Préparation et injection d’embryons de moustiques Culex pour générer des mutations nulles à l’aide de CRISPR/Cas9
Summary
CRISPR/Cas9 est de plus en plus utilisé pour caractériser la fonction des gènes dans les organismes non modèles. Ce protocole décrit comment générer des lignées knock-out de Culex pipiens,de la préparation de mélanges d’injection à l’obtention et à l’injection d’embryons de moustiques, ainsi que la façon d’élever, de croiser et de dépister les moustiques injectés et leur progéniture pour les mutations souhaitées.
Abstract
Les moustiques Culex sont les principaux vecteurs de plusieurs maladies qui ont un impact négatif sur la santé humaine et animale, y compris le virus du Nil occidental et les maladies causées par des nématodes filaires tels que le ver du cœur canin et l’éléphantasis. Récemment, l’édition du génome CRISPR / Cas9 a été utilisée pour induire des mutations dirigées par le site en injectant une protéine Cas9 qui a été complexée avec un ARN guide (aRNg) dans des embryons fraîchement pondus de plusieurs espèces d’insectes, y compris des moustiques appartenant aux genres Anopheles et Aedes. Manipuler et injecter des moustiques Culex est légèrement plus difficile car ces moustiques pondent leurs œufs debout dans des radeaux plutôt que individuellement comme d’autres espèces de moustiques. Nous décrivons ici comment concevoir des ARNg, les complexer avec la protéine Cas9, induire des moustiques femelles de Culex pipiens à pondre des œufs, et comment préparer et injecter des embryons nouvellement pondus pour la microinjection avec Cas9 / ARNg. Nous décrivons également comment élever et dépister les moustiques injectés pour la mutation souhaitée. Les résultats représentatifs démontrent que cette technique peut être utilisée pour induire des mutations dirigées vers le site dans le génome des moustiques Culex et, avec de légères modifications, peut également être utilisée pour générer des mutants nuls chez d’autres espèces de moustiques.
Introduction
Les moustiques Culex sont répartis dans toutes les régions tempérées et tropicales du monde et transmettent plusieurs virus mortels dont le virus du Nil occidental1,l’encéphalite de Saint-Louis2 ainsi que les nématodes filaires qui causent le ver du cœur canin3 et l’éléphantiasis4. Les membres du complexe Culex pipiens, qui comprend Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens et Cx. pipiens molestus, présentent des variations frappantes dans de nombreux aspects de leur biologie. Par exemple, alors que Cx. quinquefasciatus et Cx. pipiens molestus sont incapables d’entrer dans une dormance hivernante5,6, Cx. pipiens pipiens affichent des réponses saisonnières robustes et entrent en diapause en réponse à des jours courts7,8. De plus, Cx. pipiens molestus a tendance à être plus anthropophile tandis que Cx. pipiens et Cx. quinquefasciatus sont plus zoophiles6. Cependant, aux États-Unis et dans de nombreux autres endroits du monde, ces espèces se croisent, ce qui a de fortes implications pour la transmission de maladies en tant qu’hybrides du Cx. pipiens pipiens et du Cx. pipiens molestus sont des mangeoires opportunistes et mordront à la fois les oiseaux et les humains9, servant ainsi de vecteurs de pont pour le virus du Nil occidental. L’étude de ces aspects et d’autres aspects fascinants de la biologie des moustiques Culex a été entravée, en partie parce que les moustiques Culex sont légèrement plus difficiles à élever en laboratoire que les moustiques Aedes, qui produisent des œufs quiescents et résistants à la dessiccation10 et parce que les outils moléculaires fonctionnels ne sont pas aussi bien développés pour les espèces Culex.
L’édition du génome CRISPR/ Cas9 est une technologie puissante qui a été utilisée pour évaluer la biologie de plusieurs espèces importantes de moustiques11,12,13, y compris le moustique domestique du Sud, Culex quinquefasciatus14,15,16. Cette technologie, développée par Jennifer Doudna et Emmanuelle Charpentier, exploite une défense bactérienne naturelle contre les virus par des endonucléases bactériennes associées à CRISPR (protéines Cas; voir revue par Van der Oost et al.17). Lorsqu’elles sont injectées dans des embryons animaux, les protéines Cas9 en combinaison avec un ARN guide approprié peuvent produire des cassures double brin dans le génome. Ceci est le plus souvent fait en utilisant la protéine Cas9 qui est complexée avec des ARN guides, qui dirige l’activité de l’endonucléase vers une région spécifique du génome. Une fois que la protéine Cas9 a créé une rupture double brin spécifique au site, la machinerie cellulaire tente de réparer la rupture en utilisant l’un des deux mécanismes. La première consiste à ligaturer les deux extrémités ensemble par jointure d’extrémité non homologue (NHEJ), qui est sujette aux erreurs et produit souvent des insertions et des délétions hors cadre dans le génome qui peuvent entraîner des protéines non fonctionnelles, générant ainsi une mutation knock-out. Alternativement, la machinerie cellulaire peut utiliser la réparation dirigée par homologie (HDR) en trouvant des séquences similaires pour réparer correctement la rupture. La séquence similaire peut être fournie par le deuxième chromosome dans l’organisme (voir revue18). Cependant, si la séquence réparée correspond exactement à la séquence originale, la protéine Cas9 sera capable de couper à nouveau l’ADN. Alternativement, les chercheurs peuvent également inclure un plasmide donneur qui contient des séquences homologues de chaque côté du site coupé de la séquence cible avec une séquence de réparation alternative – souvent une protéine marqueur fluorescente, une version modifiée du gène original ou une autre modification – qui peut être copiée et insérée dans le génome, ou « knocked-in ».
Le timing est essentiel lors de l’injection d’embryons, et c’est particulièrement le cas lors de l’utilisation de l’édition du génome CRISPR / Cas9 pour créer des mutations chez les insectes. En effet, la protéine Cas9 et les aRNg n’ont la plus grande capacité à générer des mutations que lorsque l’embryon est dans son état syncytial, avant que les membranes cellulaires ne se soient formées et lorsque plusieurs noyaux sont accessibles à l’intérieur de l’embryon. Pour les moustiques, les noyaux atteignent la périphérie ~ 2-4 heures après la ponte, en fonction de la température19, et donc une micro-injection réussie doit se produire avant cette heure. De plus, la protéine Cas9 coupera tout ADN nucléaire auquel elle peut accéder, de sorte que l’individu résultant de l’injection contiendra une mosaïque de cellules, certaines ayant la mutation souhaitée et d’autres non. Pour que ces mutations soient héritées avec succès, la protéine Cas9 doit couper l’ADN qui réside dans la lignée germinale qui donnera naissance aux futurs ovules et spermatozoïdes. Pour s’assurer que des mutations sont générées dans la lignée germinale, il est préférable d’injecter tous les matériaux proches de l’emplacement des cellules polaires dans l’embryon, qui sont les progéniteurs de la lignée germinale de l’insecte. Les cellules polaires sont situées près de l’extrémité postérieure des embryons de Culex 20. En plus d’injecter des embryons, il est impératif d’élaborer un plan minutieux pour le croisement et le dépistage de la progéniture afin de détecter la mutation souhaitée.
Ce protocole décrit comment générer des ARNg et les complexer avec la protéine Cas9 pour préparer des mélanges d’injection, ainsi que comment inciter les moustiques femelles de Culex pipiens à pondre des œufs et comment préparer et injecter ces œufs pour l’édition du génome médiée par CRISPR / Cas9. De plus, nous décrivons comment élever, croiser et dépister les embryons injectés et leur descendance pour confirmer que la mutation souhaitée a été obtenue. En utilisant ce protocole, nous avons généré des mutations nulles pour un gène d’intérêt, cycle,dans la souche Buckeye de Culex pipiens. Cette souche a été établie à l’origine en 2013 à partir de moustiques collectés sur le terrain à Columbus, Ohio et est maintenue par le laboratoire Meuti. Ce protocole peut être utilisé pour des études supplémentaires qui nécessitent l’édition du génome CRISPR / Cas9 chez les moustiques Culex, ainsi que d’autres espèces de moustiques, et, plus généralement, est pertinent pour l’utilisation de l’édition du génome CRISPR / Cas9 à toute espèce d’insecte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole présente des méthodes pour introduire des mutations spécifiques dans le génome des moustiques Culex et peut également être utilisé pour modifier le génome d’autres moustiques. Le protocole est important en ce qu’il fournit des détails spécifiques non seulement sur la façon de préparer les matériaux d’injection, mais aussi un aperçu vidéo détaillé de la façon d’inciter les moustiques à pondre des œufs, ainsi que sur la façon de préparer et d’injecter ces œufs. Nous r?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr David O’Brochta et tous les membres du Réseau de recherche sur la coordination des technologies génétiques des insectes pour l’aide et la formation qu’ils nous fournissent, ainsi qu’à d’autres, sur la mise en œuvre des technologies génétiques. Nous remercions tout particulièrement Channa Aluvihare d’avoir optimisé le protocole de micromanipulation pour permettre l’injection et l’éclosion d’embryons Culex. Nous remercions également Devante Simmons et Joseph Urso, étudiants de premier cycle travaillant au laboratoire Meuti, pour leur aide à soigner et à dépister les moustiques transgéniques, et Zora Elmkami de l’ITF pour leur aide à l’élevage et à la préparation des moustiques pour l’injection. Ce travail a été soutenu par une subvention interdisciplinaire sur les semences de l’Institut des maladies infectieuses de l’OSU fournie à MEM.
Materials
| Artificial Membrane Feeder | Hemotek | SP5W1-3 | Company location: Blackburn, UK |
| ATP | Invitrogen | 18330019 | Company location: Carlsbad, CA, USA |
| Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | World Precision Instruments | 1B100-6 | Company Location: Sarasota, FL, USA |
| BV10 Needle Beveler | Sutter Instruments | BV-10-B | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Whatman Circular filter paper (12.5 cm) | Sigma Aldrich | WHA1001125 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Conical tube (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Fisherbrand course filter paper with fast flow rate | Thermo Fisher Scientific | 09-800 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Cover glass (24 x 40 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-311-20 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Dental dam | Henry Schein Inc | 1010171 | Company Location: Melville, NY USA |
| Scotch double-sided tape | Thermo Fisher Scientific | NC0879005 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| FemtoJet 4i microinjector | Eppendorf | 5252000021 | Company Location: Hamburg, Germany |
| Glass vial (2 dram) | Thermo Fisher Scientific | 033401C | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Halocarbon oil | Sigma Aldrich | H8898-50ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| P-2000 Laser Needle Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Parafilm | Thermo Fisher Scientific | 50-998-944 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| PC-100 Weighted Needle Puller | Narishige | PC-100 | This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA |
| Phire Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F140WH | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Kodak Photo-Flo (1%) | Thermo Fisher Scientific | 50-268-05 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | Capillary Tube Supplies Limited | QGCT 1.0 | Company Location: Cornwall, UK |
| Guide-it™ sgRNA Screening Kit | Takara, Bio USA | 632639 | This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Small petri dishes (35X10 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-190-0273 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Sodium citrate chicken blood | Lampire biologicals | 7201406 | Company Location: Everett, PA, USA |
| Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875711A | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Tegaderm | Henry Schein Inc. | 7771180 | Company Location: Melville, NY USA |
| Tropical fish food | Tetramin | N/A | |
| Whatman filter paper | Thermo Fisher Scientific | 09-927-826 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Whatman filter paper, 4.25 cm | Sigma Aldrich | 1001-042 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
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