Summary

Calciumbilleddannelse i frit opførende caenorhabditis elegans med velkontrolleret, ikke-lokaliseret vibration

Published: April 29, 2021
doi:

Summary

Rapporteret her er et system til calciumbilleddannelse i frit at opføre caenorhabditis elegans med velkontrolleret, ikke-lokaliseret vibration. Dette system gør det muligt for forskere at fremkalde ikke-lokaliserede vibrationer med velkontrollerede egenskaber ved nanoskala forskydning og kvantificere calciumstrømme under reaktioner fra C. elegans på vibrationerne.

Abstract

Ikke-lokaliserede mekaniske kræfter, såsom vibrationer og akustiske bølger, påvirker en lang række biologiske processer fra udvikling til homeostase. Dyr klare disse stimuli ved at ændre deres adfærd. Forståelse af de mekanismer, der ligger til grund for en sådan adfærdsændring, kræver kvantificering af neural aktivitet under adfærd af interesse. Her rapporterer vi en metode til calciumbilleddannelse i frit at opføre Caenorhabditis elegans med ikke-lokaliserede vibrationer af specifik frekvens, forskydning og varighed. Denne metode tillader produktion af velkontrollerede, ikke-lokaliserede vibrationer ved hjælp af en akustisk transducer og kvantificering af fremkaldte calciumresponser ved enkeltcelleopløsning. Som et bevis på princippet demonstreres calciumresponset fra en enkelt interneuron, AVA, under C. elegans flugtrespons på vibrationer. Dette system vil lette forståelsen af neurale mekanismer, der ligger til grund for adfærdsmæssige reaktioner på mekaniske stimuli.

Introduction

Dyr udsættes ofte for ikke-lokaliserede mekaniske stimuli såsom vibrationer eller akustiske bølger 1,2. Fordi disse stimuli påvirker homeostase, udvikling og reproduktion, skal dyr ændre deres adfærd for at klare dem 3,4,5. Imidlertid er de neurale kredsløb og mekanismer, der ligger til grund for en sådan adfærdsændring, dårligt forstået.

Mekanosensorisk adfærd i nematoden, Caenorhabditis elegans, er et simpelt adfærdsmæssigt paradigme, hvor orme normalt ændrer adfærd fra fremadgående bevægelse til et baglæns flugtrespons, når de støder på ikke-lokaliseret vibration6. Det neurale kredsløb, der ligger til grund for denne adfærd, består primært af fem sensoriske neuroner, fire par interneuroner og flere typer motorneuroner 7,8. Derudover er orme vant til sådanne mekaniske stimuli efter adskilt træning, der involverer gentagen stimulering 9,10,11. Derfor udgør denne enkle adfærdsmæssige reaktion et ideelt system til at undersøge neurale mekanismer, der ligger til grund for både ikke-lokaliseret vibrationsdrevet adfærd og hukommelse. En protokol for calciumbilleddannelse i frit opførende orme under påvirkning af ikke-lokaliserede vibrationer er illustreret. Sammenlignet med tidligere rapporterede systemer er dette system simpelt, fordi det ikke kræver et ekstra kamera til sporing; det giver os dog mulighed for at ændre frekvensen, forskydningen og varigheden af ikke-lokaliserede vibrationer. Fordi aktivering af AVA-interneuronerne inducerer det bagudrettede flugtrespons, blev orme, der samtidig udtrykker GCaMP, en calciumindikator, og TagRFP, et calcium-ufølsomt fluorescerende protein, under kontrol af en AVA-specifik promotor brugt som et eksempel (se Tabel over materialer for detaljer). Protokollen demonstrerer aktiveringen af AVA-neuroner, når en orm skifter fra fremadgående til baglæns bevægelse. Denne protokol letter forståelsen af den neurale kredsløbsmekanisme, der ligger til grund for mekanosensorisk adfærd.

Protocol

1. Dyrkning af orme indtil calciumbilleddannelse Fire dage før et calciumbilleddannelseseksperiment overføres to voksne ST12-orme til en ny nematodevækstmediumplade (Table of Materials), hvorpå Escherichia coli OP50 stribes i et firkantet mønster (ca. 4 mm x 4 mm) ved hjælp af en cellespreder, så ormen tilbringer det meste af tiden i bakterierne under calciumbilleddannelse12. Inkuber denne NGM-plade i 4 dage ved 20 °C i en inkubator (Ta…

Representative Results

Her bruges en orm, der udtrykker både GCaMP og TagRFP under kontrol af den AVA interneuron-specifikke promotor, som et eksempel på calciumbilleddannelse i frit at opføre C. elegans. GCaMP- og TagRFP-kanaldata blev opnået som en række billeder, hvoraf nogle er vist i figur 6 og som en film (supplerende film 1). Forskydningen af Petri-pladen induceret af vores ikke-lokaliserede vibrationssystem (figur 7) blev også kvantificeret. For…

Discussion

Generelt kræver kvantificering af neural aktivitet indførelse af en sonde og / eller begrænsninger på dyrs kropsbevægelse. For undersøgelser af mekanosensorisk adfærd udgør den invasive introduktion af en sonde og begrænsninger i sig selv mekaniske stimuli. C. elegans giver et system til at omgå disse problemer, fordi dets funktioner er gennemsigtige, og fordi det har et simpelt, kompakt neuralt kredsløb, der kun består af 302 neuroner. Ved at kombinere disse fordele med den tidligere udviklede metod…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Caenorhabditis Genetics Center for at levere de stammer, der anvendes i denne undersøgelse. Denne publikation blev støttet af JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant no. JP18H02483), om innovative områder “Science of Soft Robot” -projektet (Bevillingsnr. JP18H05474), PRIME fra Japan Agency for Medical Research and Development (bevillingsnummer 19gm6110022h001) og Shimadzu Foundation.

Materials

Data anaylsis software
DualViewImaging.nb author For analysis of acquired data
Mathematica12 Wolfram For running data anaysis software DualViewImaging
Escherichia coli and C. elegans strains
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center OP50 Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.
lite-1(ce314) strain Caenorhabditis Genetics Center KG1180 Light-insensitive mutant
lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter author ST12 lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays
Laser Doppler vibrometer
Lase Doppler vibrometer Polytec Japan IVS-500 For quantifying  frequency and displacement generated by the accoustic transducer
Mouse macro system
Assay.txt Author Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows
HiMacroEx Vector https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html Free download software for controling mouse cursor based on a script
Nematode growth media plate
Agar purified, powder Nakarai tesque 01162-15 For preparation of NGM plates
Bacto pepton Becton Dickinson 211677 For preparation of NGM plates
Calcium chloride Wako 036-00485 For preparation of NGM plates
Cholesterol Wako 034-03002 For preparation of NGM plates
di-Photassium hydrogenphosphate Nakarai tesque 28727-95 For preparation of NGM plates
LB broth, Lennox Nakarai tesque 20066-95 For culture of E. coli OP50
Magnesium sulfate anhydrous TGI M1890 For preparation of NGM plates
Potassium Dihydrogenphosphate Nakarai tesque 28720-65 For preparation of NGM plates
Sodium Chloride Nakarai tesque 31320-05 For preparation of NGM plates
Petri dishes (60 mm) Nunc 150270 For preparation of NGM plates
Nonlocalized vibration device
Amplifier LEPY LP-A7USB For stimulation with controllable vibration
Acoustic transducer MinebeaMitsumi LVC25 For stimulation with controllable vibration
WaveGene Ver. 1.5 Thrive http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html Free download software for controling vibration property
Noninvasive calcium imaging
2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller Thorlabs BBD202 Compatible controller for MLS203-1 stages
479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter Semrock FF01-479/585-25 For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)
505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter Semrock FF505/606-Di01-25×36 For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)
512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter Semrock FF01-512/25-25 For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)
630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter Semrock FF01-630/92-25 For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)
Computer Dell Precision T7600 Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM
High-speed x-y motorized stage Thorlabs MLS203-1 Fast XY scannning stage
Image splitting optics Hamamatsu photonics A12801-01 For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics
LED light source CoolLED pE-4000 For generating 470 nm and 560 nm excitation light
Microscope Olympus MVX10
sCMOS camera Andor Zyla
x 2 Objective lens Olympus MVPLAPO2XC Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5
Plasmid
pKDK66 plasmid author pKDK66 Co-injection marker
pTAK83 plasmid author pTAK83 Plasmid for expression of TagRFP under the control of  the flp-18 promoter
pTAK144 plasmid author pTAK144 Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of  the flp-18 promoter
Tracking software
homingback.vi author SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage
LabVIEW National instruments For running tracking software
Zyla Control ver.2.6CI.vi author For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage

References

  1. Hill, P. S. M., Wessel, A. Biotremology. Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).
  2. Fettiplace, R., Hackney, C. M. The sensory and motor roles of auditory hair cells. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).
  3. Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (4), 265-275 (2006).
  4. Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling force: physical and physiological principles enabling sensory mechanotransduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 347-371 (2015).
  5. Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Developmental Cell. 10 (1), 11-20 (2006).
  6. Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).
  7. Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
  8. Wicks, S. R., Rankin, C. H. The integration of antagonistic reflexes revealed by laser ablation of identified neurons determines habituation kinetics of the Caenorhabditis elegans tap withdrawal response. Journal of Comparative Physiology. A Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 179 (5), 675-685 (1996).
  9. Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
  10. Bozorgmehr, T., Ardiel, E. L., McEwan, A. H., Rankin, C. H. Mechanisms of plasticity in a Caenorhabditis elegans mechanosensory circuit. Frontiers in Physiology. 4, 88 (2013).
  11. Sugi, T., Ohtani, Y., Kumiya, Y., Igarashi, R., Shirakawa, M. High-throughput optical quantification of mechanosensory habituation reveals neurons encoding memory in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17236-17241 (2014).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  13. Sugi, T., Okumura, E., Kiso, K., Igarashi, R. Nanoscale mechanical stimulation method for quantifying C. elegans mechanosensory behavior and memory. Analytical Sciences: The International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (11), 1159-1164 (2016).
  14. Brownell, P. H. Compressional and surface waves in sand: used by desert scorpions to locate prey. Science. 197 (4302), 479-482 (1977).
  15. Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. T. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. Journal of Neuroscience. 27 (23), 6083-6090 (2007).
  16. Tsukada, Y., et al. Reconstruction of spatial thermal gradient encoded in thermosensory neuron AFD in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 36 (9), 2571-2581 (2016).
  17. Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147 (4), 922-933 (2011).
  18. Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 1074-1081 (2016).
  19. Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
  20. Prevedel, R., et al. Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature Methods. 11, 727-730 (2014).
  21. Nichols, A. L. A., Eichler, T., Latham, R., Zimmer, M. A global brain state underlies C. elegans sleep behavior. Science. 356 (6344), (2017).
  22. Zheng, M., Cao, P., Yang, J., Xu, X. Z. S., Feng, Z. Calcium imaging of multiple neurons in freely behaving C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 78-82 (2012).
  23. Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. C. elegans collectively forms dynamical networks. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).

Play Video

Cite This Article
Shigyou, K., Maeoka, H., Igarashi, R., Sugi, T. Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration. J. Vis. Exp. (170), e61626, doi:10.3791/61626 (2021).

View Video