Summary
我们描述了一种在Gram-阴性细菌中生成饱和变性突变库的方法，以及随后制备用于高通量测序的DNA安培库。例如，我们关注ESKAPE病原体 ，Acineto细菌鲍曼尼，但这个协议是适用于广泛的革兰阴性生物。
Abstract
转波子测序 （Tn-seq） 是一种强大的方法，结合了转生突变和大规模并行测序，以识别有助于各种环境条件下细菌健身的基因和通路。Tn-seq 应用范围很广，不仅能够检查生物体一级的基因型-表型关系，而且能够检查人口、社区和系统层面的基因型-表型关系。革兰氏阴性细菌与抗菌素耐药性表型高度相关，增加了抗生素治疗失败的事件。抗微生物药物耐药性被定义为细菌生长在存在否则致命的抗生素。"最后一线"抗菌共体素用于治疗革兰阴性细菌感染。然而，一些Gram阴性病原体， 包括阿辛 托菌鲍曼尼可以通过一系列分子机制产生共利素耐药性，其中一些病原体的特点是使用Tn-seq。此外，调节高利素耐药性的信号转导通路在Gram阴性细菌中有所不同。在这里，我们提出了一种在 A.baumannii中跨 生突变的高效方法，通过消除限制性酶、适配器连接和凝胶纯化，简化了饱和转子插入库和安培库结构的生成。本文描述的方法将使人们能够深入分析分子决定因素，当受到科利丁的挑战时，这些决定因素有助于 A. baumannii 的健身。该协议也适用于其他革兰阴性CSKAPE病原体，这些病原体主要与耐药医院获得的感染有关。
Introduction
抗生素的发现无疑是20世纪影响最大的健康相关事件之一。抗生素不仅能快速解决严重的细菌感染问题，而且在现代医学中发挥着举足轻重的作用。大手术，移植和新生儿医学和化疗的进步，使病人容易受到威胁生命的感染，这些疗法将是不可能的抗生素1,1，2。然而，抗生素耐药性在人类病原体中的迅速发展和扩散，已显著降低所有临床上重要类抗生素的疗效。许多细菌感染，曾经很容易通过抗生素治疗清除，不再响应经典的治疗方案，对全球公共卫生构成严重威胁1。抗微生物药物耐药性（AMR）是细菌细胞生长在抗生素的致命浓度，无论治疗持续时间4，5。,5迫切需要了解调节 AMR 的分子和生化因素，这将有助于指导替代抗菌药物的发展。具体来说，ESKAPE病原体在临床环境中存在问题，并且与广泛的 AMR 相关。这些包括耳麦耳、金黄色葡萄球菌、肺炎克勒布西拉、阿西托菌包曼尼、Pseudomonas aeruginosa 和 Entero 细菌spp。虽然几个机制有助于在埃斯卡佩病原体的 AMR，后四种生物体是革兰阴性。
革氏阴性细菌组装一种决定性的外膜，保护它们免受不利的环境条件。外膜是限制有毒分子（如抗生素）进入细胞的渗透屏障。与其他生物膜不同，外膜是不对称的。外叶富含表面暴露的脂质糖，而内叶是磷脂6的混合物。脂质糖分子由嵌入在脂质双层7中的保守脂质的一种摩尔基锚定在外膜上。大肠杆菌脂质A域是大多数革兰氏阴性细菌生长所需的，由九步酶通路合成，这是Gram阴,性生物6、7、8,7中最基本和最保守的通路之一。
多霉素是阳离子抗菌肽，针对脂质 A 域的脂质糖，以扰乱外膜并裂解细胞。多霉素的正电荷残留物和带负电荷脂的磷酸盐组之间的静电相互作用会破坏细菌细胞膜，最终导致细胞死亡9，10，11，12，13。10,11,12,139科利丁（多霉素E）是用于治疗由多药耐药性革新的革新的病原体，如阿辛托菌Acinetobacter baumannii鲍曼尼14，15，16,15引起的感染的最后手段抗菌剂。1947年首次发现多霉素是由土壤细菌Paenibacillus聚米沙17、18、19,18,产生的。多霉素被规定治疗革兰阴性感染多年之前，他们的临床使用是有限的，由于报告严重的肾毒性和神经毒性20，21。20,
A.鲍曼尼是一种非同性革兰阴性病原体，在最近几十年中，它大大增加了患者发病和死亡率。曾经被视为低威胁病原体，现在对全世界医院获得的感染构成重大风险，因为它获得 AMR 的能力令人难以置信，而且感染的高风险为 23，24。,24A. 鲍曼尼在美国占非同体感染的10%以上。疾病表现为肺炎、细菌血症、尿路感染、皮肤和软组织感染、脑膜炎和心内膜炎25。由于对几乎所有抗生素类的耐药性，包括β-乳酸、氟基诺洛宁、四环素和氨基糖二十,四类的耐药性，A.鲍曼尼感染的治疗方案已经减少。耐多药、广泛耐药和抗泛药的 A. baumannii分离物的流行已导致科利丁治疗的复苏，这被认为是为数不多的仍然有效对抗耐多药A. 鲍曼尼的治疗选择之一。然而，A.鲍曼尼分离,物中高利丁耐药性的增加进一步扩大了其对全球公共卫生10、11、12、13、27、30、31,11,27,30,的威胁。12,13
高通量测序技术（如转波子测序（Tn-seq）的最新进展，为增进我们对体外和体内细菌健身的理解提供了重要工具。Tn-seq 是一个强大的工具，可用于研究细菌中的基因型-表型相互作用。Tn-seq广泛适用于细菌病原体，它结合了传统的转子突变和大规模平行测序，以快速绘制插入位点，可用于将DNA突变与全基因组尺度32、33、34、35,33,34上的表型变异联系起来。虽然转生突变方法之前已经描述过，但一般步骤是相似的33。首先，使用转生突变生成插入库，其中种群中的每个细菌细胞都限制在基因组DNA （gDNA） 中的单个转子插入。在突变之后，单个突变体被汇集在一起。gDNA从插入突变池中提取，转子结被放大并接受高通量测序。读取表示插入位点，可映射到基因组。减少健身的转生插入会迅速从种群中消失，同时有益插入被丰富。Tn-seq有助于促进我们对基因如何影响压力33中的细菌健身的理解。
在pJNW684中编码的Himar1水手转波系统是专门为转生突变的目的而构建和优化的。它包括一个水手家族转子侧翼的卡那霉素抗性基因，这是用于选择转子插入突变体在A.鲍曼尼。它还编码一个A.鲍曼尼特定的启动子，驱动转位编码基因36的表达。基于水手的转波子还包含两个转化终止器下游的卡那霉素抵抗基因，这防止读取下游插入37。pJNW684还带有RP4/oriT/oriR6K条件的复制起源，这需要由供体菌株贡献的μpir基因复制38。如果没有μpir 基因，,携带转位机械的pJNW684载体将无法在A.鲍曼尼接收菌株10、36、38,36中复制。因此，在细菌结合过程中，只有转子插入接收者基因组，而不插入携带转位基因的质粒的背景插入。这一点很重要，因为转位活性的丧失以及质粒导致单一、稳定的转位事件，防止转子在插入接收者基因组后移动到不同位置。
pJNW648也已被测试在另一个革兰阴性有机体，大肠杆菌的活动。在大肠杆菌株W3110中成功组装了饱和Tn-seq库，表明该系统适用于在包括肠杆菌在内的多种病原体中进行变异。 E. coli此外，驱动转置表达的A.baumannii特异性促进剂可以快速与物种特异性促进剂交换。最后，根据所研究的生物体的AMR表型，可以交换卡那霉素抗性基因作为其他抗性盒。
造成阿·鲍曼尼耐药的一个因素是剂量不足，细菌在非致命性水平39时暴露于选择性压力。几份报告显示，亚抑制抗菌浓度可诱发调节反应，改变细胞生理，降低整个细菌种群的易感性11，12，30，31。11,12,30,31使用 Tn-seq，我们发现在接触抑制性10和副抑制性浓度后，在A. baumannii菌株 ATCC 17978 中调节高利素耐药性的因素。此示例详细介绍了一种 Tn-seq 方法，该方法使用基于水手的转置子40、41系列来简化饱和转子突变库mariner的构建和浓缩。虽然几个 Tn-seq 协议生成 20，000 - 100，000 个突变体35、,42、,43、44、45、46，但此处描述的协议可以快速生成 400，000 + 突变体的转波子库，这大致相当于A. baumann ii10中每 10 个基对中每 10 个基对的转波子插入。此外，无需大量额外努力即可扩展库大小。该方法还消除了限制内结、适配器结扎和凝胶纯化的要求，从而减少了最终库的多样性。
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Protocol
1. 细菌菌株制备
- 条纹"捐赠体"菌株（大肠杆菌 MFD DAP-/pJNW684， 材料表），用于Luria-Bertani加糖的孤立菌落，辅以600μM二米甲酸（DAP），100毫克/升的安霉素和25毫克/升的卡那霉素。在37°C下孵育过夜。 使用单个孤立的菌落，在 250 mL Erlenmeyer 烧瓶中接种 50 mL 的 Luria 肉汤 （LB），并辅以 600 μM DAP、100 毫克/升的安皮西林和 25 毫克/升的卡纳霉素，并贴上"捐赠者"的标签。
- 条纹"接收者"菌株（A.鲍曼尼菌株 ATCC 17978， 材料表），用于卢里亚-贝尔塔尼阿加的孤立菌落。在37°C下孵育过夜。 使用单个隔离菌落，在 250 mL Erlenmeyer 烧瓶中接种 50 mL 的 LB，并标记为"接收者"。
- 在37°C下用震动孵育两种文化（"捐赠者"和"接受者"）。
2. 细菌交配
- 将隔夜培养转移到 50 mL 锥形管。
- 使用离心的接受者和捐赠者培养物，以 5，000 x g 进行 7 分钟。
- 丢弃上一液，在35 mL中重新喷洒"捐赠"菌株颗粒，并辅以DAP，以洗去残留的抗生素。
- 使用离心的"捐赠者"菌株细胞，以5，000 x g 进行7分钟。
- 丢弃上一杯，在4.5 mL中重新暂停用DAP补充的4.5 mL中"供体"菌株颗粒。使用 10 mL 血清移液器。
- 将重新暂停的"捐赠者"菌株转移到"受助器"应变管中，该菌株管包含颗粒状的"受助人"细胞。使用步骤 2.5 中的相同 10 mL 血清移液器混合培养物。立即转到下一步。
注：最终悬架的总体积应为 5 mL。 - 将交配悬浮液作为单独的 100 μL 液滴分配在 LB 加糖板上，并辅以 DAP（每板 5-7 滴）（图 1A）。
- 在室温下孵育板30分钟。
- 在不干扰液滴的情况下，小心地将板转移到37°C的培养箱中，并允许培养物交配1小时。
注：潜伏期超过1小时的风险生成姐妹突变体。 - 孵育后，在每个板上加入1.5 mL的LB，然后通过从板中重新产生细菌来收获。使用 1 mL 微管进行再暂停。最终体积应约为 12 - 15 mL。
- 将收获的细胞组合在50 mL锥形管中。
- 在5，000 x g 下用离心对配合细胞进行7分钟的磨碎。
- 丢弃 50 mL 中上重和重新暂停的细胞，以去除残留的 DAP。
- 在 5，000 x g 下用离心 进行交配 ，7 分钟。
- 重复洗涤步骤（步骤 2.13 和 2.14）。
- 使用 10 mL 血清移液器，在 10 mL LB 中重新暂停颗粒，并辅以 25% 甘油。
- 使用洗涤的细胞，在LB汤中进行五次连续稀释（1：10、1：100、1：1000、1：10，000、1：10000、1：100，000）。
- 使用无菌玻璃珠将每个稀释 100 μL 扩散到 4 个不同的盘子上：Luria-Bertani agar 辅以卡那霉素，加糖辅以安西林，只辅用 DAP 和 agar 补充的加糖。
- 孵育板在37°C过夜。
- 将剩余的交配以1 mL等分，储存在-80°C。
3. 确定转子库的适当稀释
- 记录隔夜板的聚落形成单位 （CFU）。
- 对每个不同板条件的可计数菌落图像（图2A）。
注："捐赠者"和"接受者"菌株都应生长在加糖板上，并辅以DAP，因此大多数镀盐都会产生草坪。只有"接受者"菌株才能生长在阿加板上。"捐赠者"和"接受者"菌株都不能生长在加糖板上，并辅以安西林，所以应该有/最小生长。只有编码转波子插入的目标应变细胞才能生长在加糖板上，并辅以卡那霉素。殖民地的大小应该不同， 表明转子插入基因， 有助于在加糖上健身， 辅以卡那霉素。 - 计算冷冻交配中的转生突变体数量，计算用卡纳霉素补充的LB加糖板上的菌落数量。
注：对于A.鲍曼尼基因组（约4 Mbps），目标是获得约400，000个菌落，以生成一个高分辨率突变库（大约一个转波子插入/10个基对）。但是，此数字应根据目标物种的基因组大小进行优化）。
4. 生成最终细菌突变库
- 在冰上解冻冷冻交配的一样。
- 150 mm Luria-Bertani 阿加板上的板交配，根据步骤 3.1 中计算的 CLU 辅以卡那霉素。使用 LB 调节体积，在电镀前每 150 μL 产生 13，333 个菌落。
注：此处的 CFU 计数被确定为大约 105 CFU/mL，因此调整的交配体积为每板获得 13，333 个菌落，因为这将为高分辨率突变库提供 30 个板上的最佳菌落数量，而不会使板过于拥挤。 - 使用无菌玻璃珠在30 x 150毫米Luria-Bertani阿加板上扩散150μL稀释，并辅以卡那霉素，获得400，000个菌落（图1C）。
注：无菌棒或任何类型的无菌传播工具（即玻璃珠）可用于将细菌传播到板材上。 - 处理含有过量交配的已用管。
注：冻结/解冻循环会增加细菌培养的选择性压力，从而扭曲Tn-seq实验结果。每次使用新鲜的等分。 - 孵育板在37°C14小时。
注：孵育时间经过优化，可防止过度生长（菌落接触）。建议通过减少孵化时间来尽量减少增长。
5. 估算库密度和存储池
- 计算每个板上的C总和，以估计转子库中的总突变体。计算至少3个板块的20%，以确定整个板块组的组数估计值（图2A）。确保殖民地不会接触另一个殖民地。
- 计算估计菌落产量后，在每个板中加入3-5 mL（如果需要或更多），并使用无菌刮擦工具刮掉细菌。
注：无菌接种回路用于有效刮板。 - 将所有板的细菌悬浮液池入 50 mL 锥形管（图 1D）。这将需要多个 50 mL 锥形管，至少 3。
- 在 5，000 x g 下使用离心液将细菌 悬浮液 ，7 分钟。
- 在 5 mL 中丢弃上流液和重新暂停的颗粒，并辅以 30% 甘油。
- 1 mL 的转波库的 Aliquot 1 mL 进入低温，并储存在 -80 °C。
6. 确定调节鲍曼尼中高利丁 耐药性的因素
- 准备 4 x 250 mL Erlenmeyer 烧瓶，每个瓶瓶都含有 50 mL LB 肉汤，并标注为 （图 2B）
- A. 鲍曼尼应变 ATCC 17978 Tn-seq 库;（-） colistin_1
- A. 鲍曼尼应变 ATCC 17978 Tn-seq 库;（-） colistin_2
- A. 鲍曼尼应变 ATCC 17978 Tn-seq 库;（+） colistin_1
-
A. 鲍曼尼应变 ATCC 17978 Tn-seq 库;（+） colistin_2
注意：在这里描述的挑战增长中，每个条件（-）共利丁控制和（+）科利丁挑战，正在重复测试。因此，设置需要 4 x 250 mL Erlenmeyer 烧瓶，每个条件两个。
- 将 50 μL 的 0.5 mg/L colistin 添加到 （+） 科利丁烧瓶 （6.1.3 和 6.1.4） 和 50 μL 水到 （-） 科利丁烧瓶 （6.1.1 和 6.1.2）。
- 从冰上第 5 步解冻一个冰冻的 Tn - seq 库等分。
- 将解冻的库移液 1 μL 切成 1 mL 的 PBS。
- 测量 600 nm （OD600） 的光学密度，乘以 1，000。
注：这决定了 Tn 库的 1 μL 的 OD600。 - 根据步骤 6.5 中的计算，将每个含有 50 mL LB 的烧瓶接种到最终 OD600 0.001。
- 在 37 °C 至 OD 6000.5 的摇培养箱中生长培养文化。
注意：培养物必须保持对数生长阶段，因此，如果您的菌株在指数增长期间处于不同的 OD600， 则需要调整 OD600 以确保培养在对数生长阶段中尽可能多次地复制。如果培养只复制3次，那么在理论上，检测突变体中体能缺陷的功率上限为3倍的差异。由于不同的细菌有不同的倍增倍数，因此在固定的OD600中播种 培养物，使起始的内分物正常化非常重要。这可确保整个库在所有区域性中的一致表示。 - 在 4 °C 下以 5，000 x g 的离心率进行收获培养，使用离心 7 分钟。
- 拆下上一液，用 50 mL 的 PBS 清洗。
- 在 4 °C 下以 5，000 x g 离心使用离心，使用 7 分钟。
- 取出上一液，在1 mL的PBS中重新暂停颗粒。阿里素 = 200 μL 到 5 微离心管中。
- 在 4 °C 下以 5，000 x g 离心使用离心，使用 5 分钟。使用移液器尖端拆下所有上流液。
- 将颗粒储存在-20°C，或进行gDNA提取。
7. gDNA提取
- 在冰上解冻一个细胞颗粒。
- 加入0.6 mL解液缓冲液（材料表）和涡流，完全重新暂停颗粒。
- 在37°C下孵育1小时。
- 在样品中加入0.6 mL酚/氯仿/异丙醇，并大力加入涡流。
- 在室温下以最大速度在微离心中使用离心分离阶段 5 分钟。
- 将上水相转移到新管中。避免在传输过程中干扰相位接口。
- 在上述和涡流中加入同等体积的氯仿。
- 在室温下以最大速度在微离心中使用离心的分离相，为 5 分钟。
- 将上水相转移到新管。
注：请务必避免在传输过程中干扰接口。 - 加入2.5x水相体积的冷100%乙醇，轻轻混合。沉淀的DNA是可见的。
- 将管子在-80°C下放置至少1小时。
- 在4°C下以最高速度离心的颗粒DNA，30分钟。
- 小心地去除上流水，而不干扰DNA颗粒，通过移液用150μL的70%乙醇清洗。
- 在4°C下以最高速度离心2分钟的颗粒DNA。
- 小心地取出上一液。
- 重复步骤 7.14 一次。小心地去除所有剩余的乙醇。
- 在室温下孵育5-10分钟，使DNA干燥。
- 通过移液将DNA颗粒在100μLTE缓冲液中重新填充。
8. DNA剪切 （图3A）
- 用TE缓冲液稀释gDNA，浓度为250纳克/mL，总体积为200μL。
- 将管子放在水浴声波器中。
- 声波化DNA产生大约300个核苷酸的片段。功率： 60 %， 总时间： 20 分钟， 周期： 10 s ON 和 10 s 关闭在 4 °C （图 3A）.
- 通过将10μL未听到的DNA和10μL剪切DNA分离到1%的阿加罗斯凝胶上，确认DNA被适当剪切。根据需要重复声波或优化（图3B）。
9. 3'端添加多面尾 （图 3A）
- 根据表 1 设置聚 C 反应。
- 在37°C下孵育反应1小时。
- 按照以下步骤，用40μL的尺寸选择顺磁珠（图3A）进行纯化聚C反应。
- 在每个样品中加入 40 μL 的尺寸选择顺磁珠。涡流 = 5 s 或移液器上下。
- 在室温下孵育样品5分钟。
- 简言之，离心管收集管底部的液体（+2 s）。
- 将管子转移到磁性机架上，在室温下孵育±2分钟，直到溶液清除。
- 在磁架上安装管，小心地拆下上流液。
- 在磁架上安装管，加入200μL新鲜制备的80%乙醇（请勿打扰珠子）。
- 孵育样品至少30 s，直到溶液清楚。
- 在磁架上安装管，小心地拆下上流液。
- 重复洗涤步骤（步骤 9.3.6 - 9.3.8）。
- 使用短暂的离心步骤（± 2 s）收集管底中的液体。
- 将管子转移到磁架上，并清除所有剩余的液体。
- 在室温下孵育2-5分钟干燥样品。不要过度干燥。
- 从磁架上拆下管子，并给每个管子加25μL水。涡流为 ± 5 s 或移液器上下。
- 简言之，离心管收集管底部的液体（+2 s）。
- 将管子转移到磁架上，并允许坐约 2 分钟，直到溶液清除。
- 在磁架上安装管，在不干扰珠子的情况下取出液体并转移到新管（±23 μL的DNA）。
10. 透波结放大 （图3A）
- 设置 PCR 1，如表1 中所述的第一个嵌套 PCR（表 2）。
- 使用表 1 中描述的条件执行 PCR 1。
- 使用 40 μL 尺寸选择顺磁珠（步骤 9.3.1 = 9.3-12）净化 PCR 产品。在50μL的水（步骤9.3.13=9.3.16）。此时样品可以储存在-20°C。
- 准备斯特雷普他丁耦合顺磁珠：
- 通过剧烈摇晃来重新暂停斯特雷普他丁珠。
- 将每个样品添加 32 μL 珠子到新鲜的微离心管中。
注：6 + 样品的珠子可以在一个管中准备。 - 将管子转移到磁性机架上。孵育±2分钟，直到溶液清晰。
- 在磁架上安装管，拆下上一根。
- 从磁性机架上拆下管子。通过上下移液，在 1 mL 1x B&W 缓冲液中重新填充珠子。
- 将管子转移到磁性机架上。孵育±2分钟，直到溶液清晰。
- 将管子放在磁架上，拆下上一液。
- 使用 1 mL 1x B&W 缓冲液重复洗涤步骤（步骤 10.4.5 = 10.4.7）两次以上，总共洗涤 3 次。
- 从磁性机架上拆下管子，并在每个样品的 52 μL 2x B&W 缓冲液中重新悬浮珠子。
- 将制备的珠子的 50 μL 与 50 μL 的纯化 PCR1（从步骤 10.3 开始）混合。移液器混合。
- 在室温下旋转30分钟。
- 洗去未绑定的DNA：
- 简言之，离心机收集管底的液体（+2 s）。
- 将管子转移到磁性机架上。孵育±2分钟，直到溶液清晰。
- 将管子放在磁架上，拆下上一液。
- 从磁架上拆下管子，在 100 μL 1x B&W 缓冲液中重新悬浮珠子，然后上下移液。
- 将管子转移到磁性机架上。孵育±2分钟，直到溶液清晰。
- 在磁架上安装管，拆下上一根。
- 使用 100 μL LOTE（步骤 10.7.4 = 10.7.6）重复洗涤步骤两次，总共洗涤 3 次。
- 设置 PCR 2，如表 1 中所述，以放大转子结，并在每个样本中添加单个条形码（表 2 和表 3）。
- 使用表 1 中描述的条件执行 PCR 2。
- 使用 40 μL 的尺寸选择顺磁珠进行净化（步骤 9.3.1 = 9.3.12）。在 17 μL 水中（步骤 9.3.13 = 9.3.16），收集 ± 15 μL。
- 使用荧光计量化DNA浓度。最终浓度应为 ± 50 至 250 纳克/μl。
- 使用基于芯片的毛细管电泳评估DNA质量（图4A）。
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Representative Results
概述的方法描述了在A.鲍曼尼菌株 ATCC 17978 中通过使用大肠杆菌MFD DAP 通过细菌结合生成高密度转子库- 复制质粒 pJNW684 （图 4B）.详细的协议使用双亲细菌结合转移pJNW684从大肠杆菌E. coli [皮尔]供体菌株到 A. 鲍曼尼接受者菌株。这是生成密集转子突变库的高效且廉价的方法。细菌以优化比率混合，在Luria-Bertani阿加盘上发现1小时（图1A）。在交配过程中，转子从供体转移到接受菌株，并插入gDNA（图1B）。收集交配，约105 CFU/mL计算和镀在150毫米x15毫米的阿加板辅以卡那霉素。在37°C下生长14小时后，板内含有数千个大小不一的菌落（图1C），表明跨波子突变库的成功生成。转波子插入突变体被汇集（图1D），并冻结在等分中，以防止重复的冻结-解冻循环，这可能增加插入库的选择性压力。
池式A.baumannii转波子突变库用于识别抗菌素亚抑制作用的健身因素（图2B）。突变库在重复的0.5毫克/L colistin不存在时生长到对数阶段，以耗尽编码插入基因的突变细胞，这些基因有助于高利素的耐药性。其余库池的总gDNA与控制和实验培养物分离，并进行了处理，以准备DNA进行测序（图3A）。
分离的gDNA是使用机械剪切碎片，在DNA片段上添加了一个多C尾巴（图3A）。在添加聚C尾部后，DNA被纯化，使用聚C特异性底转富化转子基因组结，然后使用另一个多C特异性底转来丰富第二轮PCR，该底转法引入P7测序位点，该底源是结合光照流细胞和聚类生成所需的，以及用于测序后分布的六,47基条形码。计算了DNA浓度，并使用基于芯片的毛细管电泳对样品进行分析，以确认成功的库构建（图4A），这些库是为高通量测序做好准备的。
DNA库由下一代测序测序。执行了单端 50 个循环运行，产生了 3000 万高质量的读取/样本，使跨波森库的覆盖率为 62.5 倍。跨波森结（读取）被映射到参考基因组48，使用市售的生物信息学分析软件。将输入样本中每个插入站点（（-） colistin 控制条件的读取数与输出样本中的读取数（+）科利丁实验条件进行比较，并计算了每个插入站点的适合分数。然后按基因对健身分数进行分组。当库相对于输入样本在科利丁存在的情况下生长时，显示分数降低的基因被认为是 A. baumannii 在科利丁亚基亚抑制浓度下存活的适合决定因素。例如，在输入样本中存在 PmrAB 双组件系统中的转波子插入，但在输出样本中未找到。PmrAB直接调节 pmrC的表达，将磷脂乙醇胺转移到脂质甲上，以中和细胞表面12、31上的电荷。细菌表面电荷的中和被认为可以降低由共利丁培养的杀戮所需的静电电位。已知有助于抗性表型的耗尽基因的鉴定验证了该方法。
图1：转波子突变库结构的示意图。（A） 细菌结合。编码换位机械的"捐赠者"菌株与"受助器"应变混合。混合物被发现在LB加糖板，并允许交配1小时（B） 代转子库.携带转位机械的质粒从"捐赠者"菌株转移到"受者"菌株，转子随机插入整个"接受者"菌株的基因组。（C） 选择。结果细胞被镀在阿加板上，辅以卡那霉素，以选择转波子插入突变体。（D） 池库。殖民地从盘子里刮掉，在LB中重新暂停，并汇集在一起。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：代表性细菌结合结果和共生Tn-seq实验的示意图。 （A） 代表性卡那霉素选择板。板分为五个相等的部分。蓝点表示殖民地计数，用于 估计 A. 鲍曼尼 转波子插入突变体。至少计算了三个单独的板来计算最终估计。（B） 亚抑制素浓度的体能因子的识别。池式转子库在科利丁不存在（控制）或存在（实验）时，都生长到对数生长阶段。一旦培养物达到适当的光学密度，细胞被造粒，从每个样品中提取gDNA。每个条件都重复测试了四个样本。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：用于大规模并行测序和代表性剪切gDNA的DNA安培库构建流程图。 （A） Tn-seq DNA库构建示意图。提取后，gDNA通过机械剪切被分裂。在PCR扩增转子基因组结和条形码添加之前，终端脱氧核苷酸转移酶用于在分段DNA的3'端添加多C尾。（B） 未听到和剪切的 A. 鲍曼 尼突变库的 1% 阿加罗斯凝胶遵循 gDNA 剪切步骤。1 Kb 梯子用作 DNA 标记。剪切 gDNA 涂片主要在 ± 100 和 500 基对之间。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：代表性质量控制（QC）结果和携带转位基因的质粒图。（A） DNA库构建的QC跟踪。在 + 350 基对时有一个峰值，表示库构建成功。如果在QC结果中检测到一些较大的DNA，样品可以进一步清理，以去除大型DNA片段。（B） 质粒 pJNW684 由Himar1 水手转子 （绿色） 和卡那霉素抗性盒 （紫色） 组成， 用于突变选择， 编码超活性水手marinerHimar1 C9 转置酶（红色）的基因，由 A. baumannii 17978 特异性启动子（蓝色）、安皮林抗性基因（bla、橙色）和 RP4/oriT/oriR6K 条件复制起源（黄色）控制。请单击此处查看此图的较大版本。
| 反应 | 设置 | 条件 |
| 聚-C 反应 | 30 μL 剪切 gDNA 2.5 μL 的 9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP 10 μL 5X 端子脱氧核苷酸转移酶 （Tdt） 反应缓冲液 1.25 μL 的 rTdt 6.25 μL 水到 50 μL |
在37oC下孵育1小时 |
| PCR 1 | 23 μL 3'-聚丙酸化DNA（前一步整个样品） 10 μL 10x 高保真DNA聚合酶反应混合物 2 μL 10 mM dNTP 2 μL 50 mM MgSO4 1 μL 30 μM olj 510 生物素 3 μL 30 μM olj 376 0.5 μL 高保真DNA聚合酶 8.5 μL 纯净水至 50 μL 总 |
1 周期：2 分钟 94 oC 15 个周期：15 s 94 oC 30 s 60 oC 2 分钟 68 oC 1 周期：4 分钟 68 oC 保持： ∞ 4 oC |
| PCR 2 | 前一步DNA结合珠 10 μL 10x 高保真DNA聚合酶反应混合物 2 μL 10 mM dNTP 2 μL 50 mM MgSO4 1 μL 30 μM olj 511 1 μL 30 μM 条形码底图（表 2） 0.5 μL 高保真DNA聚合酶 33.5 μL 纯净水至 50 μL |
1 周期：2 分钟 94 oC 15 个周期：15 s 94 oC 30 s 60 oC 2 分钟 68 oC 1 周期：4 分钟 68 oC 保持： ∞ 4 oC |
表1：反应设置。 聚C、PCR 1 和 PCR 2 反应的设置和条件。
| 目的 | 名字 | 序列 |
| 安妮尔斯到转波森 | olj510-生物素 | 生物素 - 加特格特格特克特克特克格特格格格格格格格 |
| 折翼到多 C 尾部 | olj376 | Gtgactggttcagacgttctctcttcttctgg 格格 |
| 嵌套到转波器 + P5 适配器： P5 捕获站点 = P5 测序站点 = N5 =Tn |
olj511 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCACTCTT Ctacacgacgtctcttcgatctngactta TCATCACCTGTTAG |
| 嵌套到 olj376： P7 测序站点 • 条形码 XXXXXX • P7 捕获站点） |
公元前## | 卡加加加格格加加加加加格特加 Ctggagttcagacgtgtgtg |
| 有关特定条形码，请参阅表 2*** |
表2：PCR扩增底片。 协议中使用的PCR扩增底转器放大透气结。每个列的用途列在第一列中。
| 底漆 | 读 | 条码 | 序列 |
| BC1 | Atcacg | 克格特加特 | 卡加加加格格加加加格特 盖特格特加特加特加特加特卡加格特格格 |
| BC2 | 克加特 | 阿卡特克 | 卡加加加格格加加加加塔加塔 Atcggtgactggagttcagacgtgtg |
| BC3 | 塔格格 | 海格塔 | 卡加加加格格加加加格特克 塔格特格特加格特加格特加格特格 |
| BC4 | 特加卡 | 特格特卡 | 卡加加加格格加塔加格特 格格特格特格特加格特加加格特格特格特 |
| BC5 | 阿卡格特格 | 卡格特 | 卡加加加格卡塔卡加加特 卡格特格特格特格格特加格特加加格格特 |
| BC6 | 海加特 | Attggc | 卡加加加加格卡塔加塔 Ttgcgtgactggagttgacgtgtg |
| BC7 | 卡加特 | 加特克 | 卡加加加格卡塔卡加加特 加特格特格特加特加特加加特加特加特格特格 |
| BC8 | 阿克特加 | 特卡特 | 卡加加加格卡塔卡加加特 Tcaagtgtgttggagttcagacgtgtg |
| BC9 | 加茨卡格 | Ctgatc | 卡加加加格格加加加 Tctgatcgtgactggagttcagacgtgtg |
| BC10 | 塔格特 | 阿格塔 | 卡加加加格卡塔卡加加特 Aagctagtgactggagttcagacgtgtgtg |
| BC11 | 格克塔奇 | 格塔格奇 | 卡加加加格卡塔卡加加特 Gtagcgtgactggagttcagacgtgtgtg |
| BC12 | Cttgta | 塔卡阿格 | 卡加加加格格加塔加格特 阿卡格格特格格特加格特加格特加格特格特格 |
| BC13 | 阿格特卡 | 特格格特 | 卡加加加格卡塔卡加加特 特格特格特格特加格特加格特加加格特格特格特 |
| BC14 | 阿格特克 | 格加特 | 卡加加加格格加卡塔加格 加克特格特格格特加格特加格特加格格特格特格特格特 |
| BC15 | ATGTCA | 特加卡特 | 卡加加加格格加加加 特加卡格特格特加格特加加格特加格格特 |
| BC16 | CCGTCC | 格加克 | 卡加加加格卡塔卡加加特 Ggagggtggagttcagacgtgtgtg |
| BC17 | 格塔加格 | 反恐委员会 | 卡加加加格卡塔卡加加特 Ctctacgtgactggagttcagacgtgtg |
| BC18 | 格特克 | Gcggac | 卡加加加格卡塔卡加加特 Gcggacgtgactggagttcagacgtgtgtg |
| BC19 | 格特帕 | 特卡科 | 卡加加加格卡塔卡加加特 特卡特格特格特加格特加格特加格格特加格特格特 |
| BC20 | 格特格克 | 格格克卡 | 卡加加加格格加卡塔加格 Gccacgtgactggagttcagacgtgtg |
| BC21 | 格特克 | 克加亚克 | 卡加加加格卡塔卡加加特 Cgagggactggagttcagacgtgtg |
| BC22 | Cgtacg | Cgtacg | 卡加加加格卡塔卡加加特 Cgtacggtgactggagttcagacgtgtg |
| BC23 | 加格特格 | CCACTC | 卡加加加格格加塔加加特 卡茨格特格格特加格特加格特加格特格特格 |
| BC24 | 格格格斯克 | 格格塔奇 | 卡加加加格卡塔卡加加特 Gctaccgtgactggagttcagacgtgtg |
| BC25 | Actgat | 阿尔卡格特 | 卡加加加格卡塔卡加加特 Atcagtgtgactggagttcagacgtgtgtg |
| BC26 | 阿加格 | 格卡特 | 卡加加加格卡塔卡加加特 格克特卡特格特加格特加格特加加格特格特格特 |
| BC27 | Attcct | 阿格加特 | 卡加加加加格卡塔加塔 加加特格特加特加特加特加加格格特 |
| BC28 | 卡格 | Ctg | 卡加加加格格加塔加加特 特格特格特加格特加格特加格特格特 |
| BC29 | 卡塔塔 | 塔格特格 | 卡加加加格卡塔卡加加特 塔格特格特加特加特加特加加特格特格特格特 |
| BC30 | 卡奇格 | Ccggtg | 卡加加加格卡塔卡加加特 Ccggttgtgactggagttcagacgtgtgtg |
| BC39 | CTATAC | 塔塔格 | 卡加加加格卡塔卡加加特 Gtataggtgactggagttcagacgtgtg |
| BC40 | 反恐 | 特克加格 | 卡加加加格卡塔卡加加特 Tctgaggtgactggagttgacgtgtg |
| BC42 | 塔特克 | CGATTA | 卡加加加格格加塔加加特 加特格特加特加特加特加特卡加格特格 |
| BC43 | 塔卡伊克 | 格格特格塔 | 卡加加加格卡塔卡加加特 Gctgtaggactggagttcagacgtgtg |
| BC44 | 塔塔特 | 阿塔塔 | 卡加加加格卡塔卡加加特 阿塔塔格特加特加特加特加加特加格特格 |
| BC45 | Tcattc | 加特加 | 卡加加加格卡塔卡加加特 加特加特格特加特加特加特加特加加格格特格 |
| BC46 | 特加 | Tcga | 卡加加加格卡塔卡加加特 特加格特格特加格特加加格特格特格特 |
| BC47 | 特加格 | Cttcga | 卡加加加格格加塔加加特 Ttcgagtgactggagttcagacgtgtg |
| BC48 | 茨格卡 | 特格奇加 | 卡加加加格卡塔卡加加特 Tcgcgagtgactggagttcagacgtgtg |
表3：条形码底图。 在第二个 PCR 步骤中，条形码底转器用于放大转子结，同时向安培康添加 P7 测序站点和条形码。并非所有条形码底项都用于生成库。仅需要样品数的条形码底项。
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Discussion
A. 鲍曼尼是一个新兴的威胁，全球公共卫生由于迅速获得 AMR 对"最后一线"治疗，如科利丁10，11，,12，,23，,24，,30，,31.,近几十年来，Tn-seq在阐明众多细菌物种的基因型-表型相互作用，以及扩大我们对细菌遗传学34、35、42、43,35,42,的理解方面，发挥了关键作用。Tn-seq协议在识别不同细菌物种中的基本基因，如杰朱尼杆菌、金黄色葡萄球菌、期安病原病原体Porphyromonas gingivalis，甚至Mycobacterium tuberculosis结核分枝杆菌37、49、50、51。,49,50,51. 除了识别基本基因外，Tn-seq还用于鉴定伪多莫纳斯的抗生素耐药基因、沙门氏菌病中的几个有条件的基本基因， Salmonella typhimurium, 以及肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae52、53、54,53,中的多种基因型-表型关系。最近，霍乱病毒的转生测序被用于霍乱婴儿兔模型，以确定在感染期间对体内健康很重要的基因。这些研究证明了Tn-seq的多功能性，因为它可用于体外和体内研究。
与其他方法（如微阵列技术、2D凝胶电泳和 qPCR）相比，Tn-seq的主要优点是，它不需要事先了解基因组或基因组信息55。因此，转生突变与大规模平行测序相结合，使得可以研究已知的基因和基因组，并发现新的基因相互作用。在这里，我们提出了一个综合的方法，在 A. baumanni 生成一个高密集的转子突变库，以确定暴露在副生物浓度的科利丁中时对细菌健身至关重要的因素。所述方法还成功地应用于 大肠杆菌 （未公布的数据），表明该系统可用于在其他革兰阴性病原体（包括肠杆菌）中进行Tn-seq分析。
使用水手转置子进行插入性突变有几个优点。转子家族起源于真核宿主，并被广泛用于在不同细菌群体中产生饱和突变库。水手转位与宿主无关，这意味着在没有特定宿主因子40、41的情况下，可以实现稳定的随机插入。此外，水手转位子有一个定义的插入事件数，因为它们优先插入到胸腺腺素（"TA"）图案，这减少了插入偏差，并导致更有力的统计分析37，56，57，58。37,56,57,58
几种基于水手的Tn-seq方法使用MmeI限制消化gDNA碎片32，42，43。,42,43虽然酶DNA碎片是一种流行和成功的方法，它增加了不必要的步骤的程序，并增加了潜在的偏差37。这些技术不仅需要大量的起始材料，它们还可能导致在下游分析37，59中插入序列的不相等表示。与其他一些不依赖于MmeI核酸酶活性52、60、61的方法52,60,一样，本文概述的方法依赖于机械剪切来碎片gDNA，TdT在DNA片段的3'端添加一个多C尾。与酶DNA碎片和适配器结扎方法相比，这种方法需要显著减少起始DNA的量，同时提供更一致的结果，它也降低了DNA交叉污染的风险，并减少了样品损失，由于封闭在密封管37，59，62。37,59,62此外，该方法可产生更长、高质量的50个核苷酸的测序读取，有助于更有效、更精确地绘制序列图，并产生更健壮的下游分析37，59。37,添加合成聚C尾不理会碎片可能导致的潜在悬垂，因为此方法依赖于外源添加的多C尾部作为反向底原的识别位点，其3'端包含16 dG核苷酸，在5'端包含下一代测序的序列（例如，光照测序），以质合成47,，59。使用合成核苷酸尾部扩大了这种方法的应用，许多不同的基因组独立于其原生内容59。随后，使用聚C特异性底转37扩增转子基因组结。这种替代方案无需昂贵的限制性酶、适配器结扎、适配器二丁字和凝胶纯化步骤，从而简化了程序。我们进一步优化了协议，在包括阿辛托菌包曼尼尼在内的几种Gram阴性ESKAPE病原体中高效生成高饱和转子插入库，并可用于研究不同体外和体内条件下的in vitro 遗传相互作用。
Tn突变的一个限制是它依赖于抗生素耐药标记的选择。然而，许多Gram阴性ESKAPE病原体是多药或广泛耐药，这意味着用户可能需要根据感兴趣的特定病原体交换抗药性盒。此外，一些临床分离物不能使用水手的转生发生。
协议的一个关键步骤是计算到板的Tn突变体的数量。电镀太多的菌落会导致草坪，使下游分析复杂化。如果菌落太近或太接触，它们可能会增加不必要的选择性压力库，可能会导致伪影。理想情况下，殖民地不会像所示，在板块上接触和均匀地穿过（图2A）。相反，如果镀块太少，则很难分离出每个基因中的多个 Tn 插入。
执行步骤 2.18 中列出的控件也很重要。如第3节说明所述。2、任何"捐赠者"或"接受者"菌株都不应生长在补充安比西林的板块上。由于"捐赠者"菌株的生长需要外源DAP，因此任何生长都表明"受援"菌株复制pJNW684。这是一个严重的问题，因为如果转子不集成到 gDNA 中，测序读取将仅映射到质粒，而不是集成站点。在这种情况下，实验可能不会生成可用数据。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家卫生研究所（向J.M.B.授予AI146829号赠款）的资助，并表示感谢。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate | Affymetrix | 77112 | |
| 100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate | Invitrogen | 10217-016 | |
| 100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker | Promega | PR-G2101 | |
| 100mm x 15mm Petri Dishes | Corning | 351029 | |
| 150mm x 15mm Petri Dishes | Corning | 351058 | |
| 1X B&W | N/A | N/A | Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W. |
| 2,6-Diaminopimelic acid | Alfa Aesar | B2239103 | used at 600 µM |
| 2X B&W | N/A | N/A | Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature. |
| 50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| 9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP | N/A | N/A | 9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C. |
| AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 12344 | |
| Acinetobacter baumannii ATCC 17978 | ATCC | N/A | AmpS, KanS |
| Ampicillin (100 mg/L) | Fisher Scientific | BP1760 | used at 100 mg/L |
| AMPure XP PCR purification system | BECKMAN COULTER | A63881 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939B | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis | Agilent | 5067-4626 | |
| Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP) | New England Biolabs (NEB) | N0447L | |
| DynaMag-2 Magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
| E.coli MFD Dap- | N/A | N/A | DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36). |
| Ethanol | Fisher Scientific | A4094 | |
| Externally Threaded Cryogenic Vials | Corning | 09-761-71 | |
| Glass beads | Corning | 72684 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33 | |
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-602 | Scraping tool |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | used at 25 mg/L |
| LB agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426 | |
| LoTE | N/A | N/A | Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature. |
| Lysis buffer | N/A | N/A | 9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL) |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.) | Fisher Scientific | BP1752I | |
| Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher Scientific | BP39920 | Diluted to 1X |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33238 | |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| Sonicator with refridgerated waterbath | Qsonica Sonicators | Q2000FCE | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs (NEB) | S1420S | |
| TE buffer | N/A | N/A | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0) |
| Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt) | Promega | PR-M1875 |
References
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