הכנה והזרקה של עוברים של יתושי קולקס כדי ליצור מוטציות Null באמצעות CRISPR /Cas9
Summary
CRISPR/Cas9 משמש יותר ויותר כדי לאפיין את תפקוד הגנים באורגניזמים שאינם מודל. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור שורות נוק-אאוט של Culex pipiens, מהכנת תערובות הזרקה, להשגה והזרקה של עוברים יתושים, כמו גם כיצד לגדל, לחצות, מסך מוזרק יתושים וצאצאיהם עבור מוטציות הרצויות.
Abstract
יתושי קולקס הם הווקטורים העיקריים של מספר מחלות המשפיעות לרעה על בריאות האדם ובעלי החיים, כולל וירוס הנילוס המערבי ומחלות הנגרמות על ידי נמטודות פילריות כגון תולעי לב של כלבים ופילהזיס. לאחרונה, עריכת הגנום CRISPR/Cas9 שימשה כדי לגרום למוטציות מכוונות אתר על ידי הזרקת חלבון Cas9 שהיה מורכב עם RNA מדריך (gRNA) לעוברים טריים של כמה מיני חרקים, כולל יתושים השייכים לג’נרה אנופלס ו- Aedes. מניפולציה והזרקת יתושי Culex הוא קצת יותר קשה כמו יתושים אלה להטיל את ביציהם זקוף רפסודות ולא בנפרד כמו מינים אחרים של יתושים. כאן אנו מתארים כיצד לעצב gRNAs, מורכבים אותם עם חלבון Cas9, לגרום יתושים נקבות של Culex pipiens להטיל ביצים, וכיצד להכין ולהזריק עוברים שהונחו לאחרונה עבור microinjection עם Cas9 / gRNA. אנו גם מתארים כיצד לגדל ולמסך יתושים מוזרקים למוטציה הרצויה. התוצאות הייצוגיות מראות כי טכניקה זו יכולה לשמש כדי לגרום מוטציות מכוונות אתר בגנום של יתושי Culex, עם שינויים קלים, ניתן להשתמש כדי ליצור מוטציות null גם במינים אחרים יתושים.
Introduction
יתושי קולקס מופצים ברחבי האזורים הממוזגים והטרופיים של העולם ומעבירים מספר וירוסים קטלניים כולל וירוס הנילוס המערבי1, דלקת המוח סנט לואיס2, כמו גם נמטודות פילריות הגורמות לתולעת לב כלבים3 ופיליאזיס4. חברי מתחם Culex pipiens, הכולל Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens ו- Cx. pipiens molestus, מראים וריאציות בולטות בהיבטים רבים של הביולוגיה שלהם. לדוגמה, בעוד Cx. quinquefasciatus ו Cx. pipiens molestus אינם מסוגלים להיכנס לתרדמת overwintering5,6, Cx. pipiens pipiens להציג תגובות עונתיות חזקות ולהיכנס diapause בתגובה לימים קצרים7,8. בנוסף, Cx. pipiens molestus נוטים להיות אנתרופופיליים יותר בעוד Cx. pipiens ו Cx. quinquefasciatus הם יותר זופילי6. עם זאת, בארצות הברית ובמקומות רבים אחרים בעולם, מינים אלה שזורים זה בזה, אשר יש השלכות חזקות על העברת מחלות כמו כלאיים של Cx. pipiens pipiens ו Cx. פיפיינס molestus הם מזינים אופורטוניסטיים והם לנשוך הן ציפורים ובני אדם9, ובכך לשמש וקטורים גשר עבור וירוס הנילוס המערבי. לימוד היבטים מרתקים אלה ואחרים של הביולוגיה של יתושי קולקס הופרע, בין היתר, משום יתושי קולקס מעט יותר קשה לגדל במעבדה מאשר יתושי Aedes, המייצרים ביצים עמידות בפניייבוש וייבוש 10 ומכיוון שכלים מולקולריים פונקציונליים אינם מפותחים באותה מידה עבור מינים קולקס.
עריכת הגנום CRISPR/Cas9 היא טכנולוגיה רבת עוצמה ששימשה להערכת הביולוגיה של מספר מיני יתושים חשובים11,12,13, כולל יתוש הבית הדרומי, קולקס קווינקפסיאטוס14,15,16. טכנולוגיה זו, שפותחה על ידי ג’ניפר דודנה ועמנואל שרפנטייה, מנצלת הגנה חיידקית טבעית מפני וירוסים על ידי אנדונקולאזים הקשורים ל- CRISPR (חלבוני Cas; ראו סקירה של ואן דר אוסט ואח ‘17). כאשר מוזרקים לעוברים מן החי, חלבוני Cas9 בשילוב עם RNA מדריך מתאים יכולים לייצר הפסקות כפולות בתוך הגנום. זה נעשה לעתים קרובות ביותר באמצעות חלבון Cas9 המורכב עם RNAs מדריך, אשר מכוון פעילות אנדונוקלאז לאזור מסוים של הגנום. לאחר שחלבון Cas9 יצר הפסקה כפולה ספציפית לאתר, המכונות התאיות מנסות לתקן את ההפסקה באמצעות אחד משני מנגנונים. הראשון כרוך קשירת שני הקצוות יחד באמצעות הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ), אשר נוטה לשגיאה ולעתים קרובות מייצר כניסות ומחיקות מחוץ למסגרת בגנום שיכול לגרום חלבונים לא פונקציונליים, ובכך ליצור מוטציה נוק-אאוט. לחלופין, המכונות הסלולריות עשויות להשתמש בתיקון מונחה ההומולוגיה (HDR) על-ידי מציאת רצפים דומים כדי לתקן נכון את ההפסקה. רצף דומה עשוי להיות מסופק על ידי הכרומוזום השני בתוך האורגניזם (ראה סקירה18). עם זאת, אם הרצף המתוקן מתאים בדיוק לרצף המקורי, חלבון Cas9 יוכל שוב לחתוך את הדנ”א. לחלופין, החוקרים יכולים לכלול גם פלסמיד תורם המכיל רצפים הומולוגיים משני צדי אתר החיתוך של רצף היעד עם רצף תיקונים חלופי – לעתים קרובות חלבון סמן פלואורסצנטי, גרסה שונה של הגן המקורי או שינוי אחר – שניתן להעתיק ולהכניס לגנום, או “דפק פנימה”.
תזמון הוא קריטי בעת הזרקת עוברים, וזה במיוחד המקרה בעת שימוש עריכת הגנום CRISPR /Cas9 כדי ליצור מוטציות בחרקים. הסיבה לכך היא שלחלבון Cas9 ול-gRNAs יש את היכולת הגדולה ביותר ליצור מוטציות רק כאשר העובר נמצא במצבו הסינכיציאלי, לפני שנוצרים ממברנות תאיות וכאשר גרעינים מרובים נגישים בתוך העובר. עבור יתושים, גרעינים להגיע לפריפריה ~ 2-4 שעות לאחר oviposition, בהתאם לטמפרטורה19, ולכן microinjection מוצלח חייב להתרחש לפני הפעם. בנוסף, חלבון Cas9 יחתוך כל DNA גרעיני שהוא יכול לגשת אליו, כך הפרט הנובע ההזרקה יכיל פסיפס של תאים, חלקם בעלי המוטציה הרצויה, ואחרים לא. על מנת שהמוטציות הללו יירשו בהצלחה, חלבון Cas9 חייב לחתוך DNA השוכנים בקו הנבט שיוליד את הביצים והזרע העתידיים. כדי להבטיח כי מוטציות נוצרות בחיידק עדיף להזריק את כל החומרים קרוב למיקום של תאי הקוטב בתוך העובר, שהם אבותיו של חיידק החרקים. תאי הקוטב ממוקמים ליד הקצה האחורי של עוברים Culex 20. בנוסף להזרקת עוברים, חובה לפתח תוכנית זהירה לחצייה וסינון צאצאים על מנת לזהות את המוטציה הרצויה.
פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור gRNAs ולרכב אותם עם חלבון Cas9 להכנת תערובות הזרקה, כמו גם כיצד לגרום יתושים נקבות של פיפיינס Culex להטיל ביצים וכיצד להכין ולהזריק ביצים אלה לעריכת גנום CRISPR / Cas9 בתיווך. בנוסף, אנו מתארים כיצד לגדל, לחצות ולמסך מוזרקים עוברים וצאצאיהם כדי לאשר כי המוטציה הרצויה הושגה. באמצעות פרוטוקול זה, יצרנו מוטציות Null עבור גן של עניין, מחזור, בזן Buckeye של Culex pipiens. זן זה הוקם במקור בשנת 2013 מיתושים שנאספו בשטח בקולומבוס, אוהיו ומתוחזק על ידי מעבדת Meuti. פרוטוקול זה יכול לשמש למחקרים נוספים הדורשים עריכת גנום CRISPR/Cas9 יתושי קולקס, כמו גם מינים אחרים של יתושים, ובאופן כללי יותר, רלוונטי לשימוש בעריכת הגנום CRISPR/Cas9 לכל מיני חרקים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מציג שיטות להכניס מוטציות ספציפיות לגנום של יתושי קולקס וניתן להשתמש בו לעריכת הגנום של יתושים אחרים גם כן. הפרוטוקול הוא משמעותי בכך שהוא מספק פרטים ספציפיים לא רק כיצד להכין את חומרי ההזרקה, אלא גם סקירת וידאו מפורטת של איך לגרום יתושים להטיל ביצים, כמו גם איך להכין ולהז?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר דוד או’ברוכטה ולכל חברי רשת המחקר לתיאום טכנולוגיות גנטיות של חרקים על העזרה וההכשרה שהם מספקים לנו ולאחרים על הטמעת טכנולוגיות גנטיות. אנו מודים במיוחד לחנה אלוביהאר על אופטימיזציה של פרוטוקול המיקרו-מניב כדי לאפשר להזריק ולבקע עוברי קולקס. אנו מודים גם לדבנטה סימונס ויוסף אורסו, סטודנטים לתואר ראשון העובדים במעבדת מיוטי, על הסיוע בטיפול ובהקרנת יתושים מהונדסים, וזורה אלמקמי מקרן ה-IT על סיוע בגידול והכנת יתושים להזרקה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק זרעים בין תחומיים מהמכון למחלות זיהומיות ב- OSU שסופק ל- MEM.
Materials
| Artificial Membrane Feeder | Hemotek | SP5W1-3 | Company location: Blackburn, UK |
| ATP | Invitrogen | 18330019 | Company location: Carlsbad, CA, USA |
| Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | World Precision Instruments | 1B100-6 | Company Location: Sarasota, FL, USA |
| BV10 Needle Beveler | Sutter Instruments | BV-10-B | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Whatman Circular filter paper (12.5 cm) | Sigma Aldrich | WHA1001125 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Conical tube (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Fisherbrand course filter paper with fast flow rate | Thermo Fisher Scientific | 09-800 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Cover glass (24 x 40 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-311-20 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Dental dam | Henry Schein Inc | 1010171 | Company Location: Melville, NY USA |
| Scotch double-sided tape | Thermo Fisher Scientific | NC0879005 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| FemtoJet 4i microinjector | Eppendorf | 5252000021 | Company Location: Hamburg, Germany |
| Glass vial (2 dram) | Thermo Fisher Scientific | 033401C | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Halocarbon oil | Sigma Aldrich | H8898-50ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| P-2000 Laser Needle Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Parafilm | Thermo Fisher Scientific | 50-998-944 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| PC-100 Weighted Needle Puller | Narishige | PC-100 | This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA |
| Phire Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F140WH | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Kodak Photo-Flo (1%) | Thermo Fisher Scientific | 50-268-05 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | Capillary Tube Supplies Limited | QGCT 1.0 | Company Location: Cornwall, UK |
| Guide-it™ sgRNA Screening Kit | Takara, Bio USA | 632639 | This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Small petri dishes (35X10 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-190-0273 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Sodium citrate chicken blood | Lampire biologicals | 7201406 | Company Location: Everett, PA, USA |
| Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875711A | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Tegaderm | Henry Schein Inc. | 7771180 | Company Location: Melville, NY USA |
| Tropical fish food | Tetramin | N/A | |
| Whatman filter paper | Thermo Fisher Scientific | 09-927-826 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Whatman filter paper, 4.25 cm | Sigma Aldrich | 1001-042 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
References
- Hamer, G. L., et al. Culex pipiens (Diptera: Culicidae): a bridge vector of West Nile virus to humans. Journal of Medical Entomology. 45 (1), 125-128 (2008).
- Bailey, C. L., et al. Isolation of St. Louis encephalitis virus from overwintering Culex pipiens mosquitoes. Science. 199 (4335), 1346-1349 (1978).
- Sabry, M. A new realistic index of experimental transmission efficiency for Bancroftian filariasis. The Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (4), 283-290 (1991).
- Cancrini, G., et al. Aedes albopictus and Culex pipiens implicated as natural vectors of Dirofilaria repens in central Italy. Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1064-1066 (2007).
- Wilton, D. P., Smith, G. C. Ovarian diapause in three geographic strains of Culex pipiens (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 22 (5), 524-528 (1985).
- Mattingly, P. F. The Culex pipiens complex. Transactions of the Royal Entomological Society of London. 102 (7), 331-342 (1951).
- Eldridge, B. F. The effect of temperature and photoperiod on blood-feeding and ovarian development in mosquitoes of the Culex pipiens complex. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 17 (1), 133-140 (1968).
- Spielman, A., Wong, J. Environmental control of ovarian diapause in Culex pipiens. Annals of the Entomological Society of America. 66 (4), 905-907 (1973).
- Fritz, M. L., Walker, E. D., Miller, J. R., Severson, D. W., Dworkin, I. Divergent host preferences of above-and below-ground Culex pipiens mosquitoes and their hybrid offspring. Medical and Veterinary Entomology. 29 (2), 115-123 (2015).
- Meola, R. The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti. Annals of the Entomological Society of America. 57 (4), 468-472 (1964).
- Dong, S., Lin, J., Held, N. L., Clem, R. J., Passarelli, A. L., Franz, A. W. Heritable CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. PloS one. 10 (3), (2015).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Liu, T., et al. Construction of an efficient genomic editing system with CRISPR/Cas9 in the vector mosquito Aedes albopictus. Insect Science. 26 (6), 1045-1054 (2019).
- Itokawa, K., Komagata, O., Kasai, S., Ogawa, K., Tomita, T. Testing the causality between CYP9M10 and pyrethroid resistance using the TALEN and CRISPR/Cas9 technologies. Scientific Reports. 6, 24652 (2016).
- Li, M., Li, T., Liu, N., Raban, R. R., Wang, X., Akbari, O. S. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29, 214-220 (2019).
- Anderson, M. E., et al. CRISPR/Cas9 gene editing in the West Nile Virus vector, Culex quinquefasciatus Say. PloS one. 14 (11), (2019).
- Van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends in Biochemical Sciences. 34 (8), 401-407 (2009).
- Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
- Monnerat, A. T., et al. Anopheles albitarsis embryogenesis: morphological identification of major events. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 97 (4), 589-596 (2002).
- Davis, C. W. C. A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilia sericata Meigen (Diptera: Calliphoridae). Australian Journal of Zoology. 15 (3), 547-579 (1967).
- Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (29), 2967-2976 (2014).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Gokcezade, J., Sienski, G., Duchek, P. Efficient CRISPR/Cas9 plasmids for rapid and versatile genome editing in Drosophila. G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (11), 2279-2282 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient in vivo genome editing using RNA-guided nucleases. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (13), 4038-4043 (2015).
- Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
