准备和注射 Culex 蚊子的胚胎，使用CRISPR/Cas9产生空突变
Summary
CRISPR/Cas9越来越多地用于非模型生物体的基因功能特征。该协议描述了如何产生 Culex皮皮恩斯的淘汰线，从准备注射混合，获得和注射蚊子胚胎，以及如何后方，交叉和屏幕注射蚊子及其后代所需的突变。
Abstract
Culex 蚊子是多种疾病的主要传播媒介，这些疾病对人类和动物健康产生了负面影响，包括西尼罗河病毒和由犬心虫和象虫病等纤维线虫引起的疾病。最近，CRISPR/Cas9基因组编辑被用来诱导现场定向突变，通过注射一种Cas9蛋白，该蛋白质已经与导引RNA（gRNA）复合成几个昆虫物种的新鲜胚胎，包括属于 阿诺菲勒斯 家族和 伊蚊的蚊子。操纵和注射 Culex 蚊子稍微困难一些，因为这些蚊子将卵子直立在木筏上，而不是像其他种类的蚊子那样单独。在这里，我们描述如何设计gRNA，用Cas9蛋白复合它们，诱导 Culex皮皮恩斯 雌性蚊子产卵，以及如何准备和注射新铺设的胚胎与Cas9/gRNA进行微注射。我们还描述了如何饲养和筛选注射蚊子的所需突变。具有代表性的结果表明，该技术可用于诱导 Culex 蚊子基因组中的部位定向突变，并稍作修改，也可用于在其他蚊子物种中产生空突变体。
Introduction
Culex蚊子分布在世界各地的温带和热带地区，传播几种致命的病毒，包括西尼罗河病毒1，圣路易斯脑炎2，以及引起犬心虫3和象虫病4的线虫。库莱克斯皮皮恩斯综合体的成员，其中包括Cx.五角星，Cx.皮皮恩斯皮皮恩斯和Cx.皮皮恩斯摩尔斯，显示其生物学的许多方面惊人的变化。例如，虽然Cx.五角星和Cx.皮皮恩斯骚扰者不能进入过冬的休眠5，6，Cx.皮皮恩斯皮皮恩斯显示强大的季节性反应，并进入糖尿病，以回应短天7，8。此外，Cx.皮皮恩斯的骚扰往往更人为的，而Cx.皮皮恩斯和Cx.五角星更动物性6。然而，在美国和世界许多其他地方，这些物种杂交，这对疾病传播有很强的影响，因为Cx.pipiens皮皮恩斯和Cx.皮皮恩斯的杂交是机会型的喂食者，将咬鸟和人类9，从而成为西尼罗河病毒的桥梁载体。研究Culex蚊子生物学的这些和其他迷人的方面受到了阻碍，部分原因是Culex蚊子在实验室中饲养比伊蚊稍微困难一些，伊蚊产生静止和耐干燥的鸡蛋10，而且功能分子工具不如Culex物种开发得那么好。
CRISPR/Cas9基因组编辑是一项强大的技术，已用于评估几个重要的蚊子物种11，12，13的生物学，包括南方房子蚊子，Culex五角星14，15，16。这项技术由詹妮弗·杜德纳和埃马努埃尔·夏彭蒂埃开发，利用细菌衍生的CRISPR相关内核糖（Cas蛋白：见范德奥斯特等人的评论）对病毒进行天然细菌防御。当注射到动物胚胎中时，Cas9蛋白质与适当的引导RNA结合，可以在基因组内产生双链断裂。这是最常通过使用Cas9蛋白质，这是复杂的指南RNA，引导内分泌酶活性到基因组的特定区域。在Cas9蛋白创造了一个特定于部位的双链断裂后，细胞机械试图使用两种机制之一来修复断裂。第一种需要通过非同源端连接（NHEJ）将两端连结在一起，这种连接容易出错，并且经常在基因组中产生框架外插入和缺失，从而产生非功能性蛋白质，从而产生淘汰突变。或者，蜂窝机械可能使用同源定向修复 （HDR）， 通过查找类似的序列来正确修复中断。类似的序列可能由生物体内的第二条染色体提供（见审查18）。但是，如果修复的序列与原始序列完全匹配，Cas9 蛋白质将能够再次切割 DNA。或者，研究人员还可以包括一个供体质粒，该质粒包含目标序列切口两侧的同源序列，该序列通常带有荧光标记蛋白、原始基因的修改版本或其他可复制并插入基因组的修饰序列，或”敲击”。
注射胚胎时，时机至关重要，在使用CRISPR/Cas9基因组编辑在昆虫中产生突变时尤其如此。这是因为Cas9蛋白质和gRNA只有在胚胎处于同步状态、细胞膜形成之前以及胚胎内可获得多个细胞核时，才具有产生突变的最大能力。对于蚊子，核在卵泡后2-4小时到达外围，取决于温度19，因此必须在此时之前成功进行微喷射。此外，Cas9蛋白质将切断任何核DNA，它可以访问，这样，从注射产生的个体将包含细胞的马赛克，有些有所需的突变，而另一些没有。为了成功遗传这些突变，Cas9蛋白质必须切割存在于生殖系中的DNA，从而产生未来的卵子和精子。为了确保在生殖系中产生突变，最好将所有材料注射到靠近胚胎中极细胞位置的位置的地方，而胚胎是昆虫生殖系的祖细胞。极细胞位于 Culex 胚胎20的后端附近。除了注射胚胎外，还必须制定一个仔细的交叉和筛选后代的计划，以便检测所需的突变。
该协议描述了如何生成gRNA，并将其与Cas9蛋白复合，以准备注射混合物，以及如何诱导 Culex皮皮恩斯 雌性蚊子产卵，以及如何准备和注射这些卵子为CRISPR/Cas9介导的基因组编辑。此外，我们描述如何后方，交叉和屏幕注射胚胎及其后代，以确认所需的突变已经获得。使用这个协议，我们产生了一个感兴趣的基因， 周期，在 Culex皮皮恩斯的巴克耶菌株的空突变。这种菌株最初于2013年从俄亥俄州哥伦布市的野外采集蚊子中建立，由Meuti实验室维持。该协议可用于其他研究，要求CRISPR/Cas9基因组编辑在 Culex 蚊子，以及其他蚊子物种，更笼统地，是相关的使用CRISPR/Cas9基因组编辑到任何昆虫物种。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议提出了将特定突变引入 Culex 蚊子基因组的方法，也可用于编辑其他蚊子的基因组。该协议意义重大，因为它不仅提供了如何准备注射材料的具体细节，而且还提供了如何诱导蚊子产卵以及如何准备和注射这些卵子的详细视频概述。我们还总结了如何利用雌性 Cx.pipiens 的生物学在单独的木筏上产卵，从而筛选出每个雌性子的较小比例的后代，以寻找所需的突变。这里提出的方法…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢David O’Brochta博士和昆虫遗传技术协调研究网络的所有成员，感谢他们为我们和其他人提供的关于实施遗传技术的帮助和培训。我们特别感谢香娜·阿卢维哈雷优化了微操纵方案，允许 Culex 胚胎被注射和孵化。我们还要感谢在Meuti实验室工作的本科生德文特·西蒙斯和约瑟夫·乌尔索，感谢他们帮助照顾和筛查转基因蚊子，感谢ITF的佐拉·埃尔姆卡米协助饲养和准备蚊子注射。这项工作得到了奥苏传染病研究所向MEM提供的跨学科种子赠款的支持。
Materials
| Artificial Membrane Feeder | Hemotek | SP5W1-3 | Company location: Blackburn, UK |
| ATP | Invitrogen | 18330019 | Company location: Carlsbad, CA, USA |
| Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | World Precision Instruments | 1B100-6 | Company Location: Sarasota, FL, USA |
| BV10 Needle Beveler | Sutter Instruments | BV-10-B | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Whatman Circular filter paper (12.5 cm) | Sigma Aldrich | WHA1001125 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Conical tube (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Fisherbrand course filter paper with fast flow rate | Thermo Fisher Scientific | 09-800 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Cover glass (24 x 40 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-311-20 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Dental dam | Henry Schein Inc | 1010171 | Company Location: Melville, NY USA |
| Scotch double-sided tape | Thermo Fisher Scientific | NC0879005 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| FemtoJet 4i microinjector | Eppendorf | 5252000021 | Company Location: Hamburg, Germany |
| Glass vial (2 dram) | Thermo Fisher Scientific | 033401C | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Halocarbon oil | Sigma Aldrich | H8898-50ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| P-2000 Laser Needle Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Parafilm | Thermo Fisher Scientific | 50-998-944 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| PC-100 Weighted Needle Puller | Narishige | PC-100 | This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA |
| Phire Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F140WH | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Kodak Photo-Flo (1%) | Thermo Fisher Scientific | 50-268-05 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | Capillary Tube Supplies Limited | QGCT 1.0 | Company Location: Cornwall, UK |
| Guide-it™ sgRNA Screening Kit | Takara, Bio USA | 632639 | This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Small petri dishes (35X10 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-190-0273 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Sodium citrate chicken blood | Lampire biologicals | 7201406 | Company Location: Everett, PA, USA |
| Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875711A | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Tegaderm | Henry Schein Inc. | 7771180 | Company Location: Melville, NY USA |
| Tropical fish food | Tetramin | N/A | |
| Whatman filter paper | Thermo Fisher Scientific | 09-927-826 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Whatman filter paper, 4.25 cm | Sigma Aldrich | 1001-042 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
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