer Schüttelplatte) zu lagern. Muskeln können nur so lange gespeichert werden, bevor ihre Funktion beeinträchtigt wird. Die allgemeine Anleitung dazu ist, dass die Muskeln ihre Funktion innerhalb der Glycerinlösung für mindestens 3 Monate in einem Gefrierschrank von -20 °C oder ein Jahr in einem Gefrierschrank von -80 °C beibehalten.

Muskelproben wurden unter einem Seziermikroskop visualisiert. Einige Muskelteile waren klein oder beschädigt (Abbildung 4B) und wurden entfernt. Als nächstes wurden Fasergruppen auf strukturelle Schäden (visuell gebrochenes oder zerkleinertes Fasersarcolemma, Abbildung 4C)untersucht. Aus diesen Bündeln wurden kleinere Faserbündel von 3-10 Fasern entfernt und vorsichtig in die Versuchskammer des mechanischen Prüfstandes gelegt (Abbildung 4D). Strukturell nutzbare Faserlängen waren typischerweise 3-5 mm lang. Die Bergström-Nadel hatte ein Sammelfenster von 7 mm, so dass die Biopsie nur maximal 7 mm lange Fasern ergeben konnte. So waren die strukturell verwendbaren Fasern, die wir sammelten, fast so lang wie möglich. In der Regel bereiten wir 5-10 Faserbündel pro 50 mg (gesammeltes) Gewebe vor. Ausführliche Informationen zu diesen Verfahren finden Sie an anderer Stelle14,15,25. Um die Haltbarkeit der Fasern zu demonstrieren, zeigen wir repräsentative Daten eines einfachen mechanischen Protokolls mit glykierten TA-Faserbündeln (Abbildung 5). 40 Faserbündel aus den Biopsien von 10 Teilnehmern wurden in Aktivierungslösung26 (hoch [Ca2+], pCa < 4.2) bei 2,7 m Sarkomelänge für 60 Sekunden aktiviert und die stationäre aktive Spannung wurde mit 100,71 x 11 mN mm-2 (mittelwert - SEM) gemessen.

Figure 1
Abbildung 1: Die Bergström-Nadel. Die in dieser Studie verwendete Bergström-Nadel besteht aus der Nadel selbst (A-F), Saugschlauch (G) und Spritze (F). Die Bergström-Nadel besteht aus einer äußeren Nadel (A), die ein Fenster in der Nähe der Nadelspitze hat, einem kleineren hohlen inneren Trokar (B), der sich nach oben und unten bewegt und den Muskel beim Passieren des Nadelfensters schneidet, und einer Stange (C), die sich nach oben und unten bewegt, um den Muskel von der Nadel zu entfernen. Diese Stücke werden durch eine Scheibe (D) getrennt, die die Nadel luftdicht macht, und ein Abstandsraum (E) zwischen Derstange und Trokar schützt vor Zerkleinerung der Muskelbiopsie. Schließlich wird ein Saugschlauchadapter angebracht. Um den Muskel in das Nadelfenster zu ziehen, wird ein Saugschlauch (G) am Nadeladapter und der Spritze befestigt. Dies saugt die Luft aus der Nadel und zieht den Muskel über Unterdruck in das Nadelfenster, was eine Probenentnahme ermöglicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Ultraschallbildgebung und Nadelplatzierung. Die TA besteht aus oberflächlichen und tiefen Fächern, die durch Aponeurosen definiert sind. Die TA wird mit der Ultraschallsonde in der distal-proximalen (A) und medial-lateralen (B) Perspektive dargestellt, so dass die 3D-Form der TA erkannt werden kann. Ideale Nadeltiefe für die Sammlung ist zwischen den horizontal gestrichelten Linien. Eine Cartoon-Darstellung der Nadeleinfügung ist in den Panels C und D dargestellt. Nach dem Schnitt wird die Nadel zunächst senkrecht zum Muskel positioniert und in den Muskel geschoben, bis sich das Nadelfenster im Muskel befindet (C). Die Nadel wird dann auf einen Winkel von 45° entlang der langen Achse des Beins umgegliedert und weiter in den Muskel geschoben, wobei darauf geachtet wird, dass die Nadel nicht in die tiefe Aponeurose (D)eindringt. Live-Bilder (E, F) während des Verfahrens werden in Bezug auf die Karikatur gegeben (C, D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Platzierung der Teilnehmer. Der Teilnehmer liegt in einer Supine-Position auf dem Operationstisch. Der Kopf kann für Komfort erhöht werden. Der rechte Fuß wird in einem benutzerdefinierten Gerät platziert, das den Fuß leicht dorsiflexiert hält, wodurch Muskelverspannungen reduziert werden. Vor dem Teilnehmer wird ein Vorhang angebracht, so dass er das Verfahren nicht beobachten kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative Bilder von Muskelgewebe. (A) Unmittelbar nach der Biopsie ist die Muskelprobe dunkler als andere Gewebe, einschließlich Fettgewebe und Bindegewebe (im Panel gekennzeichnet). (B) Zerlegung von Proben mit Beschädigten/kurzen (oben) und lebensfähigen (unten) Faserbündeln. (C) Vergrößerung einer lebensfähigen Fasergruppierung zur Inspektion der Oberfläche auf Anzeichen von Beschädigungen. (D) Ein 6-Faser-Bundle wurde von diesem Faserbündel entfernt (an den Enden mit 6-0 Naht für einfache Bewegung gebunden und an der mechanischen Vorrichtung befestigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Repräsentative Kraftausgänge einer Faserbündelvorbereitung. Um die Haltbarkeit der Fasern zu demonstrieren, zeigen wir repräsentative Spannungsdaten eines einfachen mechanischen Protokolls mit glykiertem TA-Faserbündel (3 Fasern). Insgesamt wurden 40 Faserbündel aus den Biopsien von 10 Teilnehmern von der Slack-Länge auf 2,7 m Sarcomere-Länge gestreckt und gehalten, um Stressentspannung zu ermöglichen. Als nächstes wurden Fasern in Aktivierungslösung26 (schattierte Fläche; hoch [Ca2+], pCa < 4.2) bei 2,7 m Sarcomere-Länge für 60 Sekunden aktiviert und eine stationäre aktive Spannung bei 100,71 x 11 mN mm-2 (mittleres SEM) gemessen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

In diesem Bericht haben wir eine Technik zur Biopsie von strukturell unbeschädigtem Muskelgewebe von TA beschrieben. Wir fanden heraus, dass dieses Verfahren einen akzeptablen Gehalt an nutzbaren Muskelfasern (5-10 Faserbündelpräparate pro 50 mg gesammeltes Gewebe) für mechanische Tests liefert. Außerdem hatten wir genug Gewebe für mechanische, genetische und proteomische Folgeexperimente.

Es gibt mehrere Methoden in der Regel für die Sammlung von Muskelbiopsienverwendet 3,4,6,27,28. Die sogenannte offene Biopsie20 produziert fasern von höchster Qualität, weil ein Chirurg den Muskel vollständig freilegt und die Probe seziert. Natürlich ist offene Chirurgie ein ziemlich invasives Verfahren und kein geeignetes Verfahren, um gesunde Teilnehmer, unabhängig von der Forschungsfrage, wegen der potenziellen Risiken im Zusammenhang mit offenen Operationen einzureichen. Die am wenigsten invasive Biopsiemethode ist die Feinnadelbiopsie29,30, die eine relativ kleinere Nadel verwendet, um Gewebe zu sammeln. Die Feinnadelbiopsien reichen aus, um Experimente an den genetischen/chemischen/Proteinkomponenten der Fasern30,31durchzuführen, aber oft ist die Faserqualität sehr schlecht, was mechanische Tests schwierig oder unmöglich macht. Die Bergström-Nadeltechnik ist ein guter Kompromiss zwischen den beiden oben erläuterten Verfahren, da die Operation weniger invasiv ist als die offene Biopsie, aber immer noch Muskelproben sammelt, die größer und (potenziell) strukturell intakter sind als feine Nadelbiopsien. Frühere Berichte über das Bergström-Nadelverfahren3,5 sind große Ressourcen für diejenigen, die die Technik lernen, aber nur Protokolle für den vastus lateralis präsentieren. Unser Bericht zeigt die Technik für die TA, die sich auf die Sammlung hoher Erträge strukturell intakter Fasern für mechanische Tests konzentriert.

Nach unserem Wissen gibt es keine detaillierten Veröffentlichungen über die Sammlung von TA-Biopsien. Dennoch ist es üblich, den Teilnehmer supine zu legen und sie ihr Bein so weit wie möglich zu entspannen. Der entspannte Fuß in dieser Position ist natürlich plantarflexiert, was die TA verlängert und in Spannung versetzt. Wir stellen fest, dass jede Muskelverspannungen es schwieriger macht, Muskeln in die Biopsienadel zu treiben, auch bei Unterdruck, und so sollte Spannung so weit wie möglich minimiert werden. Um dies zu erreichen, bestand die einfache, aber wichtigste Modifikation hier darin, eine maßgeschneiderte Fußplatte zu verwenden, die den Knöchel in einer leicht dorsiflexierten Position (0 - 5° von neutral) hielt, die TA-Slack und verbesserte Sammlung. Ärzte sollten aufpassen, dass sie den Knöchel nicht überdorsiflexen, da die TA unkontrolliert aktiviert wird, was die Spannung erhöht, was natürlich dem Eingriff in erster Linie zuwiderläuft. Der Teilnehmer kann diese Muskelaktivierung in der Regel fühlen, so dass Kommunikation der Schlüssel ist. Aus den Protokollen ergibt die TA nur 25 % Gewebe im Vergleich zu den am häufigsten verwendeten Vastus lateralis, 100 mg bzw. 400 mg. Daher ist es wichtig, die Größe der Gewebesammlung zu maximieren und gleichzeitig zu prüfen, ob die TA-Gewebeprobe groß genug für die gewünschten Forschungsprojekte ist. Wir haben festgestellt, dass die Einnahme einer zweiten Probe unmittelbar nach der ersten keine zusätzlichen Komplikationen oder Heilungszeit für die Teilnehmer verursacht.

Obwohl das Protokoll einige Hinweise zu anderen Muskelbiopsien gibt, wird die Muskelauswahl das entsprechende Verfahren diktieren. Daher empfehlen wir anderen Forschern und Klinikern dringend, ihre Biopsiemethoden vollständig zu veröffentlichen. Aus Erfahrung identifizieren wir einige wichtige Faktoren für die Muskelauswahl, außerhalb der Forschungsfrage. Zuerst schlagen wir vor, Muskeln zu berücksichtigen, die oberflächlich auf die Haut sind und große Arterien/Nerven haben, die entweder tief oder leicht vermeidbar sind. Zweitens, weil die Teilnehmer während des Eingriffs wach sind, ist es wichtig zu überlegen, ob das Biopsieverfahren für den Patienten sehr unangenehm sein wird, entweder wegen der anfänglichen Positionierung des Patienten, oder wegen des Drucks der Biopsienadel, die auch auf tiefere Muskeln in einer unangenehmen Weise drückt. Wir hatten Erfolg mit dem vastus lateralis und pectoralis. Weitere mögliche Optionen sind Trapez, Latissimus dorsi und Gastrocnemius (obwohl stark vaskularisiert und anfällig für Blutungen). Die Hamstring-Muskeln sind möglich, aber unbequem für den Patienten, und schwierig, weil sie seitlich bewegen, wenn die Biopsie zu sammeln.

Obwohl Bergström Nadeln können von Herstellern gekauft werden, einige Laboratorien maßgeschneiderte ihre eigenen. Kleine, aber clevere Anpassungen des Designs können die Ausbeute an langen und unbeschädigten Muskelfasern erhöhen. Das Hier verwendete Sammelfenster der Nadel betrug beispielsweise 7 mm x 5 mm (Länge x Breite). Dies ist angemessen, um einen Muskelwürfel zu erfassen. Wenn das Ziel jedoch darin besteht, lange und unbeschädigte Fasern (des gleichen Volumens) zu sammeln, könnte die Länge erhöht und die Breite verringert werden (d. h. 10 mm x 3,5 mm). Wenn die Nadel entlang der Faszikelrichtung ausgerichtet ist, dann ist es wahrscheinlich, dass diese Nadel längere Faserabschnitte sammeln würde.

Muskelbiopsien werden oft sicher ohne Dieführung eines Ultraschallbildes gesammelt, vor allem für größere Muskeln wie die vastus lateralis. In dieser Situation kann ein richtig erfahrener Arzt den Muskel leicht palepate, um die beste Einschnittstelle zu finden. Jedoch, wenn der Arzt weniger Erfahrung mit dem Zielmuskel ist, oder zusätzliche Sorgfalt ist gerechtfertigt, um größere Nerven oder Blutgefäße zu vermeiden, ist der Ultraschall ein großes und einfach angewendetes Werkzeug. Schließlich kann die Post-Op-Überwachung des Biopsiebereichs schnell mit Hilfe eines Ultraschalls durchgeführt werden.

Pädiatrische Biopsien sind sicherlich möglich und häufig durchgeführt32,33,34. Es werden jedoch in der Regel mehrere Änderungen an der Prozedur vorgenommen. Eine kleinere Messnadel und eine bewusste Sedierung sind oft erforderlich, und der Eingriff findet in einem Krankenhaus-Umfeld statt. Im Allgemeinen könnte die Erfahrung für ein Kind traumatisch sein und Forschungsgruppen, die gesunde pädiatrische Teilnehmer einbeziehen möchten, sollten dies sorgfältig gegen die potenziellen Vorzüge der Studie abwägen.

Faserbündel oder ungenutztes Material können vor oder nach der Fasermechanik in andere Experimente übertragen werden. Beispielsweise können Techniken durchgeführt werden, die den gehaltantischen Proteingehalt bewerten oder den Isoformtyp klassifizieren35. Um jedoch den Proteinabbau zu begrenzen und den Analyseerfolg zu verbessern, sollte Gewebe entweder nach der ursprünglichen Extraktion, unmittelbar nach der mechanischen Auswertung, in flüssigem Stickstoff eingefroren oder sofort zur Proteinanalyse verarbeitet werden. Fasern können auch für die Immunhistochemie oder andere bildgebende Verfahren36 hergestellt werden, die die Beurteilung der Proteinposition innerhalb der Faser ermöglichen. In diesem Fall können Fasern in eine fixative Lösung (z.B. 4% Paraformaldehyd/0,25% Glutaraldehyd in physiologischen Puffer bei pH 7; kein Glutaraldehyd für die Immunhistochemie) gelegt werden, während sie noch auf dem mechanischen Prüfgerät sind, wobei die sarkomischen Strukturen in einer gewünschten Sarkome-Länge erhalten bleiben. Wenn möglich, kann ein kleines Stück der originalen Biopsie geerntet, 10 min in Sammellösung kräftig gewaschen und dann in fixative Lösung gelegt werden. Viele Gruppen ziehen es vor, frisch ausgeschnittene Proben in Isopentan sofort einzufrieren, was die Bildung schädlicher Eiskristalle einschränkt und die Bildqualität für visuelle Beurteilungen verbessert. Dies ist in der Tat der Goldstandard für Flash Freezing; Wir stellen jedoch fest, dass sich die Eiskristallschäden durch Stickstoff-Gefrieren nur auf extra-myofibril-Strukturen konzentrieren. Wir haben eine zufriedenstellende strukturelle Integrität von sarkomischen Komponenten in Proben, die auch in flüssigem Stickstoff eingefroren sind, und daher denken wir, dass Stickstoff eine Möglichkeit ist, vor allem, wenn er leichter verfügbar ist oder das chirurgische Team/lokale chemische Behörde nicht bereit ist, isopentane zu verwenden. Ein wichtiges und oft nicht gemeldetes Problem bei der Vorbereitung von Proben für die Betrachtung ist, dass die Sarkomen oft kontrahiert/kurz sind, wobei der I-Band-Bereich des Sarcomere kurz oder nicht beobachtbar ist. Um dies zu überwinden, muss der Forscher die Faserproben (durch das Prüfgerät oder von Hand mit einer feinen Pinzette) manuell dehnen, bevor er fixiert wird. In der Regel dehnen wir uns in einer kalziumarmen physiologischen Entspannungslösung auf eine Sarkome-Länge von 3,2 m (gemessen mittels Laserbeugung) oder auf 150 % der Lockerlänge aus. Wenn schließlich Subsamples für die RNA-Expressionsanalyse gewünscht werden, hat die Methode des Flash-Freezing keinen Einfluss auf die Ergebnisse, sondern Proben müssen unmittelbar nach der ursprünglichen Extraktion eingefroren und in einen -80 °C-Gefrierschrank gelegt werden, da rna sehr instabil ist. Es gibt einige RNA-Schutz-Speicherlösungen auf dem Markt, aber wir haben gemischte Ergebnisse mit ihrer Verwendung gefunden, und nur Flash-Gefrierfrische Proben.

Um die Menge der während einer Testversion gesammelten Informationen zu maximieren, kann die gleichzeitige Erfassung anderer Daten während der Durchführung mechanischer Tests abgeschlossen werden. Zum Beispiel kann die Untersuchung von sarkomischen Strukturen während mechanischer Tests mit Hilfe von Low-Winkel-Röntgenbeugungs-Bildgebung durchgeführt werden, wie es bei anderen Tieren37,38geschieht. Bei genetischen Experimenten muss der ausgeschnittene Muskel sofort zu diesem Zweck verarbeitet oder eingefroren werden, da DNA/RNA relativ weniger stabil sind als Proteine.

Einige Einschränkungen sind bereits oben beschrieben. Hier besprechen wir das Verfahren selbst. Eine große Einschränkung für die meisten Gruppen ist ein Teammitglied, das in der Biopsiesammlung entsprechend geschult ist. Unabhängig vom Beruf der Person (Arzt, Arzthelfer, Techniker oder auf andere Weise) ist dieses Verfahren schwierig, da der Prüfer die Nadel blind antreibt und sich auf "fühlen"3,28 verlassen muss, um das Nadelfenster genau zu lokalisieren. Fehler sind nicht tolerierbar, weil die Zustimmung menschlicher Teilnehmer zu Biopsien spärlich ist, eine Biopsie vielen vorzuziehen ist und Fehler zu Gefäß- oder Nervenschäden führen können. Daher sollten alle Trainingsmöglichkeiten abgeschlossen werden, bevor eine menschliche Biopsie durchgeführt wird. Zum Beispiel, um ein "Gefühl" für das Fahren der Nadel zu gewinnen, Kann Schweinefleisch mit noch befestigter Haut in den meisten Lebensmittelgeschäften gekauft und als Stellvertreter für menschliche Haut und Muskeln verwendet werden. Eine weitere wertvolle Erfahrung ist es, eine ausgebildete Forschungsgruppe zu beschatten.

Wir bewerteten die Schmerzen/Beschwerden der Teilnehmer qualitativer und stützten uns auf die Erfahrung des Arztes und die Gespräche mit dem Teilnehmer, um wahrgenommene Schmerzen zu bewerten. Die Beurteilung von Schmerzen und Beschwerden nach der Biopsie kann jedoch durch die Verwendung validierter Schmerz-/Beschwerden-Umfragen personweit und studienübergreifend quantifiziert und vergleichbarer werden. Diese Punkte werden in der Literatur überraschend wenig behandelt. Eine aktuelle Studie präsentierte jedoch eine Möglichkeit, die Schmerzen/Beschwerden der Teilnehmer vor, während und nach Biopsien zu quantifizieren, indem sie gut etablierte Erhebungen über Schmerzen39. Wir stellen fest, dass dieses Papier die vastus lateralis als Zielmuskel verwendet, und so Folgestudien sind notwendig, um Schmerzbewertungen zwischen den Muskeln zu vergleichen.

Unabhängig von der Extraktionsmethode kann die Bergström-Technik die Gesamtlänge der Faser im Muskel nicht verbrauchen, da die Fasern zu lang sind (in TA406-8 cm, in Vastus lateralis40) 6-8 cm). Daher ist es unvermeidbar, dass für ein langes Stück gesammelte Faser die Enden durch die Biopsietechnik zerstört werden. Oft ist der nutzbare mittelschwere Teil einer Faser klein und daher ist es schwer mechanisch zu testen. Obwohl die Technik relativ lange zentrale Bereiche (3-5 mm) bietet, muss der Prüfer die Qualität der Faserbündel während der Zerlegung sorgfältig überprüfen, da der Einsatz beschädigter Fasern passive oder aktive Kraftausgänge verändern wird. Die visuelle Beobachtung erfolgreicher Biopsien zeigt einen Teil der Fasern, die durch das Biopsieverfahren unbeschädigt sind. Von einem traditionellen Sezierlichtmikroskop aus betrachtet, sieht die Oberfläche der Fasern glatt aus, ohne Löcher oder Risse (Abbildung 4). Darüber hinaus sollten Fasern zylindrisch aussehen und keine abgeflachten Bereiche haben. Obwohl nicht sichtbar, wird der Muskel selbst im Laufe der Zeit aufgrund natürlich vorkommender Proteasen abbauen, die beginnen, die Muskelproteine fast unmittelbar nach der Extraktion zu brechen. Daher ist es wichtig, Protease-Inhibitoren zu allen Lösungen hinzuzufügen, die mit den Fasern verwendet werden. Darüber hinaus schlagen wir auch zusätzliche Wassen der Biopsien vor, um so viel Blut wie möglich zu entfernen.

Auch bei sorgfältiger Vorbereitung können Faserschäden auftreten und zu schlechten Faseraktivierungen führen. Es gibt viele Gründe für Faserschäden, weil Fasern sehr empfindlich auf fast jeden Teil des Verfahrens sind. Zum Beispiel, während der Biopsie, wenn der Trokar nicht scharf genug ist, kann es in das Muskelgewebe während der Extraktion schieben, anstatt es durchzuschneiden, die die Fasern dehnen und zerstören können. Die Sammellösung muss entsprechend vorbereitet werden, da Fasern empfindlich auf osmotische Veränderungen, pH-Wert und Temperatur reagieren. Beim Umgang mit den Fasern ist sehr darauf zu achten, dass der Druck auf die Fasern vollständig begrenzt wird. Stattdessen sollte eine Pinzette verwendet werden, um die Biopsie durch ihr Bindegewebe zu greifen. Eine andere Alternative ist, eine Seidennaht der Größe 0-7 zu verwenden, um ein unbrauchbares Ende der Biopsie zu wickeln und diese dann beim Handling zu greifen. Schließlich dient das Glycerin zwei Rollen: Die erste besteht darin, den Muskel bei -20 °C vor dem Einfrieren zu bewahren, und die zweite ist ein mildes Reinigungsmittel für die Faser. Das heißt, Glycerin permeabiliert die Faser zu externen Lösungen, so dass der Zustrom von Kalzium (über eine Aktivierungslösung). Für die meisten Muskeln dauert dieser Prozess 10 Tage. Je nach Menge des Kollagengehalts und der Größe der Probe kann dies jedoch bis zu 6 Wochen dauern. Fasern müssen durchmeabilisiert werden, damit bei mechanischen Experimenten eine hochkalziumreiche Aktivierung auftritt. Fasern sind in der Regel für mindestens 3 Monate nutzbar. Um Faserabfälle zu begrenzen, wird eine längere Permeabilisationswartezeit (4-6 Wochen) für TA-Muskelfasern empfohlen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken Michaela Rau, Lea-Fedia Rissmann, Michael Marsh, Janina-Sophie Tennler, Kilian Kimmeskamp und Wolfgang Linke für die Unterstützung des Projekts. Die Finanzierung dieses Projekts wurde von der MERCUR Foundation (ID: An-2016-0050) an DH zur Verfügung gestellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26 guage subcutaneous needle with 2 ml glass syringe B. Braun Melsungen AG
Carl-Braun-Straße 1
34212 Melsungen, Hessen
Germany
 		 4606027V Drug administration
5mm Berstöm needle homemade N/A Tissue collection. Similar to other Berstöm needles
Acrylastic BSN medical GmbH
22771 Hamburg		 269700 elastic compression bandage
Complete protease inhibitor cocktail Roche Diagnostics, Mannheim, Germany 11836145001 Protease inhibitor tabeletes added to all solutions that hold muscle tissue.
Cutasept PAUL HARTMANN AG
Paul-Hartmann-Straße 12
89522 Heidenheim
Germany		 9805630 Disenfectant spray for the skin
Leucomed T plus BSN medical GmbH
22771 Hamburg		 7238201 Transparent wound dressing with wound pad to seal the wound and protect against infection
Leukostrip Smith and Nephew medical Limitied 101 Hessle road,
Hull
Great Britain		 66002876 wound closure
Surgical disposable scalpels Aesculap AG
Am Aesculap-Platz
78532 Tuttlingen
Germany		 BA200 series Incision
Unihaft cohesive elastic bandage BSN medical GmbH
22771 Hamburg		 4589600 cohesive elastic bandage that protects against mechanical impact
Xylocitin 2% with Epinephrin Milbe GmbH
Münchner Straße 15
06796 Brehna
Germany		 N/A Controlled substance anesthesia, vasoconstriction

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Biologie Ausgabe 163 Tibialis anterior Muskelbiopsie Ultraschall menschliche Fasermechanik Biomechanik modifizierte Bergström-Technik
Sammlung von Skelettmuskelbiopsien aus dem Superior-Fach des menschlichen Musculus Tibialis Anterior für mechanische Bewertung
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Hessel, A. L., Hahn, D., de Marées, M. Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation. J. Vis. Exp. (163), e61598, doi:10.3791/61598 (2020).

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