Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Generere transposon innsetting biblioteker i Gram-negative bakterier for høy gjennomstrømning sekvensering

Published: July 7, 2020 doi: 10.3791/61612
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Texas at Arlington

Summary

Vi beskriver en metode for å generere mettende transposonmutantbiblioteker i Gram-negative bakterier og påfølgende fremstilling av DNA amplicon biblioteker for høy gjennomstrømning sekvensering. Som et eksempel fokuserer vi på ESKAPE-patogenet, Acinetobacter baumannii,men denne protokollen er mottagelig for et bredt spekter av Gram-negative organismer.

Abstract

Transposon sekvensering (Tn-seq) er en kraftig metode som kombinerer transposon mutagenese og massiv parallell sekvensering for å identifisere gener og veier som bidrar til bakteriell fitness under et bredt spekter av miljøforhold. Tn-seq-applikasjoner er omfattende og har ikke bare aktivert undersøkelse av genotype-fenotyperelasjoner på organismenivå, men også på befolknings-, samfunns- og systemnivå. Gram-negative bakterier er sterkt forbundet med antimikrobielle resistensfenotyper, som har økt tilfeller av antibiotikabehandlingssvikt. Antimikrobiell resistens er definert som bakteriell vekst i nærvær av ellers dødelige antibiotika. Den "siste-linje" antimikrobielle colistin brukes til å behandle Gram-negative bakterielle infeksjoner. Imidlertid kan flere Gram-negative patogener, inkludert Acinetobacter baumannii utvikle colistinresistens gjennom en rekke molekylære mekanismer, hvorav noen ble karakterisert ved hjelp av Tn-seq. Videre varierer signaltransduksjonsveier som regulerer colistinresistens i Gram-negative bakterier. Her foreslår vi en effektiv metode for transposon mutagenese i A. baumannii som effektiviserer generering av et mettende transposon innsettingsbibliotek og amplicon bibliotekkonstruksjon ved å eliminere behovet for begrensningsenzymer, adapter ligation og gelrensing. Metodene som er beskrevet her, vil muliggjøre grundig analyse av molekylære determinanter som bidrar til A. baumannii fitness når de utfordres med colistin. Protokollen gjelder også for andre Gram-negative ESKAPE patogener, som primært er forbundet med legemiddelresistente sykehusinfeksjoner.

Introduction

Oppdagelsen av antibiotika er utvilsomt en av de mest virkningsfulleth helserelaterte hendelsene i det 20. Ikke bare løser antibiotika raskt alvorlige bakterielle infeksjoner, de spiller også en avgjørende rolle i moderne medisin. Store operasjoner, transplantasjoner og fremskritt i neonatal medisin og kjemoterapi la pasienter utsatt for livstruende infeksjoner og disse terapiene ville ikke være mulig uten antibiotika1,2. Imidlertid har rask utvikling og spredning av antibiotikaresistens blant menneskelige patogener betydelig redusert effekten av alle klinisk viktige klasser av antibiotika3. Mange bakterielle infeksjoner som en gang var lett ryddet med antibiotikabehandling, reagerer ikke lenger på klassiske behandlingsprotokoller, noe som forårsaker en alvorlig trussel mot global folkehelse1. Antimikrobiell resistens (AMR) er der bakterielle celler vokser i ellers dødelige konsentrasjoner av antibiotika, uavhengig av behandlingsvarighet4,5. Det er et presserende behov for å forstå molekylære og biokjemiske faktorer som regulerer AMR, noe som vil bidra til å veilede alternativ antimikrobiell utvikling. Spesielt er ESKAPE patogener problematiske i kliniske omgivelser og forbundet med omfattende AMR. Disse inkluderer Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa og Enterobacter spp. Mens flere mekanismer bidrar til AMR i ESKAPE patogener, er de siste fire organismene Gram-negative.

Gram-negative bakterier monterer en definerende ytre membran som beskytter dem mot ugunstige miljøforhold. Den ytre membranen fungerer som en permeabilitetsbarriere for å begrense oppføring av giftige molekyler, som antibiotika, inn i cellen. I motsetning til andre biologiske membraner er den ytre membranen asymmetrisk. Det ytre pakningsvedlegget er beriket med overflateksponert lipopolysakkarid, mens det indre pakningsvedlegget er en blanding av fosfolipider6. Lipopolysakkaridmolekyler er forankret til den ytre membranen av en konservert lipid A moiety innebygd i lipid bilayer7. Den kanoniske lipid Et domene av Escherichia coli lipopolysakkarid er nødvendig for veksten av de fleste Gram-negative bakterier og syntetiseres av en ni-trinns enzymatisk vei som er en av de mest grunnleggende og bevarte banene i Gram-negativeorganismer 6,7,8.

Polymyxiner er kationiske antimikrobielle peptider som retter seg mot lipid et domene av lipopolysakkarid for å perturb den ytre membranen og lyse cellen. Den elektrostatiske interaksjonen mellom positivt ladede rester av polymyxiner og de negativt ladede lipid A fosfatgruppene forstyrrer bakteriecellemembranen som til slutt fører tilcelledød 9,10,11,12,13. Colistin (polymyxin E) er en siste-resort antimikrobiell brukes til å behandle infeksjoner forårsaket av multidrug resistente Gram-negative nosocomial patogener, som Acinetobacter baumannii14,15,16. Først oppdaget i 1947, polymyxiner er produsert av jordbakterier, Paenibacillus polymyxa17,18,19. Polymyxiner ble foreskrevet for å behandle Gram-negative infeksjoner i mange år før deres kliniske bruk var begrenset på grunn av rapporter om signifikant nefro- og nevrotoksisitet20,21.

A. baumannii er et nosocomial Gram-negativt patogen som har dramatisk økt sykeligheten og dødeligheten av pasientutfall de sistetiårene 22. Det som en gang ble ansett som et lavtrusselpatogen, utgjør nå en betydelig risiko for sykehusinfeksjon over hele verden på grunn av sin utrolige evne til å skaffe AMR og høy risiko forepidemi 23,24. A. baumannii står for mer enn 10% av nosocomial infeksjoner i USA. Sykdom manifesterer seg som lungebetennelse, bakteriemi, urinveisinfeksjoner, hud- og bløtvevsinfeksjoner, meningitt og endokarditt25. Behandlingstilbud for A. baumannii infeksjoner har sunket på grunn av motstand mot nesten alle antibiotikaklasser, inkludert β-lactams, fluorokinoloner, tetracyklin og aminoglykosider23,24. Utbredelsen av multiresistente, omfattende legemiddelresistente og panresistente A. baumannii-isolater har ført til en oppblomstring i colistinbehandling, som ble antatt å være et av de få gjenværende terapeutiske alternativene som fortsatt er effektive mot multiresistentE A. baumannii. Imidlertid har økt colistin motstand blant A. baumannii isolater ytterligere forsterket sin trussel mot den globalefolkehelsen 10,11,12,13,27,30,31.

Nylige fremskritt innen sekvenseringsteknologi med høy gjennomstrømning, som transposonsekvensering (Tn-seq), har gitt viktige verktøy for å fremme vår forståelse av bakteriell fitness in vitro og in vivo. Tn-seq er et kraftig verktøy som kan utnyttes til å studere genotype-fenotype interaksjoner i bakterier. Tn-seq er bredt anvendelig på tvers av bakterielle patogener, hvor den kombinerer tradisjonell transposon mutagenese med massiv parallell sekvensering for raskt å kartlegge innsettingssteder, som kan brukes til å koble DNA-mutasjoner til fenotypiske varianter på en genom-wide skala32,,33,,34,,35. Mens transposon mutagenesis metoder har tidligere blitt beskrevet, de generelle trinnene er lik33. For det første genereres et innsettingsbibliotek ved hjelp av transposon mutagenese, hvor hver bakteriell celle i en populasjon er begrenset til en enkelt transposoninnsetting i det genomiske DNA (gDNA). Etter mutagenese er individuelle mutanter samlet. gDNA ekstraheres fra innsettingmutantbassenget, og transposonkryssene forsterkes og utsettes for sekvensering med høy gjennomstrømning. Leser representerer innsettingsområder, som kan tilordnes genomet. Transposon innsettinger som reduserer fitness raskt faller ut av befolkningen, mens gunstige innsettinger er beriket. Tn-seq har vært medvirkende til å fremme vår forståelse av hvordan gener påvirker bakteriell kondisjon i stress33.

Himar1 mariner transposon system kodet i pJNW684 ble spesielt konstruert og optimalisert for formålet med transposon mutagenesis. Det inkluderer en mariner-familietransposon flankerer kanamycin motstand genet, som brukes til valg av transposon innsetting mutanter i A. baumannii. Den koder også en A. baumannii-spesifikk promotor som driver uttrykk for transposasekodingsgenet36. Den marinerbasertetransposon inneholder også to translasjonelle terminatorer nedstrøms av kanamycinresistensgenet, som forhindrer gjennomlesning nedstrøms av innsetting37. pJNW684 bærer også en RP4/oriT/oriR6K-betinget opprinnelse av replikering som krever at λpir-genet som donorstammen bidrar med, replikerer38. I fravær av λpir genet, pJNW684 vektor bærer transposition maskiner vil ikke være i stand til å replikere i A. baumannii mottaker stamme10,,36,,38. Derfor, under bakteriell bøyning, settes bare transposonet inn i mottakergenomet uten bakgrunnsinnsetting av plasmiden, som bærer transposasegenet. Dette er viktig fordi tapet av transposaseaktivitet sammen med plasmid resulterer i enkelt, stabil transposisjonshendelse som hindrer transposonet fra å flytte til forskjellige steder når den setter seg inn i mottakergenomet.

pJNW648 har også blitt testet for aktivitet i en annen Gram-negativ organisme, E. coli. Vellykket montering av et mettende Tn-seq bibliotek i E. coli stamme W3110 indikerte at systemet er mottagelig for å utføre mutagenese i et bredt spekter av patogener, inkludert Enterobacteriaceae. Videre kan A. baumannii spesifikke arrangør som driver transposase uttrykk raskt utveksles med en arts-spesifikk promotor. Til slutt kan kanamycinresistensgenet byttes mot andre motstandskassetter, avhengig av AMR-fenotypen til organismen som studeres.

En faktor som bidrar til kolitinresistens i A. baumannii er administrasjon av utilstrekkelige doser, hvor bakterier utsettes for selektivt trykk ved ikke-dødelige nivåer39. Flere rapporter viste at subinhibitory antimikrobielle konsentrasjoner kan indusere regulerte responser som endrer cellefysiologi for å redusere mottakeligheten til helebakteriepopulasjonen 11,,12,,30,,31. Ved hjelp av Tn-seq oppdaget vi faktorer som regulerer colistinresistens i A. baumannii-stammen ATCC 17978 etter eksponering for hemmende10 og subinhibitory konsentrasjoner av colistin. Dette eksemplet beskriver en Tn-seq metode som effektiviserer konstruksjon og berikelse av en mettet transposon mutant bibliotek ved hjelp av mariner-basertefamilien av transposoner40,41. Mens flere Tn-seq protokoller generere 20.000 - 100.000 mutanter35,,42,,43,,44,,45,,46, protokollen beskrevet her kan raskt generere en transposon bibliotek på 400.000 + mutanter, som omtrent tilsvarer en transposon innsetting hver 10-base par i A. baumannii10. Videre kan bibliotekstørrelsen skaleres opp uten betydelig ekstra innsats. Denne metoden eliminerer også kravet om begrensning endonucleases, adapter ligation og gel rensing, noe som kan redusere endelig bibliotek mangfold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bakteriell belastning forberedelse

  1. Strek "donor" belastning (E. coli MFD DAP-/ pJNW684, Table of Materials) for isolerte kolonier på Luria-Bertani agar supplert med 600 μM diaminopisyre (DAP), 100 mg / L ampicillin og 25 mg / L kanamycin. Inkuber over natten ved 37 °C. Ved hjelp av en enkelt isolert koloni, inokulere 50 ml Luria kjøttkraft (LB) supplert med 600 μM DAP, 100 mg / L av ampicillin og 25 mg / L kanamycin i en 250 ml Erlenmeyer kolbe og merk den som "donor".
  2. Strek "mottaker" belastning (A. baumannii stamme ATCC 17978, Table of Materials) for isolerte kolonier på Luria-Bertani agar. Inkuber over natten ved 37 °C. Ved hjelp av en enkelt isolert koloni, inokuler 50 ml LB i en 250 ml Erlenmeyer kolbe og merk den som "mottaker".
  3. Inkuber begge kulturer ("donor" og "mottaker") over natten ved 37 °C med risting.

2. Bakteriell parring

  1. Overfør over natten kulturer til 50 ml koniske rør.
  2. Pellet både mottaker- og giverkulturer bruker sentrifugering på 5000 x g i 7 min.
  3. Kast den overnaturlige og gjenbruke "donor" stammepellet i 35 ml LB supplert med DAP for å vaske bort gjenværende antibiotika.
  4. Pellet "donor" stammeceller ved hjelp av sentrifugering på 5000 x g i 7 min.
  5. Kast den overnaturlige og resuspend "donor" stammepellet i 4,5 ml LB supplert med DAP. Bruk en 10 ml serologisk pipette.
  6. Overfør den gjenbrukte "donor" belastningen til "mottaker" belastningsrør, som inneholder pelleted "mottaker" celler. Bruk den samme 10 ml serologiske pipetten fra trinn 2.5 for å blande kulturene. Gå umiddelbart til neste trinn.
    MERK: Det totale volumet på den endelige suspensjonen skal være 5 ml.
  7. Fordel parringsfjæringen som individuelle 100 μL dråper på LB agarplater supplert med DAP (5-7 dråper per plate) (figur 1A).
  8. Inkuber plater ved romtemperatur i 30 min.
  9. Uten å forstyrre dråpene, overfør forsiktig plater til en 37 ° C inkubator og la kulturer parre seg i 1 time.
    MERK: Inkubasjonsperioder som overstiger 1 t risikogenerering av søstermutanter.
  10. Etter inkubasjon, tilsett 1,5 ml LB på hver tallerken og høst ved å gjenbruke bakterier fra platene. Bruk en 1 ml mikropipette for gjenoppliving. Endelig volum skal være ca 12 - 15 ml.
  11. Kombiner høstede celler i et 50 ml konisk rør.
  12. Pellet de parret cellene ved hjelp av sentrifugering på 5000 x g i 7 min.
  13. Kast de overnaturlige og gjenbrukscellene i 50 ml LB for å fjerne gjenværende DAP.
  14. Pellet parring ved hjelp av sentrifugering på 5000 x g i 7 min.
  15. Gjenta vasketrinnet (trinn 2.13 og 2.14).
  16. Ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette, resuspend pellet i 10 ml LB supplert med 25% glyserol.
  17. Bruk vasket celler, lage fem seriell fortynninger i LB kjøttkraft (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000, 1:100,000).
  18. Spre 100 μL av hver fortynning på 4 forskjellige plater ved hjelp av sterile glassperler: Luria-Bertani agar supplert med kanamycin, agar supplert med ampicillin, agar supplert med DAP og agar bare.
  19. Inkuber plater ved 37 °C over natten.
  20. Aliquot de resterende parring i 1 ml aliquots og lagre ved -80 °C.

3. Bestem riktig fortynning av transponibibliotek

  1. Registrer kolonidannende enheter (CFU) fra nattplater.
  2. Bilde en plate med fylker for hver enkelt plate tilstand (Figur 2A).
    MERK: Både "donor" og "mottaker" stammer bør vokse på agar plater supplert med DAP, så de fleste belagte fortynninger vil gi en plen. Bare "mottaker" belastningen kan vokse på agar plater. Verken "donor" eller "mottaker" belastningen kan vokse på agar plater supplert med ampicillin, så det bør ikke være noen / minimal vekst. Bare mål stamme celler koding transposon innsetting kan vokse på agar plater supplert med kanamycin. Kolonier bør variere i størrelse, noe som indikerer transposon innsettinger i gener som bidrar til fitness på agar supplert med kanamycin.
  3. Beregn antall transposonmutanter i den frosne paringen ved å telle antall kolonier på LB agarplater supplert med kanamycin.
    MERK: For A. baumannii-genomet (ca. 4 Mbps) var målet å få tak i ca. 400 000 kolonier for å generere et høyoppløselig mutantbibliotek (omtrent én transposoninnsetting/10 basispar). Dette tallet bør imidlertid optimaliseres basert på genomstørrelsen til målartene).

4. Generasjon av endelig bakteriell mutant bibliotek

  1. Tin en aliquot av den frosne parring på is.
  2. Plateparring på 150 mm Luria-Bertani agar plater supplert med kanamycin basert på CfUer beregnet i trinn 3.1. Juster volumet med LB for å gi 13 333 kolonier per 150 μL før plating.
    MERK: CFU-tellingen her var fastslått å være ca 105 CFU / ml, så parringsvolumet ble justert for å få 13 333 kolonier per plate, da dette ville gi et optimalt antall kolonier på 30 plater for et høyoppløselig mutantbibliotek uten å overbefolke platene.
  3. Bruk sterile glassperler til å spre 150 μL av fortynningen per plate på 30 x 150 mm Luria-Bertani agarplater supplert med kanamycin for å oppnå 400.000 kolonier (figur 1C).
    MERK: Sterile stenger eller noen form for sterilt sprederverktøy (f.eks. glassperler) kan brukes til å spre bakteriene på plater.
  4. Kast det brukte røret som inneholder overflødig parring.
    MERK: Frys/tinesykluser legger selektivt press på bakteriekulturen, noe som kan forvrenge Tn-seq-eksperimentresultatene. Bruk en fersk aliquot hver gang.
  5. Inkuber plater ved 37 °C i 14 timer.
    MERK: Inkubasjonstiden er optimalisert for å hindre overvekst (kolonier berøre). Minimere veksten ved å redusere inkubasjonstiden foreslås.

5. Estimere bibliotektetthet og pooling for lagring

  1. Tell CFUer på hver plate for å estimere de totale mutantene i transposonbiblioteket. Tell 20 % av minst 3 plater for å bestemme kolonitellingsestimatet for hele gruppen plater (figur 2A). Sørg for at koloniene ikke berører en annen koloni.
  2. Etter beregning av estimert koloniutbytte, tilsett 3-5 ml LB (eller mer om nødvendig) til hver plate og skrap av bakteriene ved hjelp av et sterilt skrapverktøy.
    MERK: Sterile inokulerende løkker ble brukt til å effektivt skrape plater.
  3. Pool bakterielle suspensjoner fra alle plater i 50 ml koniske rør (Figur 1D). Dette vil kreve flere 50 ml koniske rør, minst 3.
  4. Pellet samlet bakteriell suspensjon ved hjelp av sentrifugering på 5000 x g i 7 min.
  5. Kast den supernatante og resuspend pellet i 5 ml LB supplert med 30% glyserol.
  6. Aliquot 1 ml transposon biblioteket i kryovials og lagre ved -80 °C.

6. Identifisering av faktorer som regulerer colistinresistens i A. baumannii

  1. Forbered 4 x 250 ml Erlenmeyer flasker med hver inneholder 50 ml LB kjøttkraft og etikett som (figur 2B)
    1. A. baumannii stamme ATCC 17978 Tn-seq bibliotek; (-) colistin_1
    2. A. baumannii stamme ATCC 17978 Tn-seq bibliotek; (-) colistin_2
    3. A. baumannii stamme ATCC 17978 Tn-seq bibliotek; (+) colistin_1
    4. A. baumannii stamme ATCC 17978 Tn-seq bibliotek; (+) colistin_2
      MERK: I utfordringen som er beskrevet her, testes hver tilstand, (-) colistinkontroll og (+) colistin-utfordring, i duplikat. Derfor krever oppsettet 4 x 250 ml Erlenmeyer kolbe, to per tilstand.
  2. Tilsett 50 μL 0,5 mg/l colistin i (+) kolikk (6,1,3 og 6,1,4) og 50 μL vann til (-) colistin kolbe (6.1.1 og 6.1.2).
  3. Tin en frossen Tn-seq bibliotek aliquot fra trinn 5 på is.
  4. Pipette 1 μL av det tinte biblioteket i 1 ml PBS.
  5. Mål den optiske tettheten ved 600 nm (OD600) og multipliser med 1000.
    MERK: Dette bestemmer OD600 av 1 μL i Tn-biblioteket.
  6. Basert på beregningen i trinn 6.5, inokuler hver kolbe som inneholder 50 ml LB til en endelig OD600 0,001.
  7. Vokse kulturer i en risting inkubator ved 37 ° C til OD600 0,5.
    MERK: Det er viktig at kulturer forblir i logaritmisk vekstfase, så hvis belastningen din er på en annen OD600 under eksponentiell vekst, må OD600 justeres for å sikre at kulturen replikerer så mange ganger som mulig innenfor logaritmisk vekstfase. Hvis kulturen bare replikerer 3 ganger, er kraften til å oppdage treningsfeil i mutanter avkortet på 3-fold forskjeller, i teorien. Siden ulike bakterier har forskjellige doblingstider, er det viktig å så kulturene på en fast OD600 for å normalisere startinokumen. Dette sikrer konsekvent representasjon av hele biblioteket i alle kulturer.
  8. Høst kulturer ved hjelp av sentrifugering ved 5000 x g ved 4 °C i 7 min.
  9. Fjern det overnaturlige og vask med 50 ml PBS.
  10. Pellet ved hjelp av sentrifugering ved 5000 x g ved 4 °C i 7 min.
  11. Fjern den overnaturlige og resuspend pellet i 1 ml PBS. Aliquot ~ 200 μL i 5 mikrocentrifuge rør.
  12. Pellet ved hjelp av sentrifugering ved 5000 x g ved 4 °C i 5 min. Fjern alle de overnaturlige med en pipettespiss.
  13. Oppbevar pellets ved -20 °C eller fortsett med gDNA ekstraksjon.

7. gDNA ekstraksjon

  1. Tin en cellepellet på is.
  2. Tilsett 0,6 ml lysisbuffer (Materialsovertred) og vortex for å fullstendig bruke pelleten på.
  3. Inkuber ved 37 °C i 1 time.
  4. Tilsett 0,6 ml fenol/kloroform/isoamylalkohol i prøven og virvelen kraftig.
  5. Separate faser ved hjelp av sentrifugering i en mikrocentrifuge ved maksimal hastighet ved romtemperatur i 5 min.
  6. Overfør den øvre vandige fasen til et nytt rør. Unngå å forstyrre fasegrensesnittet under overføring.
  7. Tilsett et likt volum kloroform til vandig fase oppnådd ovenfor og vortex kraftig.
  8. Separate faser ved hjelp av sentrifugering i mikrocentrifuge ved maksimal hastighet ved romtemperatur i 5 min.
  9. Overfør øvre vandige fase til et nytt rør.
    MERK: Pass på at du unngår å forstyrre grensesnittet under overføringen.
  10. Tilsett 2,5 x vandig fasevolum av kaldt 100 % etanol og bland forsiktig. Utfelling av DNA vil være synlig.
  11. Plasser røret ved -80 °C i minst 1 time.
  12. Pellet DNA ved hjelp av sentrifugering ved maksimal hastighet ved 4 °C i 30 min.
  13. Fjern forsiktig supernatant uten å forstyrre DNA-pelleten og vask med 150 μL på 70 % etanol ved pipettering.
  14. Pellet DNA ved hjelp av sentrifugering ved maksimal hastighet ved 4 °C i 2 min.
  15. Fjern forsiktig det overnaturlige.
  16. Gjenta trinn 7.14 én gang. Fjern forsiktig alle gjenværende etanol.
  17. Tørk DNA ved å inkubere på romtemperatur i 5-10 min.
  18. Gjenbruk DNA pellet i 100 μL TE buffer ved pipettering.

8. DNA-klipping (figur 3A)

  1. Fortynn gDNA med TE-buffer til en konsentrasjon på 250 ng/ml i et totalt volum på 200 μL.
  2. Plasser rør i et vannbad sonicator.
  3. Sonicate DNA å gi fragmenter av ca 300 nukleotider. Effekt: 60 %, Total tid: 20 min, Sykluser: 10 s ON og 10 s OFF ved 4 °C (figur 3A).
  4. Bekreft at DNA er skjært riktig ved å skille 10 μL av uskrukne DNA og 10 μL av skjært DNA på en 1% agarose gel. Gjenta sonikering eller optimaliser etter behov (figur 3B).

9. Poly-C hale tillegg til 3' slutten (Figur 3A)

  1. Oppsett poly-C reaksjon i henhold til tabell 1.
  2. Inkuber reaksjon ved 37 °C i 1 time.
  3. Rens poly-C-reaksjon med 40 μL av paramagnetiske perler (figur 3A) ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Tilsett 40 μL av størrelsesvalg paramagnetiske perler til hver prøve. Vortex ~ 5 s eller pipette opp og ned.
    2. Inkuber prøver ved romtemperatur i 5 min.
    3. Kort sagt, sentrifuge rør for å samle væske i bunnen av røret (~ 2 s).
    4. Overfør rør til et magnetisk stativ og inkuber ved romtemperatur i ~ 2 min til løsningen er klar.
    5. Med rør på magnetisk stativ, fjern forsiktig det overnaturlige.
    6. Med rør på magnetstativ, tilsett 200 μL nylaget 80% etanol (ikke forstyrr perler).
    7. Inkuber prøver i minst 30 s til løsningen er klar.
    8. Med rør på magnetisk stativ, fjern forsiktig det overnaturlige.
    9. Gjenta vasketrinnet (trinn 9.3.6 - 9.3.8).
    10. Samle væske i bunnen av røret ved hjelp av et kort sentrifugeringstrinn (~ 2 s).
    11. Overfør rør til magnetstativet og fjern eventuell gjenværende væske.
    12. Inkuber ved romtemperatur i 2-5 min for å tørke prøver. Ikke tørk for langt.
    13. Fjern rørene fra magnetstativet og tilsett 25 μL vann til hver. Vortex for ~ 5 s eller pipette opp og ned.
    14. Kort sagt, sentrifuge rør for å samle væske i bunnen av røret (~ 2 s).
    15. Overfør rør til magnetstativet og la det sitte i ~ 2 min til løsningen er klar.
    16. Med rør på magnetstativet fjerner du væske uten å forstyrre perlene og overføres til et nytt rør (~ 23 μL DNA).

10. Forsterkning av transposonkobling (figur 3A)

  1. Installasjons-PCR 1 som beskrevet i tabell 1 for den første nestede PCR(tabell 2).
  2. Utfør PCR 1 ved hjelp av forhold som er beskrevet i tabell 1.
  3. Rens PCR-produkter med 40 μL av paramagnetiske perler (trinn 9.3.1 – 9.3-12). Elute i 50 μL vann (trinn 9.3.13 – 9.3.16). På dette punktet prøvene kan lagres ved -20 °C.
  4. Forbered Streptavidin-koplet paramagnetiske perler:
    1. Resuspend Streptavidin perler ved å riste kraftig.
    2. Tilsett 32 μL perler per prøve til et friskt mikrocentrifugerør.
      MERK: Perler for 6 + prøver kan tilberedes i et enkelt rør.
    3. Overfør røret til et magnetisk stativ. Inkuber i ~ 2 min til løsningen er klar.
    4. Med røret på magnetstativet, fjern supernatant.
    5. Fjern røret fra magnetstativet. Vask perler ved å gjenbruke i 1 ml 1x B & W buffer ved å pipetter opp og ned.
    6. Overfør røret til magnetisk stativ. Inkuber i ~ 2 min til løsningen er klar.
    7. Med røret på magnetstativet fjerner du supernatanten.
    8. Gjenta vasketrinnet med 1 ml 1x B&W-buffer (trinn 10.4.5 – 10.4.7) to ganger til for totalt 3 vasker.
    9. Fjern røret fra magnetstativet og resuspend perler i 52 μL av 2x B & W buffer per prøve.
  5. Kombiner 50 μL av de tilberedte perlene med 50 μL renset PCR1 (fra trinn 10,3). Pipette å blande.
  6. Roter ved romtemperatur i 30 min.
  7. Vask bort ubundet DNA:
    1. Kort sagt, sentrifuge å samle væske på bunnen av røret (~ 2 s).
    2. Overfør røret til magnetisk stativ. Inkuber i ~ 2 min til løsningen er klar.
    3. Med røret på magnetstativet fjerner du supernatanten.
    4. Fjern røret fra magnetstativet, vask perler ved å gjenbruke i 100 μL 1x B & W buffer og pipettering opp og ned.
    5. Overfør rør til magnetisk stativ. Inkuber i ~ 2 min til løsningen er klar.
    6. Med røret på magnetstativet, fjern supernatant.
    7. Gjenta vasketrinnene med 100 μL LoTE (trinn 10.7.4 – 10.7.6) to ganger mer for totalt 3 vasker.
  8. Oppsett av PCR 2 som beskrevet i tabell 1 for å forsterke transponerkoblinger og legge til én enkelt strekkode i hver prøve (tabell 2 og tabell 3).
  9. Utfør PCR 2 ved hjelp av betingelser som er beskrevet i tabell 1.
  10. Rens med 40 μL av størrelsesvalg paramagnetiske perler (trinn 9.3.1 – 9.3.12). Elute i 17 μL vann (trinn 9.3.13 – 9.3.16), samle ~ 15 μL.
  11. Kvantifisere DNA-konsentrasjon ved hjelp av et fluorometer. De endelige konsentrasjonene skal være ~ 50 til 250 ng / μl.
  12. Vurder DNA-kvalitet ved hjelp av chipbasert kapillærelektroforese (figur 4A).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De skisserte metodene beskriver genereringen av et transposonbibliotek med høy tetthet i A. baumannii-stammen ATCC 17978 gjennom bakteriell bøyning ved hjelp av E. coli MFD DAP-, som replikerer plasmid pJNW684 (figur 4B). Den detaljerte protokollen bruker to-foreldre bakteriell bøyning for overføring av pJNW684 fra E. coli λpir+ donor belastning til A. baumannii mottaker belastning. Dette er en effektiv og billig metode for å generere tett transposon mutant biblioteker. Bakterier ble blandet ved optimaliserte forhold og parring ble oppdaget på Luria-Bertani agar plater i 1 time (Figur 1A). Under parring ble transposonet overført fra donor til mottakerstamme, hvor den ble satt inn i gDNA (figur 1B). Parring ble samlet inn, ca. 105 CFU/ml ble beregnet og belagt på 150 mm x 15 mm agarplater supplert med kanamycin. Etter 14 timer med vekst ved 37 °C inneholdt plater tusenvis av kolonier av varierende størrelse (figur 1C) som indikerer vellykket generering av et transposonmutant bibliotek. Transposon innsetting mutanter ble samlet (Figur 1D) og frosset i aliquots for å hindre gjentatte fryse-tine sykluser, noe som kan legge selektivt trykk på innsetting biblioteket.

Det samlede A. baumannii transposonmutantbiblioteket ble brukt til å identifisere treningsfaktorer som er viktige for colistinresistens under subinhibitory konsentrasjoner av antimikrobielle (figur 2B). Det muterte biblioteket ble dyrket til logaritmisk fase i fravær/tilstedeværelse av 0,5 mg/l colistin i duplikat for å tømme muterte celler som koder innsettinger i gener som bidrar til kolitinresistens. Den totale gDNA av gjenværende bibliotek bassenget ble isolert fra kontroll og eksperimentelle kulturer og behandlet for å forberede DNA for sekvensering (Figur 3A).

Isolert gDNA ble fragmentert ved hjelp av mekanisk klipping og en poly-C hale ble lagt på DNA fragmenter (Figur 3A). Etter tillegg av poly-C hale, DNA ble renset og transposon-genom veikryss ble beriket ved hjelp av poly-C spesifikke primer etterfulgt av en andre runde med PCR ved hjelp av en annen poly-C spesifikk primer som introduserte P7 sekvensering området som er nødvendig for binding av Illumina flyt celle og klynge generasjon, og en seks-base strekkode som brukes til demultiplex biblioteker post sekvensering37,47. DNA-konsentrasjoner ble beregnet og prøvene ble analysert ved hjelp av chipbasert kapillærelektroforese for å bekrefte vellykkede bibliotekbygginger (figur 4A), som er klare for sekvensering med høy gjennomstrømning.

DNA-biblioteker ble sekvensert av neste generasjons sekvensering. En enkelt-end, 50 syklus kjøre ble utført, noe som ga 30 millioner høy kvalitet leser / prøve gir 62,5-fold dekning av transposon biblioteket. Transposon-veikryss (leser) ble kartlagt til referansegenomet48, ved hjelp av kommersielt tilgjengelig bioinformatikkanalyseprogramvare. Antallet lys på hvert innsettingssted i inndataprøvene, (-) colistinkontrolltilstand, ble sammenlignet med antall lesinger i utdataprøvene, (+) colistin eksperimentell tilstand, og treningsresultater for hvert innsettingssted ble beregnet. Kondisjonsresultatene ble deretter gruppert etter genet. Gener som viste reduserte score når biblioteket ble dyrket i nærvær av colistin i forhold til inndataprøvene ble ansett som fitness determinanter for A. baumannii overlevelse ved subinhibitory konsentrasjoner av colistin. Transposoninnsettinger i PmrAB-systemet med to komponenter finnes for eksempel i inndataprøven, men ble ikke funnet i utdataprøven. PmrAB regulerer direkte uttrykk for pmrC, som overfører fosfoetanolamin til lipid A for å nøytralisere ladningen på celleoverflaten12,31. Nøytralisering av bakteriell overflateladning antas å redusere det elektrostatiske potensialet som kreves for kolitinmediert drap. Identifisering av utarmede gener som er kjent for å bidra til resistensfenotypen validerte metoden.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk transposon mutant bibliotek konstruksjon. (A)Bakteriell bøyning. "Donor" belastningen, som koder transposisjon maskineriet, ble blandet med "mottaker" belastning. Blandingen ble oppdaget på LB agar plater og lov til å parre seg i 1 t. (B) Generasjon av transposon bibliotek. Plasmid som fraktet transponeringsmaskineriet ble overført fra "donor" belastningen til "mottaker" belastning og transposon ble tilfeldig satt inn i genomet til "mottaker" belastningen. (C) Valg. Resulterende celler ble belagt på agarplater supplert med kanamycin å velge for transposon innsettingmutanter. (D) Pooled bibliotek. Kolonier ble skrapt fra plater, resuspended i LB og samlet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representative bakterielle konjugeringsresultater og en skjematisk av colistin Tn-seq-eksperimentet. (A)Representativ kanamycin valgplate. Platen er delt inn i fem like deler. Blå prikker representerer kolonitelling for estimering av A. baumannii transposon innsettingmutanter. Minst tre separate plater ble talt for å beregne den endelige estimeringen. (B) Identifikasjon av treningsfaktorer ved subinhibitory colistinkonsentrasjoner. Det samlede transposonbiblioteket ble dyrket til logaritmisk vekstfase enten i fravær (kontroll) eller i nærvær (eksperimentell) av colistin. Når kulturene nådde passende optisk tetthet, ble cellene pelleted og gDNA ble hentet fra hver prøve. Hver betingelse ble testet i duplikat for totalt fire prøver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Flytskjema av DNA amplicon biblioteket bygge for massiv parallell sekvensering og representativ skjært gDNA. (A) Tn-seq DNA bibliotek bygge skjematisk. Etter ekstraksjon ble gDNA fragmentert via mekanisk klipping. Terminal deoksynucleotidyl transferase ble brukt til å legge til en poly-C hale til 3 'slutten av fragmentert DNA før PCR forsterkning av transposon-genom veikryss og strekkode tillegg. (B) 1% agarose gel av usjeared og skjært A. baumannii mutant biblioteker etter gDNA klipping trinn. 1 Kb stige ble brukt som en DNA-markør. Skjært gDNA smøre primært varierer mellom ~ 100 og 500 base par. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representative kvalitetskontroll (QC) resultater og kart over plasmid bærer transposisjonsgenene. (A) QC spor for et DNA-bibliotek bygge. Det er en topp på ~ 350 basispar, noe som indikerer vellykket bibliotekbygging. Hvis noe større DNA ble oppdaget i QC-resultatene, kan prøvene ryddes opp ytterligere for å fjerne store DNA-fragmenter. (B)Plasmid pJNW684 består av en Himar1 mariner transposon (grønn) med en kanamycin motstand kassett (lilla) for mutert utvalg, et gen som koder den hyperaktive sjømann Himar1 C9 transposase (rød) under kontroll av en A. baumannii 17978 spesifikk promotor (blå), en ampicillin motstand gen (bla, oransje) og en RP4 /oriT/oriR6K-betinget opprinnelse av replikering (gul). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Reaksjon Installasjonsprogrammet Forhold
Poly-C reaksjon 30 μL av skjært gDNA
2,5 μL på 9,5 mM dCTP/0,5 mM ddCTP
10 μL 5X Terminal deoksynucleotidyl transferase (Tdt) reaksjonsbuffer
1,25 μL av rTdt
6,25 μL vann til 50 μL		 Inkuber ved 37ºC i 1 time
1. 1. 23 μL 3'-poly-C renset DNA (hele prøven fra forrige trinn)
10 μL 10x high-fidelity DNA polymerase reaksjon blanding
2 μL 10 mM dNTPs
2 μL 50 mM MgSO4
1 μL 30 μM olj 510 biotin
3 μL 30 μM olj 376
0,5 μL high-fidelity DNA polymerase
8,5 μL rent vann til 50 μL totalt		 1 syklus: 2 min 94 ºC
15 sykluser: 15 s 94 ºC
30 s 60 ºC
2 min 68 ºC
1 syklus: 4 min 68 ºC
Hold: ∞ 4 ºC
2. 2. DNA-bundne perler fra forrige trinn
10 μL 10x high-fidelity DNA polymerase reaksjon blanding
2 μL 10 mM dNTP
2 μL 50 mM MgSO4
1 μL 30 μM olj 511
1 μL 30 μM strekkode primer (tabell 2)
0,5 μL high-fidelity DNA polymerase
33,5 μL rent vann til 50 μL		 1 syklus: 2 min 94 ºC
15 sykluser: 15 s 94 ºC
30 s 60 ºC
2 min 68 ºC
1 syklus: 4 min 68 ºC
Hold: ∞ 4 ºC

Tabell 1: Reaksjonsoppsett. Oppsett og betingelser for poly-C, PCR 1 og PCR 2 reaksjoner.

Formål navn Sekvens
Anneals til transposon olj510-Biotin Biotin-GATGGCCTTTTTTTGCGTTTCTACCTGCAGGGCGCG
Anneals til poly-C hale Olj376 Gjestgiveri GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGG
GGGGGGGGGGGGGGGG
Nestet til transposon + P5 adapter:
P5 fange området - P5 sekvensering nettsted– N5 –Tn		 Olj511 Gjestgiveri AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTT
CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNGGGGACTTA
TCATCCAACCTGTTAG
Nestet til olj376: P7 sekvenseringssted
– strekkode XXXXXX - P7 fange nettstedet)		 F.kr ## CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAGAGATxxxxxxGTGA
2009: 100 000 000 000 000 000 0
se tabell 2 for spesifikke strekkoder***

Tabell 2: PCR-forsterkning primere. PCR-forsterkning primere som brukes i protokollen for å forsterke transposon-veikryssene. Formålet med hver er oppført i den første kolonnen.

Primer Lese Strekkode Sekvens
F.Kr. 1 ATCACG CGTGAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGT
GATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 2 CGATGT ACATCG Inn CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAC LEILIGHET
ATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 3 TTAGGC GCCTAA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCC LEILIGHET
TAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 4 TGACCA TGGTCA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATT
GGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 5 Tilbud på ACAGTG CACTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 6 GCCAAT VED Å CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATA
TTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 7 CAGATC Leilighet GATCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 8 ACTTGA TCAAGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
9. mai kl. GATCAG 1999– 2009 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA
TCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 10 TAGCTT AAGCTA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
AAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 11 GGCTAC GTAGCC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 12 Cttgta (andre» TACAAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATT
AAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 13 AGTCAA TTGACT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 14 I 1999 ble det 10 GGAACT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATG
GAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 15 ATGTCA TGACAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA
TTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 16 CCGTCC GGACGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 17 GTAGAG Ctctac (andre) CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CTCTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 18 I 1999 ble det gjennomført en GCGGAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 19 GTGAAA TTTCAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 20 GTGGCC GGCCAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATG
GCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 21 GTTTCG CGAAAC Inn CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 22 CGTACG Inn CGTACG Inn CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 23 2007: 100 CCACTC (andre CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
CACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 24 GGTAGC (andre enn EGGTAGC) GCTACC (andre enn GCTACC) CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTACCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 25 ACTGAT ARCAGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
ATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 26 ATGAGC GcTCAT Inn CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTCATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 27 ATTCCT AAGGAAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATA
GGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 28 CAAAAG CtTTTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
TTTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 29 CAACTA TAGTTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TAGTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 30 CACCGG CCGGTG Inn CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CCGGTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 39 CtATAC GTATAG (andre enn de 150 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GTATAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 40 1999 – CtCAGA TCTGAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCTGAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 42 TAATCG CGATTA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
GATTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 43 TACAGC GcTGTA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTGTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 44 TATAAT ATTATA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
ATTATAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 45 TCATTC GAATGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GAATGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 46 TCCCGA TCGGGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCGGGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 47 TCGAAG 1999 – Cttcga CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
TTCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
F.Kr. 48 TCGGCA TGCCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TGCCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG

Tabell 3: Strekkode primere. Strekkode primere brukes i det andre PCR-trinnet for å forsterke transposonkryssene mens du legger til et P7-sekvenseringssted og strekkoder til ampliconen. Ikke alle strekkode primere er nødvendig for å generere et bibliotek. Bare strekkode primere for antall prøver er nødvendig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

A. baumannii er en fremvoksende trussel mot global folkehelse på grunn av rask oppkjøp av AMR mot "siste linje" terapeutiske midler, for eksempel colistin10,11,12,23,24,30,31. I de siste tiårene har Tn-seq spilt en kritisk rolle i å belyse genotype-fenotype interaksjoner på tvers av mange bakterielle arter og utvide vår forståelse av bakteriell genetikk34,35,42,43. Tn-seq protokoller har vært medvirkende i å identifisere essensielle gener i ulike bakterielle arter som Campylobacter jejuni, Staphylococcus aureus, periodontal patogen Porphyromonas gingivalis, og selv Mycobacterium tuberculosis37,49,50,51. Utover identifisering av essensielle gener, har Tn-seq blitt brukt til å identifisere antibiotikaresistensgener i Pseudomonas aeruginosa, flere betinget essensielle gener i Salmonella typhimurium, og mange genotype-fenotyperelasjoner i Streptococcus pneumoniae52,53,54. Mer nylig ble transposonsekvensering av Vibrio kolerae ansatt i spedbarnskainmodellen av Kolera for å identifisere gener som er viktige for in vivo fitness under infeksjon47. Disse studiene viser allsidigheten til Tn-seq, da den kan brukes til både in vitro- og in vivo-studier.

Den største fordelen med Tn-seq over andre metoder, for eksempel mikroarray teknologier, 2D gel elektroforese, og qPCR, er at det ikke krever forkunnskaper om genom eller genomisk informasjon55. Derfor muliggjør transposon mutagenese kombinert med massiv-parallell sekvensering studiet av kjente gener og genomer, samt oppdagelse av nye genetiske interaksjoner. Her har vi presentert en omfattende metode for å generere et svært tett transposonmutant bibliotek i A. baumannii for å identifisere faktorer som er avgjørende for bakteriell kondisjon når de utsettes for subinhibitory konsentrasjoner av colistin. Den beskrevne metoden har også blitt brukt i E. coli (upubliserte data), som viser at systemet er mottagelig for å utføre Tn-seq-analyse i andre Gram-negative patogener, inkludert Enterobacteriaceae.

Bruk av mariner transposoner for innsettingssmertease har flere fordeler. Transposonfamilien stammer fra eukaryotiske verter og har blitt mye brukt til å generere mettende mutantbiblioteker i ulike bakterielle populasjoner. Mariner transposoner er vertsuavhengige, noe som betyr at stabile tilfeldige innsettinger kan oppnås i fravær av spesifikkevertsfaktorer 40,41. I tillegg har mariner transposoner et definert antall innsettingshendelser fordi de fortrinnsvis setter inn i thymine-adenine ("TA") motiver, noe som reduserer innsettingsbias og fører til mer robust statistisk analyse37,56,57,58.

Flere mariner-baserteTn-seq metoder bruker MmeI begrensning fordøyelsen for gDNA fragmentering32,,42,,43. Mens enzymatisk DNA fragmentering er en populær og vellykket metode, legger det unødvendige skritt til prosedyren og øker potensielle bias37. Ikke bare krever disse teknikkene store mengder startmaterialer, de kan også potensielt føre til ulik representasjon av innsettingssekvenser i nedstrøms analyser37,,59. Som noen andre metoder som ikke er avhengige av MmeI kjerner aktivitet52,60,61, metoden skissert heri er avhengig av mekanisk klipping å fragmentere gDNA, og TdT å legge til en poly-C hale til 3 'slutten av DNA fragmenter. Sammenlignet med enzymatisk DNA fragmentering og adapter ligation metoder, denne tilnærmingen krever betydelig mindre mengder start DNA samtidig som det gir mer konsistente resultater, det senker også risikoen for DNA krysskontaminering og reduserer prøvetap på grunn av innesperring i etforseglet rør 37,59,62. Videre gir denne metoden lengre sekvensering av høy kvalitet av 50 nukleotider som hjelper til med mer effektiv og presis kartlegging av sekvenser og en mer robust nedstrømsanalyse37,59. Tilsetning av en syntetisk poly-C hale ignorerer potensielle overheng som kan skyldes fragmentering som denne metoden er avhengig av eksogenously lagt poly-C hale som et gjenkjenningssted for omvendt primer, som inneholder 16 dG nukleotider på sin 3 'end og en sekvens som er spesifikk for neste generasjon sekvensering (f.eks Illumina sekvensering) på 5 'slutten, til prime syntese47,59. Bruken av en syntetisk nukleotidhale utvider anvendelsen av denne metoden til mange forskjellige genomer uavhengig av deres opprinnelige innhold59. Deretter forsterkes transposon-genomkryss ved hjelp av poly-C-spesifikk primer37. Dette alternativet forenkler prosedyren ved å eliminere behovet for dyre restriksjonenzymer, adapter ligation, dannelse av adapter dimers og gel rensing trinn. Vi har ytterligere optimalisert protokollen for effektivt å generere svært mettede transposon innsetting biblioteker i flere Gram-negative ESKAPE patogener, inkludert Acinetobacter baumannii og kan brukes til å studere genetiske interaksjoner under ulike in vitro og in vivo forhold10.

En begrensning av Tn mutagenesis er at den er avhengig av antibiotikaresistensmarkørene for valg. Imidlertid er mange Gram-negative ESKAPE patogener multiresistente eller omfattende resistente, noe som betyr at brukeren kanskje må bytte motstandskassetten i henhold til det spesifikke patogenet av interesse. Videre er noen kliniske isolater ikke mottagelige for transposon mutagenese ved hjelp av mariner-basert transposon.

Et kritisk trinn i protokollen er å beregne antall Tn mutanter til plate. Plating for mange kolonier vil resultere i en plen som kan komplisere nedstrøms analyse. Hvis koloniene er for nære eller rørende, kan de legge til uønsket selektivt trykk på biblioteket som kan føre til artefakter. Ideelt sett kolonier ville ikke være rørende og fordelt jevnt over platen, som demonstrert (Figur 2A). Omvendt, hvis for få kolonier er belagt, vil det være vanskelig å isolere flere Tn innsettinger i hvert gen.

Det er også viktig å utføre kontrollene som er oppført i trinn 2.18. Som nevnt i note av avsnitt 3. 2, bør verken "donor" eller "mottaker" stamme vokse på plater supplert med Ampicillin. Siden eksogene DAP er nødvendig for vekst av "donor" belastning, enhver vekst ville indikere "mottaker" belastning replikerer pJNW684. Dette er et betydelig problem fordi hvis transposonet ikke integreres i gDNA, vil sekvensering av lesinger bare kartlegge til plasmid, ikke et integreringssted. I dette tilfellet vil eksperimentet sannsynligvis ikke gi brukbare data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra National Institute of Health (Grant AI146829 til J.M.B.) og er takknemlig anerkjent.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate Affymetrix 77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate Invitrogen 10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker Promega PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes Corning 351029
150mm x 15mm Petri Dishes Corning 351058
1X B&W N/A N/A Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid Alfa Aesar B2239103 used at 600 µM
2X B&W N/A N/A Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP N/A N/A 9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase Invitrogen 12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978 ATCC N/A AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L) Fisher Scientific BP1760 used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system BECKMAN COULTER A63881
BioAnalyzer Agilent G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis Agilent 5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP) New England Biolabs (NEB) N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack Invitrogen 12321D
E.coli MFD Dap- N/A N/A DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol Fisher Scientific A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials Corning 09-761-71
Glass beads Corning 72684
Glycerol Fisher Scientific G33
Inoculating loops Fisher Scientific 22-363-602 Scraping tool
Kanamycin Fisher Scientific BP906 used at 25 mg/L
LB agar, Miller Fisher Scientific BP1425
LB broth, Miller Fisher Scientific BP1426
LoTE N/A N/A Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer N/A N/A 9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.) Fisher Scientific BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution Fisher Scientific BP39920 Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Q33238
Qubit Assay Tubes Thermo Fisher Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath Qsonica Sonicators Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs (NEB) S1420S
TE buffer N/A N/A 10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt) Promega PR-M1875

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gould, I. M., Bal, A. M. New antibiotic agents in the pipeline and how they can help overcome microbial resistance. Virulence. 4 (2), 185-191 (2013).
  2. Holzheimer, R. G. Antibiotic induced endotoxin release and clinical sepsis: a review. Journal of Chemotherapy. 13 (1), Florence, Italy. Spec No 1 159-172 (2001).
  3. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). Antibiotic resistance threats in the United States, 2019. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). , (2019).
  4. Scholar, E. M., Pratt, W. B. The antimicrobial drugs. , Oxford University Press. New York. (2000).
  5. Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).
  6. Henderson, J. C., et al. The Power of Asymmetry: Architecture and Assembly of the Gram-Negative Outer Membrane Lipid Bilayer. Annual Review of Microbiology. 70, 255-278 (2016).
  7. Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).
  8. Raetz, C. R. H., Whitfield, C. Lipopolysaccharide Endotoxins. Annual Review of Biochemistry. 71 (1), 635-700 (2002).
  9. Kang, K. N., et al. Colistin heteroresistance in Enterobacter cloacae is regulated by PhoPQ-dependent 4-amino-4-deoxy- L -arabinose addition to lipid A. Molecular Microbiology. 111 (6), 1604-1616 (2019).
  10. Boll, J. M., et al. A penicillin-binding protein inhibits selection of colistin-resistant, lipooligosaccharide-deficient Acinetobacter baumannii. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (41), 6228-6237 (2016).
  11. Boll, J. M., et al. Reinforcing Lipid A Acylation on the Cell Surface of Acinetobacter baumannii Promotes Cationic Antimicrobial Peptide Resistance and Desiccation Survival. mBio. 6 (3), 00478 (2015).
  12. Arroyo, L. A., et al. The pmrCAB operon mediates polymyxin resistance in Acinetobacter baumannii ATCC 17978 and clinical isolates through phosphoethanolamine modification of lipid A. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (8), 3743-3751 (2011).
  13. Harris, T. L., et al. Small molecule downregulation of PmrAB reverses lipid A modification and breaks colistin resistance. ACS Chemical Biology. 9 (1), 122-127 (2014).
  14. Vaara, M. Agents that increase the permeability of the outer membrane. Microbiological Reviews. 56 (3), 395-411 (1992).
  15. Vaara, M. Polymyxins and their novel derivatives. Current Opinion in Microbiology. 13 (5), 574-581 (2010).
  16. Kassamali, Z., Rotschafer, J. C., Jones, R. N., Prince, R. A., Danziger, L. H. Polymyxins: wisdom does not always come with age. Clinical Infectious Diseases: An Official publication of the Infectious Diseases Society of America. 57 (6), 877-883 (2013).
  17. Ainsworth, G. C., Brown, A. M., Brownlee, G. Aerosporin, an antibiotic produced by Bacillus aerosporus Greer. Nature. 159 (4060), 263 (1947).
  18. Benedict, R. G., Langlykke, A. F. Antibiotic activity of Bacillus polymyxa. Journal of Bacteriology. 54 (1), 24 (1947).
  19. Stansly, P. G., Shepherd, R. G., White, H. J. Polymyxin: a new chemotherapeutic agent. Bulletin of the Johns Hopkins Hospital. 81 (1), 43-54 (1947).
  20. Hermsen, E. D., Sullivan, C. J., Rotschafer, J. C. Polymyxins: pharmacology, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and clinical applications. Infectious Disease Clinics of North America. 17 (3), 545-562 (2003).
  21. Pedersen, M. F., Pedersen, J. F., Adsen, P. O. A clinical and experimental comparative study of sodium colistimethate and polymyxin B sulfate. Investigative Urology. 9 (3), 234-237 (1971).
  22. Falagas, M. E., Bliziotis, I. A. Pandrug-resistant Gram-negative bacteria: the dawn of the post-antibiotic era. International Journal of Antimicrobial Agents. 29 (6), 630-636 (2007).
  23. Peleg, A. Y., Seifert, H., Paterson, D. L. Acinetobacter baumannii: Emergence of a Successful Pathogen. Clinical Microbiology Reviews. 21 (3), 538-582 (2008).
  24. Beceiro, A., Tomás, M., Bou, G. Antimicrobial resistance and virulence: a successful or deleterious association in the bacterial world. Clinical Microbiology Reviews. 26 (2), 185-230 (2013).
  25. Eliopoulos, G. M., Maragakis, L. L., Perl, T. M. Acinetobacter baumannii: Epidemiology, Antimicrobial Resistance, and Treatment Options. Clinical Infectious Diseases. 46 (8), 1254-1263 (2008).
  26. Lee, A., Nolan, A., Watson, J., Tristem, M. Identification of an ancient endogenous retrovirus, predating the divergence of the placental mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1626), 20120503 (2013).
  27. Moffatt, J. H., et al. Colistin Resistance in Acinetobacter baumannii Is Mediated by Complete Loss of Lipopolysaccharide Production. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (12), 4971-4977 (2010).
  28. Cai, Y., Chai, D., Wang, R., Liang, B., Bai, N. Colistin resistance of Acinetobacter baumannii: clinical reports, mechanisms and antimicrobial strategies. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (7), 1607-1615 (2012).
  29. Da Silva, G., Domingues, S. Interplay between Colistin Resistance, Virulence and Fitness in Acinetobacter baumannii. Antibiotics. 6 (4), 28 (2017).
  30. Chin, C. -Y., Gregg, K. A., Napier, B. A., Ernst, R. K., Weiss, D. S. A PmrB-Regulated Deacetylase Required for Lipid A Modification and Polymyxin Resistance in Acinetobacter baumannii. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7911-7914 (2015).
  31. Beceiro, A., et al. Phosphoethanolamine modification of lipid A in colistin-resistant variants of Acinetobacter baumannii mediated by the pmrAB two-component regulatory system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (7), 3370-3379 (2011).
  32. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-Wide Fitness and Genetic Interactions Determined by Tn-seq, a High-Throughput Massively Parallel Sequencing Method for Microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36, 1-24 (2015).
  33. Kwon, Y. M., Ricke, S. C., Mandal, R. K. Transposon sequencing: methods and expanding applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (1), 31-43 (2016).
  34. Yamaichi, Y., Dörr, T. Transposon Insertion Site Sequencing for Synthetic Lethal Screening. Methods in Molecular Biology. 1624, Clifton, N.J. 39-49 (2017).
  35. Goodman, A. L., et al. Identifying Genetic Determinants Needed to Establish a Human Gut Symbiont in Its Habitat. Cell Host & Microbe. 6 (3), 279-289 (2009).
  36. Wang, N., Ozer, E. A., Mandel, M. J., Hauser, A. R. Genome-Wide Identification of Acinetobacter baumannii Genes Necessary for Persistence in the Lung. mBio. 5 (3), 01163 (2014).
  37. Klein, B. A., et al. Identification of essential genes of the periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis. BMC Genomics. 13 (1), 578 (2012).
  38. Ferrieres, L., et al. Silent Mischief: Bacteriophage Mu Insertions Contaminate Products of Escherichia coli Random Mutagenesis Performed Using Suicidal Transposon Delivery Plasmids Mobilized by Broad-Host-Range RP4 Conjugative Machinery. Journal of Bacteriology. 192 (24), 6418-6427 (2010).
  39. Lim, L. M., et al. Resurgence of Colistin: A Review of Resistance, Toxicity, Pharmacodynamics, and Dosing. Pharmacotherapy. 30 (12), 1279-1291 (2010).
  40. Lampe, D. J., Churchill, M. E., Robertson, H. M. A purified mariner transposase is sufficient to mediate transposition in vitro. The EMBO Journal. 15 (19), 5470-5479 (1996).
  41. Mazurkiewicz, P., Tang, C. M., Boone, C., Holden, D. W. Signature-tagged mutagenesis: barcoding mutants for genome-wide screens. Nature Reviews. Genetics. 7 (12), 929-939 (2006).
  42. Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nature Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
  43. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Reviews. Microbiology. 11 (7), 3033 (2013).
  44. Liu, H., Bouillaut, L., Sonenshein, A. L., Melville, S. B. Use of a Mariner-Based Transposon Mutagenesis System To Isolate Clostridium perfringens Mutants Deficient in Gliding Motility. Journal of Bacteriology. 195 (3), 629-636 (2013).
  45. Singer, J. T., Finnerty, W. R. Insertional specificity of transposon Tn5 in Acinetobacter sp. Journal of Bacteriology. 157 (2), 607-611 (1984).
  46. Subashchandrabose, S., et al. Acinetobacter baumannii Genes Required for Bacterial Survival during Bloodstream Infection. mSphere. 1 (1), 13-15 (2015).
  47. Shull, L. M., Camilli, A. Transposon Sequencing of Vibrio cholerae in the Infant Rabbit Model of Cholera. Vibrio Cholerae. 1839, 103-116 (2018).
  48. Smith, M. G., et al. New insights into Acinetobacter baumannii pathogenesis revealed by high-density pyrosequencing and transposon mutagenesis. Genes & Development. 21 (5), 601-614 (2007).
  49. Stahl, M., Stintzi, A. Identification of essential genes in C. jejuni genome highlights hyper-variable plasticity regions. Functional & Integrative Genomics. 11 (2), 241-257 (2011).
  50. Chaudhuri, R. R., et al. Comprehensive identification of essential Staphylococcus aureus genes using Transposon-Mediated Differential Hybridisation (TMDH). BMC Genomics. 10 (1), 291 (2009).
  51. Griffin, J. E., et al. High-resolution phenotypic profiling defines genes essential for mycobacterial growth and cholesterol catabolism. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002251 (2011).
  52. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. mBio. 2 (1), 00315 (2011).
  53. Khatiwara, A., et al. Genome scanning for conditionally essential genes in Salmonella enterica Serotype Typhimurium. Applied and Environmental Microbiology. 78 (9), 3098-3107 (2012).
  54. van Opijnen, T., Camilli, A. A fine scale phenotype-genotype virulence map of a bacterial pathogen. Genome Research. 22 (12), 2541-2551 (2012).
  55. Hurd, P. J., Nelson, C. J. Advantages of next-generation sequencing versus the microarray in epigenetic research. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (3), 174-183 (2009).
  56. Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing. RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).
  57. Perry, B. J., Yost, C. K. Construction of a mariner-based transposon vector for use in insertion sequence mutagenesis in selected members of the Rhizobiaceae. BMC Microbiology. 14 (1), 298 (2014).
  58. Plasterk, R. H. A., Izsvák, Z., Ivics, Z. Resident aliens: the Tc1/ mariner superfamily of transposable elements. Trends in Genetics. 15 (8), 326-332 (1999).
  59. Lazinski, D. W., Camilli, A. Homopolymer tail-mediated ligation PCR: a streamlined and highly efficient method for DNA cloning and library construction. BioTechniques. 54 (1), (2013).
  60. Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (38), 16422-16427 (2009).
  61. Langridge, G. C., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).
  62. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved Protocols for the Illumina Genome Analyzer Sequencing System. Current Protocols in Human Genetics. 62 (1), (2009).

Tags

Biologi Utgave 161 transposon høy gjennomstrømning sekvensering Gram-negativ Acinetobacter baumannii colistin ESKAPE
Generere transposon innsetting biblioteker i Gram-negative bakterier for høy gjennomstrømning sekvensering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kazi, M. I., Schargel, R. D., Boll,… More

Kazi, M. I., Schargel, R. D., Boll, J. M. Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing. J. Vis. Exp. (161), e61612, doi:10.3791/61612 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter