CRISPR/Cas9 Kullanarak Boş Mutasyonlar Oluşturmak için Culex Sivrisineklerinin Embriyolarının Hazırlanması ve EnjekteSi
Summary
CRISPR/Cas9, model olmayan organizmalarda gen fonksiyonunu karakterize etmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu protokol, enjeksiyon karışımlarının hazırlanmasından sivrisinek embriyolarının elde ve enjektesine kadar Culex pipiens’innakavt hatlarının nasıl oluşturulacağını ve enjekte edilen sivrisineklerin ve bunların istenen mutasyonlar için soylarının nasıl arka, çapraz ve taramadan geçeceğini açıklar.
Abstract
Culex sivrisinekleri, Batı Nil virüsü ve köpek kalp kurdu ve elephantasis gibi filarial nematodların neden olduğu hastalıklar da dahil olmak üzere insan ve hayvan sağlığını olumsuz etkileyen çeşitli hastalıkların başlıca vektörleridir. Son zamanlarda, CRISPR / Cas9 genom düzenleme, bir rehber RNA (gRNA) ile karmaşık hale gelen bir Cas9 proteinini, Anopheles ve Aedes cinslerine ait sivrisinekler de dahil olmak üzere çeşitli böcek türlerinin taze döşenmiş embriyolarına enjekte ederek bölgeye yönelik mutasyonları teşvik etmek için kullanılmıştır. Culex sivrisineklerini manipüle etmek ve enjekte etmek biraz daha zordur, çünkü bu sivrisinekler yumurtalarını diğer sivrisinek türleri gibi ayrı ayrı değil, sallara dik bir şekilde bırakırlar. Burada gRNA’ların nasıl tasarlanacağı, Cas9 proteini ile nasıl karmaşıklaşacağı, Culex pipiens’in dişi sivrisineklerinin yumurta bırakmaya nasıl teşvik edeceği ve cas9/gRNA ile mikroenjeksiyon için yeni döşenen embriyoların nasıl hazırlanacağı ve enjekte edeceği anlatılacağı açıklanmaktadır. Ayrıca, istenen mutasyon için enjekte edilen sivrisineklerin nasıl arka ve taramadan geçirildiği de açıklanmaktadır. Temsili sonuçlar, bu tekniğin Culex sivrisineklerinin genomunda bölgeye yönelik mutasyonları teşvik etmek için kullanılabileceğini ve hafif değişikliklerle diğer sivrisinek türlerinde de boş mutantlar oluşturmak için kullanılabileceğini göstermektedir.
Introduction
Culex sivrisinekleri dünyanın ılıman ve tropikal bölgelerine dağılmıştır ve Batı Nil virüsü1, St. Louis ensefaliti2 ve köpek kalp kurdu3 ve elephantiasis4’eneden olan filarial nematodlar da dahil olmak üzere birkaç ölümcül virüs iletir. Cx. quinquefasciatus , Cx. pipiens pipiensve Cx. pipiens molestus içeren Culex pipienskompleksinin üyeleri, biyolojilerinin birçok alanında çarpıcı varyasyonlar göstermektedir. Örneğin, Cx. quinquefasciatus ve Cx. pipiens molestus kışlayan bir dormancy 5,6, Cx. pipiens pipiens girmek için yetersiz iken sağlam mevsimsel tepkiler gösterir ve kısa günlere yanıt olarak diapause girer7,8. Ek olarak, Cx. pipiens molestus daha antropofilik olma eğilimindedir, Cx. pipiens ve Cx. quinquefasciatus ise daha zoofilik6. Bununla birlikte, Amerika Birleşik Devletleri’nde ve dünyadaki diğer birçok yerde, Cx. pipiens pipiens ve Cx. pipiens molestus’un melezleri fırsatçı besleyiciler olduğu ve hem kuşları hem de insanları ısıracağı için hastalık bulaşmasında güçlü etkileri olan bu türler iç içe geçmiştir9, böylece Batı Nil virüsü için köprü vektörleri olarak hizmet eder. Culex sivrisineklerinin biyolojisinin bu ve diğer büyüleyici yönlerini incelemek kısmen engellenmiştir, çünkü Culex sivrisineklerinin laboratuvarda geri yetiştirilmeleri, sessiz ve kuruluğa dayanıklı yumurta10 üreten Aedes sivrisineklerinden biraz daha zordur ve fonksiyonel moleküler araçlar Culex türleri için iyi gelişmemiştir.
CRISPR / Cas9 genom düzenleme, Güney evi sivrisinek, Culex quinquefasciatus14,15,16dahil olmak üzere birkaç önemli sivrisinek türünün biyolojisini değerlendirmek için kullanılan güçlü bir teknolojidir. Jennifer Doudna ve Emmanuelle Charpentier tarafından geliştirilen bu teknoloji, bakteriyel olarak türetilmiş, CRISPR ile ilişkili endonülonikleazlar tarafından virüslere karşı doğal bir bakteriyel savunmadan yararlanır (Cas proteinleri; Van der Oost ve ark.17tarafından incelenmiştir). Hayvan embriyolarına enjekte edildiğinde, Cas9 proteinleri uygun bir kılavuz RNA ile birlikte genom içinde çift iplikli kırılmalar üretebilir. Bu en sık, endononekleaz aktivitesini genomun belirli bir bölgesine yönlendiren kılavuz RNA’larla karmaşık cas9 proteini kullanılarak yapılır. Cas9 proteini bölgeye özgü çift iplikli bir kırılma yarattıktan sonra, hücresel makine iki mekanizmadan birini kullanarak kırılmayı onarmaya çalışır. birincisi, iki ucun homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) yoluyla birbirine bağlanmasını gerektirir, bu da hataya eğilimlidir ve genomda genellikle işlev dışı proteinlerle sonuçlanabilen çerçeve dışı eklemeler ve silmeler üretir, böylece bir nakavt mutasyonu oluşturur. Alternatif olarak, hücresel makineler, molayı doğru bir şekilde onarmak için benzer diziler bularak homolojiye yönelik onarım (HDR) kullanabilir. Benzer dizi organizma içindeki ikinci kromozom tarafından sağlanabilir (bkz. gözden geçirme18). Bununla birlikte, onarılmış dizi orijinal diziyle tam olarak eşleşirse, Cas9 proteini DNA’yı tekrar kesebilecektir. Alternatif olarak, araştırmacılar, hedef dizinin kesim bölgesinin her iki tarafında homolog diziler içeren bir donör plazmidi de içerebilir ve alternatif bir onarım dizisi (genellikle floresan bir işaret proteini, orijinal genin değiştirilmiş versiyonu veya başka bir değişiklik) kopyalanıp genoma eklenebilir veya “girilebilen”.
Embriyo enjekte ederken zamanlama kritiktir ve bu özellikle böceklerde mutasyon oluşturmak için CRISPR / Cas9 genom düzenlemesini kullanırken durumdur. Bunun nedeni, Cas9 proteini ve gRNA’ların sadece embriyo senksiyal durumundayken, hücresel zarlar oluşmadan önce ve embriyo içinde birden fazla çekirdeğe erişilmeden önce mutasyon üretme kapasitesine sahip olmasıdır. Sivrisinekler için, çekirdekler, sıcaklık 19’a bağlı olarak yumurtlamadan yaklaşık2-4saat sonra çevreye ulaşır ve bu nedenle bu süreden önce başarılı mikroenjeksiyon gerçekleşmelidir. Ek olarak, Cas9 proteini erişebileceği herhangi bir nükleer DNA’yı kesecektir, böylece enjeksiyondan kaynaklanan birey, bazıları istenen mutasyona sahip, diğerleri ise olmayan bir hücre mozaiği içerecektir. Bu mutasyonların başarıyla kalıtsal olabilmesi için Cas9 proteininin mikrop hattında bulunan ve gelecekteki yumurta ve sperme yol açacak DNA’yı kesmesi gerekir. Mutasyonların mikrop hattında üretilmesini sağlamak için, böcek germline’ın ataları olan embriyo içindeki kutup hücrelerinin bulunduğu yere yakın tüm malzemeleri enjekte etmek en iyisidir. Kutup hücreleri Culex embriyolarının arka ucuna yakın bulunur20. Embriyo enjekte etmenin yanı sıra, istenen mutasyonu tespit etmek için yavruları geçmek ve taramak için dikkatli bir plan geliştirmek zorunludur.
Bu protokol, enjeksiyon karışımlarını hazırlamak için gRNA’ların nasıl üretilip Cas9 proteini ile nasıl karmaşıklaştırılacağını, ayrıca Culex pipiens’in dişi sivrisineklerinin yumurta bırakmaya nasıl teşviklanacağını ve crispr/ Cas9 aracılı genom düzenlemesi için bu yumurtaların nasıl hazırlanacağını ve enjektelanacağını açıklar. Ek olarak, istenen mutasyonun elde edildiğini doğrulamak için enjekte edilen embriyoların ve soylarının nasıl arka, çapraz ve taramadan geçeceğini açıklıyoruz. Bu protokolü kullanarak, bir ilgi geni için boş mutasyonlar ürettik, döngü, Culex pipiensBuckeye suşunda . Bu suş ilk olarak 2013 yılında Columbus, Ohio’da tarlada toplanan sivrisineklerden kuruldu ve Meuti laboratuvarı tarafından korunuyor. Bu protokol, Culex sivrisineklerinin yanı sıra diğer sivrisinek türlerinde CRISPR / Cas9 genom düzenlemesini gerektiren ek çalışmalar için kullanılabilir ve daha genel olarak, crispr / cas9 genom düzenlemesini herhangi bir böcek türüne sağlamakla ilgilidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, Culex sivrisineklerinin genomuna belirli mutasyonları sokmak için yöntemler sunar ve diğer sivrisineklerin genomlarını düzenlemek için de kullanılabilir. Protokol, sadece enjeksiyon malzemelerinin nasıl hazırlanacağına dair özel ayrıntılar değil, aynı zamanda sivrisineklerin yumurta bırakmaya nasıl teşviklanacağı ve bu yumurtaların nasıl hazırlanacağı ve enjektelanacağı hakkında ayrıntılı bir video özeti sağlaması açısından önemlidir. Ayrıca, dişi Cx. p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. David O’Brochta’ya ve Böcek Genetik Teknolojileri Koordinasyon Araştırma Ağı’nın tüm üyelerine genetik teknolojilerin uygulanması konusunda bize ve diğerlerine sağladıkları yardım ve eğitim için teşekkür ederiz. Özellikle Channa Aluvihare’ye Culex embriyolarının enjekte edilmesine ve yumurtadan çıkmasına izin vermek için mikro yönetim protokolünü optimize ettiği için teşekkür ediyoruz. Ayrıca, Meuti laboratuvarında çalışan lisans öğrencileri Devante Simmons ve Joseph Urso’ya transgenik sivrisineklerin bakım ve taramalarına yardımcı olmaları için ve ITF’den Zora Elmkami’ye sivrisineklerin enjeksiyon için yetiştirilmelerine ve hazırlanmasına yardımcı olmaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, MEM’e sağlanan OSU’daki Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü’nden disiplinler arası tohumlar hibesi ile desteklendi.
Materials
| Artificial Membrane Feeder | Hemotek | SP5W1-3 | Company location: Blackburn, UK |
| ATP | Invitrogen | 18330019 | Company location: Carlsbad, CA, USA |
| Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | World Precision Instruments | 1B100-6 | Company Location: Sarasota, FL, USA |
| BV10 Needle Beveler | Sutter Instruments | BV-10-B | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Whatman Circular filter paper (12.5 cm) | Sigma Aldrich | WHA1001125 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Conical tube (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Fisherbrand course filter paper with fast flow rate | Thermo Fisher Scientific | 09-800 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Cover glass (24 x 40 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-311-20 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Dental dam | Henry Schein Inc | 1010171 | Company Location: Melville, NY USA |
| Scotch double-sided tape | Thermo Fisher Scientific | NC0879005 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| FemtoJet 4i microinjector | Eppendorf | 5252000021 | Company Location: Hamburg, Germany |
| Glass vial (2 dram) | Thermo Fisher Scientific | 033401C | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Halocarbon oil | Sigma Aldrich | H8898-50ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| P-2000 Laser Needle Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Parafilm | Thermo Fisher Scientific | 50-998-944 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| PC-100 Weighted Needle Puller | Narishige | PC-100 | This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA |
| Phire Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F140WH | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Kodak Photo-Flo (1%) | Thermo Fisher Scientific | 50-268-05 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | Capillary Tube Supplies Limited | QGCT 1.0 | Company Location: Cornwall, UK |
| Guide-it™ sgRNA Screening Kit | Takara, Bio USA | 632639 | This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Small petri dishes (35X10 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-190-0273 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Sodium citrate chicken blood | Lampire biologicals | 7201406 | Company Location: Everett, PA, USA |
| Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875711A | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Tegaderm | Henry Schein Inc. | 7771180 | Company Location: Melville, NY USA |
| Tropical fish food | Tetramin | N/A | |
| Whatman filter paper | Thermo Fisher Scientific | 09-927-826 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Whatman filter paper, 4.25 cm | Sigma Aldrich | 1001-042 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
References
- Hamer, G. L., et al. Culex pipiens (Diptera: Culicidae): a bridge vector of West Nile virus to humans. Journal of Medical Entomology. 45 (1), 125-128 (2008).
- Bailey, C. L., et al. Isolation of St. Louis encephalitis virus from overwintering Culex pipiens mosquitoes. Science. 199 (4335), 1346-1349 (1978).
- Sabry, M. A new realistic index of experimental transmission efficiency for Bancroftian filariasis. The Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (4), 283-290 (1991).
- Cancrini, G., et al. Aedes albopictus and Culex pipiens implicated as natural vectors of Dirofilaria repens in central Italy. Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1064-1066 (2007).
- Wilton, D. P., Smith, G. C. Ovarian diapause in three geographic strains of Culex pipiens (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 22 (5), 524-528 (1985).
- Mattingly, P. F. The Culex pipiens complex. Transactions of the Royal Entomological Society of London. 102 (7), 331-342 (1951).
- Eldridge, B. F. The effect of temperature and photoperiod on blood-feeding and ovarian development in mosquitoes of the Culex pipiens complex. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 17 (1), 133-140 (1968).
- Spielman, A., Wong, J. Environmental control of ovarian diapause in Culex pipiens. Annals of the Entomological Society of America. 66 (4), 905-907 (1973).
- Fritz, M. L., Walker, E. D., Miller, J. R., Severson, D. W., Dworkin, I. Divergent host preferences of above-and below-ground Culex pipiens mosquitoes and their hybrid offspring. Medical and Veterinary Entomology. 29 (2), 115-123 (2015).
- Meola, R. The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti. Annals of the Entomological Society of America. 57 (4), 468-472 (1964).
- Dong, S., Lin, J., Held, N. L., Clem, R. J., Passarelli, A. L., Franz, A. W. Heritable CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. PloS one. 10 (3), (2015).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Liu, T., et al. Construction of an efficient genomic editing system with CRISPR/Cas9 in the vector mosquito Aedes albopictus. Insect Science. 26 (6), 1045-1054 (2019).
- Itokawa, K., Komagata, O., Kasai, S., Ogawa, K., Tomita, T. Testing the causality between CYP9M10 and pyrethroid resistance using the TALEN and CRISPR/Cas9 technologies. Scientific Reports. 6, 24652 (2016).
- Li, M., Li, T., Liu, N., Raban, R. R., Wang, X., Akbari, O. S. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29, 214-220 (2019).
- Anderson, M. E., et al. CRISPR/Cas9 gene editing in the West Nile Virus vector, Culex quinquefasciatus Say. PloS one. 14 (11), (2019).
- Van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends in Biochemical Sciences. 34 (8), 401-407 (2009).
- Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
- Monnerat, A. T., et al. Anopheles albitarsis embryogenesis: morphological identification of major events. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 97 (4), 589-596 (2002).
- Davis, C. W. C. A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilia sericata Meigen (Diptera: Calliphoridae). Australian Journal of Zoology. 15 (3), 547-579 (1967).
- Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (29), 2967-2976 (2014).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Gokcezade, J., Sienski, G., Duchek, P. Efficient CRISPR/Cas9 plasmids for rapid and versatile genome editing in Drosophila. G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (11), 2279-2282 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient in vivo genome editing using RNA-guided nucleases. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (13), 4038-4043 (2015).
- Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
