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Biology

उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया में ट्रांसपोसन प्रविष्टि पुस्तकालयों का सृजन

Published: July 7, 2020 doi: 10.3791/61612
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Texas at Arlington

Summary

हम ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया में संतृप्त ट्रांसपोसन उत्परिवर्ती पुस्तकालयों और उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए डीएनए एम्प्लिकॉन पुस्तकालयों की बाद की तैयारी उत्पन्न करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। एक उदाहरण के रूप में, हम एस्केपी रोगजनक, Acinetobacter baumanniiपर ध्यान केंद्रित है, लेकिन यह प्रोटोकॉल ग्राम-नकारात्मक जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उत्तरदायी है।

Abstract

ट्रांसपोसन अनुक्रमण (टीएन-एसईक्यू) एक शक्तिशाली तरीका है जो ट्रांसपोसन म्यूटाजेनेसिस और बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण को जोड़ती है ताकि जीन और रास्तों की पहचान की जा सके जो पर्यावरणीय स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला के तहत बैक्टीरियल फिटनेस में योगदान देते हैं। टीएन-एसईक्यू अनुप्रयोग व्यापक हैं और न केवल जीव स्तर पर जीनोटाइप-फेनोटाइप संबंधों की जांच सक्षम है बल्कि जनसंख्या, समुदाय और प्रणालियों के स्तर पर भी। ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया एंटीमाइक्रोबियल रेजिस्टेंस फेनोटाइप से अत्यधिक जुड़े होते हैं, जिससे एंटीबायोटिक उपचार विफलता की घटनाएं बढ़ी हैं। रोगाणुरोधी प्रतिरोध को अन्यथा घातक एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति में बैक्टीरियल विकास के रूप में परिभाषित किया गया है। "लास्ट-लाइन" एंटीमाइक्रोबियल कोलिस्टिन का उपयोग ग्राम-नकारात्मक जीवाणु संक्रमणों के इलाज के लिए किया जाता है। हालांकि, Acinetobacter baumannii सहित कई ग्राम नकारात्मक रोगजनकों आणविक तंत्र की एक श्रृंखला के माध्यम से कोलिस्टिन प्रतिरोध विकसित कर सकते हैं, जिनमें से कुछ Tn-seq का उपयोग कर विशेषता थे । इसके अलावा, कोलिस्टिन प्रतिरोध को विनियमित करने वाले सिग्नल ट्रांसडक्शन रास्ते ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के भीतर भिन्न होते हैं। यहां हम ए बाउमैनी में ट्रांसपोसन म्यूटेगेनिसिस की एक कुशल विधि का प्रस्ताव करते हैं जो प्रतिबंध एंजाइमों, एडाप्टर लिगेशन और जेल शुद्धिकरण की आवश्यकता को नष्ट करके एक संतृप्त ट्रांसपोसन प्रविष्टि पुस्तकालय और एम्प्लिकॉन पुस्तकालय निर्माण की पीढ़ी को सुव्यवस्थित करता है। यहां वर्णित तरीकों से आणविक निर्धारकों का गहराई से विश्लेषण किया जा सकेगा जो कोलिस्टिन के साथ चुनौती दिए जाने पर ए बॉमनी फिटनेस में योगदान देते हैं। प्रोटोकॉल अन्य ग्राम-नकारात्मक एस्कापे रोगजनकों पर भी लागू होता है, जो मुख्य रूप से दवा प्रतिरोधी अस्पताल-अधिग्रहीत संक्रमणों से जुड़े होतेहैं।

Introduction

एंटीबायोटिक दवाओं की खोज निस्संदेह 20वीं सदी की सबसे प्रभावशाली स्वास्थ्य से संबंधित घटनाओं में से एक है । न केवल एंटीबायोटिक्स गंभीर बैक्टीरियल संक्रमण को जल्दी से हल करते हैं, वे आधुनिक चिकित्सा में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। नवजात चिकित्सा और कीमोथेरेपी में प्रमुख सर्जरी, प्रत्यारोपण और प्रगति रोगियों को जीवन के लिए खतरा संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील छोड़ देते हैं और ये उपचार एंटीबायोटिक दवाओं के बिना संभव नहीं होंगे1,,2। हालांकि, मानव रोगजनकों के बीच एंटीबायोटिक प्रतिरोध के तेजी से विकास और प्रसार ने एंटीबायोटिक दवाओं के सभी चिकित्सकीय रूप से महत्वपूर्ण वर्गों की प्रभावकारिता में काफी कमी आई है3। कई जीवाणु संक्रमण है कि एक बार आसानी से एंटीबायोटिक दवाओं के उपचार के साथ मंजूरी दे दी थी, अब क्लासिक उपचार प्रोटोकॉल का जवाब है, वैश्विक सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए एक गंभीर खतरापैदा 1। एंटीमाइक्रोबियल प्रतिरोध (एएमआर) वह जगह है जहां जीवाणु कोशिकाएं एंटीबायोटिक दवाओं की अन्यथा घातक सांद्रता में बढ़ती हैं, चाहे उपचार अवधि4,,5 कीपरवाहकिए बिना। एएमआर को विनियमित करने वाले आणविक और जैव रासायनिक कारकों को समझने की तत्काल आवश्यकता है, जिससे वैकल्पिक रोगाणुरोधी विकास का मार्गदर्शन करने में मदद मिलेगी । विशेष रूप से, एस्कापे रोगजनक नैदानिक सेटिंग्स में समस्याग्रस्त हैं और व्यापक एएमआर से जुड़े हैं। इनमें ईनेटरोकोकस फेक्यूम, एसटैफिलोकोकस ऑरियस, केलेबसीला निमोनिया, एकसिनेटोबैक्टर बाउमैनी, पीसेडोमोनास एरुगिनोसा और ईएनटीरोबैक्टर एसपीपी शामिल हैं। जबकि कई तंत्र एस्केपे रोगजनकों में एएमआर में योगदान देते हैं, बाद के चार जीव ग्राम-नकारात्मक हैं।

ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया एक परिभाषित बाहरी झिल्ली को इकट्ठा करते हैं जो उन्हें प्रतिकूल पर्यावरणीय स्थितियों से बचाता है। बाहरी झिल्ली कोशिका में एंटीबायोटिक दवाओं जैसे जहरीले अणुओं के प्रवेश को प्रतिबंधित करने के लिए एक पारमिबिलिटी बाधा के रूप में कार्य करती है। अन्य जैविक झिल्ली के विपरीत, बाहरी झिल्ली विषम है। बाहरी पत्रक सतह से उजागर लिपोपोलिनासैकराइड से समृद्ध है, जबकि आंतरिक पत्रक फॉस्फोलिपिड6का मिश्रण है। लिपोपोलिनासैकराइड अणुओं को बाहरी झिल्ली में एक संरक्षित लिपिड द्वारा लंगर डाला जाता है जो लिपिड बाइलेयर7के भीतर एम्बेडेड एक मोइटी है । विहित लिपिड सबसे अधिक ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के विकास के लिए एस्चेरिचिया कोलाई लिपोपॉलीसकैचराइड का एक डोमेन आवश्यक है और इसे नौ-चरणों वाले एंजाइमेटिक मार्ग द्वारा संश्लेषित किया जाता,है जो ग्राम-नकारात्मक जीवों6,,7,8में सबसे मौलिक और संरक्षित मार्गों में से एक है।

पॉलीमाइक्सिन्स एंटिक एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड्स होते हैं जो लिपिड को बाहरी झिल्ली को परेशान करने और कोशिका को लाइसे करने के लिए लिपोपोलिनासैकराइड के डोमेन को लक्षित करते हैं। पॉलीमाइक्सिन के सकारात्मक आवेशित अवशेषों और नकारात्मक आवेशित लिपिड एक फॉस्फेट समूहों के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत बैक्टीरियल कोशिका झिल्ली को बाधित करती है जिससे अंततः कोशिका मृत्यु9,10,11,12,,13हो जाती है । कोलिस्टिन (पॉलीमाइक्सिन ई) एक अंतिम-रिसॉर्ट एंटीमाइक्रोबियल है जिसका उपयोग मल्टीड्रग प्रतिरोधी ग्राम-नकारात्मक नोसोकोमियल रोगजनकों के कारण संक्रमणों के इलाज के लिए किया जाता है, जैसे कि एसिनेटोबैक्टर बाउमैनी14,15,,16।, सबसे पहले 1947 में खोजा गया, पॉलीमाइक्सिन मिट्टी के बैक्टीरिया, पैनिबासिलस पॉलीमाइक्सा17, 18,,19,19द्वारा उत्पादित होते हैं। महत्वपूर्ण नेफ्रो और न्यूरोटॉक्सिकिटी20, 21,21की रिपोर्ट के कारण उनके नैदानिक उपयोग के सीमित होने से पहले वर्षों तक ग्राम-नकारात्मक संक्रमणों का इलाज करने के लिए पॉलीमाइक्सिन निर्धारित किए गए थे।

ए baumannii एक nosocomial ग्राम नकारात्मक रोगजनक है कि नाटकीय रूप से रुग्णता और हाल के दशकों में रोगी परिणामों की मृत्यु दर में वृद्धि हुई है22। क्या एक बार एक कम खतरे रोगजनक के रूप में माना जाता था, अब अपने अविश्वसनीय AMR प्राप्त करने की क्षमता और महामारी23, 24,24के उच्च जोखिम के कारण दुनिया भर में अस्पताल का अधिग्रहण संक्रमण के लिए एक महत्वपूर्ण जोखिम बन गया है । ए Baumannii संयुक्त राज्य अमेरिका में nosocomial संक्रमण के 10% से अधिक के लिए खातों । रोग निमोनिया, जीवाणु, मूत्र पथ संक्रमण, त्वचा और नरम ऊतक संक्रमण, दिमागी बुखार, और एंडोकार्डाइटिस25के रूप में प्रकट होता है । ए बॉमनी संक्रमण के लिए उपचार विकल्प लगभग सभी एंटीबायोटिक वर्गों के खिलाफ प्रतिरोध के कारण घट गए हैं, जिनमें β-लैक्टाम्स, फ्लोरोक्विनोलोन, टेट्रासाइक्लिन और अमीनोगलिकोसाइड्स23,,24शामिल हैं। मल्टीड्रग प्रतिरोधी, बड़े पैमाने पर दवा प्रतिरोधी और पैन-ड्रग प्रतिरोधी ए बाउमैनी आइसोले की व्यापकता ने कोलिस्टिन उपचार में पुनरुत्थान का नेतृत्व किया है, जिसे मल्टीड्रग प्रतिरोधी ए बाउमानीके खिलाफ अभी भी प्रभावी कुछ शेष चिकित्सीय विकल्पों में से एक माना जाता था। तथापि , ए. बॉमनी आइसोले के बीच कोलिस्टिन प्रतिरोध ने वैश्विक जन स्वास्थ्य 10 , 11 ,12,13,27,30,,,27,31के लिए अपना खतरा और बढ़ा दिया है ।3031

ट्रांसपोसन अनुक्रमण (टीएन-एसईक्यू) जैसी उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों में हाल की प्रगति ने विट्रो और वीवो मेंबैक्टीरियल फिटनेस की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान किए हैं। टीएन-एसईक्यू एक शक्तिशाली उपकरण है जिसे बैक्टीरिया में जीनोटाइप-फेनोटाइप इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए लीवरेज किया जा सकता है। टीएन-एसईक्यू मोटे तौर पर बैक्टीरियल रोगजनकों में लागू होता है, जहां यह पारंपरिक ट्रांसपोसन म्यूटेनेसिस को तेजी से मानचित्र प्रविष्टि साइटों के लिए बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण के साथ जोड़ती है, जिसका उपयोग डीएनए म्यूटेशन को जीनोम-वाइड स्केल32, 33,,34,,,35पर फेनोटाइपिक वेरिएंट से जोड़ने के लिए किया जा सकता है।34 जबकि ट्रांसपोसन म्यूटेनेसिस विधियों को पहले वर्णित किया गया है, सामान्य कदम समान33हैं। सबसे पहले, ट्रांसपोसन म्यूटागेनेसिस का उपयोग करके एक प्रविष्टि पुस्तकालय उत्पन्न होता है, जहां जनसंख्या के भीतर प्रत्येक जीवाणु कोशिका जीनोमिक डीएनए (gDNA) के भीतर एक ट्रांसपोसन प्रविष्टि तक सीमित है। म्यूटेनेसिस के बाद, व्यक्तिगत म्यूटेंट पूल किए जाते हैं। gDNA सम्मिलन उत्परिवर्ती पूल से निकाला जाता है और ट्रांसपोसन जंक्शनों को परिलक्षित किया जाता है और उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के अधीन किया जाता है। पढ़ता सम्मिलन साइटों का प्रतिनिधित्व करता है, जिसे जीनोम में मैप किया जा सकता है। ट्रांसपोसन सम्मिलन जो फिटनेस को कम करते हैं, जल्दी से आबादी से बाहर आते हैं, जबकि लाभकारी सम्मिलन समृद्ध होते हैं। टीएन-एसईक्यू ने तनाव३३में जीन बैक्टीरियल फिटनेस को कैसे प्रभावित करते हैं, इस बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है ।

PJNW684 में एन्कोडेड हिमार 1 मेरिनर ट्रांसपोसन सिस्टम को विशेष रूप से ट्रांसपोसन म्यूटेनेसिस के उद्देश्य से बनाया और अनुकूलित किया गया था। इसमें एक मेरिनर-फैमिलीट्रांसपोसन शामिल है, जो कानमाइसिन प्रतिरोध जीन को फ्लैंक कर रहा है, जिसका उपयोग ए बाउमैनी में ट्रांसपोसन प्रविष्टि म्यूटेंट के चयन के लिए किया जाता है। यह एक ए बाउमैनी विशिष्ट प्रमोटर को भी एन्कोड करता है जो ट्रांसपोसेस एन्कोडिंग जीन36की अभिव्यक्ति को चलाता है। मेरिनर-आधारितट्रांसपोसन में कानमाइसिन प्रतिरोध जीन के डाउनस्ट्रीम में दो ट्रांसलेशनल टर्मिनेटर भी होते हैं, जो प्रविष्टि37के डाउनस्ट्रीम के माध्यम से पढ़ने से रोकता है। pJNW684 भी एक RP4/oriT/oriR6K-प्रतिकृति की सशर्त उत्पत्ति जो λpir दाता तनाव द्वारा योगदान जीन की आवश्यकता को दोहराने के लिए३८किया जाता है । λpir जीन के अभाव में, ट्रांसपोजिशन मशीनरी ले जाने वाले pJNW684 वेक्टर ए बॉमनी ,प्राप्तकर्ता तनाव10,36,38में दोहराने में सक्षम नहीं होंगे।, इसलिए, बैक्टीरियल कंजूगेशन के दौरान, प्लाज्मिड की पृष्ठभूमि प्रविष्टि के बिना प्राप्तकर्ता जीनोम में केवल ट्रांसपोसन डाला जाता है, जिसमें ट्रांसपोसेस जीन होता है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि प्लाज्मिड परिणामों के साथ ट्रांसपोसेज गतिविधि का नुकसान एकल, स्थिर पक्षांतरण घटना में होता है जो ट्रांसपोसन को प्राप्तकर्ता जीनोम में सम्मिलित करने के बाद विभिन्न स्थानों पर जाने से रोकता है।

pJNW648 भी एक और ग्राम नकारात्मक जीव, ई. कोलाईमें गतिविधि के लिए परीक्षण किया गया है । ई. कोलाई तनाव W3110 में एक संतृप्त Tn-seq पुस्तकालय की सफल विधानसभा ने संकेत दिया कि सिस्टम एंटेरोबैक्टीरिया सहित रोगजनकों की एक विस्तृत श्रृंखला में म्यूटेनेसिस करने के लिए उत्तरदायी है। इसके अलावा, ए baumannii विशिष्ट प्रमोटर है कि स्थानांतरित अभिव्यक्ति ड्राइव जल्दी से एक प्रजाति विशिष्ट प्रमोटर के साथ विमर्श किया जा सकता है । अंत में, कनामाइसिन प्रतिरोध जीन का अध्ययन किया जा रहा जीव के एएमआर फेनोटाइप के आधार पर अन्य प्रतिरोध कैसेट के लिए आदान-प्रदान किया जा सकता है।

ए बॉमनी में कोलिस्टिन प्रतिरोध में योगदान देने वाला एक कारक अपर्याप्त खुराक का प्रशासन है, जहां बैक्टीरिया गैर-घातक स्तर39पर चयनात्मक दबाव के संपर्क में हैं। कई रिपोर्टों से पता चला है कि उपनिषदीय रोगाणुरोधी सांद्रता विनियमित प्रतिक्रियाओं को प्रेरित कर सकती है जो सेल फिजियोलॉजी को बदल देती हैं ताकि संपूर्ण जीवाणु जनसंख्या11,12,30,31की संवेदनशीलता को कम कियाजा30सके । टीएन-एसईक्यू का उपयोग करके, हमने उन कारकों की खोज की जो कोलिस्टिन के अवरोधक 10 और उपभिक्षा सांद्रता के संपर्क में आने के बाद ए बॉमनी स्ट्रेन एटीसीसी17978 में कोलिस्टिन प्रतिरोध को विनियमित करते हैं। यह उदाहरण एक टीएन-सेक्यू विधि का विवरण देता है जो ट्रांसपोसंस40, 41,41के मेरिनर-आधारित परिवार का उपयोग करके संतृप्त ट्रांसपोसन उत्परिवर्तीपुस्तकालय के निर्माण और संवर्धन को सुव्यवस्थित करता है। जबकि,कई टीएन-सेक्यू प्रोटोकॉल 20,000 - 100,000 म्यूटेंट35,42,43, 44,,,1044,45,46उत्पन्न करते हैं, यहां वर्णित प्रोटोकॉल तेजी से 400,000 + म्यूटेंट की ट्रांसपोसन लाइब्रेरी उत्पन्न कर सकता है, जो मोटे तौर पर ए baumannii10 में हर 10 आधार जोड़े एक ट्रांसपोसन प्रविष्टि के बराबर है ., इसके अलावा, पुस्तकालय के आकार को महत्वपूर्ण अतिरिक्त प्रयास के बिना बढ़ाया जा सकता है। यह विधि प्रतिबंध एंडोक्यूक्लिस, एडाप्टर लिगेशन और जेल शुद्धिकरण की आवश्यकता को भी समाप्त करती है, जो अंतिम पुस्तकालय विविधता को कम कर सकती है।

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Protocol

1. बैक्टीरियल स्ट्रेन की तैयारी

  1. लकीर "दाता" तनाव(ई. कोलाई MFD डीएपी-/pJNW684, सामग्री की मेज)लुरिया पर अलग कालोनियों के लिए-Bertani आगर ६०० μM डायमियोपेमिलिक एसिड (डीएपी), १०० मिलीग्राम/एल एम्पीसिलिन के और 25 मिलीग्राम/एल kanamycin के साथ पूरक ।- रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया। एक अलग कॉलोनी का उपयोग करना, लुरिया शोरबा (पौंड) के ५० मिलीएल टीका ६०० μM डीएपी, १०० मिलीग्राम/ampicillin के एल और 25 मिलीग्राम/L kanamycin के साथ एक २५० मिलीएल Erlenmeyer फ्लास्क में पूरक और यह "दाता" के रूप में लेबल ।
  2. लकीर "प्राप्तकर्ता" तनाव(ए baumannii तनाव एटीसीसी 17978, सामग्री की मेज)लुरिया-Bertani आगर पर अलग कालोनियों के लिए. रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया। एक अलग कॉलोनी का उपयोग करना, 250 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में एलबी के 50 एमएल को टीका लगाएं और इसे "प्राप्तकर्ता" के रूप में लेबल करें।
  3. दोनों संस्कृतियों ("दाता" और "प्राप्तकर्ता") मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।

2. बैक्टीरियल संभोग

  1. 50 एमएल शंकु ट्यूबों के लिए रातोंरात संस्कृतियों हस्तांतरण।
  2. 7 मिनट के लिए 5,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र का उपयोग करके प्राप्तकर्ता और दाता संस्कृतियों दोनों को गोली करें।
  3. सुपरनैंट को त्यागें और अवशिष्ट एंटीबायोटिकदवाओं को धोने के लिए डीएपी के साथ पूरक एलबी के 35 एमएल में "दाता" स्ट्रेन पेलेट को फिर से खर्च करें।
  4. 7 मिनट के लिए 5,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र का उपयोग कर "दाता" तनाव कोशिकाओं को गोली दें।
  5. सुपरनैंट को त्यागें और डीएपी के साथ पूरक एलबी के 4.5 एमएल में "दाता" स्ट्रेन पेलेट को फिर से खर्च करें। 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का इस्तेमाल करें।
  6. पुनर्संरित "दाता" तनाव को "प्राप्तकर्ता" स्ट्रेन ट्यूब में स्थानांतरित करें, जिसमें पेलेट "प्राप्तकर्ता" कोशिकाएं शामिल हैं। संस्कृतियों को मिलाने के लिए स्टेप 2.5 से उसी 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें। तुरंत अगले कदम पर ले जाएं।
    नोट: अंतिम निलंबन की कुल मात्रा 5 एमएल होनी चाहिए।
  7. डीएपी (प्रति प्लेट 5-7 बूंदों)(चित्रा 1A)के साथ पूरक एलबी एगर प्लेटों पर व्यक्तिगत 100 माइक्रोल बूंदों के रूप में संभोग निलंबन वितरित करें।
  8. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट प्लेटें।
  9. बूंदों को परेशान किए बिना, ध्यान से प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें और संस्कृतियों को 1 घंटे के लिए दोस्त बनाने की अनुमतिदें।
    नोट: इनक्यूबेशन बहन म्यूटेंट के 1 घंटे जोखिम पीढ़ी से अधिक अवधि ।
  10. इनक्यूबेशन के बाद, प्लेटों से बैक्टीरिया को फिर से खर्च करके प्रत्येक प्लेट और फसल पर पौंड का 1.5 एमएल जोड़ें। रीसेपेशन के लिए 1 एमएल माइक्रोपिपेट का इस्तेमाल करें। अंतिम मात्रा लगभग 12 - 15 एमएल होनी चाहिए।
  11. 50 एमएल शंकुदाता में काटी गई कोशिकाओं को मिलाएं।
  12. 7 मिनट के लिए 5,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र का उपयोग कर संभोग कोशिकाओं को गोली।
  13. अवशिष्ट डीएपी को हटाने के लिए एलबी के 50 एमएल में सुपरनेट और रिसिप्ट कोशिकाओं को त्यागें।
  14. 7 मिनट के लिए 5,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र का उपयोग कर संभोग गोली।
  15. वॉश स्टेप (चरण 2.13 और 2.14) दोहराएं।
  16. 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, एलबी के 10 एमएल में गोली को 25% ग्लाइसरोल के साथ फिर से ढूँढें।
  17. धोया कोशिकाओं का उपयोग करना, पौंड शोरबा (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000, 1:100,000) में पांच धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाते हैं ।
  18. बाँझ कांच के मोतियों का उपयोग करके 4 अलग-अलग प्लेटों पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के 100 μL फैलाएं: लुरिया-बर्टानी एगर को कानमाइसिन के साथ पूरक, एम्पीसिलिन के साथ पूरक एगर, आगर को डीएपी और एगर के साथ पूरक किया गया।
  19. रात 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट प्लेटें।
  20. 1 एमएल एलिकोट्स में शेष संभोग को अलीकोट करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. ट्रांसपोसन लाइब्रेरी के उचित कमजोर पड़ने का निर्धारण करें

  1. रातोंरात प्लेटों से रिकॉर्ड कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां (सीएलयू) ।
  2. प्रत्येक अलग प्लेट की स्थिति(चित्रा 2A)के लिए गिनती कालोनियों के साथ एक प्लेट छवि ।
    नोट: दोनों "दाता" और "प्राप्तकर्ता" उपभेदों को डीएपी के साथ पूरक आगर प्लेटों पर विकसित करना चाहिए, इसलिए सबसे चढ़ाया कमजोर पड़ने से लॉन निकलेगा। केवल "प्राप्तकर्ता" तनाव आगर प्लेटों पर बढ़ सकता है। न तो "दाता" और न ही "प्राप्तकर्ता" तनाव एम्पीसिलिन के साथ पूरक आगर प्लेटों पर विकसित कर सकते हैं, तो वहां कोई नहीं होना चाहिए/ ट्रांसपोसन प्रविष्टि को एन्कोड करने वाली केवल लक्षित तनाव कोशिकाएं कनामाइसिन के साथ पूरक आगर प्लेटों पर बढ़ सकती हैं। कालोनियों के आकार में भिन्न होना चाहिए, जीन में ट्रांसपोसन सम्मिलन का संकेत है कि कनामाइसिन के साथ पूरक आगर पर फिटनेस में योगदान ।
  3. कानामाइसिन के साथ पूरक एलबी आगर प्लेटों पर कालोनियों की संख्या की गणना करके जमे हुए संभोग में ट्रांसपोसन म्यूटेंट की संख्या की गणना करें।
    नोट: ए baumannii जीनोम (लगभग 4 एमबीपीएस) के लिए, लक्ष्य के बारे में ४००,००० कालोनियों प्राप्त करने के लिए एक उच्च संकल्प उत्परिवर्ती पुस्तकालय (लगभग एक ट्रांसपोसन प्रविष्टि/10 आधार जोड़े) उत्पन्न करने के लिए किया गया था । हालांकि, इस संख्या को लक्षित प्रजातियों के जीनोम आकार के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए।)

4. अंतिम जीवाणु उत्परिवर्ती पुस्तकालय की पीढ़ी

  1. बर्फ पर जमे हुए संभोग का एक बहाना गल।
  2. 150 मिमी लुरिया-बर्टानी आगर प्लेटों पर प्लेट संभोग चरण 3.1 में गणना किए गए सीएफएस के आधार पर कानमाइसिन के साथ पूरक है। चढ़ाना से पहले प्रति 150 माइक्रोन प्रति 13,333 कॉलोनियों उपज के लिए पौंड के साथ मात्रा समायोजित करें।
    नोट: यहां CFU गिनती के बारे में १०५ CFU/mL होना निर्धारित किया गया था, तो संभोग की मात्रा प्लेट प्रति १३,३३३ कालोनियों प्राप्त करने के लिए समायोजित किया गया था के रूप में यह प्लेटों भीड़ के बिना एक उच्च संकल्प उत्परिवर्ती पुस्तकालय के लिए 30 प्लेटों पर कालोनियों की एक इष्टतम संख्या प्रदान करेगा ।
  3. 400,000 कॉलोनियों(चित्रा 1C)प्राप्त करने के लिए कनमाइसिन के साथ पूरक 30 x 150 मिमी लुरिया-बर्टानी आगर प्लेटों पर प्रति प्लेट कमजोर पड़ने के 150 माइक्रोन फैलाने के लिए बाँझ ग्लास मोतियों का उपयोग करें।
    नोट: बाँझ छड़ या बाँझ स्प्रेडर उपकरण के किसी भी प्रकार (यानी, कांच मोती) प्लेटों पर बैक्टीरिया फैल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  4. अतिरिक्त संभोग युक्त उपयोग की गई ट्यूब का निपटान करें।
    नोट: फ्रीज/गल चक्र जीवाणु संस्कृति है, जो Tn-seq प्रयोग परिणाम तिरछा कर सकते है पर चयनात्मक दबाव कहते हैं । हर बार एक ताजा aliquot का प्रयोग करें।
  5. 14 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट प्लेटें।
    नोट: इनक्यूबेशन समय ओवरग्रोथ (को छूने वाली कालोनियों) को रोकने के लिए अनुकूलित किया जाता है। इनक्यूबेशन समय को कम करके विकास को कम करने का सुझाव दिया जाता है ।

5. पुस्तकालय घनत्व का आकलन और भंडारण के लिए पूलिंग

  1. ट्रांसपोसन पुस्तकालय में कुल म्यूटेंट का अनुमान लगाने के लिए प्रत्येक प्लेट पर सीएफओ गिनें। प्लेटों के पूरे समूह(चित्रा 2A)के लिए कॉलोनी गिनती अनुमान निर्धारित करने के लिए कम से कम 3 प्लेटों का 20% गिनती। यह सुनिश्चित करें कि कॉलोनियां दूसरी कॉलोनी को न छुए।
  2. अनुमानित कॉलोनी उपज की गणना करने के बाद, प्रत्येक प्लेट में एलबी (या अधिक यदि आवश्यक हो) का 3-5 एमएल जोड़ें और बाँझ स्क्रैपिंग टूल का उपयोग करके बैक्टीरिया को कुरेदें।
    नोट: स्टेरल इनोक्यूलेटिंग लूप का उपयोग प्लेटों को कुशलतापूर्वक परिमार्जन करने के लिए किया जाता था।
  3. पूल बैक्टीरियल सभी प्लेटों से 50 एमएल शंकु ट्यूबों(चित्रा 1D)में निलंबन। इसके लिए कम से कम 3, कम से कम 3 से अधिक 50 एमएल शंकु नलियों की आवश्यकता होगी।
  4. 7 मिनट के लिए 5,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र का उपयोग करके गोली पूल किए गए बैक्टीरियल सस्पेंशन।
  5. 30% ग्लाइसेरोल के साथ पूरक एलबी के 5 मिलील में सुपरनेट और रिसिस्पेंड पेलेट को त्यागें।
  6. ट्रांसपोसन लाइब्रेरी का 1 मिलियन क्रायोवियल्स में और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

6. ए में कोलिस्टिन प्रतिरोध को विनियमित करने वाले कारकों की पहचान

  1. 50 एमएल एलबी शोरबा और लेबल के रूप में प्रत्येक के साथ 4 x 250 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क तैयार करें(चित्रा 2 बी)
    1. A. baumannii तनाव एटीसीसी 17978 Tn-seq पुस्तकालय; (-) colistin_1
    2. A. baumannii तनाव एटीसीसी 17978 Tn-seq पुस्तकालय; (-) colistin_2
    3. A. baumannii तनाव एटीसीसी 17978 Tn-seq पुस्तकालय; (+) colistin_1
    4. A. baumannii तनाव एटीसीसी 17978 Tn-seq पुस्तकालय; (+) colistin_2
      नोट: यहां वर्णित चुनौती वृद्धि में, प्रत्येक स्थिति, (-) कोलिस्टिन नियंत्रण और (+) कोलिस्टिन चैलेंज, डुप्लिकेट में परीक्षण किया जा रहा है। इसलिए, सेटअप के लिए 4 x 250 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क, दो प्रति कंडीशन की आवश्यकता होती है।
  2. (+) कोलिस्टिन फ्लास्क (6.1.3 और 6.1.4) और 50 माइक्रोन पानी (-) कोलिस्टिन फ्लैक्स (6.1.1 और 6.1.2) में 0.5 मिलीग्राम/एल कोलिस्टिन के 50 माइक्रोन जोड़ें।
  3. बर्फ पर 5 कदम से एक जमे हुए Tn-seq पुस्तकालय aliquot गल ।
  4. पीबीएस के 1 मिलीएल में गल पुस्तकालय के पिपेट 1 माइक्रोन।
  5. 600 एनएम(ओडी600) पर ऑप्टिकल घनत्व को मापें और 1,000 से गुणा करें।
    नोट: यह टीएन-लाइब्रेरी के 1 माइक्रोन के ओडी600 निर्धारित करता है।
  6. चरण 6.5 में गणना के आधार पर, प्रत्येक फ्लास्क जिसमें 50 एमएल पौंड होता है, एक अंतिम ओडी600 0.001 तक टीका लगाया जाता है।
  7. 37 डिग्री सेल्सियस से ओडी600 0.5 पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में संस्कृतियों को बढ़ाएं।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि संस्कृतियों logarithmic विकास चरण में रहते हैं, इसलिए यदि आपके तनाव घातीय विकास के दौरान एक अलग OD६०० पर है, OD६०० को सुनिश्चित करने के लिए समायोजित करने की जरूरत है संस्कृति के रूप में कई बार के रूप में संभव के रूप में logarithmic विकास चरण के भीतर प्रतिकृति । यदि संस्कृति केवल 3 बार प्रतिकृति, म्यूटेंट में फिटनेस दोषों का पता लगाने की शक्ति 3 गुना मतभेदों पर छाया हुआ है, सिद्धांत रूप में । चूंकि विभिन्न बैक्टीरिया अलग दोहरीकरण समय है, यह एक निश्चित OD600 पर संस्कृतियों बीज के लिए शुरू inoculum सामान्य महत्वपूर्ण है. यह सभी संस्कृतियों में पूरे पुस्तकालय का लगातार प्रतिनिधित्व सुनिश्चित करता है।
  8. 7 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र का उपयोग कर हार्वेस्ट संस्कृतियों।
  9. सुपरनेट निकालें और पीबीएस के 50 एमएल से धो लें।
  10. 7 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र का उपयोग करते हुए गोली।
  11. सुपरनेट निकालें और पीबीएस के 1 एमएल में पैलेट को रीसस्ट करें। 5 माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में अलीकोट ~ 200 माइक्रोल।
  12. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5,000 x g पर अपकेंद्रित्र का उपयोग कर गोली। एक पिपेट टिप का उपयोग करके सभी सुपरनेट निकालें।
  13. -20 डिग्री सेल्सियस पर छर्रों की दुकान या gDNA निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ें।

7. जीडीएनए निष्कर्षण

  1. बर्फ पर एक सेल गोली गल।
  2. गोली को पूरी तरह से फिर से व्यतीत करने के लिए 0.6 एमएल लाइसिस बफर(सामग्री की तालिका)और भंवर जोड़ें।
  3. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  4. सैंपल और भंवर में फिनॉल/क्लोरोफॉर्म/आइसोअमिल अल्कोहल का 06 एमएल जोरदार ढंग से डालें।
  5. 5 मिनट के लिए कमरे में अस्थायी पर अधिकतम गति पर एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज में अपकेंद्रित्र का उपयोग करते हुए अलग चरण।
  6. ऊपरी जलीय चरण को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें। स्थानांतरण के दौरान चरण इंटरफेस को परेशान करने से बचें।
  7. ऊपर प्राप्त जलीय चरण और भंवर में क्लोरोफॉर्म की बराबर मात्रा जोड़ें।
  8. 5 मिनट के लिए कमरे में अस्थायी पर अधिकतम गति पर माइक्रोसेंट्रफ्यूज में अपकेंद्रित्र का उपयोग करते हुए अलग चरण।
  9. ऊपरी जलीय चरण को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: स्थानांतरण के दौरान इंटरफ़ेस को परेशान करने से बचना सुनिश्चित करें।
  10. ठंड 100% इथेनॉल की 2.5x जलीय चरण मात्रा जोड़ें और धीरे-धीरे मिलाएं। उपजी डीएनए दिखाई देगा ।
  11. कम से कम 1 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब रखें।
  12. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अधिकतम गति से अपकेंद्रित्र का उपयोग करते हुए गोली डीएनए।
  13. ध्यान से डीएनए गोली परेशान किए बिना सुपरनेट को हटा दें और पिपटिंग द्वारा 70% इथेनॉल के 150 माइक्रोन से धोएं।
  14. 2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अधिकतम गति से अपकेंद्रित्र का उपयोग करते हुए गोली डीएनए।
  15. सुपरनेट को सावधानी से दूर करें।
  16. एक बार चरण 7.14 दोहराएं। शेष सभी इथेनॉल को सावधानी से हटा दें।
  17. 5-10 मिनट के लिए कमरे में अस्थायी पर इनक्यूबेटिंग द्वारा डीएनए सूखी ।
  18. पिपटिंग द्वारा 100 माइक्रोन ते बफर में डीएनए पेलेट को फिर से रेंट करें।

8. डीएनए कतरनी(चित्रा 3A)

  1. 200 माइक्रोन की कुल मात्रा में 250 एनजी/एमएल की एकाग्रता के लिए ते बफर के साथ पतला gDNA।
  2. एक पानी स्नान ध्वनिक में ट्यूब रखें।
  3. लगभग 300 न्यूक्लियोटाइड के टुकड़े उपज के लिए डीएनए को सोनिकेट करें। पावर: 60%, कुल समय: 20 मिनट, चक्र: 10 एस ऑन और 10 एस 4 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 3A)पर बंद।
  4. पुष्टि डीएनए उचित रूप से unsheared डीएनए के 10 μL और एक 1% agarose जेल पर कतरनी डीएनए के 10 μL अलग से कतरनी है । जरूरत के अनुसार सोनीशन दोहराएं या ऑप्टिमाइज़ करें(चित्रा 3B)।

9. पॉली-सी पूंछ 3 ' अंत करने के लिए इसके अलावा(चित्रा 3A)

  1. तालिका 1 के अनुसार सेटअप पॉली-सी प्रतिक्रिया।
  2. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट रिएक्शन।
  3. नीचे दिए गए चरणों का पालन करके आकार-चयन पैरामैग्नेटिक मोतियों(चित्रा 3 ए)के 40 माइक्रोन के साथ पॉली-सी प्रतिक्रिया को शुद्ध करें।
    1. प्रत्येक नमूने में आकार-चयन पैरामैग्नेटिक मोतियों का 40μL जोड़ें। भंवर ~ 5 एस या पिपेट ऊपर और नीचे।
    2. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने इनक्यूबेट।
    3. संक्षेप में, अपकेंद्रित्र ट्यूब ट्यूब के नीचे में तरल इकट्ठा करने के लिए (~ 2 एस)।
    4. एक चुंबकीय रैक के लिए ट्यूबों हस्तांतरण और ~ 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट जब तक समाधान स्पष्ट है ।
    5. चुंबकीय रैक पर ट्यूबों के साथ, ध्यान से सुपरनैंट को हटा दें।
    6. चुंबकीय रैक पर ट्यूबों के साथ, हौसले से तैयार 80% इथेनॉल के 200 माइक्रोन जोड़ें (मोतियों को परेशान न करें)।
    7. समाधान स्पष्ट होने तक कम से कम 30 एस के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें।
    8. चुंबकीय रैक पर ट्यूबों के साथ, ध्यान से सुपरनैंट को हटा दें।
    9. वॉश स्टेप (स्टेप्स 9.3.6 - 9.3.8) दोहराएं।
    10. एक संक्षिप्त अपकेंद्रित्र चरण (~ 2 एस) का उपयोग करके ट्यूब के नीचे तरल ले लीजिए।
    11. चुंबकीय रैक में ट्यूब स्थानांतरित करें और किसी भी शेष तरल को हटा दें।
    12. सूखे नमूनों के लिए 2-5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। अधिक सूखी मत करो।
    13. चुंबकीय रैक से ट्यूब निकालें और प्रत्येक के लिए पानी की 25 माइक्रोन जोड़ें। ~ 5 एस या पिपेट अप और डाउन के लिए भंवर।
    14. संक्षेप में, अपकेंद्रित्र ट्यूब ट्यूब के नीचे में तरल इकट्ठा करने के लिए (~ 2 एस)।
    15. चुंबकीय रैक के लिए ट्यूबों हस्तांतरण और समाधान स्पष्ट है जब तक ~ 2 मिनट के लिए बैठने के लिए अनुमति देते हैं।
    16. चुंबकीय रैक पर ट्यूबों के साथ, मोतियों को परेशान किए बिना तरल को हटा दें और एक नई ट्यूब (डीएनए के ~ 23 माइक्रोन) में स्थानांतरित करें।

10. ट्रांसपोसन जंक्शन प्रवर्धन(चित्रा 3A)

  1. सेटअप पीसीआर 1 के रूप में तालिका 1 में पहली नेस्टेड पीसीआर(तालिका 2)के लिए वर्णित है ।
  2. तालिका 1 में वर्णित शर्तों का उपयोग करके पीसीआर 1 करें।
  3. आकार-चयन पैरामैग्नेटिक मोतियों के 40 माइक्रोन के साथ पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करें (चरण 9.3.1 - 9.3-12)। पानी के 50 माइक्रोन में Elute (कदम 9.3.13 - 9.3.16). इस बिंदु पर नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. स्ट्रेप्टाविडिन-युग्मित पैरामैग्नेटिक मोती तैयार करें:
    1. तेजी से मिलाते हुए स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों को फिर से रिसालें।
    2. एक ताजा माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में प्रति नमूना 32 माइक्रोल मोतियों को जोड़ें।
      नोट: 6 + नमूनों के लिए मोती एक ही ट्यूब में तैयार किया जा सकता है।
    3. ट्यूब को चुंबकीय रैक में स्थानांतरित करें। समाधान स्पष्ट होने तक ~ 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. चुंबकीय रैक पर ट्यूब के साथ, सुपरनैंट निकालें।
    5. चुंबकीय रैक से ट्यूब निकालें। ऊपर और नीचे पाइपिंग करके 1 एमएल 1x बी एंड डब्ल्यू बफर में रीसलपेंड करके मोतियों को धोएं।
    6. ट्यूब को चुंबकीय रैक में स्थानांतरित करें। समाधान स्पष्ट होने तक ~ 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    7. चुंबकीय रैक पर ट्यूब के साथ, सुपरनैंट को हटा दें।
    8. कुल 3 वॉश के लिए दो बार 1 एमएल 1x बी एंड डब्ल्यू बफर (स्टेप्स 10.4.5 - 10.4.7) के साथ रिपीट वॉश स्टेप।
    9. प्रति नमूना 2x बी एंड डब्ल्यू बफर के 52 माइक्रोन में चुंबकीय रैक और रीसस्स्पेंड मोतियों से ट्यूब निकालें।
  5. तैयार मोतियों के 50 माइक्रोन को शुद्ध पीसीआर1 के 50 माइक्रोन के साथ मिलाएं (चरण 10.3 से)। पिपेट मिश्रण करने के लिए।
  6. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर घूमते हैं।
  7. अनबाउंड डीएनए को धो लें:
    1. संक्षेप में, ट्यूब के तल पर तरल इकट्ठा करने के लिए अपकेंद्रित्र (~ 2 एस)।
    2. ट्यूब को चुंबकीय रैक में स्थानांतरित करें। समाधान स्पष्ट होने तक ~ 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. चुंबकीय रैक पर ट्यूब के साथ, सुपरनैंट को हटा दें।
    4. चुंबकीय रैक से ट्यूब निकालें, 100 μL 1x बी एंड डब्ल्यू बफर में खर्च करके मोतियों को धोएं और ऊपर और नीचे पाइपिंग करें।
    5. चुंबकीय रैक के लिए ट्यूब हस्तांतरण। समाधान स्पष्ट होने तक ~ 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. चुंबकीय रैक पर ट्यूब के साथ, सुपरनैंट निकालें।
    7. कुल 3 वॉश के लिए दो बार 100 माइक्रोनल लोटे (चरण 10.7.4 - 10.7.6) के साथ धोते कदम दोहराएं।
  8. सेटअप पीसीआर 2 जैसा कि टेबल 1 में वर्णित है, ट्रांसपोसन जंक्शनों को बढ़ाना और प्रत्येक नमूने में एक बारकोडजोड़ना (टेबल 2 और टेबल 3)।
  9. तालिका 1में वर्णित शर्तों का उपयोग कर पीसीआर 2 प्रदर्शन करें ।
  10. आकार-चयन पैरामैग्नेटिक मोतियों के 40 माइक्रोन के साथ शुद्ध करें (चरण 9.3.1 - 9.3.12)। पानी के 17 माइक्रोन में Elute (कदम 9.3.13 - 9.3.16), ~ 15 μL इकट्ठा।
  11. फ्लोरोमीटर का उपयोग करके डीएनए एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें। अंतिम सांद्रता ~ 50 से 250 एनजी/μl होना चाहिए।
  12. चिप आधारित केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस(चित्रा 4A)का उपयोग करके डीएनए की गुणवत्ता का आकलन करें।

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Representative Results

उल्लिखित तरीकों में ई. कोलाई एमएफडी डीएपी का उपयोग करके बैक्टीरियल कंजूगेशन के माध्यम से ए बाउमैनी स्ट्रेन एटीसीसी 17 9 78 में उच्च घनत्व वाले ट्रांसपोसन लाइब्रेरी की पीढ़ी का वर्णन किया गया है-जो प्लाज्मिड पीजेएनडब्ल्यू684(चित्रा 4B) को दोहराताहै। विस्तृत प्रोटोकॉल ई. कोलाई λpir+ दाता तनाव से ए baumannii प्राप्तकर्ता तनाव के लिए pJNW684 के हस्तांतरण के लिए द्वि-माता पिता बैक्टीरियल conjugation का उपयोग करता है । यह घने ट्रांसपोसन उत्परिवर्ती पुस्तकालयों को उत्पन्न करने के लिए एक कुशल और सस्ती विधि है। बैक्टीरिया अनुकूलित अनुपात में मिश्रित थे और 1 घंटे(चित्रा 1A)के लिए लुरिया-बर्टानी आगर प्लेटों पर संभोग देखा गया था । संभोग के दौरान, ट्रांसपोसन को दाता से प्राप्तकर्ता तनाव में स्थानांतरित कर दिया गया था, जहां इसे जीडीएनए(चित्रा 1B)में डाला गया था। संभोग एकत्र किए गए थे, लगभग 105 सीएलयू/एमएल की गणना की गई थी और 150 मिमी x 15 मिमी आगर प्लेटों पर चढ़ाया गया था जो कानमाइसिन के साथ पूरकथे। 37 डिग्री सेल्सियस पर विकास के 14 घंटे के बाद, प्लेटों में ट्रांसपोसन उत्परिवर्ती पुस्तकालय की सफल पीढ़ी का संकेत देने वाले अलग-अलग आकार(चित्रा 1 सी)की हजारों उपनिवेश शामिल थे। ट्रांसपोसन प्रविष्टि म्यूटेंट को(चित्रा 1D)पूल किया गया था और बार-बार फ्रीज-गल चक्र को रोकने के लिए एलिकोट्स में जमे हुए थे, जो प्रविष्टि पुस्तकालय पर चयनात्मक दबाव जोड़ सकते थे।

पूल्ड ए बॉमनी ट्रांसपोसन म्यूटेंट लाइब्रेरी का उपयोग एंटीमाइक्रोबियल(चित्रा 2B)की उपनिषदिविंद्रता के तहत कोलिस्टिन प्रतिरोध के लिए महत्वपूर्ण फिटनेस कारकों की पहचान करने के लिए किया गया था। उत्परिवर्ती पुस्तकालय को जीन में सम्मिलन को कम करने वाली उत्परिवर्ती कोशिकाओं को कम करने के लिए डुप्लिकेट में 0.5 मिलीग्राम/एल कोलिस्टिन की अनुपस्थिति/उपस्थिति में लॉगरिथम चरण में उगाया गया था जो कोलिस्टिन प्रतिरोध में योगदान देते हैं। शेष पुस्तकालय पूल के कुल gDNA नियंत्रण और प्रयोगात्मक संस्कृतियों से अलग किया गया था और अनुक्रमण के लिए डीएनए तैयार करने के लिएसंसाधित (चित्रा 3A)।

अलग gDNA यांत्रिक कतरन का उपयोग कर खंडित किया गया था और डीएनए टुकड़े(चित्रा 3A)पर एक पाली-सी पूंछ जोड़ा गया था । पॉली-सी पूंछ के अलावा, डीएनए को शुद्ध किया गया था और ट्रांसपोसन-जीनोम जंक्शनों को पॉली-सी विशिष्ट प्राइमर का उपयोग करके समृद्ध किया गया था जिसके बाद पीसीआर के दूसरे दौर में एक और पॉली-सी विशिष्ट प्राइमर का उपयोग किया गया था जिसने पी 7 अनुक्रमण साइट को पेश किया जो इलुमिना प्रवाह सेल और क्लस्टर पीढ़ी को बाध्यकारी करने के लिए आवश्यक है, और एक छह-बेस बारकोड जिसका उपयोग37, 4777,के बाद डिमुलिप्लेक्स पुस्तकालयों को डीटमुलाप करने के लिए कियाजाताहै। डीएनए सांद्रता की गणना की गई और नमूनों का विश्लेषण चिप आधारित केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करके सफल पुस्तकालय बिल्ड(चित्रा 4 ए)की पुष्टि करने के लिए किया गया, जो उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए तैयार हैं ।

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा डीएनए पुस्तकालयों का अनुक्रम किया गया । एक एकल अंत, ५० चक्र रन किया गया था, जो ३०,०००,००० उच्च गुणवत्ता पढ़ता है/नमूना ट्रांसपोसन पुस्तकालय के ६२.५ गुना कवरेज प्रदान मिले । ट्रांसपोसन जंक्शनों (पढ़ता है) संदर्भ जीनोम48के लिए मैप किया गया, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जैव सूचना विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर. इनपुट नमूनों में प्रत्येक प्रविष्टि स्थल पर पढ़ता है की संख्या, (-) colistin नियंत्रण हालत, उत्पादन नमूनों में पढ़ता है की संख्या की तुलना में थे, (+) कोलिस्टिन प्रयोगात्मक हालत, और प्रत्येक प्रविष्टि साइट के लिए फिटनेस स्कोर की गणना की गई । इसके बाद फिटनेस स्कोर को जीन द्वारा ग्रुप किया गया । कम स्कोर का प्रदर्शन जीन जब पुस्तकालय इनपुट नमूनों के सापेक्ष कोलिस्टिन की उपस्थिति में उगाया गया था कोलिस्टिन के उपनिषदिविंद्रता में ए baumannii अस्तित्व के लिए फिटनेस निर्धारक माना जाता था । उदाहरण के लिए, PmrAB दो घटक प्रणाली के भीतर ट्रांसपोसन सम्मिलन इनपुट नमूने में मौजूद थे, लेकिन उत्पादन नमूने में नहीं पाए गए । पीएमआरएबी सीधे पीएमआरसीकी अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है , जो कोशिका की सतह12,31पर आवेश को बेअसर करने के लिए लिपिड ए पर फॉस्फोथेनेमाइन को स्थानांतरित करता है । बैक्टीरियल सतह चार्ज के बेअसर कोलिस्टिन-मध्यस्थता हत्या के लिए आवश्यक इलेक्ट्रोस्टैटिक क्षमता को कम करने के लिए सोचा है । समाप्त जीन की पहचान प्रतिरोध फेनोटाइप में योगदान करने के लिए जाना जाता विधि मान्य ।

Figure 1
चित्रा 1: ट्रांसपोसन उत्परिवर्ती पुस्तकालय निर्माण की योजनाबद्ध। (A)बैक्टीरियल कंजूगेशन। "दाता" तनाव, जो पक्षांतरण मशीनरी encodes, "प्राप्तकर्ता" तनाव के साथ मिलाया गया था । इस मिश्रण को पौंड आगर प्लेटों पर देखा गया और ट्रांसपोसन पुस्तकालय की 1 घंटे(बी)पीढ़ी के लिए दोस्त की अनुमति दी गई । ट्रांसपोशन मशीनरी ले जाने वाले प्लाज्मिड को "दाता" तनाव से "प्राप्तकर्ता" तनाव में स्थानांतरित कर दिया गया था और ट्रांसपोसन को बेतरतीब ढंग से "प्राप्तकर्ता" तनाव के जीनोम में डाला गया था। (ग)चयन । जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं को ट्रांसपोसन प्रविष्टि म्यूटेंट के लिए चयन करने के लिए कनामाइसिन के साथ पूरक आगर प्लेटों पर चढ़ाया गया था। (घ)पूल्ड लाइब्रेरी। कॉलोनियों को प्लेटों से स्क्रैप किया गया, एलबी में फिर से निलंबित कर दिया गया और पूल किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि जीवाणु conjugation परिणाम और कोलिस्टिन Tn-seq प्रयोग की एक योजनाबद्ध । }Aप्रतिनिधि कानमाइसिन सेलेक्शन प्लेट। थाली को पांच बराबर वर्गों में बांटा गया है। ब्लू डॉट्स ए बाउमैनी ट्रांसपोसन प्रविष्टि म्यूटेंट के अनुमान के लिए कॉलोनी गिनती का प्रतिनिधित्व करते हैं। अंतिम अनुमान की गणना के लिए कम से तीन अलग प्लेटों की गणना की गई । (ख)उपनिषद सहलिस्टिक सांद्रता में फिटनेस कारकों की पहचान । पूल्ड ट्रांसपोसन लाइब्रेरी को या तो अनुपस्थिति (नियंत्रण) या कोलिस्टिन की उपस्थिति (प्रायोगिक) में लॉगरिथम विकास चरण में उगाया गया था। एक बार जब संस्कृतियां उपयुक्त ऑप्टिकल घनत्व तक पहुंच गईं, तो कोशिकाओं को गोली मार दी गई और प्रत्येक नमूने से gDNA निकाला गया। कुल चार नमूनों के लिए प्रत्येक स्थिति की नकल में परीक्षण किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: डीएनए एम्प्लिकॉन लाइब्रेरी का फ्लोचार्ट बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण और प्रतिनिधि कतरनी gDNA के लिए निर्माण करता है। (A)टीएन-सेक्यू डीएनए लाइब्रेरी योजनाबद्ध का निर्माण । निष्कर्षण के बाद, gDNA यांत्रिक कतरन के माध्यम से खंडित किया गया था । ट्रांसपोसन-जीनोम जंक्शनों और बारकोड के अलावा पीसीआर प्रवर्धन से पहले खंडित डीएनए के 3 ' अंत में पॉली-सी पूंछ जोड़ने के लिए टर्मिनल डिऑक्सीन्यूनियोटिडाइल ट्रांसफरेज का उपयोग किया गया था। (ख)1% gDNA बाल पालन कदम के बाद unsheared और कतरनी ए baumannii उत्परिवर्ती पुस्तकालयों के जेल उठी । 1 केबी सीढ़ी डीएनए मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया था । कतरनी gDNA धब्बा मुख्य रूप से ~ 100 और 500 आधार जोड़े के बीच पर्वतमाला। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि गुणवत्ता नियंत्रण (QC) परिणाम और पक्षांतरण जीन ले जाने प्लाज्मिड के नक्शे । (क)डीएनए लाइब्रेरी बिल्ड के लिए क्यूसी ट्रेस। ~ 350 बेस जोड़े पर एक चोटी है, जो सफल पुस्तकालय निर्माण का संकेत देता है। यदि क्यूसी परिणामों में कुछ बड़े डीएनए का पता चला, तो नमूनों को बड़े डीएनए टुकड़ों को हटाने के लिए आगे साफ किया जा सकता है । (B)प्लाज्मिड pJNW684 में उत्परिवर्ती चयन के लिए एक कानामाइसिन प्रतिरोध कैसेट (बैंगनी) के साथ एक Himar1 मेरिनर ट्रांसपोसन (ग्रीन) होते हैं, एक जीन एक ए baumannii १७९७८ विशिष्ट प्रमोटर (नीला), एक एम्पीसिलिन प्रतिरोध जीन(बीएलए,नारंगी) और एक RP4/oriT/oriR6K-प्रतिकृति (पीला) की सशर्त उत्पत्ति के नियंत्रण में अतिसक्रिय मेरिनर Himar1 C9 ट्रांसपोसेस (लाल) के नियंत्रण में । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रतिक्रिया सेटअप शर्तों
पॉली-सी प्रतिक्रिया कतरनी gDNA के 30 माइक्रोन
9.5 m dCTP/0.5 m m ddCTP के 2.5 माइक्रोन
5X टर्मिनल डीऑक्सीन्यूक्लियोटिडिल ट्रांसफरेज (टीडीटी) रिएक्शन बफर के 10 माइक्रोन
1.25 μL के rTdt
6.25 माइक्रोन पानी के लिए 50 माइक्रोन		 1 घंटे के लिए 37ºC पर इनक्यूबेट
पीसीआर 1 23 माइक्रोन 3'-पॉली-सी शुद्ध डीएनए (पिछले चरण से पूरा नमूना)
10 माइक्रोन 10x उच्च निष्ठा डीएनए बहुलक प्रतिक्रिया मिश्रण
2 माइक्रोल 10 एमएमएल डीएनटीपी
2 माइक्रोन 50 एमएमएम MgSO4
1 माइक्रोन 30 माइक्रोन ओल्ज 510 बायोटिन
3 माइक्रोन 30 माइक्रोन ओल्ज 376
0.5 माइक्रोल उच्च निष्ठा डीएनए बहुलक
8.5 माइक्रोन शुद्ध पानी से 50 माइक्रोन कुल		 1 चक्र: 2 मिनट 94 डिग्री सेल्सियस
15 चक्र: 15 एस 94 डिग्री सेल्सियस
30 एस 60 डिग्री सेल्सियस
2 मिनट 68 डिग्री सेल्सियस
1 चक्र: 4 मिनट 68 डिग्री सेल्सियस
पकड़ो: ∞ 4 ºC
पीसीआर 2 पिछले कदम से डीएनए बंधे मोती
10 माइक्रोन 10x उच्च निष्ठा डीएनए बहुलक प्रतिक्रिया मिश्रण
2 माइक्रोन 10 एमएमएम डीएनटीपी
2 माइक्रोन 50 एमएमएम MgSO4
1 माइक्रोन 30 माइक्रोन ओल्ज 511
1 माइक्रोन 30 माइक्रोन बारकोड प्राइमर (टेबल 2)
0.5 माइक्रोल उच्च निष्ठा डीएनए बहुलक
33.5 माइक्रोन शुद्ध पानी 50 माइक्रोन		 1 चक्र: 2 मिनट 94 डिग्री सेल्सियस
15 चक्र: 15 एस 94 डिग्री सेल्सियस
30 एस 60 डिग्री सेल्सियस
2 मिनट 68 डिग्री सेल्सियस
1 चक्र: 4 मिनट 68 डिग्री सेल्सियस
पकड़ो: ∞ 4 ºC

तालिका 1: रिएक्शन सेटअप। पॉली-सी, पीसीआर 1 और पीसीआर 2 प्रतिक्रियाओं के लिए सेटअप और शर्तें।

उद्देश्य नाम अनुक्रम
ट्रांसपोसन के लिए एनील्स olj510-Biotin बायोटिन-गेटगक्क्टेटटीटीटीटीटीटीटीटीटीसीटीसीटीसीटीसीटीसीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजी
पॉली-सी पूंछ के लिए एनील्स olj376 GTGACTGGAGTTCAGGTGTGCTCTCTCCCCCGATCTGG
GGGGGGGGGGGGGGGG
ट्रांसपोसन + पी 5 एडाप्टर के लिए नेस्टेड:
P5 कैप्चर साइट - P5 अनुक्रमण साइट- N5 -Tn		 olj511 AATGATACGGCGACCACCGATGATCTACACTCTCTTT
सीसीसीटीसीसीसीजीसीटीसीटीसीटीसीटीसीटीसीटीसीटीसीटीसीटीसीटीसीटीएनएनएनजीजीजीजीजीएक्टटा
TCATCCAACCTGTTAG
olj376 को नेस्टेड: P7 अनुक्रमण साइट
- बारकोड XXXXXX - P7 कैप्चर साइट)		 ईसा पूर्व ## CAAGCAAGAAGACGGCATACAGATxxxxxxGGGGG
CTGGAGTTCAGACGTGGG
विशिष्ट बारकोड के लिए तालिका 2 देखें ***

तालिका 2: पीसीआर प्रवर्धन प्राइमर। ट्रांसपोसन जंक्शनों को बढ़ाने के लिए प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले पीसीआर प्रवर्धन प्राइमर। प्रत्येक का उद्देश्य पहले कॉलम में सूचीबद्ध है।

प्राइमर पढ़ना बारकोड अनुक्रम
बीसी 1 एटीकेसीजी सीजीटीएटीटी CAAGCAAGACGGCATACGAGATGT
GATGTGACTGGAGTTCAGCGTGGG
बीसी 2 सीजीटीजीटी एसीएसीजी CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGATAC
एटीसीजीजीजीएटीजीटीसीजीजीजीजीजीजी
बीसी 3 टीटीजीजीसी जीसीसीटीएए CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGATGCC
TAAGTGACTGGAGCAGCGTGGG
बीसी4 टीजीक्का टीजीजीटीसीए CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGATT
GGTCAGTGACTGGTTCAGCGTGGG
बीसी5 एसीएजीटीजी CACTGT CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGAT
CACTGTGTGACTGGगटकागैकगटगटगटीजीटीजीटीजी
बीसी6 जीसीकेट एटीटीजीजीसी CAAGCAAGAAGACGGCATACATAAGATA
TTGGCGTGACTGGAGTTCAGCGTGG
बीसी7 सीएजीएटीसी गैटक्टीजी CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGAT
गैटसीजीजीजीएटीजीजीटीसीजीजीजी
बीसी8 एसीटीजीए TCAAGT CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGAT
TCAAGTGTGACTGGTTCAGCGTGG
बीसी9 गैटकाग सीटीगाटीसी CAAGCAAGACGGCATACAGAAGA
TCTGATCGTGACTGGAGTTCAGCGTGG
बीसी10 टैगसीटीटी AAGCTA CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGAT
AAGCTAGTGACTGGTAGCAGCGTGGG
बीसी11 जीजीसीटीैक जीटीजीसीसी CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGAT
GTAGCCGTGACTGGTAGCAGCGTGGG
बीसी12 सीटीटीजीटीए ताकाग CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGATT
ACAAGGTGACTGGTTCAGCGTGGG
बीसी13 एजीटीसीएए टीटीजीएक्ट CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGAT
TTGACTGTGACTGGTTCACACGTGGG
बीसी14 एजीटीसीसी जीजीएएक्ट CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGATG
GAACTTTGACTGGAGCAGACGTGGG
बीसी15 एटीजीटीसीए TGACAT CAAGCAAGACGGCATACAGAAGA
TTGACATGTGACTGGAGTTCACGTGGG
बीसी16 सीसीजीटीसीसी जीजीएसीजी CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGAT
GGACGGGTGACTGGAGTTCAGCGTGG
बीसी17 गगाग सीटीसीटीएसी CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGAT
CTCTACGTGACTGGTTCACACGTGGG
बीसी18 जीटीसीसीसी जीसीजीजीएसी CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGAT
GCGGACGTGACTGGTTCAGCGTGGG
बीसी19 जीटीएएए टीटीटीसीसी CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGAT
TTTCACGTGACTGGAGTTCAGCGTGG
बीसी20 जीटीजीसीसी जीजीसीसीैक CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGATG
जीसीसीएसीजीटीजीएजीजीटीसीजीजीजीजी
बीसी21 जीटीटीसीजी सीजीएएसी CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGAT
CGAAACGTGACTGGTTCACACGTGGG
बीसी22 सीजीटीएसीजी सीजीटीएसीजी CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGAT
CGTACGGTGACTGGTTCAGCGTGG
बीसी23 गैगेटिग सीसीएटीसी CAAGCAAGAAGACGGCATAC
CACTCGTGACTGGAGCAGACGTGG
बीसी24 जीजीजीजीटीसी जीसीटीएसीसी CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTACCGTGACTGGTTCAGCGTGG
बीसी25 एक्टगाट एटीकेजीटी CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGAT
ATCAGTTTGACTGGगटागगगगटगटीजीटीजी
बीसी26 एटीजीसी जीसीकैट CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTCATGTGACTGGTTCAGCGTGGG
बीसी27 एटीसीसीटी अग्निवत CAAGCAAGAAGACGGCATACATAAGATA
GGAATGTTGACTGGTTCAGCGTGG
बीसी28 सीएएएजी सीटीटीटीजी CAAGCAAGAAGACGGCATAC
टीटीटीजीजीजीएजीजीटीसीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजी
बीसी29 सीएएटा टैगटीजी CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGAT
TAGTTGGTGACTGGAGCAGCGTGG
बीसी30 CACCGG सीसीजीजीजी CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGAT
CCGGTGGTGACTGGTTCACACGTGGG
बीसी39 सीटीएटीसी जीटीएैग CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGAT
GTATAGGTGACTGGAGCAGCGGGGG
बीसी40 सीटीसीगा आईसीटीजीजी CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGAT
TCTGAGGTGACTGGCAGCGTGG
बीसी42 TAATCG सीजीटीए CAAGCAAGAAGACGGCATAC
गैटगटगैक्टगगगटकागैकगगटगटगटीजी
बीसी43 टीएसीजीसी जीसीटीजीटीए CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTGTAGTGACTGGTAGCAGCGTGGGG
बीसी44 तातात अट्टाटा CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGAT
ATTATAGTAGTAGTAGCAGCGTGGG
बीसी45 टीकैटटीसी गाटगा CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGAT
GAATGAGTGACTGGTTCACGTGGG
बीसी46 टीसीसीसीजीए टीसीजीजीए CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGAT
टीसीजीजीजीटीजीएजीजीटीसीजीजीजीजीजीजीजी
बीसी47 टीसीजीएग सीटीटीसीजीए CAAGCAAGAAGACGGCATAC
TTCGAGTGACTGGTTCAGCGTGG
बीसी48 टीसीजीसीए टीजीसीसीजीए CAAGCAAGAAGACGGCATACGAGAT
TGCCGAGTGACTGGAGCAGACGTGG

तालिका 3: बारकोड प्राइमर। एम्प्लिकन में पी 7 अनुक्रमण साइट और बारकोड जोड़ते समय ट्रांसपोसन जंक्शनों को बढ़ाने के लिए दूसरे पीसीआर चरण में बारकोड प्राइमर का उपयोग किया जाता है। पुस्तकालय उत्पन्न करने के लिए सभी बारकोड प्राइमर की आवश्यकता नहीं है। नमूनों की संख्या के लिए केवल बारकोड प्राइमर की आवश्यकता होती है।

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Discussion

ए बॉमनी वैश्विक जन स्वास्थ्य के लिए एक उभरता हुआ खतरा है, जो "अंतिम पंक्ति" चिकित्सीय के खिलाफ एएमआर के तेजी से अधिग्रहण के कारण है, जैसे कोलिस्टिन10,11,,12,,23,,24,,,30,,31। हाल के दशकों में, टीएन-सेक ने कई जीवाणु प्रजातियों में जीनोटाइप-फेनोटाइप इंटरैक्शन को स्पष्ट करने और बैक्टीरियल जेनेटिक्स,,34, 35,42, 43की हमारी समझ का विस्तार करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है।,3543 टीएन-सेक प्रोटोकॉल ने विभिन्न जीवाणु प्रजातियों जैसे कैम्पिलोबैक्टर जेजुनी, स्टेफिलोकोकस ऑरियस, पीरियोडोन्टल रोगजनक पोर्फिरोमोनास जिंगिवलिसऔर यहां तक कि माइकोबैक्टीरियम तपेदिक37,49,50,,51जैसी विविध जीवाणु प्रजातियों में आवश्यक जीन की पहचान करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाईहै। ,, आवश्यक जीन की पहचान से परे, टीएन-एसईक्यू का उपयोग स्यूडोमोनास एरुगिनोसामें एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन, साल्मोनेला टाइफिमुरियम में कई सशर्त आवश्यक जीन, और स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया52,53, 54,54में कई जीनोटाइप-फेनोटाइप संबंधों की पहचान करने के लिए किया गया है।, हाल ही में, विब्रियो हैजा के ट्रांसपोसन अनुक्रमण को हैजा के शिशु खरगोश मॉडल में नियोजित किया गया था ताकि संक्रमण47के दौरान वीवो फिटनेस में महत्वपूर्ण जीन की पहचान की जा सके। ये अध्ययन टीएन-एसईक्यू की बहुमुखी प्रतिभा को प्रदर्शित करते हैं क्योंकि इसका उपयोग इन विट्रो और वीवो अध्ययन दोनों के लिए किया जा सकता है।

अन्य तरीकों जैसे माइक्रोएरे टेक्नोलॉजीज, 2डी जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और क्यूपीसीआर पर टीएन-सेक्यू का मुख्य लाभ यह है कि इसके लिए जीनोम या जीनोमिक जानकारी55के पूर्व ज्ञान की आवश्यकता नहीं है। इसलिए, बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण के साथ मिलकर ट्रांसपोसन म्यूटाजेनिस ज्ञात जीन और जीनोम के अध्ययन के साथ-साथ उपन्यास आनुवंशिक बातचीत की खोज में सक्षम बनाता है। यहां हमने ए बाउमैनी में एक अत्यधिक घने ट्रांसपोसन उत्परिवर्ती पुस्तकालय पैदा करने के लिए एक व्यापक विधि प्रस्तुत की है ताकि उन कारकों की पहचान की जा सके जो कोलिस्टिन की उपभिषता सांद्रता के संपर्क में आने पर बैक्टीरियल फिटनेस के लिए आवश्यक हैं। वर्णित विधि का ई कोलाई (अप्रकाशित डेटा) में भी सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है, जो सिस्टम का प्रदर्शन एंटेरोबैक्टीरिया सहित अन्य ग्राम-नकारात्मक रोगजनकों में टीएन-सेक्यू विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी है।

सम्मिलन म्यूटेनेसिस के लिए मेरिनर ट्रांसपोसंस का उपयोग करने के कई फायदे हैं। ट्रांसपोसन परिवार यूकेरियोटिक मेजबानों से उत्पन्न हुआ है और व्यापक रूप से विविध जीवाणु आबादी में संतृप्त उत्परिवर्ती पुस्तकालयों को उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया गया है। मेरिनर ट्रांसपोसंस मेजबान-स्वतंत्र हैं, जिसका अर्थ है कि विशिष्ट मेजबान कारकों40,,41के अभाव में स्थिर यादृच्छिक सम्मिलन प्राप्त किए जा सकते हैं। इसके अतिरिक्त, मेरिनर ट्रांसपोसंस में प्रविष्टि की घटनाओं की एक परिभाषित संख्या होती है क्योंकि वे अधिमानतः थाइमाइन-एडेनाइन ("टीए") रूपांकनों में डालते हैं, जो सम्मिलित पूर्वाग्रह को कम करता है और अधिक मजबूत सांख्यिकीय विश्लेषण37,56,57, 58,58की ओर जाता है।,,

कई मेरिनरआधारित टीएन-सेक्यू विधियां,जीडीएनए विखंडन32, 42,,43के लिए एमएमईआई प्रतिबंध पाचन का उपयोगकरतेहैं। जबकि एंजाइमेटिक डीएनए विखंडन एक लोकप्रिय और सफल विधि है, यह प्रक्रिया के लिए अनावश्यक कदम जोड़ता है और संभावित पूर्वाग्रह37को बढ़ाता है। न केवल इन तकनीकों के लिए बड़ी मात्रा में प्रारंभिक सामग्रियों की आवश्यकता होती है, बल्कि वे संभावित रूप से डाउनस्ट्रीम विश्लेषण37,,59में सम्मिलन दृश्यों के असमान प्रतिनिधित्व का कारण बन सकती हैं। कुछ अन्य तरीकों की तरह जो एमएमईआई नाभिक गतिविधि52,60, 61,61पर भरोसा नहीं करते हैं, इसमें उल्लिखित विधि जीडीएनए को टुकड़ा करने के लिए यांत्रिक कतरन पर निर्भर करती है, और डीएनए टुकड़ों के 3' अंत में पॉली-सी पूंछ जोड़ने के लिए टीडीटी।, एंजाइमेटिक डीएनए विखंडन और एडाप्टर लिगेशन विधियों की तुलना में, इस दृष्टिकोण को डीएनए शुरू करने की काफी छोटी मात्रा की आवश्यकता होती है, जबकि अधिक सुसंगत परिणाम प्रदान करते हैं, यह डीएनए क्रॉस-संदूषण के जोखिम को भी कम करता है और सीलबंद ट्यूब37,59,,62में कारावास के कारण नमूना हानि को कम करता है।, इसके अलावा, यह विधि लंबी पैदा होती है, उच्च गुणवत्ता वाले अनुक्रमण 50 न्यूक्लियोटाइड्स की पढ़ती है जो दृश्यों के अधिक प्रभावी और सटीक मानचित्रण और अधिक मजबूत डाउनस्ट्रीम विश्लेषण37,,59में सहायता करती है। सिंथेटिक पॉली-सी पूंछ के अलावा संभावित ओवरहांग्स को अस्वीकार करता है जो विखंडन से हो सकता है क्योंकि यह विधि रिवर्स प्राइमर के लिए मान्यता स्थल के रूप में एक्सोजेनोसली रूप से जोड़ी गई पॉली-सी पूंछ पर निर्भर करती है, जिसमें इसके 3 ' अंत में 16 डीजी न्यूक्लियोटाइड और 5 के अंत में अगली पीढ़ी के अनुक्रम (जैसे, इलुमिना अनुक्रमण) के लिए विशिष्ट अनुक्रम, प्राइम सिंथेसिस४७,,५९शामिल हैं । सिंथेटिक न्यूक्लियोटाइड पूंछ का उपयोग इस विधि के अनुप्रयोग को उनकी मूल सामग्रीसेस्वतंत्र कई अलग - अलग जीनोम में फैलता है । इसके बाद, ट्रांसपोसन-जीनोम जंक्शनों को पॉली-सी विशिष्ट प्राइमर37का उपयोग करके परिलक्षित किया जाता है। यह विकल्प महंगे प्रतिबंध एंजाइमों, एडाप्टर लिगेशन, एडाप्टर डिमीटर के गठन और जेल शुद्धिकरण चरणों की आवश्यकता को नष्ट करके प्रक्रिया को सरल बनाता है। हमने कई ग्राम-नकारात्मक एस्कापे रोगजनकों में अत्यधिक संतृप्त ट्रांसपोसन प्रविष्टि पुस्तकालयों को कुशलतापूर्वक उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल को और अनुकूलित किया है, जिसमें एकिनेटोबैक्टर बाउमैनी शामिल हैं और इसका उपयोग विविध इन विट्रो और वीवो स्थितियों10में आनुवंशिक बातचीत का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

टीएन म्यूटेगेनिसिस की एक सीमा यह है कि यह चयन के लिए एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्कर पर निर्भर करता है। हालांकि, कई ग्राम-नकारात्मक ESKAPE रोगजनक मल्टीड्रग या बड़े पैमाने पर दवा प्रतिरोधी हैं, जिसका अर्थ है कि उपयोगकर्ता को ब्याज के विशिष्ट रोगजनक के अनुसार प्रतिरोध कैसेट का आदान-प्रदान करने की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, कुछ नैदानिक आइसोलेशन मेरिनर-आधारित ट्रांसपोसन का उपयोग करके ट्रांसपोसन म्यूटाजेनेसिस के लिए उत्तरदायी नहीं हैं।

प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण कदम प्लेट में टीएन म्यूटेंट की संख्या की गणना कर रहा है। चढ़ाना भी कई कालोनियों एक लॉन है कि बहाव विश्लेषण जटिल कर सकते है में परिणाम होगा । यदि उपनिवेश बहुत करीब हैं या छू रहे हैं, तो वे पुस्तकालय पर अवांछित चयनात्मक दबाव जोड़ सकते हैं जिसके परिणामस्वरूप कलाकृतियों हो सकते हैं। आदर्श रूप में, कालोनियों को छू नहीं जाएगा और थाली भर में समान रूप से दूरी, के रूप में प्रदर्शन(चित्रा 2A)। इसके विपरीत, यदि बहुत कम उपनिवेशों को चढ़ाया जाता है, तो प्रत्येक जीन में कई टीएन सम्मिलनों को अलग करना मुश्किल होगा।

चरण 2.18 में सूचीबद्ध नियंत्रणों को करना भी महत्वपूर्ण है। जैसा कि 3 के सेक्शन के नोट में कहा गया है। 2, न तो "दाता" या "प्राप्तकर्ता" तनाव एम्पिसिलिन के साथ पूरक प्लेटों पर बढ़ना चाहिए । चूंकि "दाता" तनाव के विकास के लिए बहिर्जात डीएपी की आवश्यकता होती है, इसलिए कोई भी विकास "प्राप्तकर्ता" तनाव को pJNW684 की प्रतिकृति का संकेत देगा। यह एक महत्वपूर्ण समस्या है क्योंकि यदि ट्रांसपोसन जीडीएनए में एकीकृत नहीं होता है, तो अनुक्रमण पढ़ता है केवल प्लाज्मिड के लिए नक्शा होगा, न कि एकीकरण साइट। इस मामले में प्रयोग की संभावना useable डेटा नहीं निकलेगा ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (अनुदान AI146829 से J.M.B.) के वित्तपोषण द्वारा समर्थित किया गया था और कृतज्ञता से स्वीकार किया जाता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate Affymetrix 77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate Invitrogen 10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker Promega PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes Corning 351029
150mm x 15mm Petri Dishes Corning 351058
1X B&W N/A N/A Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid Alfa Aesar B2239103 used at 600 µM
2X B&W N/A N/A Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP N/A N/A 9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase Invitrogen 12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978 ATCC N/A AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L) Fisher Scientific BP1760 used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system BECKMAN COULTER A63881
BioAnalyzer Agilent G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis Agilent 5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP) New England Biolabs (NEB) N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack Invitrogen 12321D
E.coli MFD Dap- N/A N/A DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol Fisher Scientific A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials Corning 09-761-71
Glass beads Corning 72684
Glycerol Fisher Scientific G33
Inoculating loops Fisher Scientific 22-363-602 Scraping tool
Kanamycin Fisher Scientific BP906 used at 25 mg/L
LB agar, Miller Fisher Scientific BP1425
LB broth, Miller Fisher Scientific BP1426
LoTE N/A N/A Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer N/A N/A 9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.) Fisher Scientific BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution Fisher Scientific BP39920 Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Q33238
Qubit Assay Tubes Thermo Fisher Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath Qsonica Sonicators Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs (NEB) S1420S
TE buffer N/A N/A 10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt) Promega PR-M1875

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जीव विज्ञान अंक 161 ट्रांसपोसन उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण ग्राम-नकारात्मक एसिनेटोबैक्टर बाउमैनी,कोलिस्टिन ईएसकेपीई
उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया में ट्रांसपोसन प्रविष्टि पुस्तकालयों का सृजन
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Kazi, M. I., Schargel, R. D., Boll,… More

Kazi, M. I., Schargel, R. D., Boll, J. M. Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing. J. Vis. Exp. (161), e61612, doi:10.3791/61612 (2020).

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