Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

توليد مكتبات الإدراج Transposon في البكتيريا السلبية الغرامية لتسلسل عالي الإنتاجية

Published: July 7, 2020 doi: 10.3791/61612
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Texas at Arlington

Summary

نحن وصف طريقة لتوليد مكتبات متحولة تشبع transposon في البكتيريا السلبية الغرام وإعداد لاحقة من مكتبات ابيرليكون الحمض النووي لتسلسل عالية الإنتاجية. على سبيل المثال، ونحن نركز على مسببات الأمراض ESKAPE، Acinetobacter baumannii، ولكن هذا البروتوكول هو قابل لمجموعة واسعة من الكائنات الحية سلبية الغرام.

Abstract

إن تسلسل الـ Transposon (Tn-eq) هو طريقة قوية تجمع بين التوازج المُتَرْكَمِيّة المُتَرْكِم والتسلسل المُزَاَتِقِي لتحديد الجينات والمسارات التي تُسهم في اللياقة البدنية الجرثومية في ظل مجموعة واسعة من الظروف البيئية. 31 - إن تطبيقات Tn-eq هي تطبيقات واسعة النطاق ولم تُمكّن فقط من فحص العلاقات بين النمط الجيني والفينوين على مستوى الكائنات الحية، بل أيضاً على مستوى السكان والمجتمع المحلي والنظم. ترتبط البكتيريا السلبية بالجرام ارتباطًا كبيرًا بالأنماط الظاهرية المقاومة للميكروبات ، والتي زادت من حوادث فشل العلاج بالمضادات الحيوية. تُعرَّف مقاومة مضادات الميكروبات بأنها نمو البكتيريا في وجود مضادات حيوية قاتلة. يستخدم الكُليسين المضاد للميكروبات "الخط الأخير" لعلاج العدوى البكتيرية السالبة بالجرام. ومع ذلك ، يمكن أن العديد من مسببات الأمراض سلبية الغرام ، بما في ذلك Acinetobacter baumannii تطوير مقاومة colistin من خلال مجموعة من الآليات الجزيئية ، والتي تم وصف بعضها باستخدام Tn-seq. وعلاوة على ذلك، تختلف مسارات نقل الإشارة التي تنظم مقاومة الكولستين داخل البكتيريا السالبة للجرام. هنا نقترح طريقة فعالة من التحول المطفرة في A. baumannii أن يبسط توليد مكتبة الإدراج transposon تشبع وبناء مكتبة أمليكون من خلال القضاء على الحاجة إلى الإنزيمات تقييد, ربط محول, وتنقية هلام. الأساليب المذكورة هنا ستمكن من التحليل المتعمق للمحددات الجزيئية التي تسهم في اللياقة البدنية A. baumannii عندما تحدى مع colistin. كما ينطبق البروتوكول على مسببات الأمراض الأخرى ESKAPE السلبية للجرام ، والتي ترتبط في المقام الأول بالعدوى التي يتم الحصول عليها من المستشفيات المقاومةللأدوية.

Introduction

اكتشاف المضادات الحيوية هو بلا شك واحدة من الأحداث الأكثر تأثيرا ذات الصلة بالصحة فيالقرن 20. لا تقتصر المضادات الحيوية على حل الالتهابات البكتيرية الخطيرة بسرعة، بل تلعب أيضًا دورًا محوريًا في الطب الحديث. العمليات الجراحية الكبرى، وعمليات زرع وتقدم في طب حديثي الولادة والعلاج الكيميائي ترك المرضى عرضة للعدوى تهدد الحياة وهذه العلاجات لن يكون ممكنا من دون المضادات الحيوية1,2. ومع ذلك ، فإن التطور السريع وانتشار مقاومة المضادات الحيوية بين مسببات الأمراض البشرية قد انخفض بشكل كبير فعالية جميع الفئات الهامة سريريًا من المضادات الحيوية3. العديد من الالتهابات البكتيرية التي تم تطهيرها مرة واحدة بسهولة مع العلاج بالمضادات الحيوية، لم تعد تستجيب لبروتوكولات العلاج الكلاسيكية، مما تسبب في تهديد خطير للصحة العامة العالمية1. مقاومة مضادات الميكروبات (AMR) هي المكان الذي تنمو فيه الخلايا البكتيرية في تركيزات قاتلة من المضادات الحيوية ، بغض النظر عن مدة العلاج4،5. هناك حاجة ملحة لفهم العوامل الجزيئية والبيوكيميائية التي تنظم العلاج بمضادات الميكروبات، والتي ستساعد على توجيه التنمية البديلة لمضادات الميكروبات. على وجه التحديد، مسببات الأمراض ESKAPE هي إشكالية في البيئات السريرية والمرتبطة AMR واسعة النطاق. وتشمل هذه Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa وEnterobacter spp. في حين أن العديد من الآليات تساهم في AMR في مسببات الأمراض ESKAPE ، فإن الكائنات الأربعة الأخيرة سلبية الغرام.

البكتيريا السلبية الغرام تجميع غشاء خارجي محدد أن يحميهم من الظروف البيئية الضارة. يعمل الغشاء الخارجي كحاجز نفاذي لتقييد دخول الجزيئات السامة، مثل المضادات الحيوية، إلى الخلية. خلافا للأغشية البيولوجية الأخرى، والغشاء الخارجي غير متناظرة. يتم إثراء النشرة الخارجية مع lipopolysaccharide المكشوفة السطح ، في حين أن النشرة الداخلية هي مزيج من الفوسفاتية6. يتم إرساء جزيئات Lipopolysaccharide إلى الغشاء الخارجي من قبل الحفاظ على الدهون A moiety جزءا لا يتجزأ من ثنائي الطبقات الدهنية7. مطلوب من الدهون الكنسي المجال من الإشريكية القولونية lipopolysaccharide لنمو معظم البكتيريا سلبية الغرام ويتم تصنيعها من قبل مسار انزيمي من تسع خطوات التي هي واحدة من المسارات الأساسية الأكثر والحفاظ عليها في الكائنات الحية سلبية الغرام6,7,8.

البوليميكسينات هي الببتيدات المضادة للميكروبات الكاتيونية التي تستهدف نطاق الدهون A من السكاريد الدهنية لاضطرابات الغشاء الخارجي وثقب الخلية. التفاعل الكهربائي بين بقايا مشحونة إيجابيا من البولي الديميسينات والدهون المشحونة سلبا مجموعات الفوسفات تعطل غشاء الخلية البكتيرية مما يؤدي في نهاية المطاف إلى موت الخلية9,10,11,12,13. Colistin (بوليميكسين E) هو الملاذ الأخير المضادة للميكروبات المستخدمة لعلاج العدوى الناجمة عن عدة مسببات الأمراض المقاومة للأدوية الغرام سلبية الرضّع، مثل Acinetobacter baumannii14،15،16. اكتشفت لأول مرة في عام 1947 ، يتم إنتاج البوليميكسينات من قبل بكتيريا التربة ، Paenibacillus بوليميكا17،18،19. وقد وصفت polymyxins لعلاج التهابات الغرام السلبية لسنوات قبل استخدامها السريري كان محدودا بسبب تقارير عن nephro كبيرة ،والأعصاب 20،21.

A. baumannii هو مرض الأمراض السلبية الغرام nosocomial التي زادت بشكل كبير من المراضة والوفيات من نتائج المرضى على مدى العقود الأخيرة22. ما كان يعتبر مرة واحدة كمسببات الأمراض منخفضة التهديد، تشكل الآن خطرا كبيرا للعدوى المكتسبة في المستشفى في جميع أنحاء العالم بسبب قدرتها لا يصدق للحصول على AMR وارتفاع خطر الوباء23،24. ألف baumannii مسؤولة عن أكثر من 10 ٪ من الإصابات النوسومية في الولايات المتحدة. يظهر المرض مثل الالتهاب الرئوي، البكتيريا، التهابات المسالك البولية، التهابات الجلد والأنسجة الرخوة، التهاب السحايا، والتهاب الشغاف25. وقد تضاءلت خيارات العلاج لعدوى A. baumannii بسبب المقاومة ضد جميع فئات المضادات الحيوية تقريبا، بما في ذلك β-lactams، الفلوروكينولون، التتراسيكلين، و aminoglycosides23،24. وقد أدى انتشار مقاومة للأدوية المتعددة، ومقاومة للأدوية على نطاق واسع ومقاومة للأدوية A. baumannii عزل إلى عودة في علاج colistin، الذي كان يعتقد أن يكون واحدا من الخيارات العلاجية القليلة المتبقية لا تزال فعالة ضد مقاومة للأدوية المتعددة A. baumannii. ومع ذلك ، زيادة مقاومة colistin بين العزل A. baumannii قد تضخيم تهديدها للصحة العامة العالمية10،11،12،13،27،30،31.

وقد وفرت التطورات الأخيرة في التكنولوجيات ذات الإنتاجية العالية التسلسل، مثل التسلسل transposon (TN-seq)، أدوات هامة لتعزيز فهمنا للياقة البدنية البكتيرية في المختبر وفي الجسم الحي. Tn-seq هي أداة قوية يمكن الاستفادة منها لدراسة التفاعلات ذات النمط الجيني-النمط الظاهري في البكتيريا. TN-seq قابلة للتطبيق على نطاق واسع عبر مسببات الأمراض البكتيرية، حيث يجمع بين التطفرة التقليدية transposon مع تسلسل متوازي ضخمة لمواقع الإدراج خريطة بسرعة، والتي يمكن استخدامها لربط طفرات الحمض النووي إلى المتغيرات الظاهرية على نطاق الجينوم على نطاق32،33،34،35. في حين أن طرق التاطفرة التي تم وصفها سابقاً، فإن الخطوات العامة مماثلة33. أولاً، يتم إنشاء مكتبة إدخال باستخدام التماطيل المُتَرَكَّة، حيث تقتصر كل خلية بكتيرية داخل مجموعة سكانية على إدخال واحد في مادة الـ DNA الجينومية (gDNA). بعد الطفرات، يتم تجميع المسوخ الفردية. يتم استخراج gDNA من تجمع متحولة الإدراج ويتم تضخيم وصلات transposon وتخضع لتسلسل عالي الإنتاجية. تمثل القراءة مواقع الإدراج، والتي يمكن تعيينها إلى الجينوم. إدراج Transposon التي تقلل من اللياقة البدنية تسقط بسرعة من السكان, في حين يتم إثراء عمليات الإدراج المفيدة. TN-seq كان له دور فعال في تعزيز فهمنا لكيفية تأثير الجينات على اللياقة البكتيرية في الإجهاد33.

وقد تم بناء نظام همار 1 للناور بالبوافير المشفّر المشفّر في pJNW684 على وجه التحديد وجرى تحسينه على النحو الأمثل لغرض التوليد المُتَجَدّ. وهو يشمل تبديل -الأسرة البحريةيحيط جين مقاومة كاناميسين, الذي يستخدم لاختيار المسوخ transposon في A. baumannii. كما أنه يشفّر A. baumannii المروج محددة أن يدفع التعبير عن ترميز transposase الجين36. يحتوي transposon أساسًامن البحار أيضًا على جهازي إنهاء تحويلي في اتجاه مجرى النهر من جين مقاومة الكاناميسين ، والذي يمنع القراءة من خلال المصب37من الإدراج . pJNW684 يحمل أيضا RP4/oriT/oriR6K-مشروط أصل النسخ المتماثل الذي يتطلب الجين λpir التي ساهمت بها سلالة المانحة لتكرار38. في غياب الجين λpir، لن يكون الناقل pJNW684 الذي يحمل آلية نقل القدرة على تكرار في سلالة المتلقي A. baumannii 10،36،38. لذلك, أثناء الاقتران بكتيريّة, فقط التبّاجن يكون أدخلت داخل الالجتم جينوم دون خلفيّة إدراج من البلازميّ, أيّ يحمل الpopoase مورثة. وهذا أمر هام لأن فقدان نشاط الـ transposase جنبا إلى جنب مع نتائج البلازميد في واحد, حدث نقل مستقرة التي تمنع transposon من الانتقال إلى مواقع مختلفة بمجرد إدراجها في الجينوم المتلقي.

PJNW648 كما تم اختبار للنشاط في كائن آخر غرام سالبة، E. القولونية. وأشار التجميع الناجح لمكتبة Tn-seq المشبعة في سلالة القولونية W3110 إلى أن النظام قابل لإجراء الطفرات في مجموعة واسعة من مسببات الأمراض ، بما في ذلك Enterobacteriaceae. وعلاوة على ذلك، يمكن بسرعة تبادل المروج A. baumannii محددة التي تدفع التعبير transposase مع المروج الأنواع المحددة. وأخيراً، يمكن استبدال جين مقاومة الكاناميسين بشرائط المقاومة الأخرى، وذلك حسب النمط الظاهري AMR للكائن الحي الذي تجري دراسته.

أحد العوامل التي تساهم في مقاومة الكولستين في A. baumannii هو إدارة جرعات غير كافية ، حيث تتعرض البكتيريا لضغوط انتقائية عند مستويات غير قاتلة39. وأظهرت عدة تقارير أن تركيزات مضادة للميكروبات دون الباطنية يمكن أن تحفز الاستجابات المنظمة التي تغير فسيولوجيا الخلية للحد من قابلية جميع السكان البكتيرية11,12,30,31. باستخدام Tn-seq، اكتشفنا العوامل التي تنظم مقاومة الكليستين في سلالة A. baumannii ATCC 17978 بعد التعرض لتركيزاتمثبطة 10 و subinhibitory من colistin. هذا المثال تفاصيل طريقة Tn-seq التي تبسط بناء وإثراء مكتبة متحولة transposon المشبعة باستخدام الأسرة أساسها marinerمن transposons40،41. في حين أن العديد من بروتوكولات Tn-seq تولد 20،000 - 100،000 المسوخ35،42،43،44،45،46، البروتوكول الموصوف هنا يمكن أن تولد بسرعة مكتبة transposon من 400،000 + المسوخ ، الذي يعادل تقريبا إلى الإدراج transposon كل أزواج 10 قاعدة في A. baumannii10. وعلاوة على ذلك، يمكن توسيع حجم المكتبة دون بذل جهد إضافي كبير. هذه الطريقة أيضا يلغي شرط تقييد endonucleases ، ربط محول وتنقية هلام ، والتي يمكن أن تقلل من تنوع المكتبة النهائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد سلالة بكتيرية

  1. خط "المانح" سلالة(E. القولونية MFD DAP-/ pJNW684، جدول المواد)للمستعمرات المعزولة على Luria-Bertani agar تكملها 600 ميكرومتر ديامينوميليك حمض (DAP)، 100 ملغ/لتر من الأمبيسيلين و 25 ملغم/لتر من kanamycin. احتضان ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية. باستخدام مستعمرة معزولة واحدة، تلقيح 50 مل من مرق لوريا (LB) تكملها 600 ميكرومتر DAP، 100 ملغ/لتر من الأمبيسيلين و 25 ملغ/لتر من الكاناميسين في قارورة 250 مل إرلينماير وتسميتها بأنها "مانح".
  2. خط "المتلقي" سلالة(أ. baumannii سلالة ATCC 17978 ، جدول المواد) للمستعمرات المعزولة على لوريا - بيرتاني أجار. احتضان ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية. باستخدام مستعمرة واحدة معزولة، تلقيح 50 مل من LB في قارورة 250 مل Erlenmeyer وتسميتها بأنها "المتلقي".
  3. احتضان كلا الثقافات ("المانحة" و "المتلقي") بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز.

2. التزاوج البكتيري

  1. نقل الثقافات بين عشية وضحاها إلى 50 مل أنابيب المخروطية.
  2. بيليه كل من الثقافات المتلقية والمانحة باستخدام الطرد المركزي في 5000 × ز لمدة 7 دقائق.
  3. تجاهل افرا و resuspend بيليه سلالة "المانحة" في 35 مل من LB تكملها DAP لغسل المضادات الحيوية المتبقية.
  4. بيليه "المانح" خلايا سلالة باستخدام الطرد المركزي في 5000 س ز لمدة 7 دقائق.
  5. تجاهل عظمى و resuspend بيليه سلالة "المانحة" في 4.5 مل من LB تكملها DAP. استخدام ماصة المصلية 10 مل.
  6. نقل سلالة "المانح" التي أعيد فرضها إلى أنبوب سلالة "المتلقي"، الذي يحتوي على خلايا "المتلقي" الكريات. استخدم نفس ماصات المصلية 10 مل من الخطوة 2.5 لخلط الثقافات. الانتقال فورا إلى الخطوة التالية.
    ملاحظة: يجب أن يكون الحجم الإجمالي للتعليق النهائي 5 مل.
  7. توزيع تعليق التزاوج كما قطرات 100 μL الفردية على لوحات LB agar تكملها DAP (5-7 قطرات لكل لوحة) (الشكل 1A).
  8. احتضان لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  9. دون إزعاج قطرات، نقل لوحات بعناية إلى حاضنة 37 درجة مئوية والسماح الثقافات لتزاوج لمدة 1ساعة.
    ملاحظة: فترات الحضانة التي تتجاوز 1 ح خطر توليد المسوخ الشقيقة.
  10. بعد الحضانة، إضافة 1.5 مل من LB على كل لوحة والحصاد عن طريق إعادة تعليق البكتيريا من لوحات. استخدام 1 مل ميكروسيبيت لإعادة النيابسيون. يجب أن يكون حجم النهائي حوالي 12 - 15 مل.
  11. الخلايا المحصّاة في أنبوب مخروطي 50 مل.
  12. بيليه الخلايا تزاوج باستخدام الطرد المركزي في 5000 س ز لمدة 7 دقائق.
  13. تخلص من الخلايا الفائقة والخلايا التي تُدفع في 50 مل من LB لإزالة DAP المتبقية.
  14. بيليه التزاوج باستخدام الطرد المركزي في 5000 س ز لمدة 7 دقائق.
  15. كرر خطوة الغسيل (الخطوتين 2.13 و 2.14).
  16. باستخدام ماصة 10 مل المصلية، resuspend بيليه في 10 مل من LB تكمل مع 25٪ الجلسرين.
  17. باستخدام الخلايا المغسولة، قم بعمل خمسة عمليات تخفيف متسلسلة في مرق LB (1:10، 1:100، 1:1000، 1:10،000، 1:100,000).
  18. انتشار 100 ميكرولتر من كل تخفيف على 4 لوحات مختلفة باستخدام حبات الزجاج العقيمة: لوريا-بيرتاني أجار تكملها kanamycin، أجار تكملها الأمبيسيلين، أجار تكمل مع DAP و أجار فقط.
  19. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  20. Aliquot التزاوج المتبقي في 1 مل aliquots وتخزينها في -80 درجة مئوية.

3. تحديد التخفيف المناسب من مكتبة transposon

  1. سجل وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) من لوحات بين عشية وضحاها.
  2. صورة لوحة مع المستعمرات العد لكل حالة لوحة مختلفة (الشكل 2A).
    ملاحظة: يجب أن تنمو كل من سلالات "المانح" و "المتلقي" على لوحات agar المكملة مع DAP ، لذلك فإن معظم التخفيفات المطلية ستسفر عن حديقة. فقط سلالة "المتلقي" يمكن أن تنمو على لوحات أجار. لا يمكن أن "المانح" ولا "المتلقي" سلالة تنمو على لوحات أجار تكملها ampicillin، لذلك ينبغي أن يكون هناك لا شيء / الحد الأدنى من النمو. فقط الخلايا سلالة الهدف ترميز الإدراج transposon يمكن أن تنمو على لوحات أجار تكملها kanamycin. يجب أن تختلف المستعمرات في الحجم، مما يشير إلى عمليات إدخال transposon في الجينات التي تساهم في اللياقة البدنية على أجار تكملها الكاناميسين.
  3. حساب عدد من المسوخ transposon في التزاوج المجمدة عن طريق عد عدد المستعمرات على لوحات أجار LB تكملها kanamycin.
    ملاحظة: بالنسبة إلى الجينوم A. baumannii (حوالي 4 ميغابت في الثانية)، كان الهدف الحصول على حوالي 400،000 مستعمرات من أجل إنشاء مكتبة متحولة عالية الدقة (تقريباً زوج واحد من أزواج قاعدة إدخال transposon/10). ومع ذلك، ينبغي أن يكون هذا العدد الأمثل على أساس حجم الجينوم للأنواع المستهدفة).

4. توليد مكتبة متحولة البكتيرية النهائية

  1. ذوبان aliquot من التزاوج المجمدة على الجليد.
  2. لوحة التزاوج على 150 ملم لوريا- برتاني أجار لوحات تكملها kanamycin على أساس CFUs تحسب في الخطوة 3.1. ضبط مستوى الصوت مع LB لتسفر عن 13333 مستعمرات لكل 150 ميكرولتر قبل الطلاء.
    ملاحظة: تم تحديد عدد CFU هنا ليكون حوالي 105 CFU / مل، لذلك تم تعديل حجم التزاوج للحصول على 13333 مستعمرة لكل لوحة لأن هذا من شأنه أن يوفر العدد الأمثل من المستعمرات على 30 لوحة لمكتبة متحولة عالية الدقة دون اكتظاظ الصفائح.
  3. استخدام حبات الزجاج المعقمة لنشر 150 ميكرولتر من التخفيف لكل لوحة على 30 × 150 ملم لوريا- Bertani أجار لوحات تكملها kanamycin للحصول على 400،000 المستعمرات(الشكل 1C).
    ملاحظة: يمكن استخدام قضبان معقمة أو أي نوع من أداة المُعممة (أي الخرز الزجاجي) لنشر البكتيريا على الألواح.
  4. تخلص من الأنبوب المستخدم الذي يحتوي على تزاوج زائد.
    ملاحظة: دورات التجميد/الذوبان تضيف ضغوطًا انتقائية على الثقافة البكتيرية، والتي يمكن أن تحرف نتائج تجربة Tn-seq. استخدام aliquot الطازجة في كل مرة.
  5. احتضنت لوحات في 37 درجة مئوية ل 14 ساعة.
    ملاحظة: تم تحسين وقت الحضانة لمنع فرط النمو (لمس المستعمرات). ويقترح تقليل النمو عن طريق تقليل وقت الحضانة.

5- تقدير كثافة المكتبة وتجميعها للتخزين

  1. عد وحدات CFUs على كل لوحة لتقدير إجمالي المسوخ في مكتبة ال transposon. عد 20٪ من لوحات 3 على الأقل لتحديد تقدير عدد المستعمرات لمجموعة كاملة من لوحات (الشكل 2A). تأكد من أن المستعمرات لا تلمس مستعمرة أخرى.
  2. بعد حساب العائد المقدر للمستعمرة، أضف 3-5 مل من LB (أو أكثر إذا لزم الأمر) إلى كل لوحة وكشط من البكتيريا باستخدام أداة كشط معقمة.
    ملاحظة: تم استخدام حلقات التلقيح العقيمة لتكشط اللوحات بكفاءة.
  3. تجمع تعليق البكتيرية من جميع لوحات في أنابيب مخروطية مل 50 (الشكل 1D). وهذا يتطلب عدة 50 مل أنابيب المخروطية, على الأقل 3.
  4. بيليه تجمع تعليق البكتيرية باستخدام الطرد المركزي في 5000 س ز لمدة 7 دقائق.
  5. تجاهل بيليه عظمى و resuspend في 5 مل من LB تكملها مع 30٪ الجلسرين.
  6. Aliquot 1 مل من مكتبة transposon في التبريد وتخزينها في -80 درجة مئوية.

6. تحديد العوامل التي تنظم مقاومة الكُلستين في A. baumannii

  1. إعداد 4 × 250 مل قارورة Erlenmeyer مع كل تحتوي على 50 مل LB مرق وتسمية كما (الشكل 2B)
    1. A. baumannii سلالة ATCC 17978 مكتبة Tn-seq; (-) colistin_1
    2. A. baumannii سلالة ATCC 17978 مكتبة Tn-seq; (-) colistin_2
    3. A. baumannii سلالة ATCC 17978 مكتبة Tn-seq; (+) colistin_1
    4. A. baumannii سلالة ATCC 17978 مكتبة Tn-seq; (+) colistin_2
      ملاحظة: في النمو التحدي الموضح هنا، كل شرط، (-) colistin التحكم و (+) colistin التحدي، ويجري اختبار مكررة. ولذلك، يتطلب الإعداد 4 × 250 مل قارورة Erlenmeyer، واثنين في حالة.
  2. أضف 50 ميكرولتر من 0.5 ملغم/لتر كليستين إلى (+) قارورة كوليستين (6.1.3 و6.1.4) و50 ميكرولتر من الماء إلى قارورة colistin (-) (6.1.1 و6.1.2).
  3. ذوبان المجمدة Tn-seq مكتبة aliquot من الخطوة 5 على الجليد.
  4. ماصة 1 μL من المكتبة المذابة في 1 مل من برنامج تلفزيوني.
  5. قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD600)وضرب من قبل 1،000.
    ملاحظة: هذا يحدد OD600 من 1 ميكرولتر من مكتبة Tn.
  6. استناداً إلى الحساب في الخطوة 6.5، تلقيح كل قارورة تحتوي على 50 مل LB إلى OD النهائي600 0.001.
  7. تنمو الثقافات في حاضنة تهتز في 37 درجة مئوية إلى OD600 0.5.
    ملاحظة: من المهم أن تظل الثقافات في مرحلة النمو اللوغاريتمي، لذلك إذا كانت السلالة الخاصة بك في600 OD مختلفة أثناء النمو الأسي، فإن OD600 يحتاج إلى تعديل لضمان تكرار الثقافة عدة مرات ممكنة في مرحلة النمو اللوغاريتمي. إذا كانت الثقافة يكرر فقط 3 مرات، وتوج القدرة على الكشف عن عيوب اللياقة البدنية في المسوخ في الاختلافات 3 أضعاف، من الناحية النظرية. منذ البكتيريا المختلفة لها أوقات مضاعفة مختلفة، من المهم أن بذور الثقافات في ثابت OD600 لتطبيع inoculum البداية. وهذا يضمن التمثيل المتسق للمكتبة بأكملها في جميع الثقافات.
  8. حصاد الثقافات باستخدام الطرد المركزي في 5000 س ز في 4 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
  9. إزالة افرات وغسل مع 50 مل من برنامج تلفزيوني.
  10. بيليه باستخدام الطرد المركزي في 5000 س ز في 4 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
  11. إزالة افرا و resuspend بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني. Aliquot ~ 200 ميكرولتر في 5 أنابيب microcentrifuge.
  12. بيليه باستخدام الطرد المركزي في 5000 س ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إزالة كل من فائقة باستخدام تلميح ماصة.
  13. تخزين الكريات في -20 درجة مئوية أو المضي قدما مع استخراج gDNA.

7. استخراج gDNA

  1. ذوبان بيليه خلية واحدة على الجليد.
  2. إضافة 0.6 مل تحلل العازلة(جدول المواد)ودوامة لإعادة بناء الكريه تماما.
  3. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  4. إضافة 0.6 مل من الفينول / الكلوروفورم / ايساميل الكحول إلى العينة ودوامة بقوة.
  5. مراحل منفصلة باستخدام الطرد المركزي في الطرد الجزئي في سرعة قصوى في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  6. نقل المرحلة مائي العلوي إلى أنبوب جديد. تجنب إزعاج واجهة المرحلة أثناء النقل.
  7. إضافة حجم متساو من الكلوروفورم إلى المرحلة مائي الحصول عليها أعلاه ودوامة بقوة.
  8. مراحل منفصلة باستخدام الطرد المركزي في microcentrifuge في سرعة قصوى في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  9. نقل المرحلة مائي العليا إلى أنبوب جديد.
    ملاحظة: تأكد من تجنب إزعاج الواجهة أثناء النقل.
  10. إضافة 2.5x حجم المرحلة مائي من الإيثانول البارد 100 ٪ ومزيج بلطف. الحمض النووي المُعجل سيكون مرئياً
  11. ضع الأنبوب عند -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.
  12. بيليه الحمض النووي باستخدام الطرد المركزي في سرعة قصوى في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  13. إزالة بعناية supernatant دون إزعاج بيليه الحمض النووي وغسل مع 150 ميكرولتر من 70 ٪ من الإيثانول عن طريق الأنابيب.
  14. بيليه الحمض النووي باستخدام الطرد المركزي في سرعة قصوى في 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
  15. إزالة بعناية فائقة.
  16. كرر الخطوة 7.14 مرة واحدة. إزالة بعناية كل الإيثانول المتبقية.
  17. الحمض النووي الجاف عن طريق احتضان في غرفة درجة الحرارة لمدة 5-10 دقيقة.
  18. Resuspend الحمض النووي بيليه في 100 μL TE العازلة عن طريق الأنابيب.

8. الحمض النووي القص (الشكل 3A)

  1. تخفيف gDNA مع TE العازلة إلى تركيز 250 نانوغرام / مل في حجم إجمالي 200 ميكرولتر.
  2. ضع أنابيب في حمام مائي sonicator.
  3. سونيكات الحمض النووي إلى إنتاج شظايا من حوالي 300 نوكليوتيدات. السلطة: 60 ٪ ، إجمالي الوقت: 20 دقيقة ، دورات: 10 ق ON و 10 ق OFF عند 4 درجة مئوية(الشكل 3A).
  4. تأكيد الحمض النووي هو القص بشكل مناسب عن طريق فصل 10 ميكرولتر من الحمض النووي غير المُشحَن و10 ميكرولتر من الحمض النووي المُشَرَّد على هلام agarose بنسبة 1%. تكرار سونيكيشن أو تحسين حسب الحاجة (الشكل 3B).

9. بولي - C الذيل بالإضافة إلى نهاية 3 '(الشكل 3A)

  1. إعداد بولي جيم رد فعل وفقا للجدول 1.
  2. احتضنت رد فعل في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. تنقية تفاعل بولي-C مع 40 ميكرولتر من الخرز شبه المهاج لاختيار الحجم(الشكل 3A)باتباع الخطوات التالية.
    1. إضافة 40 ميكرولتر من الخرز شبه المغناطيسي اختيار حجم لكل عينة. دوامة ~ 5 ق أو ماصة صعودا وهبوطا.
    2. عينات احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    3. لفترة وجيزة، أنابيب الطرد المركزي لجمع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب (~ 2 s).
    4. نقل أنابيب إلى رف المغناطيسي واحتضان في درجة حرارة الغرفة ل ~ 2 دقيقة حتى الحل هو واضح.
    5. مع أنابيب على رف المغناطيسي، وإزالة بعناية فائقة.
    6. مع أنابيب على رف المغناطيسي، إضافة 200 ميكرولتر من الطازجة 80 إعداد الإيثانول ٪(لا تزعج الخرز).
    7. عينات احتضان لمدة 30 s على الأقل حتى حل واضح.
    8. مع أنابيب على رف المغناطيسي، وإزالة بعناية فائقة.
    9. كرر خطوة الغسيل (الخطوات 9.3.6 - 9.3.8).
    10. جمع السائل في الجزء السفلي من أنبوب باستخدام خطوة الطرد المركزي وجيزة (~ 2 s).
    11. نقل أنابيب إلى رف المغناطيسي وإزالة أي السائل المتبقية.
    12. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-5 دقيقة إلى عينات الجافة. لا أكثر من الجافة.
    13. إزالة أنابيب من رف المغناطيسي وإضافة 25 ميكرولتر من الماء لكل. دوامة ل ~ 5 ق أو ماصة صعودا وهبوطا.
    14. لفترة وجيزة، أنابيب الطرد المركزي لجمع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب (~ 2 s).
    15. نقل أنابيب إلى رف المغناطيسي والسماح للجلوس لمدة ~ 2 دقيقة حتى الحل هو واضح.
    16. مع أنابيب على الرف المغناطيسي، وإزالة السائل دون إزعاج الخرز ونقلها إلى أنبوب جديد (~ 23 ميكرولتر من الحمض النووي).

10. تضخيم وصلة Transposon (الشكل 3A)

  1. إعداد PCR 1 كما هو موضح في الجدول 1 لـ PCR المتداخلة الأولى(الجدول 2).
  2. تنفيذ PCR 1 باستخدام الشروط الموضحة في الجدول 1.
  3. تنقية منتجات PCR مع 40 ميكرولتر من الخرز شبه المغناطيسي لاختيار الحجم (الخطوات 9.3.1 - 9.3-12). إلوت في 50 ميكرولتر من الماء (الخطوات 9.3.13 - 9.3.16). عند هذه النقطة يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية.
  4. إعداد Streptavidin إلى جانب البارامغناطيسية الخرز:
    1. ريسوسبيند Streptavidin الخرز عن طريق هز بقوة.
    2. إضافة 32 ميكرولتر من الخرز لكل عينة إلى أنبوب جديد microcentrifuge.
      ملاحظة: يمكن إعداد الخرز لـ 6 + عينات في أنبوب واحد.
    3. نقل أنبوب إلى رف مغناطيسي. احتضان لمدة 2 دقيقة ~ حتى الحل هو واضح.
    4. مع أنبوب على رف المغناطيسي، وإزالة فائقة.
    5. إزالة أنبوب من رف المغناطيسي. غسل الخرز عن طريق resuspending في 1 مل 1X B&W العازلة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
    6. نقل أنبوب إلى رف المغناطيسي. احتضان لمدة 2 دقيقة ~ حتى الحل هو واضح.
    7. مع أنبوب على رف المغناطيسي، وإزالة عظمى.
    8. كرر خطوة الغسيل مع 1 مل 1x B&W العازلة (الخطوات 10.4.5 - 10.4.7) مرتين أكثر لمجموع 3 يغسل.
    9. إزالة أنبوب من رف المغناطيسي والخرز resuspend في 52 ميكرولتر من 2X B&W العازلة لكل عينة.
  5. الجمع بين 50 ميكرولتر من الخرز المعد مع 50 ميكرولتر من PCR1 المنقى (من الخطوة 10.3). ماصة لخلط.
  6. تدوير في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  7. غسل بعيدا الحمض النووي غير منضم:
    1. لفترة وجيزة، الطرد المركزي لجمع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب (~ 2 s).
    2. نقل أنبوب إلى رف المغناطيسي. احتضان لمدة 2 دقيقة ~ حتى الحل واضح.
    3. مع أنبوب على رف المغناطيسي، وإزالة عظمى.
    4. إزالة أنبوب من رف المغناطيسي، وغسل الخرز عن طريق resuspending في 100 μL 1X B&W العازلة و pipetting صعودا وهبوطا.
    5. نقل أنبوب إلى رف المغناطيسي. احتضان لمدة 2 دقيقة ~ حتى الحل واضح.
    6. مع أنبوب على رف المغناطيسي، وإزالة فائقة.
    7. كرر خطوات الغسيل مع 100 ميكرولتر لوتي (الخطوات 10.7.4 - 10.7.6) مرتين أكثر من ذلك لمجموع 3 يغسل.
  8. إعداد PCR 2 كما هو موضح في الجدول 1 لتضخيم وصلات transposon وإضافة الباركود واحد لكل عينة(الجدول 2 والجدول 3).
  9. تنفيذ PCR 2 باستخدام الشروط الموضحة في الجدول 1.
  10. تنقية مع 40 ميكرولتر من اختيار حجم الخرز شبه المغناطيسي (الخطوات 9.3.1 - 9.3.12). Elute في 17 ميكرولتر من الماء (الخطوات 9.3.13 - 9.3.16)، جمع ~ 15 ميكرولتر.
  11. كمّي تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الفلور. وينبغي أن تكون التركيزات النهائية ~ 50 إلى 250 نانوغرام /ميكرولتر.
  12. تقييم جودة الحمض النووي باستخدام الكهربة الشعرية القائمة على رقاقة (الشكل 4A).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تصف الطرق المبينة توليد مكتبة نقل عالية الكثافة في سلالة A. baumannii ATCC 17978 من خلال الاقتران البكتيري باستخدام E. coli MFD DAP-، الذي يكرر pJmid pJNW684 (الشكل 4B). البروتوكول المفصل يستخدم الاقتران البكتيرية ثنائية الوالدين لنقل pJNW684 من سلالة E. القولونية λpir+ المانحة إلى سلالة المتلقي A. baumannii. هذا هو وسيلة فعالة وغير مكلفة لتوليد مكتبات متحولة transposon كثيفة. اختلطت البكتيريا في نسب الأمثل ورصدت التزاوج على لوحات ليريا-بيرتاني أجار لمدة 1 ساعة(الشكل 1A). أثناء التزاوج، تم نقل transposon من سلالة المانحة إلى المتلقي، حيث إدراجه في gDNA (الشكل 1B). تم جمع التزاوجات، ما يقرب من 105 CFU/ مل تم حسابها ومطلية على 150 مم × 15 ملم لوحات أجار تكملها kanamycin. بعد 14 ح من النمو في 37 درجة مئوية، لوحات تحتوي على الآلاف من المستعمرات متفاوتة الحجم(الشكل 1C)مما يدل على جيل ناجح من مكتبة متحولة transposon. تم تجميع المسوخ المُدمجة في المُنقولات(الشكل 1D)والمجمدة في aliquots لمنع تكرار دورات التجميد والذوبان، والتي يمكن أن تضيف ضغطًا انتقائيًا على مكتبة الإدراج.

تم استخدام مكتبة متحولة A. baumannii المجمعة لتحديد عوامل اللياقة البدنية الهامة لمقاومة colistin تحت تركيزات subinhibitory من مضادات الميكروبات(الشكل 2B). وقد نمت المكتبة متحولة لمرحلة لوغاريتمي في غياب / وجود 0.5 ملغ / لتر colistin في مكررة لنضوب الخلايا المتحولة ترميز الإدراجات في الجينات التي تسهم في مقاومة colistin. تم عزل إجمالي gDNA لتجمع المكتبة المتبقية عن الثقافات التحكمية والتجريبية ومعالجتها لإعداد الحمض النووي لتسلسله (الشكل 3A).

تم تجزئة gDNA معزولة باستخدام القص الميكانيكية وأضيفت ذيل بولي جيم على شظايا الحمض النووي(الشكل 3A). بعد إضافة ذيل بولي-C، تم تنقية الحمض النووي وإثراء وصلات transposon الجينوم باستخدام التمهيدي محددة بولي-C تليها جولة ثانية من PCR باستخدام آخر التمهيدي بولي جيم محددة التي أدخلت موقع تسلسل P7 المطلوب لربط خلية تدفق Illumina وتوليد الكتلة، والباركود ستة قاعدة التي تستخدم لمكتبات demultiplex نشر تسلسل37،47. تم حساب تركيزات الحمض النووي وتم تحليل العينات باستخدام الكهرباء الشعرية المستندة إلى الرقائق لتأكيد الإنشاءات الناجحة للمكتبة(الشكل 4A)، والتي هي جاهزة لتسلسل عالي الإنتاجية.

تم تسلسل مكتبات الحمض النووي من قبل تسلسل الجيل القادم. تم تنفيذ دورة واحدة نهاية ، 50 تشغيل ، والتي أسفرت عن 30 مليون قراءات عالية الجودة / عينة توفير تغطية 62.5 أضعاف من مكتبة transposon. تم تعيين وصلات Transposon (يقرأ) إلى الجينوم المرجعي48, باستخدام برامج تحليل المعلوماتية الحيوية المتاحة تجاريا. تم مقارنة عدد القراءات في كل موقع الإدراج في عينات الإدخال ، (-) colistin شرط التحكم ، إلى عدد من يقرأ في عينات الإخراج ، (+) colistin حالة تجريبية ، وتم حساب درجات اللياقة البدنية لكل موقع الإدراج. ثم تم تجميع درجات اللياقة البدنية حسب الجينات. الجينات التي تثبت انخفاض درجات عندما نمت المكتبة في وجود colistin نسبة إلى عينات المدخلات واعتبرت محددات اللياقة البدنية لبقاء A. baumannii في تركيزات subinhibitory من colistin. على سبيل المثال، كانت عمليات إدخال المكونات المُدخلة في نظام PmrAB المكونين اثنين موجودة في عينة الإدخال، ولكن لم يتم العثور عليها في عينة الإخراج. PmrAB ينظم مباشرة التعبير عن pmrC، الذي ينقل فوسفويثانولامين على الدهون A لتحييد التهمة على سطح الخلية12،31. ويُعتقد أن تحييد شحنة السطح البكتيرية يقلل من الإمكانات الكهروستاتيكية المطلوبة للقتل بوساطة الكليستين. تحديد الجينات المنضب المعروف للمساهمة في النمط الظاهري المقاومة التحقق من صحة الأسلوب.

Figure 1
الشكل 1: التخطيطي لبناء مكتبة متحولة transposon. (أ) الاقتران البكتيري. وقد اختلطت سلالة "المانحين"، التي يشفر بها آلية نقل الملكية، مع سلالة "المتلقي". وقد رصدت الخليط على لوحات أجار LB وسمح للتزاوج لمدة 1 ح.(ب)جيل من مكتبة transposon. وقد نُقلت البلازميد التي تحمل آلة النقل من سلالة "المانح" إلى سلالة "المتلقي" وأدخل ال transposon عشوائيا في جميع أنحاء الجينوم من سلالة "المتلقي". (C) الاختيار. وكانت الخلايا الناتجة مطلية على لوحات أغار مكمّلة بالكناميسين لاختيارها لإدراج طفرات من مادة النوبرون. (D) المكتبة المجمعة. تم كشط المستعمرات من لوحات، resuspended في LB وتجميعها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: نتائج اقتران البكتيريا التمثيلية والتخطيطي للتجربة colistin Tn-seq. (أ)ممثل kanamycin لوحة الاختيار. وتنقسم اللوحة إلى خمسة أقسام متساوية. النقاط الزرقاء تمثل مستعمرة العد لتقدير A. baumannii popooni المسوخ. وقد تم حساب ما لا يقل عن ثلاثة ألواح منفصلة لحساب التقدير النهائي. (ب) تحديد عوامل اللياقة البدنية بتركيزات colistin subinhibitory. وقد نمت مكتبة نقل الروبل المجمعة إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي إما في غياب (السيطرة) أو في وجود (تجريبية) من colistin. وبمجرد أن وصلت الثقافات إلى الكثافة البصرية المناسبة، تم استنباط الخلايا واستخراج الغنا من كل عينة. تم اختبار كل حالة في نسخة مكررة لما مجموعه أربع عينات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مخطط انسيابي من مكتبة احمض الحمض النووي بناء لتسلسل موازي هائل وممثل gDNA القص. (أ)TN-seq مكتبة الحمض النووي بناء التخطيطي. بعد الاستخراج، تم تفتيت gDNA عن طريق القص الميكانيكية. وقد استُخدم نقلات الإكسيدنويتيديل الطرفية لإضافة ذيل بولي-سي إلى نهاية 3 من الحمض النووي المجزأ قبل تضخيم البوليستر من تقاطعات الجينوم المناقلة وإضافة الباركود. (ب) 1٪ agarose هلام من المكتبات المتحولة a. baumannii غير المُجَرَّد والمقطَّع بعد خطوة القص gDNA. تم استخدام سلم 1 Kb كعلامة الحمض النووي. تُقص gDNA مسحة في المقام الأول يتراوح بين ~ 100 و 500 أزواج قاعدة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تمثيل مراقبة الجودة (QC) النتائج وخريطة البلازميد تحمل الجينات نقل. (A) تتبع QC لبناء مكتبة الحمض النووي. هناك ذروة في ~ 350 أزواج قاعدة ، مما يدل على نجاح بناء المكتبة. إذا تم الكشف عن بعض الحمض النووي أكبر في نتائج مراقبة الجودة، يمكن تنظيف العينات أكثر لإزالة شظايا الحمض النووي كبيرة. (ب) Plasmid pJNW684 يتكون من همار 1 كوربون (الأخضر) مع كاسيت مقاومة كاناميسين (الأرجواني) لاختيار متحولة، جين ترميز البحارة مفرط النشاط Himar1 C9 transposase (الأحمر) تحت سيطرة A. baumannii 17978 المروج محددة (الأزرق), وهو جين مقاومة الأمبيسيلين(بلا,البرتقالي) وأصل RP4/oriT/oriR6K-مشروط من النسخ المتماثل (أصفر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

رد فعل اعداد الظروف
تفاعل بولي سي 30 ميكرولتر من gDNA القص
2.5 ميكرولتر من 9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP
10 ميكرولتر من 5X محطة ديوكسيكلوكلويديل transferase (Tdt) العازلة رد فعل
1.25 ميكرولتر من rTdt
6.25 ميكرولتر من الماء إلى 50 ميكرولتر		 احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة
PCR 1 23 ميكرولتر 3'بولي-C الحمض النووي النقي (عينة كاملة من الخطوة السابقة)
10 ميكرولتر 10x عالية الدقة الحمض النووي بوليميراز تفاعل مزيج
2 ميكرولتر 10 mM dNTPs
2 ميكرولتر 50 مللي متر ملغس 4
1 ميكرولتر 30 μM olj 510 البيوتين
3 ميكرولتر 30 ميكرومتر أولج 376
0.5 ميكرولتر عالية الدقة الحمض النووي البوليمرات
8.5 ميكرولتر الماء النقي إلى 50 ميكرولتر مجموع		 دورة 1: 2 دقيقة 94 درجة مئوية
15 دورة: 15 s 94 درجة مئوية
30 s 60 درجة مئوية
2 دقيقة 68 درجة مئوية
دورة 1: 4 دقيقة 68 درجة مئوية
عقد: ∞ 4 درجة مئوية
PCR 2 حبات مرتبطة بالحمض النووي من الخطوة السابقة
10 ميكرولتر 10x عالية الدقة الحمض النووي بوليميراز تفاعل مزيج
2 ميكرولتر 10 mM dNTP
2 ميكرولتر 50 مللي متر ملغس 4
1 ميكرولتر 30 ميكرومتر أولج 511
1 ميكرولتر 30 μM التمهيدي الباركود (الجدول 2)
0.5 ميكرولتر عالية الدقة الحمض النووي البوليمرات
33.5 ميكرولتر ماء نقي إلى 50 ميكرولتر		 دورة 1: 2 دقيقة 94 درجة مئوية
15 دورة: 15 s 94 درجة مئوية
30 s 60 درجة مئوية
2 دقيقة 68 درجة مئوية
دورة 1: 4 دقيقة 68 درجة مئوية
عقد: ∞ 4 درجة مئوية

الجدول 1: إعداد رد الفعل. الإعداد والشروط لردود الفعل بولي-C، PCR 1 و PCR 2.

الغرض اسم تسلسل
الهايّانات إلى نقل olj510-البيوتين البيوتين -GATGCCTTTTTGCGTTTCCTGCAGGGCGCG
الهايد إلى ذيل بولي-C olj376 GTGACTGGGTTCAGACGTGTGCTCTTCCCTGG
GGGGGGGGGGGG
متداخلة إلى محول transposon + P5:
P5 موقع التقاط - P5 موقع التسلسل - N5 –Tn		 olj511 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACCTCTTT
CCCTACACGAGCGCTCTTCCGATCTNNNNGGGGACTTA
TCATCCAACCTGTTAG
متداخلة إلى olj376: P7 موقع التسلسل
– الباركود XXXXXX – P7 موقع التقاط)		 Bc ## CAAGCAGAAGAGGCATACGAGATxxxxxxGTGGA
CTGGAGTTCAGACGTG
انظر الجدول 2 للاطلاع على الباركود المحددة***

الجدول 2: اُبُتات التضخيم من PCR. PCR التمهيدية التضخيم المستخدمة في البروتوكول لتضخيم وصلات transposon. يتم سرد الغرض من كل في العمود الأول.

التمهيدي قراءه الباركود تسلسل
BC1 ATCACG CGTGAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGT
ججتغكتيغغجكجاككجاكجتغ
BC2 CGATGT ACATCG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAC
ATCGGTGACTGGTTTTCAGACGTG
BC3 TTAGGC دول مجلس التعاون الخليجي CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCC
TAAGTGACTGGTTTTCAGACGTG
BC4 TGACCA TGGTCA CAAGCAGAAGACGGCATGAGATT
GGTCAGTGACTGGGTTCAGACGTG
BC5 ACAGTG CACTGT CAAGCAGAAGACGGCATGAGAT
CACTGTGACTGGGTTCAGACGTG
BC6 GCCAAT ATTGGC CAAGCAGAAGACGGCATGAGATA
TTGGCGTGACTGGGTTCAGACGTG
BC7 CAGATC غاتكتغ CAAGCAGAAGACGGCATGAGAT
جاتغت جيكتغيغغ تاغ جاغاكاتش غجتغ
BC8 ACTTGA TCAAGT CAAGCAGAAGACGGCATGAGAT
TCAAGTGACTGGTTTTCAGACGTG
BC9 جاتكاغ CTGATC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA
TCTGATCGTGACTGGGTTCAGACGTG
BC10 TAGCTT AAGCTA CAAGCAGAAGACGGCATGAGAT
AAGCTAGTGACTAGTTTTCAGACGTG
BC11 GGCTAC GTAGCC CAAGCAGAAGACGGCATGAGAT
GTAGCCGTGACTGGTTTTCAGACGTG
BC12 CTTGTA TACAAG CAAGCAGAAGACGGCATGAGATT
ACAAGGTGACTGGTTCAGACGTG
BC13 AGTCAA TTGACT CAAGCAGAAGACGGCATGAGAT
TTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTG
BC14 AGTTCC GGAACT CAAGCAGAAGACGGCATGAGATG
GAACTGTGACTGGGTTCAGACGTG
BC15 ATGTCA TGACAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA
TTGACATGTGACTGGGTTCAGACGTG
BC16 CCGTCC GGACGG CAAGCAGAAGACGGCATGAGAT
GGACGGGTGACTGGGTTCAGACGTG
BC17 جي تي باغوغ مركز التكتك CAAGCAGAAGACGGCATGAGAT
CTCTACGTGACTGGTTTTCAGACGTG
BC18 GTCCGC GCGGAC CAAGCAGAAGACGGCATGAGAT
GCGGACGTGACTGGTTTTCAGACGTG
BC19 جي تيغاا TTTCAC CAAGCAGAAGACGGCATGAGAT
TTTCACGTGACTGGTTTTCAGACGTG
BC20 GTGGCC GGCCAC CAAGCAGAAGACGGCATGAGATG
GCCACGTGACTGGGTTCAGACGTG
BC21 GTTTCG CGAAAC CAAGCAGAAGACGGCATGAGAT
CGAAACGTGACTGGGTTCAGACGTG
BC22 CGTACG CGTACG CAAGCAGAAGACGGCATGAGAT
CGTACGGTGACTGGGTTCAGACGTG
BC23 GAGTGG CCACTC CAAGCAGAAGACGGCATGAGATC
CACTCGTGACTGGGTTCAGACGTG
BC24 GGTAGC GCTACC CAAGCAGAAGACGGCATGAGAT
GCTACCGTGACTGGGTTCAGACGTG
BC25 ACTGAT ATCAGT CAAGCAGAAGACGGCATGAGAT
ATCAGTGACTGGTTTTCAGACGTG
BC26 ATGAGC GCTCAT CAAGCAGAAGACGGCATGAGAT
GCTCATGTGACTGGTTTTCAGACGTG
BC27 ATTCCT أجاغات CAAGCAGAAGACGGCATGAGATA
GGAATGTGACTGGGTTCAGACGTG
BC28 CAAAAG CTTTTG CAAGCAGAAGACGGCATGAGATC
TTTTGGTGACTGGTTTTCAGACGTG
BC29 CAACTA تاغ تى جي CAAGCAGAAGACGGCATGAGAT
TAGTTGGTGACTGGTTTTCAGACGTG
BC30 CACCGG CCGTG CAAGCAGAAGACGGCATGAGAT
CCGGTGACTGGAGTTCAGACGTG
BC39 CTATAC GTATAG CAAGCAGAAGACGGCATGAGAT
GTATAGGTGACTGGTTCAGACGTG
BC40 مركز 100 10 TCTGAG CAAGCAGAAGACGGCATGAGAT
TCTGAGGTGACTGTTTTCAGACGTG
BC42 TAATCG CGATTA CAAGCAGAAGACGGCATGAGATC
جاتاججتغتاجج تاتشكاغاكجتغ
BC43 TACAGC GCTGTA CAAGCAGAAGACGGCATGAGAT
GCTGTAGTGACTGGGTTCAGACGTG
BC44 تاتات أتاتا CAAGCAGAAGACGGCATGAGAT
ATTATAGTGACTGGGTTCAGACGTG
BC45 TCATTC GAATGA CAAGCAGAAGACGGCATGAGAT
GAATGAGTGACTGGGTTCAGACGTG
BC46 TCCCGA TCGGGA CAAGCAGAAGACGGCATGAGAT
TCGGGGTGACTGGTTTTCAGACGTG
BC47 TCGAAG CTTCGA CAAGCAGAAGACGGCATGAGATC
TTCGAGTGACTGGTTTTCAGACGTG
BC48 TCGGCA TGCCGA CAAGCAGAAGACGGCATGAGAT
TGCCGAGTGACTGGTTTTCAGACGTG

الجدول 3: الباركود التمهيدي. وتستخدم الباركود التمهيدي في الخطوة PCR الثانية لتضخيم وصلات transposon في حين إضافة موقع تسلسل P7 والباركود إلى amplicon. لا تحتاج إلى جميع التمهيديات الباركود لإنشاء مكتبة. مطلوب فقط التمهيديات الباركود لعدد من العينات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

A. baumannii هو تهديد ناشئ للصحة العامة العالمية بسبب الاكتساب السريع لـ AMR ضد العلاجيات "الخط الأخير" مثل colistin10,11,12,23,24,30,31. في العقود الأخيرة، Tn-seq لعبت دورا حاسما في توضيح التفاعلات النمط الجيني-النمط الظاهري عبر العديد من الأنواع البكتيرية وتوسيع فهمنا للوراثة البكتيرية34،35،42،43. وقد Tn-seq بروتوكولات مفيدة في تحديد الجينات الأساسية في الأنواع البكتيرية المتنوعة,مثل Campylobacter jejuni، المكورات العنقودية الذهبية، وpophyromonas gingivalisمسببات الأمراض اللثة ، وحتى مرض السل37،49،5151. Mycobacterium tuberculosis ما وراء تحديد الجينات الأساسية, وقد استخدمت TN-seq لتحديد الجينات مقاومة المضادات الحيوية في Pseudomonas aeruginosa, العديد من الجينات الضرورية المشروط في السالمونيلا typhimurium, والعديد من العلاقات genotype-النمط الظاهري في العقدية الرئوية52,53,54. في الآونة الأخيرة, تم توظيف تسلسل transposon من الكوليرا Vibrio في نموذج الأرانب الرضع من الكوليرا لتحديد الجينات التي هي مهمة لفي اللياقة البدنية في الجسم الحي أثناء العدوى47. هذه الدراسات تبين براعة TN-seq كما يمكن استخدامها لكل من في المختبر وفي دراسات في الجسم الحي.

والميزة الرئيسية لـ Tn-seq على الطرق الأخرى، مثل تقنيات microarray، 2D جل الكهرباء، وqPCR، هو أنه لا يتطلب معرفة مسبقة من الجينوم أو المعلوماتالجينومية 55. ولذلك، فإن التوليد المطفرة المترافقة مع التسلسل المتوازي الهائل يمكّن من دراسة الجينات واوجيناتها المعروفة وكذلك اكتشاف التفاعلات الجينية الجديدة. هنا قمنا بتقديم طريقة شاملة لتوليد مكتبة متحولة عالية الكثافة في A. baumannii لتحديد العوامل التي تعتبر ضرورية للياقة البدنية البكتيرية عندما تتعرض لتركيزات subinhibitory من colistin. وقد تم استخدام الطريقة الموصوفة بنجاح أيضًا في E. coli (بيانات غير منشورة)، مما يدل على أن النظام قابل لإجراء تحليل Tn-seq في مسببات الأمراض الأخرى السالبة بالغرام، بما في ذلك Enterobacteriaceae.

استخدام المناذرة لtransr transposons لطفرات ادمجية له العديد من المزايا. نشأت عائلة الناكرون من مضيفين eukaryotic واستخدمت على نطاق واسع لتوليد مكتبات متحولة مشبعة في مجموعات البكتيريا المختلفة. المنافر transposons هي المضيف مستقلة، مما يعني أن عمليات الإدراج العشوائية مستقرة يمكن أن يتحقق في غياب عوامل المضيف محددة40،41. بالإضافة إلى ذلك، فإن زخارف المنادلين البحرية لديها عدد محدد من أحداث الإدراج لأنها تدرج بشكل تفضيلي في زخارف الثيمين-أدينين ("TA")، مما يقلل من التحيز الإشائي ويؤدي إلى تحليل إحصائي أكثر قوة37،56،57،58.

تستخدم عدة طرق Tn-seq تعتمد على البحارةعملية الهضم لتقييد MmeI لتجزئة gDNA32،42،43. في حين أن تجزئة الحمض النووي الأنزيمية هي طريقة شعبية وناجحة، فإنه يضيف خطوات غير ضرورية إلى الإجراء ويزيد التحيز المحتمل37. لا تتطلب هذه التقنيات كميات كبيرة من المواد الأولية فحسب، بل يمكن أن تؤدي أيضاً إلى تمثيل غير متساوٍ لتسلسلات الإدخال في تحليلات المصب37،,59. مثل بعض الطرق الأخرى التي لا تعتمد على نشاط نيكلياز MmeI 52،60،61، تعتمد الطريقة الموضحة هنا على القص الميكانيكي لتفتيت gDNA ، وTDT لإضافة ذيل بولي سي إلى نهاية 3 من شظايا الحمض النووي. بالمقارنة مع تجزئة الحمض النووي الأنزيمي وأساليب ربط المحولات ، يتطلب هذا النهج كميات أصغر بكثير من بدء الحمض النووي مع توفير نتائج أكثر اتساقًا ، كما أنه يقلل من خطر التلوث المتبادل للحمض النووي ويقلل من فقدان العينة بسبب الحبس في أنبوب مختوم37،59،62. وعلاوة على ذلك، هذه الطريقة تسفر عن أطول، وتسلسل عالية الجودة يقرأ من 50 النيوكليوتيدات التي تساعد في رسم خرائط أكثر فعالية ودقة من تسلسل وتحليل أكثر قوة المصب37،59. إضافة ذيل بولي-C الاصطناعية يتجاهل التراكمات المحتملة التي قد تنتج عن التشرذم حيث تعتمد هذه الطريقة على ذيل بولي-سي المضافة بشكل خارجي كموقع اعتراف للواجهة التمهيدية العكسية، التي تحتوي على 16 نوكليوتيدات dG في نهايتها 3 و تسلسل خاص بتسلسل الجيل التالي (على سبيل المثال، تسلسل Illumina) في نهاية 5، إلى توليفة رئيس47،59. استخدام ذيل النيوكليوتيد الاصطناعية يوسع تطبيق هذه الطريقة إلى العديد من الجينومات متميزة مستقلة عن محتواها الأصلي59. في وقت لاحق، يتم تضخيم وصلات الجينوم transposon باستخدام التمهيدي بولي جيم محددة37. هذا البديل يبسط الإجراء من خلال القضاء على الحاجة إلى إنزيمات تقييد مكلفة، ربط محول، تشكيل خافمات محول والخطوات تنقية هلام. لقد قمنا بزيادة تحسين البروتوكول لتوليد بكفاءة مكتبات الإدراج transposon المشبعة للغاية في العديد من مسببات الأمراض ESKAPE سلبية الغرام, بما في ذلك Acinetobacter baumannii ويمكن استخدامها لدراسة التفاعلات الجينية تحت متنوعة في المختبر وفي ظروف الجسم الحي 10.

أحد القيود على موتاجينيسيس Tn هو أنه يعتمد على علامات مقاومة المضادات الحيوية للاختيار. ومع ذلك، العديد من مسببات الأمراض ESKAPE سلبية الغرام هي متعددة الأدوية أو مقاومة للأدوية على نطاق واسع، وهذا يعني أن المستخدم قد تحتاج إلى تبادل كاسيت المقاومة وفقا لمسببات الأمراض محددة من الفائدة. وعلاوة على ذلك, بعض العزل السريرية ليست قابلة للناتجات المطفرة باستخدام transposon أساس mariner.

خطوة حاسمة من البروتوكول هو حساب عدد من المسوخ TN لوحة. سوف يؤدي طلاء العديد من المستعمرات إلى حديقة يمكن أن تعقد تحليل المصب. إذا كانت المستعمرات قريبة جدا أو لمس، فإنها يمكن أن تضيف ضغطا انتقائيا غير مرغوب فيه على المكتبة التي يمكن أن تؤدي إلى القطع الأثرية. من الناحية المثالية، المستعمرات لن يكون لمس وتباعد بالتساوي عبر لوحة، كما هو موضح (الشكل 2A). وعلى العكس من ذلك، إذا كانت هناك مستعمرات قليلة جدا مطلية، فسيكون من الصعب عزل عمليات إدخال متعددة من نوع Tn في كل جين.

من المهم أيضاً تنفيذ عناصر التحكم المسرودة في الخطوة 2.18. كما ورد في حاشية القسم 3. 2، لا "المانح" أو "المتلقي" سلالة ينبغي أن تنمو على لوحات تكملها Ampicillin. وبما أن برنامج DAP الخارجية مطلوب لنمو سلالة "المانحين"، فإن أي نمو يشير إلى أن السلالة "المتلقية" تكرر pJNW684. هذه مشكلة كبيرة لأنه إذا لم يندمج transposon في gDNA، فإن عمليات القراءة التسلسلية ستخطط فقط إلى البلازميد، وليس موقع تكامل. في هذه الحالة، من المرجح ألا تسفر التجربة عن بيانات قابلة للاستخدام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل بتمويل من المعهد الوطني للصحة (منحة AI146829 إلى J.M.B.) وهو أمر يلقى التنويه به.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate Affymetrix 77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate Invitrogen 10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker Promega PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes Corning 351029
150mm x 15mm Petri Dishes Corning 351058
1X B&W N/A N/A Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid Alfa Aesar B2239103 used at 600 µM
2X B&W N/A N/A Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP N/A N/A 9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase Invitrogen 12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978 ATCC N/A AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L) Fisher Scientific BP1760 used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system BECKMAN COULTER A63881
BioAnalyzer Agilent G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis Agilent 5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP) New England Biolabs (NEB) N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack Invitrogen 12321D
E.coli MFD Dap- N/A N/A DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol Fisher Scientific A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials Corning 09-761-71
Glass beads Corning 72684
Glycerol Fisher Scientific G33
Inoculating loops Fisher Scientific 22-363-602 Scraping tool
Kanamycin Fisher Scientific BP906 used at 25 mg/L
LB agar, Miller Fisher Scientific BP1425
LB broth, Miller Fisher Scientific BP1426
LoTE N/A N/A Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer N/A N/A 9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.) Fisher Scientific BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution Fisher Scientific BP39920 Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Q33238
Qubit Assay Tubes Thermo Fisher Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath Qsonica Sonicators Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs (NEB) S1420S
TE buffer N/A N/A 10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt) Promega PR-M1875

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gould, I. M., Bal, A. M. New antibiotic agents in the pipeline and how they can help overcome microbial resistance. Virulence. 4 (2), 185-191 (2013).
  2. Holzheimer, R. G. Antibiotic induced endotoxin release and clinical sepsis: a review. Journal of Chemotherapy. 13 (1), Florence, Italy. Spec No 1 159-172 (2001).
  3. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). Antibiotic resistance threats in the United States, 2019. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). , (2019).
  4. Scholar, E. M., Pratt, W. B. The antimicrobial drugs. , Oxford University Press. New York. (2000).
  5. Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).
  6. Henderson, J. C., et al. The Power of Asymmetry: Architecture and Assembly of the Gram-Negative Outer Membrane Lipid Bilayer. Annual Review of Microbiology. 70, 255-278 (2016).
  7. Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).
  8. Raetz, C. R. H., Whitfield, C. Lipopolysaccharide Endotoxins. Annual Review of Biochemistry. 71 (1), 635-700 (2002).
  9. Kang, K. N., et al. Colistin heteroresistance in Enterobacter cloacae is regulated by PhoPQ-dependent 4-amino-4-deoxy- L -arabinose addition to lipid A. Molecular Microbiology. 111 (6), 1604-1616 (2019).
  10. Boll, J. M., et al. A penicillin-binding protein inhibits selection of colistin-resistant, lipooligosaccharide-deficient Acinetobacter baumannii. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (41), 6228-6237 (2016).
  11. Boll, J. M., et al. Reinforcing Lipid A Acylation on the Cell Surface of Acinetobacter baumannii Promotes Cationic Antimicrobial Peptide Resistance and Desiccation Survival. mBio. 6 (3), 00478 (2015).
  12. Arroyo, L. A., et al. The pmrCAB operon mediates polymyxin resistance in Acinetobacter baumannii ATCC 17978 and clinical isolates through phosphoethanolamine modification of lipid A. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (8), 3743-3751 (2011).
  13. Harris, T. L., et al. Small molecule downregulation of PmrAB reverses lipid A modification and breaks colistin resistance. ACS Chemical Biology. 9 (1), 122-127 (2014).
  14. Vaara, M. Agents that increase the permeability of the outer membrane. Microbiological Reviews. 56 (3), 395-411 (1992).
  15. Vaara, M. Polymyxins and their novel derivatives. Current Opinion in Microbiology. 13 (5), 574-581 (2010).
  16. Kassamali, Z., Rotschafer, J. C., Jones, R. N., Prince, R. A., Danziger, L. H. Polymyxins: wisdom does not always come with age. Clinical Infectious Diseases: An Official publication of the Infectious Diseases Society of America. 57 (6), 877-883 (2013).
  17. Ainsworth, G. C., Brown, A. M., Brownlee, G. Aerosporin, an antibiotic produced by Bacillus aerosporus Greer. Nature. 159 (4060), 263 (1947).
  18. Benedict, R. G., Langlykke, A. F. Antibiotic activity of Bacillus polymyxa. Journal of Bacteriology. 54 (1), 24 (1947).
  19. Stansly, P. G., Shepherd, R. G., White, H. J. Polymyxin: a new chemotherapeutic agent. Bulletin of the Johns Hopkins Hospital. 81 (1), 43-54 (1947).
  20. Hermsen, E. D., Sullivan, C. J., Rotschafer, J. C. Polymyxins: pharmacology, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and clinical applications. Infectious Disease Clinics of North America. 17 (3), 545-562 (2003).
  21. Pedersen, M. F., Pedersen, J. F., Adsen, P. O. A clinical and experimental comparative study of sodium colistimethate and polymyxin B sulfate. Investigative Urology. 9 (3), 234-237 (1971).
  22. Falagas, M. E., Bliziotis, I. A. Pandrug-resistant Gram-negative bacteria: the dawn of the post-antibiotic era. International Journal of Antimicrobial Agents. 29 (6), 630-636 (2007).
  23. Peleg, A. Y., Seifert, H., Paterson, D. L. Acinetobacter baumannii: Emergence of a Successful Pathogen. Clinical Microbiology Reviews. 21 (3), 538-582 (2008).
  24. Beceiro, A., Tomás, M., Bou, G. Antimicrobial resistance and virulence: a successful or deleterious association in the bacterial world. Clinical Microbiology Reviews. 26 (2), 185-230 (2013).
  25. Eliopoulos, G. M., Maragakis, L. L., Perl, T. M. Acinetobacter baumannii: Epidemiology, Antimicrobial Resistance, and Treatment Options. Clinical Infectious Diseases. 46 (8), 1254-1263 (2008).
  26. Lee, A., Nolan, A., Watson, J., Tristem, M. Identification of an ancient endogenous retrovirus, predating the divergence of the placental mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1626), 20120503 (2013).
  27. Moffatt, J. H., et al. Colistin Resistance in Acinetobacter baumannii Is Mediated by Complete Loss of Lipopolysaccharide Production. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (12), 4971-4977 (2010).
  28. Cai, Y., Chai, D., Wang, R., Liang, B., Bai, N. Colistin resistance of Acinetobacter baumannii: clinical reports, mechanisms and antimicrobial strategies. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (7), 1607-1615 (2012).
  29. Da Silva, G., Domingues, S. Interplay between Colistin Resistance, Virulence and Fitness in Acinetobacter baumannii. Antibiotics. 6 (4), 28 (2017).
  30. Chin, C. -Y., Gregg, K. A., Napier, B. A., Ernst, R. K., Weiss, D. S. A PmrB-Regulated Deacetylase Required for Lipid A Modification and Polymyxin Resistance in Acinetobacter baumannii. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7911-7914 (2015).
  31. Beceiro, A., et al. Phosphoethanolamine modification of lipid A in colistin-resistant variants of Acinetobacter baumannii mediated by the pmrAB two-component regulatory system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (7), 3370-3379 (2011).
  32. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-Wide Fitness and Genetic Interactions Determined by Tn-seq, a High-Throughput Massively Parallel Sequencing Method for Microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36, 1-24 (2015).
  33. Kwon, Y. M., Ricke, S. C., Mandal, R. K. Transposon sequencing: methods and expanding applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (1), 31-43 (2016).
  34. Yamaichi, Y., Dörr, T. Transposon Insertion Site Sequencing for Synthetic Lethal Screening. Methods in Molecular Biology. 1624, Clifton, N.J. 39-49 (2017).
  35. Goodman, A. L., et al. Identifying Genetic Determinants Needed to Establish a Human Gut Symbiont in Its Habitat. Cell Host & Microbe. 6 (3), 279-289 (2009).
  36. Wang, N., Ozer, E. A., Mandel, M. J., Hauser, A. R. Genome-Wide Identification of Acinetobacter baumannii Genes Necessary for Persistence in the Lung. mBio. 5 (3), 01163 (2014).
  37. Klein, B. A., et al. Identification of essential genes of the periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis. BMC Genomics. 13 (1), 578 (2012).
  38. Ferrieres, L., et al. Silent Mischief: Bacteriophage Mu Insertions Contaminate Products of Escherichia coli Random Mutagenesis Performed Using Suicidal Transposon Delivery Plasmids Mobilized by Broad-Host-Range RP4 Conjugative Machinery. Journal of Bacteriology. 192 (24), 6418-6427 (2010).
  39. Lim, L. M., et al. Resurgence of Colistin: A Review of Resistance, Toxicity, Pharmacodynamics, and Dosing. Pharmacotherapy. 30 (12), 1279-1291 (2010).
  40. Lampe, D. J., Churchill, M. E., Robertson, H. M. A purified mariner transposase is sufficient to mediate transposition in vitro. The EMBO Journal. 15 (19), 5470-5479 (1996).
  41. Mazurkiewicz, P., Tang, C. M., Boone, C., Holden, D. W. Signature-tagged mutagenesis: barcoding mutants for genome-wide screens. Nature Reviews. Genetics. 7 (12), 929-939 (2006).
  42. Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nature Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
  43. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Reviews. Microbiology. 11 (7), 3033 (2013).
  44. Liu, H., Bouillaut, L., Sonenshein, A. L., Melville, S. B. Use of a Mariner-Based Transposon Mutagenesis System To Isolate Clostridium perfringens Mutants Deficient in Gliding Motility. Journal of Bacteriology. 195 (3), 629-636 (2013).
  45. Singer, J. T., Finnerty, W. R. Insertional specificity of transposon Tn5 in Acinetobacter sp. Journal of Bacteriology. 157 (2), 607-611 (1984).
  46. Subashchandrabose, S., et al. Acinetobacter baumannii Genes Required for Bacterial Survival during Bloodstream Infection. mSphere. 1 (1), 13-15 (2015).
  47. Shull, L. M., Camilli, A. Transposon Sequencing of Vibrio cholerae in the Infant Rabbit Model of Cholera. Vibrio Cholerae. 1839, 103-116 (2018).
  48. Smith, M. G., et al. New insights into Acinetobacter baumannii pathogenesis revealed by high-density pyrosequencing and transposon mutagenesis. Genes & Development. 21 (5), 601-614 (2007).
  49. Stahl, M., Stintzi, A. Identification of essential genes in C. jejuni genome highlights hyper-variable plasticity regions. Functional & Integrative Genomics. 11 (2), 241-257 (2011).
  50. Chaudhuri, R. R., et al. Comprehensive identification of essential Staphylococcus aureus genes using Transposon-Mediated Differential Hybridisation (TMDH). BMC Genomics. 10 (1), 291 (2009).
  51. Griffin, J. E., et al. High-resolution phenotypic profiling defines genes essential for mycobacterial growth and cholesterol catabolism. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002251 (2011).
  52. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. mBio. 2 (1), 00315 (2011).
  53. Khatiwara, A., et al. Genome scanning for conditionally essential genes in Salmonella enterica Serotype Typhimurium. Applied and Environmental Microbiology. 78 (9), 3098-3107 (2012).
  54. van Opijnen, T., Camilli, A. A fine scale phenotype-genotype virulence map of a bacterial pathogen. Genome Research. 22 (12), 2541-2551 (2012).
  55. Hurd, P. J., Nelson, C. J. Advantages of next-generation sequencing versus the microarray in epigenetic research. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (3), 174-183 (2009).
  56. Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing. RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).
  57. Perry, B. J., Yost, C. K. Construction of a mariner-based transposon vector for use in insertion sequence mutagenesis in selected members of the Rhizobiaceae. BMC Microbiology. 14 (1), 298 (2014).
  58. Plasterk, R. H. A., Izsvák, Z., Ivics, Z. Resident aliens: the Tc1/ mariner superfamily of transposable elements. Trends in Genetics. 15 (8), 326-332 (1999).
  59. Lazinski, D. W., Camilli, A. Homopolymer tail-mediated ligation PCR: a streamlined and highly efficient method for DNA cloning and library construction. BioTechniques. 54 (1), (2013).
  60. Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (38), 16422-16427 (2009).
  61. Langridge, G. C., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).
  62. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved Protocols for the Illumina Genome Analyzer Sequencing System. Current Protocols in Human Genetics. 62 (1), (2009).

Tags

علم الأحياء العدد 161 transposon عالية الإنتاجية التسلسل غرام سلبي Acinetobacter baumannii colistin ESKAPE
توليد مكتبات الإدراج Transposon في البكتيريا السلبية الغرامية لتسلسل عالي الإنتاجية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kazi, M. I., Schargel, R. D., Boll,… More

Kazi, M. I., Schargel, R. D., Boll, J. M. Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing. J. Vis. Exp. (161), e61612, doi:10.3791/61612 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter