Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Generera Transposon Insertion bibliotek i gramnegativa bakterier för hög genomströmning Sekvensering

Published: July 7, 2020 doi: 10.3791/61612
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Texas at Arlington

Summary

Vi beskriver en metod för att generera mättande transposon mutanta bibliotek i Gram-negativa bakterier och efterföljande beredning av DNA-amplikon bibliotek för hög genomströmning sekvensering. Som ett exempel fokuserar vi på ESKAPE-patogenen, Acinetobacter baumannii, men detta protokoll är mottagligt för ett brett spektrum av gramnegativa organismer.

Abstract

Transposonsekvensering (Tn-seq) är en kraftfull metod som kombinerar transposon mutagenesis och massiv parallell sekvensering för att identifiera gener och vägar som bidrar till bakteriell kondition under en lång rad miljöförhållanden. Tn-seq-tillämpningar är omfattande och har inte bara möjliggjort undersökning av genotyp-fenotypssamband på organismnivå utan även på populations-, samhälls- och systemnivå. Gramnegativa bakterier är starkt förknippade med antimikrobiell resistens fenotyper, som har ökat incidenter av antibiotikabehandling misslyckande. Antimikrobiell resistens definieras som bakterietillväxt i närvaro av annars dödliga antibiotika. Den "sista linjen" antimikrobiella colistin används för att behandla Gramnegativa bakterieinfektioner. Flera gramnegativa patogener, inklusive Acinetobacter baumannii kan dock utveckla colistin resistens genom en rad molekylära mekanismer, av vilka några kännetecknades med hjälp av Tn-seq. Dessutom, signaltransduktion vägar som reglerar colistin resistens varierar inom Gram-negativa bakterier. Här föreslår vi en effektiv metod för transposon mutagenesis i A. baumannii som effektiviserar generering av en mättande transposon infogning bibliotek och amplikon bibliotek konstruktion genom att eliminera behovet av restriktionsenzymer, adapter ligering, och gel rening. De metoder som beskrivs häri kommer att möjliggöra djupgående analys av molekylära determinanter som bidrar till A. baumannii fitness när utmanas med colistin. Protokollet är också tillämpligt på andra gramnegativa ESKAPE-patogener, som i första hand är förknippade med läkemedelsresistenta sjukhusförvärvade infektioner.

Introduction

Upptäckten av antibiotika är utan tvekan en av de mest effektfullath hälsorelaterade händelserna under 1900-talet. Inte bara antibiotika snabbt lösa allvarliga bakteriella infektioner, de spelar också en central roll i modern medicin. Större operationer, transplantationer och framsteg inom neonatal medicin och kemoterapi lämna patienter mottagliga för livshotande infektioner och dessa behandlingar skulle inte vara möjligt utan antibiotika1,2. Snabb utveckling och spridning av antibiotikaresistens bland humana patogener har dock minskat effekten betydligt av alla kliniskt viktiga klasser av antibiotika3. Många bakteriella infektioner som en gång lätt rensas med antibiotika behandling, inte längre svara på klassisk behandling protokoll, orsakar ett allvarligt hot mot den globala folkhälsan1. Antimikrobiell resistens (ANTIMIKR) är där bakterieceller växer i övrigt dödliga koncentrationer av antibiotika, oavsett behandlingstid4,5. Det finns ett akut behov av att förstå molekylära och biokemiska faktorer som reglerar antis, vilket kommer att hjälpa till att styra alternativ antimikrobiell utveckling. Specifikt är ESKAPE patogener problematiska i kliniska miljöer och i samband med omfattande AMR. Dessa inkluderar Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa och Enterobacter spp. Medan flera mekanismer bidrar till AMR i ESKAPE patogener, de fyra sistnämnda organismerna är Gram-negativa.

Gramnegativa bakterier monterar ett definierande yttre membran som skyddar dem från ogynnsamma miljöförhållanden. Det yttre membranet fungerar som en permeabilitet barriär för att begränsa inträde av giftiga molekyler, såsom antibiotika, i cellen. Till skillnad från andra biologiska membran är det yttre membranet asymmetriskt. Den yttre bipacksedeln är berikad med ytexponerad lipopolysackarid, medan den inre bipacksedeln är en blandning av fosfolipider6. Lipopolysackaridmolekyler förankras i det yttre membranet av en bevarad lipid A moiety inbäddad i lipid bilayer7. Den kanoniska lipid En domän av Escherichia coli lipopolysackarid krävs för tillväxten av de flesta Gram-negativa bakterier och syntetiseras av en nio-stegs enzymatisk väg som är en av de mest grundläggande och bevarade vägar i Gram-negativa organismer6,7,8.

Polymyxiner är katjoniska antimikrobiella peptider som riktar sig mot lipopolysackaridens lipopolysackarids domän för att perturb det yttre membranet och lysa cellen. Den elektrostatiska interaktionen mellan positivt laddade rester av polymyxiner och de negativt laddade lipiden A fosfatgrupper stör bakteriecellmembranet vilket i slutändan leder till celldöd9,10,11,12,13. Colistin (polymyxin E) är en sista utväg antimikrobiell används för att behandla infektioner orsakade av multiresistenta Gram-negativa nosokomiala patogener, såsom Acinetobacter baumannii14,15,16. Först upptäcktes i 1947, polymyxiner produceras av jorden bakterier, Paenibacillus polymyxa17,18,19. Polymyxiner ordinerades för att behandla Gramnegativa infektioner i flera år innan deras kliniska användning var begränsad på grund av rapporter om betydande nefro- och neurotoxicitet20,21.

A. baumannii är en nosokomna Gramnegativ patogen som dramatiskt har ökat sjuklighet och dödlighet av patientens resultat under de senaste decennierna22. Vad som en gång betraktades som en låg hot-patogen, utgör nu en betydande risk för sjukhus-förvärvade infektion i hela världen på grund av dess otroliga förmåga att förvärva AMR och hög risk förepidemiska 23,24. A. baumannii står för mer än 10% av nosokomna infektioner i USA. Sjukdom yttrar sig som lunginflammation, bakteremi, urinvägsinfektioner, hud och mjukdelar infektioner, hjärnhinneinflammation, och endokardit25. Behandlingsalternativ för A. baumannii infektioner har krympt på grund av resistens mot nästan alla antibiotiska klasser, inklusive β-laktamer, fluorokinoloner, tetracyklin, och aminoglykosiderna23,24. Prevalensen av multiresistenta, i stor utsträckning läkemedelsresistenta och pan-resistentA A. baumannii isolat har lett till ett uppsving i colistin behandling, som ansågs vara en av de få återstående terapeutiska alternativ fortfarande effektiv mot multidrug resistenta A. baumannii. Ökat colistinmotstånd bland A. baumannii-isolat har dock ytterligare förstärkt sitt hot mot den globala folkhälsan10,11,12,13,27,30,31.

Den senaste tidens framsteg inom sekvenseringsteknik med hög genomströmning, såsom transponeringssekvensering (Tn-seq), har tillhandahållit viktiga verktyg för att främja vår förståelse av bakteriell kondition in vitro och in vivo. Tn-seq är ett kraftfullt verktyg som kan utnyttjas för att studera genotyp-fenotyp interaktioner i bakterier. Tn-seq är i stort sett tillämpligt över bakteriella patogener, där den kombinerar traditionell transposon mutagenesis med massiv parallell sekvensering för att snabbt kartlägga insättningsplatser, som kan användas för att länka DNA-mutationer till fenotypiska varianter på en genom-bred skala32,33,34,35. Medan transposon mutagenesis metoder har tidigare beskrivits, de allmänna stegen är liknande33. Först genereras ett infogningsbibliotek med hjälp av transposon mutagenes, där varje bakteriecell inom en population begränsas till en enda transposoninfogning inom det genomiska DNA (gDNA). Efter mutagenesis, enskilda mutanter är poolade. gDNA extraheras från infogningsmutsadpoolen och transponeringspunkterna förstärks och utsätts för sekvensering med hög genomströmning. Läsningen representerar infogningsplatser, som kan mappas till genomet. Transposoninfogningar som minskar konditionen faller snabbt ut ur populationen, medan välgörande infogningar berikas. Tn-seq har varit avgörande för att främja vår förståelse av hur gener påverkar bakteriell kondition i stress33.

Den Himar1 mariner transposon systemet kodade i pJNW684 var särskilt konstruerade och optimerade för syftet med transposon mutagenesis. Det inkluderar en mariner-familj transposon flankerande kanamycin resistens genen, som används för val av transposon insättningsmutanter i A. baumannii. Det kodar också en A. baumannii specifik promotor som driver uttryck för transposas kodning genen36. Den mariner-baserade transposon innehåller också två translationella terminators nedströms kanamycin resistens genen, vilket förhindrar genomläsning nedströms införandet37. pJNW684 bär också en RP4/oriT/oriR6K-villkorligt ursprung replikation som kräver λpir genen bidragit med givaren stam att replikera38. I avsaknad av λpir-genen kommer den pJNW684-vektor som bär på införlivandemaskineriet inte att kunna replikera i A. baumannii-mottagarens stam 10,36,38. Vid bakteriekonjugation förs därför endast transposon in i mottagargenomet utan bakgrundsinsättning av plasmiden, som bär transposasgenen. Detta är signifikant eftersom förlusten av transposasaktivitet tillsammans med plasmiden resulterar i enstaka, stabil införlivande händelse som hindrar transposon från att flytta till olika platser när den sätter in i mottagarens genom.

pJNW648 har också testats för aktivitet i en annan Gramnegativ organism, E. coli. Framgångsrik montering av en mättande Tn-seq bibliotek i E. coli stam W3110 anges systemet är mottagliga för att utföra mutagenesis i ett brett spektrum av patogener, inklusive Enterobacteriaceae. Vidare kan den särskilda promotorn A. baumannii som driver transposasuttryck snabbt utbytas med en artspecifik promotor. Slutligen kan kanamycin resistens genen bytas ut mot andra motstånd kassetter, beroende på AMR fenotyp av organismen studeras.

En faktor som bidrar till kolistinsistens i A. baumannii är administrering av otillräckliga doser, där bakterier utsätts för selektivt tryck vid icke-dödliga nivåer39. Flera rapporter visade att subinhibitory antimikrobiella koncentrationer kan inducera reglerade svar som förändrar cellfysiologi för att minska mottagligheten för helabakteriepopulationen 11,12,30,31. Använda Tn-seq upptäckte vi faktorer som reglerar colistin resistens i A. baumannii stam ATCC 17978 efter exponering förhämmande 10 och subinhibitory koncentrationer av colistin. Det här exemplet beskriver en Tn-seq-metod som effektiviserar konstruktion och berikning av ett mättat transposon mutantbibliotek med hjälp av den mariner-baserade familjen av transposoner40,41. Medan flera Tn-seq protokoll generera 20.000 - 100.000 mutanter35,42,43,44,45,46, protokollet som beskrivs häri kan snabbt generera en transposon bibliotek av 400.000 + mutanter, vilket ungefär motsvarar en transposoninsättning varje 10-baspar i A. baumannii10. Vidare kan bibliotekets storlek skalas upp utan betydande ytterligare ansträngning. Denna metod eliminerar också kravet på begränsning endonucéer, adapter ligering och gel rening, vilket kan minska slutliga biblioteket mångfald.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av bakteriell stam

  1. Strimma "givaren" stam (E. coli MFD DAP-/pJNW684, Tabell of Materials) för isolerade kolonier på Luria-Bertani agar kompletteras med 600 μM diaminopimelsyra (DAP), 100 mg/L av ampicillin och 25 mg/L av kanamycin. Inkubera över natten vid 37 °C. Med hjälp av en enda isolerad koloni, inokulera 50 mL Luria buljong (LB) kompletteras med 600 μM DAP, 100 mg/L av ampicillin och 25 mg/L av kanamycin i en 250 mL Erlenmeyer kolv och märka den som "givare".
  2. Strimma "mottagaren" stam (A. baumannii stam ATCC 17978, Tabell of Materials) för isolerade kolonier på Luria-Bertani agar. Inkubera över natten vid 37 °C. Med hjälp av en enda isolerad koloni, inokulera 50 mL lb i en 250 mL Erlenmeyer kolv och märka den som "mottagare".
  3. Inkubera båda kulturerna ("givare" och "mottagare") över natten vid 37 °C med skakningar.

2. Bakteriell parning

  1. Överför övernattningskulturer till 50 mL koniska rör.
  2. Pellet både mottagare och givarkulturer med centrifugeringen vid 5 000 x g i 7 min.
  3. Kassera supernatant och resuspend "givaren" stam pellet i 35 mL lb kompletteras med DAP att tvätta bort kvarvarande antibiotika.
  4. Pellet "givaren" stamceller med centrifugeringen vid 5 000 x g i 7 min.
  5. Kassera supernatanten och resuspend "givaren" stam pellet i 4.5 mL av LB kompletteras med DAP. Använd en 10 mL serologisk pipett.
  6. Överför den återanvända "givaren" stam i "mottagare" stamrör, som innehåller pelleterade "mottagare" celler. Använd samma 10 mL serologiska pipetten från steg 2,5 för att blanda kulturerna. Omedelbart flytta till nästa steg.
    OBS: Den totala volymen för den slutliga suspensionen bör vara 5 mL.
  7. Fördela parningsfjädringen som individuella 100 μL-droppar på LB-agarplattor kompletterade med DAP (5-7 droppar per plätt) (Figur 1A).
  8. Inkubera plattor i rumstemperatur i 30 min.
  9. Utan att störa dropparna, överför noggrant plattor till en 37 °C-inkubator och låter kulturer para sig i 1 h.
    OBS: Inkubationsperioder som överstiger 1 h riskerar generering av syster mutanter.
  10. Efter inkubation, tillsätt 1,5 mL LB på varje tallrik och skörd genom resuspending bakterier från plattorna. Använd en 1 mL mikropipette för resuspension. Slutlig volym bör vara cirka 12 - 15 mL.
  11. Kombinera skördade celler i ett 50 mL koniskt rör.
  12. Pellet de parade cellerna med hjälp av centrifugering vid 5.000 x g i 7 min.
  13. Kassera supernatanten och resuspend cellerna i 50 mL av LB för att ta bort rest-DAP.
  14. Pellet parningen med hjälp av centrifugering vid 5 000 x g i 7 min.
  15. Upprepa tvättsteget (steg 2.13 och 2.14).
  16. Med hjälp av en 10 mL serologisk pipet, resuspend pelleten i 10 mL lb kompletteras med 25% glycerol.
  17. Med hjälp av tvättade celler, gör fem serieutspädningar i LB-buljong (1:10, 1:100, 1:10,000, 1:100,000).
  18. Sprid 100 μL av varje spädning på 4 olika plattor med hjälp av sterila glaspärlor: Luria-Bertani-agar kompletterad med kanamycin, agar kompletterad med ampicillin, agar kompletterad med endast DAP och agar.
  19. Inkubera plattor vid 37 °C över natten.
  20. Alikvotera den återstående parningen i 1 mL alikvoter och förvara vid -80 °C.

3. Bestäm lämplig utspädning av transposonbiblioteket

  1. Registrera kolonibildande enheter (CFU) från övernattningsplattor.
  2. Avbilda en platta med uppredbara kolonier för varje olika plåtvillkor (Figur 2A).
    OBS: Både "givare" och "mottagare" stammar bör växa på agar plattor kompletteras med DAP, så de flesta pläterade utspädningar kommer att ge en gräsmatta. Endast "mottagaren" stam kan växa på agar plattor. Varken "givaren" eller "mottagaren" stam kan växa på agar plattor kompletteras med ampicillin, så det bör finnas ingen / minimal tillväxt. Endast mål stam celler kodning transposon insättningspunkten kan växa på agar plattor kompletteras med kanamycin. Kolonier bör variera i storlek, vilket indikerar transposoninfogningar i gener som bidrar till kondition på agar kompletterat med kanamycin.
  3. Beräkna antalet transposonmutanter i den frysta parningen genom att räkna antalet kolonier på LB-agarplattor kompletterade med kanamycin.
    OBS: För A. baumannii genomet (cirka 4 Mbps) var målet att få fram cirka 400 000 kolonier för att generera ett högupplöst mutantbibliotek (ungefär ett transponerings-/10-baspar). Detta antal bör dock optimeras utifrån arvsmassans storlek på målarten).

4. Generering av slutligt bakteriellt mutantbibliotek

  1. Tina en alikvot av den frusna parningen på is.
  2. Plåt parning på 150 mm Luria-Bertani agar plattor kompletterat med kanamycin baserat på CFUs beräknas i steg 3.1. Justera volymen med LB så att 13 333 kolonier per 150 μL får ge innan du pläter.
    OBS: CFU-räkningen här bestämdes till att vara ca 105 CFU/mL, så parningsvolymen justerades för att erhålla 13 333 kolonier per platta eftersom detta skulle ge ett optimalt antal kolonier på 30 plattor för ett högupplöst mutantbibliotek utan överbeläggning av plattorna.
  3. Använd sterila glaspärlor för att sprida 150 μL av utspädningen per platta på 30 x 150 mm Luria-Bertani-agarplattor kompletterade med kanamycin för att erhålla 400 000 kolonier (Figur 1C).
    OBS: Sterilstavar eller något slags sterilspridareverktyg (dvs. glaspärlor) får användas för att sprida bakterierna på plattor.
  4. Kassera det använda röret som innehåller överflödig parning.
    OBS: Freeze / tina cykler lägger selektiva tryck på bakteriekulturen, som kan skeva Tn-seq experimentresultat. Använd en färsk alikvot varje gång.
  5. Inkubera plattor vid 37 °C i 14 h.
    OBS: Inkubationstiden är optimerad för att förhindra överväxt (kolonier vidrör). Minimera tillväxten genom att minska inkubationstiden föreslås.

5. Uppskattning av bibliotekens täthet och pooling för lagring

  1. Räkna CFUs på varje platta för att uppskatta de totala mutanterna i transposonbiblioteket. Räkna 20% av minst 3 plattor för att bestämma uppskattningen av koloniräkningen för hela gruppen av plattor (Figur 2A). Se till att kolonierna inte vidrör en annan koloni.
  2. Efter beräkning av den uppskattade kolonikoavkastningen, tillsätt 3-5 mL LB (eller mer om det behövs) till varje platta och skrapa bort bakterierna med hjälp av ett sterilt skrapverktyg.
    OBS: Sterila inokulat slingor användes för att effektivt skrapa plattor.
  3. Poolbakteriella suspensioner från alla plattor in i 50 mL koniska rör (Figur 1D). Detta kommer att kräva flera 50 mL koniska rör, minst 3.
  4. Pellet poolad bakteriefjädring med centrifugation vid 5 000 x g i 7 min.
  5. Kassera supernatanten och resuspend pelleten i 5 mL av LB kompletterat med 30% glycerol.
  6. Aliquot 1 mL av transposonbiblioteket i cryovials och förvara vid -80 °C.

6. Identifiering av faktorer som reglerar resistensen colistin i A. baumannii

  1. Förbered 4 x 250 mL Erlenmeyerkolvar med var och en som innehåller 50 mL LB-buljong och etikett som (Bild 2B)
    1. A. baumannii stam ATCC 17978 Tn-seq bibliotek; (-) colistin_1
    2. A. baumannii stam ATCC 17978 Tn-seq bibliotek; (-) colistin_2
    3. A. baumannii stam ATCC 17978 Tn-seq bibliotek; (+) colistin_1
    4. A. baumannii stam ATCC 17978 Tn-seq bibliotek; (+) colistin_2
      OBS: I den utmaning tillväxt som beskrivs här, varje villkor, (-) colistin kontroll och (+) colistin utmaning, testas i två exemplar. Därför kräver uppställningen 4 x 250 mL Erlenmeyerkolvar, två per villkor.
  2. Tillsätt 50 μL på 0,5 mg/L kolistin till (+) kolvar i colistin (6,1,3 och 6,1,4) och 50 μL vatten till (-) kolvar colistin (6.1.1 och 6.1.2).
  3. Tina en fryst Tn-seq bibliotek aliquot från steg 5 på is.
  4. Pipett 1 μL av det tinade biblioteket till 1 mL PBS.
  5. Mät den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) och multiplicera med 1 000.
    OBS: Detta bestämmer OD600 av 1 μL av Tn-biblioteket.
  6. Baserat på beräkningen i steg 6.5, inokulera varje kolv som innehåller 50 mL LB till en slutlig OD600 0,001.
  7. Odla kulturer i en skakande inkubator vid 37 °C till OD600 0,5.
    OBS: Det är viktigt att kulturer kvar i logaritmisk tillväxt fas, så om din stam är på en annan OD600 under exponentiell tillväxt, OD600 måste justeras för att säkerställa kulturen replikat så många gånger som möjligt inom logaritmisk tillväxt fas. Om kulturen bara replikerar 3 gånger, är kraften att upptäcka fitness defekter i mutanter begränsas till 3-faldiga skillnader, i teorin. Eftersom olika bakterier har olika fördubblingstider är det viktigt att så odlar med en fast OD600 för att normalisera startinokulatet. Detta säkerställer en konsekvent representation av hela biblioteket i alla kulturer.
  8. Skörda kulturer med centrifugeringen vid 5 000 x g vid 4 °C i 7 min.
  9. Ta bort supernatanten och tvätta med 50 mL PBS.
  10. Pellet med centrifugeringen vid 5 000 x g vid 4 °C i 7 min.
  11. Ta bort supernatanten och resuspend pelleten i 1 mL PBS. Aliquot ~ 200 μL i 5 mikrocentrifugrör.
  12. Pellet med centrifugeringen vid 5 000 x g vid 4 °C i 5 min. Ta bort all supernatant med hjälp av en pipettspets.
  13. Förvara pellets vid -20 °C eller fortsätt med gDNA-extraktion.

7. gDNA-utvinning

  1. Tina en cellpellet på is.
  2. Tillsätt 0,6 mL lysbuffert (Tabell of Materials) och vortex till helt resuspend pelleten.
  3. Inkubera vid 37 °C i 1 h.
  4. Tillsätt 0,6 mL fenol/kloroform/isoamylalkohol till provet och virvel kraftigt.
  5. Separata faser med hjälp av centrifugering i en mikrocentrifug vid maxhastighet vid rumstemp i 5 min.
  6. Överför den övre vattenfasen till ett nytt rör. Undvik att störa fasgränssnittet under överföringen.
  7. Tillsätt en lika stor volym kloroform till vattenfasen som erhållits ovan och virvel kraftigt.
  8. Separata faser med hjälp av centrifugering i mikrocentrifug vid max hastighet vid rumstemp i 5 min.
  9. Överför övre vattenfas till ett nytt rör.
    OBS: Se till att undvika att störa gränssnittet under överföringen.
  10. Tillsätt 2,5x vattenfasvolym av kall 100 % etanol och blanda försiktigt. Utfällt DNA kommer att synas.
  11. Placera röret vid -80 °C i minst 1 h.
  12. Pellets-DNA med hjälp av centrifugering vid max hastighet vid 4 °C i 30 min.
  13. Tag försiktigt bort supernatant utan att störa DNA-pelleten och tvätta med 150 μL 70 % etanol genom pipettering.
  14. Pellet-DNA med hjälp av centrifugering vid max hastighet vid 4 °C i 2 min.
  15. Ta försiktigt bort supernatanten.
  16. Upprepa steg 7.14 en gång. Ta försiktigt bort all kvarvarande etanol.
  17. Torr DNA genom att inkubera vid rumstemp i 5-10 min.
  18. Resuspend DNA pellet i 100 μL TE buffert genom pipettering.

8. DNA-skjuvning (figur 3A)

  1. Späd gDNA med TE-buffert till en koncentration på 250 ng/mL i en total volym på 200 μL.
  2. Placera rör i ett vattenbad sonicator.
  3. Sonikera DNA att ge fragment av cirka 300 nukleotider. Effekt: 60 %, Total Tid: 20 min, Cykler: 10 s ON och 10 s OFF vid 4 °C (Figur 3A).
  4. Bekräfta DNA är skjuvning på lämpligt sätt genom att separera 10 μL av unsheared DNA och 10 μL av skjuvade DNA på en 1% agaros gel. Upprepa ultraljudsbehandling eller optimera efter behov (Bild 3B).

9. Poly-C svans tillägg till 3' änden (Figur 3A)

  1. Setup poly-C reaktion enligt tabell 1.
  2. Inkubera reaktion vid 37 °C i 1 h.
  3. Rena poly-C-reaktion med 40 μL av storleksval paramagnetiska pärlor (Figur 3A) genom att följa stegen nedan.
    1. Tillsätt 40 μL av storleksval paramagnetiska pärlor till varje prov. Vortex ~ 5 s eller pipett upp och ner.
    2. Inkubera prover i rumstemperatur i 5 min.
    3. Kortfattat, centrifugrör för att samla vätska i botten av röret (~ 2 s).
    4. Överför rör till ett magnetiskt rack och inkubera i rumstemperatur i ~ 2 min tills lösningen är klar.
    5. Med rör på magnetiskt rack, ta försiktigt bort supernatanten.
    6. Med rör på magnetiskt rack, tillsätt 200 μL nyberedd 80% etanol (stör ej pärlor).
    7. Inkubera prover i minst 30 s tills lösningen är klar.
    8. Med rör på magnetiskt rack, ta försiktigt bort supernatanten.
    9. Upprepa tvättsteget (steg 9.3.6 - 9.3.8).
    10. Samla vätska i botten av röret med hjälp av en kort centrifugering steg (~ 2 s).
    11. Överför rör till magnetstället och ta bort eventuell kvarvarande vätska.
    12. Inkubera i rumstemperatur i 2-5 min till torra prover. Torka inte över.
    13. Ta bort rör från magnetiskt rack och tillsätt 25 μL vatten till varje. Vortex för ~ 5 s eller pipett upp och ner.
    14. Kortfattat, centrifugrör för att samla vätska i botten av röret (~ 2 s).
    15. Överför rör till magnetstället och låt sitta i ~ 2 min tills lösningen är klar.
    16. Med rör på magnetstället, avlägsna vätska utan att störa pärlorna och överför till ett nytt rör (~ 23 μL DNA).

10. Transposon korsning förstärkning (Figur 3A)

  1. Inställning pcr 1 enligt beskrivningen i tabell 1 för den första kapslade PCR (tabell 2).
  2. Utför PCR 1 med hjälp av förhållanden som beskrivs i tabell 1.
  3. Rena PCR-produkter med 40 μL av storleksval paramagnetiska pärlor (steg 9.3.1 – 9.3-12). Elute i 50 μL vatten (steg 9.3.13 – 9.3.16). I detta läget kan proverna förvaras vid -20 °C.
  4. Förbered Streptavidin-kopplade paramagnetiska pärlor:
    1. Resuspend Streptavidin pärlor genom att skaka kraftigt.
    2. Tillsätt 32 μL pärlor per prov till ett färskt mikrocentrifugrör.
      OBS: Pärlor för 6 + prover kan beredas i ett enda rör.
    3. Överför röret till ett magnetiskt rack. Inkubera i ~ 2 min tills lösningen är klar.
    4. Med tub på magnetiskt rack, ta bort supernatant.
    5. Ta bort röret från magnetiskt rack. Tvätta pärlor genom resuspending i 1 mL 1x B & W buffert genom pipettering upp och ner.
    6. Överför röret till magnetiskt rack. Inkubera i ~ 2 min tills lösningen är klar.
    7. Med röret på magnetiskt rack, ta bort supernatanten.
    8. Upprepa tvättsteg med 1 mL 1x B&W-buffert (steg 10.4.5 – 10.4.7) två gånger till för totalt 3 tvättar.
    9. Avlägsna rör från magnetiskt rack och resuspend pärlor i 52 μL av 2x B & W buffert per prov.
  5. Kombinera 50 μL av de beredda pärlorna med 50 μL renad PCR1 (från steg 10.3). Pipett att blanda.
  6. Rotera i rumstemperatur i 30 min.
  7. Tvätta bort obundet DNA:
    1. Kortfattat, centrifug att samla vätska i botten av röret (~ 2 s).
    2. Överför röret till magnetiskt rack. Inkubera för ~ 2 min tills lösningen är klar.
    3. Med röret på magnetiskt rack, ta bort supernatanten.
    4. Ta bort röret från magnetiska rack, tvätta pärlor genom resuspending i 100 μL 1x B & W buffert och pipettering upp och ner.
    5. Överför röret till magnetiskt rack. Inkubera för ~ 2 min tills lösningen är klar.
    6. Med tub på magnetiskt rack, ta bort supernatant.
    7. Upprepa tvättsteg med 100 μL LoTE (steg 10.7.4 – 10.7.6) två gånger till för totalt 3 tvättar.
  8. Inställning pcr 2 enligt beskrivningen i tabell 1 för att förstärka transponeringsplatskorsningar och lägga till en enda streckkod i varje prov (tabell 2 och tabell 3).
  9. Utför PCR 2 med hjälp av förhållanden som beskrivs i tabell 1.
  10. Rena med 40 μL av storlek-val paramagnetiska pärlor (steg 9.3.1 – 9.3.12). Elute i 17 μL vatten (steg 9.3.13 – 9.3.16), samla ~ 15 μL.
  11. Kvantifiera DNA-koncentration med hjälp av en fluorometer. De slutliga koncentrationerna bör vara ~ 50 till 250 ng/μl.
  12. Bedöma DNA-kvalitet med hjälp av chipbaserad kapillärelektrofores (Figur 4A).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De skisserade metoderna beskriver genereringen av ett högdensitets transposonbibliotek i A. baumanniistam ATCC 17978 genom bakteriekonjugering med hjälp av E. coli MFD DAP-, som replikerar plasmiden pJNW684 (Figur 4B). Det detaljerade protokollet använder bi-föräldrarnas bakteriella konjugation för överföring av pJNW684 från E. coli λpir+ givaren stam till A. baumannii mottagaren stam. Detta är en effektiv och billig metod för att generera täta transposon mutant bibliotek. Bakterier blandades vid optimerade förhållanden och parningar sågs på Luria-Bertani agar plattor för 1 h (Figur 1A). Under parningen överfördes transposonen från givaren till mottagarstam, där den sattes in i gDNA (Figur 1B). Parningar samlades in, ungefär 105 CFU/mL beräknades och pläterades på 150 mm x 15 mm agarplattor kompletterade med kanamycin. Efter 14 h av tillväxt vid 37 °C innehöll plattor tusentals kolonier av varierande storlek (Figur 1C) som indikerar framgångsrik generation av ett transposon mutantbibliotek. Transposoninfogningsmutanterna poolades (Figur 1D) och frystes i alikvoter för att förhindra upprepade frys-töcykler, vilket kunde lägga till selektivt tryck på infogningsbiblioteket.

Det poolade A. baumannii transposon mutantbiblioteket användes för att identifiera fitnessfaktorer som är viktiga för colistinresistensen under subinhibitorykoncentrationer av de antimikrobiella (Figur 2B). Mutant biblioteket odlades till logaritmisk fas i frånvaro/närvaro av 0,5 mg/L colistin i duplicera att tömma mutanta celler kodning infogningar i gener som bidrar till colistin resistens. Den totala gDNA av de återstående biblioteket poolen var isolerade från kontroll och experimentella kulturer och bearbetas för att förbereda DNA för sekvensering (Figur 3A).

Isolerade gDNA var fragmenterad med hjälp av mekanisk skjuvning och en poly-C svans lades på DNA-fragmenten (Figur 3A). Efter tillsats av poly-C svans, DNA renades och transponering-genom korsningar berikades med hjälp av poly-C specifika primer följt av en andra omgången av PCR med hjälp av en annan poly-C specifik primer som infördeS P7 sekvensering webbplats som krävs för att binda Illumina flöde cell och kluster generation, och en sex-bas streckkod som används för att demultiplex bibliotek efter sekvensering37,47. DNA-koncentrationer beräknades och proverna analyserades med hjälp av chip-baserade kapillärelektrofores för att bekräfta framgångsrika bibliotek bygger (Figur 4A), som är redo för hög genomströmning sekvensering.

DNA-biblioteken var sekvenserade av nästa generations sekvensering. En enkel-end, 50 cykel köra utfördes, som gav 30 miljoner högkvalitativa läsningar / prov ger 62,5-faldig täckning av transposon biblioteket. Transposon korsningar (läsningar) var mappas tillreferensgenomet 48, med hjälp av kommersiellt tillgängliga bioinformatik analys programvara. Antalet läsningar vid varje insättningsplats i ingångsproven, (-) colistinkontrolltillstånd, jämfördes med antalet läsningar i utdataproverna, (+) colistin experimentellt tillstånd och konditionspoäng för varje insättningsstället beräknades. Fitness poängen var sedan grupperade efter gen. Gener som visar nedsatt poäng när biblioteket odlades i närvaro av colistin i förhållande till inmatningsproven ansågs vara fitness determinanter för A. baumannii överlevnad vid subinhibitory koncentrationer av colistin. Transponering av infogningar inom PmrAB-systemet med tvåkomponents fanns till exempel i indataprovet, men hittades inte i utdataprovet. PmrAB reglerar direkt uttryck av pmrC, som överför fosfoetanolamin på lipid A för att neutralisera laddningen på cellytan12,31. Neutralisering av bakteriell ytladdning är tänkt att minska den elektrostatiska potential som krävs för colistin-medierad dödande. Identifiering av utarmade gener kända för att bidra till resistens fenotyp validerade metoden.

Figure 1
Figur 1: Schematisk för transposon mutant bibliotek konstruktion. (A) Bakteriekonjugering. Den "givare" stam, som kodar för införlivande maskiner, blandades med "mottagaren" stam. Blandningen sågs på LB agar plattor och får para sig i 1 h. (B) Generation av transposon bibliotek. Den plasmid som transporterar införlivandet maskiner överfördes från "givaren" stam till "mottagaren" stam och transposon var slumpmässigt införas i hela arvsmassan av "mottagaren" stam. (C) Urval. Resulterande celler var pläterade på agar plattor kompletteras med kanamycin att välja för transposon insättnings muterade. (D) Poolat bibliotek. Kolonier skrapades från plattor, återanvänds i LB och poolades. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Representativa resultat för bakteriekonjugering och ett schematiskt av colistin Tn-seq-experimentet. (A) Representativa kanamycin urvalsplatta. Plattan är uppdelad i fem lika stora sektioner. Blå prickar representerar koloniräkning för skattning av A. baumannii transposon insertion mutanter. Minst tre separata plattor räknades för att beräkna den slutliga uppskattningen. (B) Identifiering av konditionsfaktorer vid subinhibitory kolistin koncentrationer. Den poolade transposon biblioteket odlades till logaritmisk tillväxt fas antingen i frånvaro (kontroll) eller i närvaro (experimentell) av colistin. När kulturerna nått lämplig optisk densitet, cellerna pelleterade och gDNA extraherades från varje prov. Varje villkor testades i två exemplar för totalt fyra prover. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Flödesschema av DNA-amplikonbiblioteket bygga för massiv parallell sekvensering och representativa skjuvning gDNA. (A) Tn-seq DNA bibliotek bygga schematisk. Efter extraktionen fragmenterades gDNA via mekanisk skjuvning. Terminal deoxynucleotidyl transferas användes för att lägga till en poly-C svans till 3' slutet av fragmenterad DNA innan PCR förstärkning av transponer-genomet korsningar och streckkod tillägg. (B) 1% agarosgel av unsheared och skjuvning A. baumannii mutant bibliotek efter gDNA skjuvning steg. 1 Kb stege användes som en DNA-markör. Skjuvade gDNA utstryket varierar i första hand mellan ~ 100 och 500 baspar. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Representativa kvalitetskontroll (QC) resultat och karta över plasmiden som bär på införlivandegenerna. (A) QC spår för ett DNA-bibliotek bygga. Det finns en topp på ~ 350 baspar, vilket indikerar framgångsrik bibliotek bygga. Om några större DNA upptäcktes i QC-resultaten, kan proverna rensas upp ytterligare för att ta bort stora DNA-fragment. (B) Plasmid pJNW684 består av en Himar1 mariner transposon (grön) med en kanamycin motstånd kassett (lila) för mutant urval, en gen kodning hyperaktiva mariner Himar1 C9 transposase (röd) under kontroll av en A. baumannii 17978 specifik promotor (blå), en ampicillin resistens gen (bla, orange) och en RP4/oriT/oriR6K-villkorligt ursprung replikering (gul). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Reaktion Installationen Villkor
Poly-C-reaktion 30 μL av skjuvade gDNA
2,5 μL på 9,5 mM dCTP/0,5 mM ddCTP
10 μL av 5X Terminal deoxynucleotidyl-överförings(Tdt) reaktionsbuffert
1,25 μL rTdt
6,25 μL vatten till 50 μL		 Inkubera vid 37ºC i 1 timme
PCR 1 23 μL 3'-poly-C renat DNA (hela provet från föregående steg)
10 μL 10x hög-fidelity DNA-polymeras reaktion mix
2 μL 10 mM dNTPs
2 μL 50 mM MgSO4
1 μL 30 μM olj 510 biotin
3 μL 30 μM olj 376
0,5 μL high-fidelity DNA-polymeras
8,5 μL rent vatten till 50 μL totalt		 1 cykel: 2 min 94 ºC
15 cykler: 15 s 94 ºC
30 s 60 ºC
2 min 68 ºC
1 cykel: 4 min 68 ºC
Stadga: ∞ 4 ºC
PCR 2 DNA bundna pärlor från föregående steg
10 μL 10x hög-fidelity DNA-polymeras reaktion mix
2 μL 10 mM dNTP
2 μL 50 mM MgSO4
1 μL 30 μM olj 511
1 μL 30 μM streckkodsprimer (tabell 2)
0,5 μL high-fidelity DNA-polymeras
33,5 μL rent vatten till 50 μL		 1 cykel: 2 min 94 ºC
15 cykler: 15 s 94 ºC
30 s 60 ºC
2 min 68 ºC
1 cykel: 4 min 68 ºC
Stadga: ∞ 4 ºC

Tabell 1: Uppställning av reaktion. Inställning och villkor för poly-C, PCR 1 och PCR 2 reaktioner.

Syfte Namn Sekvens
Anneals att transposon olj510-Biotin Biotin-GATGGCCTTTTTGCGTTTCTACCTGCAGGGCGCGG
Glödg till poly-C svans olj376 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTCTTCCGATCTGG
GGGGGGGGGGGG
Kapslad till transposon + P5-adapter:
P5 fånga plats – P5 sekvensering webbplats– N5 –Tn		 olj511 AATGATACGGCGACCAKGATECTACACTCTKT
CCCTACACGACGCTCTCCGATCTNNNNGGGGACTTA
TCATCCAACCTGTTAG
Kapslad till olj376: P7-sekvenseringsplats
– streckkod XXXXXX – P7 fånga plats)		 Bc ## CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxGTGA
CTGGAGTTCAGACGTGTGTG
se tabell 2 för specifika streckkoder***

Tabell 2: PCR-primrar för förstärkning. PCR-förstärkningsprimrar som används i protokollet för att förstärka transponeringspunkterna. Syftet med varje anges i den första kolumnen.

Primer Läsa Streckkod Sekvens
BC1 ATCACG CGTGAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGT
GATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTG
BC2 CGATGT ACATCG CAAGCAGAAGACGGCATAKGAGATAC
ATCGGTGACTGGAGTTCACGTGTGTG
BC3 TTAGGC GCCTAA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCC
TAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTGTG
BC4 TGACK TGGTCA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATT
GGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTG
BC5 ACAGTG CACTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTGTG
BC6 GCCAAT ATTGGC CAAGCAGAAGACGGCATAKGAGATA
TTGGCGTGTGGGGGTTCACGTGTGT
BC7 CAGATC GATCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTGTG
BC8 ACTTGA TCAAGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCAAGAGTGTGTGGAGTTK.
BC9 GATCAG CTGATC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAGA
TCTGATCGTGAKTGGGTTCACGTGTGT
BC10 TAGCTT AAGCTA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
AAGCTAGTGACTGGGTTCACGTGTGT
BC11 GGCTAC GTAGCC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTG
BC12 CTTGTA TACAAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATT
ACAAGGTGACTGGGTTCAGTGTGT
BC13 AGTCAA TTGACT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TTGACTGTGACTGGAGTTK.GTGT
BC14 AGTTCC GGAACT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATG
GAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTGTG
BC15 ATGTCA TGACAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAGA
TTGACATGTGTGACTGGGTTK.GTGT
BC16 CCGTCC GGACGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTGTG
BC17 GTAGAG CTCTAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CTCTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTGTG
BC18 GTCCGC GCGGAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTG
BC19 GTGAAA TTTCAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TTTCACGTGAKTGTTCACGTGTGTG
BC20 GTGGCC GGCCAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATG
GCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTG
BC21 GTTTCG CGAAAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTG
BC22 CGTACG CGTACG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTG
BC23 GAGTGG CCACTC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
CACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTG
BC24 GGTAGC GCTACC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTACCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTG
BC25 ACTGAT ATCAGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
ATCAGTGTGTKÄNNINGSGARAKK.
BC26 ATGAGC GCTCAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTCATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTGTG
BC27 ATTCCT AGGAAT CAAGCAGAAGACGGCATAKGAGATA
GGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTGTG
BC28 CAAAAG CTTTTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
TTTTGGTGACTGGAGTTCAGTGTGTG
BC29 CAACTA TAGTTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TAGTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTGTG
BC30 CACCGG CCGGTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CCGGTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTGTG
BC39 CTATAC GTATAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GTATAGGTGACTGGAGTTCACGTGTGTG
BC40 CTCAGA TCTGAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCTGAGGTGACTGGGTTCACGTGTGT
BC42 TAATCG CGATTA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
GATTAGTGACTGGAGTTCAGTGTGTGTG
BC43 TACAGC GCTGTA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTGTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTG
BC44 TATAAT ATTATA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
ATTATAGTGACTGGAGTTCAGTGTGTGTG
BC45 TCATTC GAATGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GAATGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTGTG
BC46 TCCCGA TCGGGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCGGGGGAGTGACTGGGTTCACGTGTGT
BC47 TCGAAG CTTCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
TTCGAGTGACTGGGTTCACGTGTGT
BC48 TCGGCA TGCCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TGCCGAGTGACTGGGTTCACGTGTGT

Tabell 3: Streckkodsprimer. Streckkodsprimrar används i det andra PCR-steget för att förstärka transponeringen av korsningar samtidigt som en P7-sekvenseringsplats och streckkoder läggs till amplikonen. Alla streckkodsprimrar behövs inte för att generera ett bibliotek. Endast streckkodsprimrar för antalet prover krävs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

A. baumannii är ett framväxande hot mot den globala folkhälsan på grund av det snabba förvärvet av ANTIR mot "sista linjen" therapeutics, såsom colistin10,11,12,23,24,30,31. Under de senaste decennierna, Tn-seq har spelat en avgörande roll i att belysa genotyp-fenotyp interaktioner över många bakteriearter och utöka vår förståelse av bakteriella genetik34,35,42,43. Tn-seq protokoll har varit avgörande för att identifiera väsentliga gener i olika bakteriearter såsom Campylobacter jejuni, Staphylococcus aureus, den parodontala patogen porfyromonas gingivalis, och även Mycobacterium tuberkulos37,49,50,51. Utöver identifiering av essentiella gener, Tn-seq har använts för att identifiera antibiotikaresistens gener i Pseudomonas aeruginosa, flera villkorligt väsentliga gener i Salmonella typhimurium, och många genotyp-fenotyp relationer i Streptococcus pneumoniae52,53,54. På senare tid, transposon sekvensering av Vibrio cholerae var anställd i spädbarn kanin modell av Kolera att identifiera gener som är viktiga för in vivo fitness under infektion47. Dessa studier visar mångsidigheten hos Tn-seq eftersom den kan utnyttjas för både in vitro- och in vivo-studier.

Den största fördelen med Tn-seq jämfört med andra metoder, såsom mikroarrayteknik, 2D gelelektrofores, och qPCR, är att det inte kräver förkunskaper om genomet eller genomisk information55. Därför möjliggör transposon mutagenesis tillsammans med massiv-parallell sekvensering studier av kända gener och genom samt upptäckt av nya genetiska interaktioner. Här har vi lagt fram en omfattande metod för att generera en mycket tät transposon mutant bibliotek i A. baumannii att identifiera faktorer som är väsentliga för bakteriell lämplighet när de utsätts för subinhibitory koncentrationer av colistin. Den beskrivna metoden har också framgångsrikt använts i E. coli (opublicerade data), vilket visar att systemet är mottagligt för att utföra Tn-seq-analys i andra Gramnegativa patogener, inklusive Enterobacteriaceae.

Använda mariner transposons för insertional mutagenesis har flera fördelar. Transposon familjen härstammar från eukaryota värdar och har använts i stor utsträckning för att generera mättande mutanta bibliotek i olika bakteriepopulationer. Sjöman transposons är värd-oberoende, vilket innebär att stabila slumpmässiga infogningar kan uppnås i avsaknad av specifika värd faktorer40,41. Dessutom har sjömännen transposons ett definierat antal infogning händelser eftersom de företrädesvis infoga i thymine-adenin ("TA") motiv, vilket minskar insättningspunkten bias och leder till mer robust statistisk analys37,56,57,58.

Flera mariner-baserade Tn-seq metoder använder MmeI begränsning matsmältningen för gDNA fragmentering32,42,43. Medan enzymatisk DNA-fragmentering är en populär och framgångsrik metod, lägger det onödiga steg till förfarandet och ökar potentiella bias37. Inte bara dessa tekniker kräver stora mängder utgångsmaterial, de kan också potentiellt leda till ojämlik representation av insättningssekvenser i nedströms analyser37,59. Liksom vissa andra metoder som inte förlitar sig på MmeI nuclease aktivitet52,60,61, den metod som beskrivs häri bygger på mekanisk skjuvning att fragmentera gDNA, och TdT att lägga till en poly-C svans till 3' slutet av DNA-fragment. Jämfört med enzymatisk DNA-fragmentering och metoder adapter ligering, detta tillvägagångssätt kräver betydligt mindre mängder start-DNA samtidigt som mer konsekvent resultat, det också sänker risken för DNA korskontaminering och minskar provförlust på grund av instängdhet i ett förseglatrör 37,59,62. Vidare ger denna metod längre, hög kvalitet sekvensering läser av 50 nukleotider som stöd i mer effektiv och exakt kartläggning av sekvenser och en mer robust nedströms analys37,59. Tillägget av en syntetisk poly-C svans bortser potentiella överhäng som kan bli följden av fragmentering som denna metod bygger på den exogent tillsatta poly-C svansen som ett erkännande plats för omvänd primer, som innehåller 16 dG nukleotider vid dess 3'-slut och en sekvens som är specifik för nästa generations sekvensering (t.ex., Illumina sequencing) vid 5' änden, till prime syntes47,59. Användningen av en syntetisk nukleotid svans expanderar tillämpningen av denna metod till många distinkta genom oberoende av deras infödda innehåll59. Därefter förstärks transponer-genomknutna knutpunkter med hjälp av poly-C-specifika primern37. Detta alternativ förenklar förfarandet genom att eliminera behovet av dyra restriktionsenzymer, adapterligering, bildande av adapter dimers och gel reningssteg. Vi har ytterligare optimerat protokollet för att effektivt generera mycket mättade transposoninfogningsbibliotek i flera Gramnegativa ESKAPE-patogener, inklusive Acinetobacter baumannii och kan användas för att studera genetiska interaktioner under olika in vitro- och in vivo-förhållanden 10.

En begränsning av Tn mutagenesis är det förlitar sig på antibiotikaresistens markörer för urval. Men många gramnegativa ESKAPE patogener är multiresistenta eller i stor utsträckning resistenta mot läkemedel, vilket innebär att användaren kan behöva byta motståndskassett enligt den specifika patogen av intresse. Vidare, vissa kliniska isolat är inte mottagliga för transposon mutagenesis med hjälp av mariner-baserade transposon.

Ett kritiskt steg i protokollet är att beräkna antalet Tn mutanter till plattan. Platering alltför många kolonier kommer att resultera i en gräsmatta som kan komplicera nedströms analys. Om kolonierna är för nära eller vidröra, kan de lägga till oönskade selektiva tryck på biblioteket som kan resultera i artefakter. Helst skulle kolonier inte vara rörande och fördelade jämnt över plattan, som visats (Figur 2A). Omvänt, om för få kolonier är pläterade, blir det svårt att isolera flera Tn-infogningar i varje gen.

Det är också viktigt att utföra de kontroller som anges i steg 2.18. Som anges i Noten i avsnitt av 3. 2, varken "givare" eller "mottagare" stam bör växa på plattor kompletteras med Ampicillin. Eftersom exogena DAP krävs för tillväxt av "givaren" stam, skulle någon tillväxt ange "mottagaren" stam replikerar pJNW684. Detta är ett betydande problem eftersom om transposon inte integreras i gDNA, sekvensering läser kommer bara kartan till plasmid, inte en integration webbplats. I detta fall experimentet kommer sannolikt inte att ge användbara data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av finansiering från National Institute of Health (Grant AI146829 till J.M.B.) och är tacksamt erkänt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate Affymetrix 77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate Invitrogen 10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker Promega PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes Corning 351029
150mm x 15mm Petri Dishes Corning 351058
1X B&W N/A N/A Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid Alfa Aesar B2239103 used at 600 µM
2X B&W N/A N/A Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP N/A N/A 9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase Invitrogen 12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978 ATCC N/A AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L) Fisher Scientific BP1760 used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system BECKMAN COULTER A63881
BioAnalyzer Agilent G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis Agilent 5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP) New England Biolabs (NEB) N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack Invitrogen 12321D
E.coli MFD Dap- N/A N/A DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol Fisher Scientific A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials Corning 09-761-71
Glass beads Corning 72684
Glycerol Fisher Scientific G33
Inoculating loops Fisher Scientific 22-363-602 Scraping tool
Kanamycin Fisher Scientific BP906 used at 25 mg/L
LB agar, Miller Fisher Scientific BP1425
LB broth, Miller Fisher Scientific BP1426
LoTE N/A N/A Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer N/A N/A 9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.) Fisher Scientific BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution Fisher Scientific BP39920 Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Q33238
Qubit Assay Tubes Thermo Fisher Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath Qsonica Sonicators Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs (NEB) S1420S
TE buffer N/A N/A 10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt) Promega PR-M1875

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gould, I. M., Bal, A. M. New antibiotic agents in the pipeline and how they can help overcome microbial resistance. Virulence. 4 (2), 185-191 (2013).
  2. Holzheimer, R. G. Antibiotic induced endotoxin release and clinical sepsis: a review. Journal of Chemotherapy. 13 (1), Florence, Italy. Spec No 1 159-172 (2001).
  3. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). Antibiotic resistance threats in the United States, 2019. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). , (2019).
  4. Scholar, E. M., Pratt, W. B. The antimicrobial drugs. , Oxford University Press. New York. (2000).
  5. Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).
  6. Henderson, J. C., et al. The Power of Asymmetry: Architecture and Assembly of the Gram-Negative Outer Membrane Lipid Bilayer. Annual Review of Microbiology. 70, 255-278 (2016).
  7. Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).
  8. Raetz, C. R. H., Whitfield, C. Lipopolysaccharide Endotoxins. Annual Review of Biochemistry. 71 (1), 635-700 (2002).
  9. Kang, K. N., et al. Colistin heteroresistance in Enterobacter cloacae is regulated by PhoPQ-dependent 4-amino-4-deoxy- L -arabinose addition to lipid A. Molecular Microbiology. 111 (6), 1604-1616 (2019).
  10. Boll, J. M., et al. A penicillin-binding protein inhibits selection of colistin-resistant, lipooligosaccharide-deficient Acinetobacter baumannii. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (41), 6228-6237 (2016).
  11. Boll, J. M., et al. Reinforcing Lipid A Acylation on the Cell Surface of Acinetobacter baumannii Promotes Cationic Antimicrobial Peptide Resistance and Desiccation Survival. mBio. 6 (3), 00478 (2015).
  12. Arroyo, L. A., et al. The pmrCAB operon mediates polymyxin resistance in Acinetobacter baumannii ATCC 17978 and clinical isolates through phosphoethanolamine modification of lipid A. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (8), 3743-3751 (2011).
  13. Harris, T. L., et al. Small molecule downregulation of PmrAB reverses lipid A modification and breaks colistin resistance. ACS Chemical Biology. 9 (1), 122-127 (2014).
  14. Vaara, M. Agents that increase the permeability of the outer membrane. Microbiological Reviews. 56 (3), 395-411 (1992).
  15. Vaara, M. Polymyxins and their novel derivatives. Current Opinion in Microbiology. 13 (5), 574-581 (2010).
  16. Kassamali, Z., Rotschafer, J. C., Jones, R. N., Prince, R. A., Danziger, L. H. Polymyxins: wisdom does not always come with age. Clinical Infectious Diseases: An Official publication of the Infectious Diseases Society of America. 57 (6), 877-883 (2013).
  17. Ainsworth, G. C., Brown, A. M., Brownlee, G. Aerosporin, an antibiotic produced by Bacillus aerosporus Greer. Nature. 159 (4060), 263 (1947).
  18. Benedict, R. G., Langlykke, A. F. Antibiotic activity of Bacillus polymyxa. Journal of Bacteriology. 54 (1), 24 (1947).
  19. Stansly, P. G., Shepherd, R. G., White, H. J. Polymyxin: a new chemotherapeutic agent. Bulletin of the Johns Hopkins Hospital. 81 (1), 43-54 (1947).
  20. Hermsen, E. D., Sullivan, C. J., Rotschafer, J. C. Polymyxins: pharmacology, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and clinical applications. Infectious Disease Clinics of North America. 17 (3), 545-562 (2003).
  21. Pedersen, M. F., Pedersen, J. F., Adsen, P. O. A clinical and experimental comparative study of sodium colistimethate and polymyxin B sulfate. Investigative Urology. 9 (3), 234-237 (1971).
  22. Falagas, M. E., Bliziotis, I. A. Pandrug-resistant Gram-negative bacteria: the dawn of the post-antibiotic era. International Journal of Antimicrobial Agents. 29 (6), 630-636 (2007).
  23. Peleg, A. Y., Seifert, H., Paterson, D. L. Acinetobacter baumannii: Emergence of a Successful Pathogen. Clinical Microbiology Reviews. 21 (3), 538-582 (2008).
  24. Beceiro, A., Tomás, M., Bou, G. Antimicrobial resistance and virulence: a successful or deleterious association in the bacterial world. Clinical Microbiology Reviews. 26 (2), 185-230 (2013).
  25. Eliopoulos, G. M., Maragakis, L. L., Perl, T. M. Acinetobacter baumannii: Epidemiology, Antimicrobial Resistance, and Treatment Options. Clinical Infectious Diseases. 46 (8), 1254-1263 (2008).
  26. Lee, A., Nolan, A., Watson, J., Tristem, M. Identification of an ancient endogenous retrovirus, predating the divergence of the placental mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1626), 20120503 (2013).
  27. Moffatt, J. H., et al. Colistin Resistance in Acinetobacter baumannii Is Mediated by Complete Loss of Lipopolysaccharide Production. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (12), 4971-4977 (2010).
  28. Cai, Y., Chai, D., Wang, R., Liang, B., Bai, N. Colistin resistance of Acinetobacter baumannii: clinical reports, mechanisms and antimicrobial strategies. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (7), 1607-1615 (2012).
  29. Da Silva, G., Domingues, S. Interplay between Colistin Resistance, Virulence and Fitness in Acinetobacter baumannii. Antibiotics. 6 (4), 28 (2017).
  30. Chin, C. -Y., Gregg, K. A., Napier, B. A., Ernst, R. K., Weiss, D. S. A PmrB-Regulated Deacetylase Required for Lipid A Modification and Polymyxin Resistance in Acinetobacter baumannii. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7911-7914 (2015).
  31. Beceiro, A., et al. Phosphoethanolamine modification of lipid A in colistin-resistant variants of Acinetobacter baumannii mediated by the pmrAB two-component regulatory system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (7), 3370-3379 (2011).
  32. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-Wide Fitness and Genetic Interactions Determined by Tn-seq, a High-Throughput Massively Parallel Sequencing Method for Microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36, 1-24 (2015).
  33. Kwon, Y. M., Ricke, S. C., Mandal, R. K. Transposon sequencing: methods and expanding applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (1), 31-43 (2016).
  34. Yamaichi, Y., Dörr, T. Transposon Insertion Site Sequencing for Synthetic Lethal Screening. Methods in Molecular Biology. 1624, Clifton, N.J. 39-49 (2017).
  35. Goodman, A. L., et al. Identifying Genetic Determinants Needed to Establish a Human Gut Symbiont in Its Habitat. Cell Host & Microbe. 6 (3), 279-289 (2009).
  36. Wang, N., Ozer, E. A., Mandel, M. J., Hauser, A. R. Genome-Wide Identification of Acinetobacter baumannii Genes Necessary for Persistence in the Lung. mBio. 5 (3), 01163 (2014).
  37. Klein, B. A., et al. Identification of essential genes of the periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis. BMC Genomics. 13 (1), 578 (2012).
  38. Ferrieres, L., et al. Silent Mischief: Bacteriophage Mu Insertions Contaminate Products of Escherichia coli Random Mutagenesis Performed Using Suicidal Transposon Delivery Plasmids Mobilized by Broad-Host-Range RP4 Conjugative Machinery. Journal of Bacteriology. 192 (24), 6418-6427 (2010).
  39. Lim, L. M., et al. Resurgence of Colistin: A Review of Resistance, Toxicity, Pharmacodynamics, and Dosing. Pharmacotherapy. 30 (12), 1279-1291 (2010).
  40. Lampe, D. J., Churchill, M. E., Robertson, H. M. A purified mariner transposase is sufficient to mediate transposition in vitro. The EMBO Journal. 15 (19), 5470-5479 (1996).
  41. Mazurkiewicz, P., Tang, C. M., Boone, C., Holden, D. W. Signature-tagged mutagenesis: barcoding mutants for genome-wide screens. Nature Reviews. Genetics. 7 (12), 929-939 (2006).
  42. Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nature Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
  43. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Reviews. Microbiology. 11 (7), 3033 (2013).
  44. Liu, H., Bouillaut, L., Sonenshein, A. L., Melville, S. B. Use of a Mariner-Based Transposon Mutagenesis System To Isolate Clostridium perfringens Mutants Deficient in Gliding Motility. Journal of Bacteriology. 195 (3), 629-636 (2013).
  45. Singer, J. T., Finnerty, W. R. Insertional specificity of transposon Tn5 in Acinetobacter sp. Journal of Bacteriology. 157 (2), 607-611 (1984).
  46. Subashchandrabose, S., et al. Acinetobacter baumannii Genes Required for Bacterial Survival during Bloodstream Infection. mSphere. 1 (1), 13-15 (2015).
  47. Shull, L. M., Camilli, A. Transposon Sequencing of Vibrio cholerae in the Infant Rabbit Model of Cholera. Vibrio Cholerae. 1839, 103-116 (2018).
  48. Smith, M. G., et al. New insights into Acinetobacter baumannii pathogenesis revealed by high-density pyrosequencing and transposon mutagenesis. Genes & Development. 21 (5), 601-614 (2007).
  49. Stahl, M., Stintzi, A. Identification of essential genes in C. jejuni genome highlights hyper-variable plasticity regions. Functional & Integrative Genomics. 11 (2), 241-257 (2011).
  50. Chaudhuri, R. R., et al. Comprehensive identification of essential Staphylococcus aureus genes using Transposon-Mediated Differential Hybridisation (TMDH). BMC Genomics. 10 (1), 291 (2009).
  51. Griffin, J. E., et al. High-resolution phenotypic profiling defines genes essential for mycobacterial growth and cholesterol catabolism. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002251 (2011).
  52. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. mBio. 2 (1), 00315 (2011).
  53. Khatiwara, A., et al. Genome scanning for conditionally essential genes in Salmonella enterica Serotype Typhimurium. Applied and Environmental Microbiology. 78 (9), 3098-3107 (2012).
  54. van Opijnen, T., Camilli, A. A fine scale phenotype-genotype virulence map of a bacterial pathogen. Genome Research. 22 (12), 2541-2551 (2012).
  55. Hurd, P. J., Nelson, C. J. Advantages of next-generation sequencing versus the microarray in epigenetic research. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (3), 174-183 (2009).
  56. Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing. RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).
  57. Perry, B. J., Yost, C. K. Construction of a mariner-based transposon vector for use in insertion sequence mutagenesis in selected members of the Rhizobiaceae. BMC Microbiology. 14 (1), 298 (2014).
  58. Plasterk, R. H. A., Izsvák, Z., Ivics, Z. Resident aliens: the Tc1/ mariner superfamily of transposable elements. Trends in Genetics. 15 (8), 326-332 (1999).
  59. Lazinski, D. W., Camilli, A. Homopolymer tail-mediated ligation PCR: a streamlined and highly efficient method for DNA cloning and library construction. BioTechniques. 54 (1), (2013).
  60. Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (38), 16422-16427 (2009).
  61. Langridge, G. C., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).
  62. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved Protocols for the Illumina Genome Analyzer Sequencing System. Current Protocols in Human Genetics. 62 (1), (2009).

Tags

Biologi Utgåva 161 transposon höggenomströmningssekvensering Gramnegativ Acinetobacter baumannii colistin ESKAPE
Generera Transposon Insertion bibliotek i gramnegativa bakterier för hög genomströmning Sekvensering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kazi, M. I., Schargel, R. D., Boll,… More

Kazi, M. I., Schargel, R. D., Boll, J. M. Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing. J. Vis. Exp. (161), e61612, doi:10.3791/61612 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter