Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

गोल्गी-निवासी प्रकार III झिल्ली प्रोटीन द्वारा विभाजित Luciferase पूरक परख का उपयोग कर द्वारा गठित हेटरोलॉगस परिसरों का प्रदर्शन

Published: September 10, 2020 doi: 10.3791/61669
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory of Biochemistry, Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw

Summary

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उद्देश्य गोल्गी-निवासी प्रकार III झिल्ली प्रोटीन के बीच हेटरोलॉगस इंटरैक्शन की घटना को प्रदर्शित करना है, जिसमें साइटोप्लाज्मिक रूप से उजागर एन- और / या सी-टर्मिनी लाइव स्तनधारी कोशिकाओं में विभाजित लूसिफेरस पूरकता परख के सबसे हालिया संस्करण का उपयोग किया जाता है।

Abstract

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य न्यूक्लियोटाइड चीनी ट्रांसपोर्टरों (एनएसटी) द्वारा गठित हेटरोलॉगस कॉम्प्लेक्स का प्रदर्शन करने के लिए स्प्लिट लूसिफेरस पूरकता के सबसे हालिया संस्करण की प्रयोज्यता का पता लगाना है। ये ईआर- और गोल्गी-निवासी मल्टीट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन साइटोप्लाज्मिक रूप से संश्लेषित न्यूक्लियोटाइड शर्करा को ऑर्गेनेल झिल्ली में ले जाते हैं ताकि एंजाइमों की आपूर्ति की जा सके जो अपने सब्सट्रेट के साथ ग्लाइकोसिलेशन की मध्यस्थता करते हैं। एनएसटी डिमर और / या उच्च ओलिगोमर्स के रूप में मौजूद हैं। विभिन्न एनएसटी के बीच हेटरोलॉगस इंटरैक्शन की भी सूचना दी गई है। यह सत्यापित करने के लिए कि क्या तकनीक एनएसटी हेटरोमेराइजेशन की घटना का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है, हमने इसे दो गोल्गी-निवासी एनएसटी के संयोजन के खिलाफ परीक्षण किया जो पहले कई अन्य तरीकों से संबद्ध करने के लिए दिखाया गया है। लूसिफेरस पूरक परख गोल्गी-निवासी झिल्ली प्रोटीन के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त प्रतीत होता है, क्योंकि इसे उच्च अभिव्यक्ति के स्तर की आवश्यकता नहीं होती है, जो अक्सर प्रोटीन मिसलोकलाइजेशन को ट्रिगर करता है और झूठी सकारात्मकता के जोखिम को बढ़ाता है।

Introduction

यह पांडुलिपि एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का वर्णन करती है ताकि गोल्गी-निवासी प्रकार III झिल्ली प्रोटीन के बीच हेटरोलॉगस इंटरैक्शन की उपस्थिति की जांच की जा सके, जो विभाजन लूसिफेरस पूरक परख के सबसे हालिया संस्करण का उपयोग करके क्षणिक रूप से संक्रमित मानव कोशिकाओं में है। प्रक्रिया को न्यूक्लियोटाइड चीनी ट्रांसपोर्टरों (एनएसटी) के खिलाफ सबसे बड़े पैमाने पर परीक्षण किया गया है, लेकिन हम अन्य गोल्गी-निवासी टाइप III झिल्ली प्रोटीन के लिए सकारात्मक परिणाम प्राप्त करने में भी सक्षम थे जिनके एन- और / या सी-टर्मिनी साइटोप्लाज्म का सामना कर रहे हैं।

हमारा शोध समूह मैक्रोमोलेक्यूल्स के ग्लाइकोसिलेशन में एनएसटी की भूमिका की पड़ताल करता है। एनएसटी गोल्गी- और / या ईआर-निवासी प्रकार III झिल्ली प्रोटीन हैं, जिसमें एन- और सी-टर्मिनी ऑर्गेनेलर झिल्ली 1 के साइटोप्लाज्मिक पक्ष का सामना कर रहे हैं। माना जाता है कि एनएसटी अपने सब्सट्रेट के साथ ग्लाइकोसिलट्रांसफरेज़ की आपूर्ति करने के लिए ऑर्गेनेल झिल्ली में न्यूक्लियोटाइड-सक्रिय शर्करा ले जाते हैं। एनएसटी डिमर और / या उच्चतर ओलिगोमर्स 2,3,4,5,6,7,8,9,10 बनाते हैं। इसके अलावा, विभिन्न एनएसटी के बीच हेटरोलॉगस इंटरैक्शन भी 6,11 की सूचना दी गई है। एनएसटी को कार्यात्मक रूप से संबंधित ग्लाइकोसिलेशन एंजाइमों के साथ परिसर बनाने के लिए भी प्रदर्शित किया गया था12,13,14। हमने वर्तमान में उपयोग की जाने वाली तकनीक, प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग (एफएलआईएम) -आधारित फ्रेट दृष्टिकोण के विकल्प की मांग की, एनएसटी और कार्यात्मक रूप से संबंधित गोल्गी-निवासी प्रोटीन की बातचीत का अध्ययन करने के लिए, इसलिए हमने विभाजित लूसिफेरस पूरक परख का परीक्षण करने का फैसला किया। इसने हमें एक एनएसटी और एक कार्यात्मक रूप से संबंधित ग्लाइकोसिलेशन एंजाइम 9 के बीच एक उपन्यास बातचीत की पहचान करने की अनुमति दी।

विभाजित लूसिफेरस पूरक परख, NanoBiT के सबसे हाल के संशोधन, प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत में प्रयोग किया जाता है15. यह दो टुकड़ों से लूसिफेरस एंजाइम (जैसे, नैनोल्यूक) के पुनर्गठन पर निर्भर करता है - बड़ा एक, जिसे बड़े बीआईटी या एलजीबीआईटी के रूप में जाना जाता है, एक 17.6 केडीए प्रोटीन, और छोटा, केवल 11 अमीनो एसिड से बना होता है, जिसे छोटे बीआईटी या एसएमबीआईटी के रूप में जाना जाता है। ब्याज के दो प्रोटीन पूरक टुकड़ों के साथ जुड़े हुए हैं और क्षणिक रूप से एक मानव सेल लाइन में व्यक्त किए जाते हैं। यदि दो संलयन प्रोटीन बातचीत करते हैं, तो सेल-पारगम्य सब्सट्रेट के अलावा सीटू में एक ल्यूमिनेसेंस का उत्पादन किया जाता है। इन दो टुकड़ों को अनुकूलित किया गया है ताकि वे न्यूनतम आत्मीयता के साथ जुड़ें, जब तक कि ब्याज के प्रोटीन के बीच बातचीत द्वारा एक साथ नहीं लाया जाता है, जिससे वे जुड़े हुए हैं।

सामान्य तौर पर, बायोल्यूमिनेसेंस-आधारित विधियों में प्रतिदीप्ति के आधार पर लोगों पर कुछ फायदे हैं। बायोल्यूमिनेसेंट संकेतों में एक उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात होता है क्योंकि पृष्ठभूमि ल्यूमिनेसेंस लूसिफेरस-व्युत्पन्न सिग्नल 16 की तुलना में नगण्य है। इसके विपरीत, प्रतिदीप्ति-आधारित दृष्टिकोण आमतौर पर ऑटोफ्लोरेसेंस की घटना के कारण अपेक्षाकृत उच्च पृष्ठभूमि से पीड़ित होते हैं। इसके अलावा, बायोल्यूमिनेसेंस प्रतिदीप्ति की तुलना में विश्लेषण की गई कोशिकाओं के लिए कम हानिकारक है, क्योंकि पूर्व मामले में नमूने को उत्तेजित करने की कोई आवश्यकता नहीं है। उन कारणों से विवो में पीपीआई का अध्ययन करने के लिए बायोल्यूमिनेसेंट दृष्टिकोण आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले फ्लोरोसेंट तरीकों जैसे कि फॉरस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) या Bimolecular प्रतिदीप्ति पूरकता (BiFC) को पछाड़ते हैं।

हमारा प्रोटोकॉल नियंत्रण संयोजन के लिए प्राप्त ल्यूमिनेसेंस के लिए ब्याज के प्रोटीन संयोजन के लिए प्राप्त ल्यूमिनेसेंस को संदर्भित करने पर निर्भर करता है। उत्तरार्द्ध में परीक्षण किए गए प्रोटीनों में से एक शामिल है जो एक बड़े टुकड़े और एक नियंत्रण प्रोटीन (जैसे, हेलोटैग) के साथ जुड़ा हुआ है, जो एक छोटे टुकड़े के साथ जुड़ा हुआ है। उत्तरार्द्ध जीवाणु मूल का एक प्रोटीन है जिसे स्तनधारी प्रोटीन में से किसी के साथ बातचीत करने की उम्मीद नहीं है। एक नियंत्रण के रूप में इस प्रोटीन का उपयोग करने से विश्लेषण किए जाने वाले प्रोटीन के गोल्गी-निवासी जोड़े की टोपोलॉजी की सीमाएं हैं। चूंकि स्तनधारी कोशिकाओं में यह प्रोटीन साइटोप्लाज्म में संश्लेषित होता है, इसलिए ब्याज के दोनों प्रोटीनों में कम से कम एक साइटोप्लाज्मिक पूंछ होनी चाहिए।

यह दृष्टिकोण पीपीआई की प्रारंभिक स्क्रीनिंग के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है। यह पसंद की विधि बन सकती है जब ब्याज के संलयन प्रोटीन को उन स्तरों पर व्यक्त किया जाता है जो अन्य दृष्टिकोणों को लागू करने के लिए अपर्याप्त हैं। इसी तरह, विभाजित लूसिफेरस पूरक परख सबसे अच्छा विकल्प हो सकता है यदि ब्याज के प्रोटीन उच्च स्तर पर व्यक्त किए जाते हैं, लेकिन यह उनके उपकोशिकीय स्थानीयकरण को प्रतिकूल रूप से प्रभावित करता है या गैर-विशिष्ट इंटरैक्शन को मजबूर करने के लिए जाना जाता है। चूंकि छोटे टुकड़े में केवल 11 अमीनो एसिड होते हैं, इसलिए बड़े टैग का उपयोग करते समय विभाजित लूसिफेरस पूरक परख को लागू किया जा सकता है असंभव है। अंत में, इसे अन्य तकनीकों का उपयोग करके प्राप्त डेटा की पुष्टि करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, जैसा कि यहां प्रस्तुत मामले में है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. अभिव्यक्ति plasmids की पीढ़ी

  1. टोपोलॉजी भविष्यवाणी उपकरण का उपयोग कर ब्याज के प्रोटीन की झिल्ली टोपोलॉजी की जांच करें।
  2. क्लोनिंग रणनीति को डिजाइन करें ताकि बड़े और छोटे टुकड़े साइटोप्लाज्म का सामना करेंगे एक बार संलयन प्रोटीन को गोल्गी झिल्ली में डाला गया है। यदि, जैसा कि यहां प्रस्तुत मामले में है, तो ब्याज के प्रोटीन के एन- और सी-टर्मिनी दोनों साइटोप्लाज्मिक रूप से उन्मुख हैं, तो प्रोटीन को आठ संभावित तरीकों से टैग करें ( चित्रा 1 बी देखें)। यदि ब्याज के एक या दोनों प्रोटीनों का एन- या सी-टर्मिनस ल्यूमिनल रूप से उन्मुख है, तो इसे टैगिंग से बाहर करें।
  3. मानक क्लोनिंग प्रोटोकॉल का पालन करके उपयुक्त अभिव्यक्ति वैक्टर ( सामग्री की तालिका देखें) में रुचि के जीन को उप-क्लोन किया जाता है।
    नोट:: सभी संभावित अभिविन्यासों का परीक्षण अनुशंसित है, क्योंकि कुछ टैगिंग विकल्प अपर्याप्त निकटता, सबऑप्टिमल ओरिएंटेशन, या स्थानिक बाधाओं के कारण काम नहीं कर सकते हैं।

2. कोशिकाओं में अभिव्यक्ति plasmids के क्षणिक अभिकर्मक

  1. ट्रिप्सिनाइजेशन द्वारा अनुयायी HEK293T सेल संस्कृति को काटें और एक समर्पित पूर्ण विकास माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। प्लेट कोशिकाओं (2 x 104/100 μL / अच्छी तरह से) एक स्पष्ट नीचे, सफेद पक्ष 96-अच्छी तरह से प्लेट पर। प्रतिकृतियों सहित सभी परीक्षण किए गए संयोजनों और नियंत्रणों को समायोजित करने के लिए कुओं की कुल संख्या को समायोजित करें।
    नोट: थर्मल शिफ्ट को कम करने और रात भर के वाष्पीकरण से बचने के लिए प्लेट के केवल आंतरिक 60 कुओं का उपयोग करने का प्रयास करें। पॉली-डी-लाइसिन-लेपित प्लेटों का उपयोग करना अत्यधिक अनुशंसित है जैसे कि सामग्री की तालिका में इंगित किया गया है, अन्यथा कोशिकाएं बाद के धोने के चरणों के दौरान अलग हो सकती हैं।
  2. मानक स्थितियों (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में रात भर कोशिकाओं को संस्कृति दें।
  3. अगले दिन बिंदु 1.1 में प्राप्त अभिव्यक्ति प्लास्मिड के वांछित संयोजनों के साथ कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट करें।
    1. प्रत्येक निर्माण के लिए 6.25 ng / μL करने के लिए एक सीरम मुक्त माध्यम में पतला अभिव्यक्ति plasmids ( सामग्री की तालिका देखें)
    2. एक उपयुक्त लिपिड-टू-डीएनए अनुपात में लिपिड-आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक जोड़ें और निर्माता के निर्देश के अनुसार इनक्यूबेट करें।
    3. निर्दिष्ट कुओं में लिपिड: डीएनए मिश्रण के 8 μL जोड़ें। कोमल रोटेशन द्वारा प्लेट की सामग्री को मिलाएं। इसके परिणामस्वरूप 50 एनजी / अच्छी तरह से दोनों अभिव्यक्ति निर्माणों का अभिकर्मक होता है।
  4. मानक स्थितियों (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में 20-24 घंटे के लिए कोशिकाओं को संस्कृति करें।
    नोट: लंबे समय तक कोशिकाओं को संवर्धित करने के परिणामस्वरूप संलयन प्रोटीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर हो सकते हैं, जो टुकड़ों के बीच एक गैर-विशिष्ट संबंध को बढ़ावा दे सकता है।

3. मध्यम विनिमय

  1. अगले दिन वातानुकूलित माध्यम को प्रत्येक कुएं में सीरम-मुक्त माध्यम के 100 μL के साथ बदलें। सुनिश्चित करें कि कक्षों को मध्यम विनिमय पर अलग नहीं किया गया है।
    नोट: इस चरण को furimazine काम समाधान के अलावा से पहले 2-3 ज किया जाना चाहिए। सीरम वापसी furimazine के autoluminescence के कारण पृष्ठभूमि को कम करता है.

4. furimazine काम समाधान की तैयारी

  1. माप से ठीक पहले, एक कमजोर पड़ने बफर (एक 20 गुना कमजोर पड़ने) के 19 संस्करणों के साथ furimazine की 1 मात्रा मिश्रण।
    नोट: तैयार किए जाने वाले furimazine काम करने वाले समाधान की कुल मात्रा विश्लेषण किए जाने वाले व्यक्तिगत कुओं की संख्या पर निर्भर करती है (furimazine काम करने वाले समाधान को 1: 5 अनुपात में सेल संस्कृति माध्यम में जोड़ा जाता है, इसलिए, प्रत्येक अच्छी तरह से पहले से 100 μL के साथ भरा हुआ सीरम-मुक्त माध्यम 25 μL furimazine काम करने वाले समाधान को जोड़ा जाना चाहिए)।
  2. नामित कुओं (25 μL / अच्छी तरह से) के लिए furimazine काम समाधान जोड़ें। धीरे से हाथ से या एक कक्षीय शेकर का उपयोग करके प्लेट को मिलाएं (उदाहरण के लिए, 300-500 आरपीएम पर 15 एस)।

5. luminescence मापने

  1. एक luminescence माइक्रोप्लेट रीडर में प्लेट डालें।
    1. उन प्रयोगों के लिए जिन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना है, संकेतित तापमान पर 10-15 मिनट के लिए प्लेट को संतुलित करें।
  2. विश्लेषण किए जाने वाले कुओं का चयन करें।
  3. 0.3 s के एकीकरण समय के साथ luminescence पढ़ें। जब आवश्यक हो तो 2 घंटे तक के लिए ल्यूमिनेसेंस की निगरानी करना जारी रखें।

6. डेटा विश्लेषण

  1. सभी परीक्षण किए गए और नियंत्रण संयोजनों के लिए माध्य मानों और मानक विचलनों की गणना करें.
  2. एकाधिक तुलनाओं के साथ एक तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें।
  3. इसी नकारात्मक नियंत्रण के लिए प्राप्त एक माध्य ल्यूमिनेसेंस द्वारा ब्याज के संयोजन के लिए प्राप्त माध्य ल्यूमिनेसेंस को विभाजित करके गुना परिवर्तन मानों की गणना करें। परिणामों का मूल्यांकन करें।
    नोट: यहाँ प्रस्तावित डेटा विश्लेषण के लिए दृष्टिकोण मानता है कि इंटरैक्शन का दावा किया जा सकता है यदि परीक्षण किए गए संयोजन के लिए प्राप्त ल्यूमिनेसेंस सांख्यिकीय रूप से संबंधित नियंत्रण संयोजन के लिए प्राप्त ल्यूमिनेसेंस से काफी अधिक है और एक ही समय में, इन दो मानों का अनुपात 10 से अधिक है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस दृष्टिकोण में सबसे विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने के लिए सभी संभावित संयोजनों का परीक्षण किया जाना चाहिए ( चित्रा 1 देखें)। समानांतर में, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण शामिल किए जाने चाहिए। सकारात्मक नियंत्रण में दो प्रोटीन शामिल होने चाहिए जो बातचीत करने के लिए जाने जाते हैं, जिनमें से एक बड़े टुकड़े के साथ जुड़ा हुआ है और दूसरा छोटे टुकड़े के साथ जुड़ा हुआ है। नकारात्मक नियंत्रण आदर्श रूप से दो गैर-बातचीत प्रकार III झिल्ली प्रोटीन से मिलकर होना चाहिए, जो इसी तरह टैग किए गए हैं। हालांकि, इस तरह के नियंत्रण को स्थापित करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, क्योंकि दो नियंत्रण प्रोटीनों की बातचीत की कमी को कई वैकल्पिक दृष्टिकोणों का उपयोग करके पूरी तरह से पुष्टि की जानी चाहिए। इसलिए, कोई गैर-मानव मूल के एक साइटोसोलिक प्रोटीन को नियोजित कर सकता है जिसे किसी भी मानव प्रोटीन (जैसे, हेलोटैग) के साथ नकारात्मक नियंत्रण के रूप में बातचीत करने की उम्मीद नहीं है, यदि प्रोटीन के एन- और / या सी-टर्मिनी, जिनकी बातचीत निर्धारित की जानी है, यहां प्रस्तुत मामले के रूप में साइटोप्लाज्मिक रूप से उजागर होते हैं। हम अत्यधिक इस प्रकार के नियंत्रण का उपयोग करके प्राप्त परिणामों के एक अतिरिक्त सत्यापन की सलाह देते हैं, जो संबंधित प्लास्मिड के अनुमापन के साथ संयुक्त ब्याज के प्रोटीन में से किसी एक के अनटैग किए गए संस्करणों की सह-अभिव्यक्ति द्वारा होता है। यदि दो प्रोटीन विशेष रूप से बातचीत करते हैं, तो उनमें से किसी एक की एक अतिरिक्त प्रतिलिपि में लूसिफेरस टुकड़े की कमी के परिणामस्वरूप ल्यूमिनेसेंस की एक विशिष्ट कमी होनी चाहिए।

सापेक्ष ल्यूमिनेसेंस इकाइयों (RLU) मानों को सकारात्मक और नकारात्मक संयोजनों के विशिष्ट तालिका 1 में सूचीबद्ध किया गया है। परिणाम दो NSTs, SLC35A2 और SLC35A3 के लिए प्राप्त किए गए थे, जिन्हें सह-immunoprecipitation और FLIM-FRET6 के साथ-साथ सीटू निकटता बंधाव परख11 में सहयोग करने के लिए दिखाया गया था। SLC35A2 और SLC35A3 दोनों गोल्गी-निवासी प्रकार III झिल्ली प्रोटीन हैं, जिसमें एन- और सी-टर्मिनी साइटोप्लाज्म (चित्रा 1 ए) का सामना कर रहे हैं। इसलिए, आठ संभावित टैगिंग विकल्प हैं और परिणामी संलयन प्रोटीन को आठ संभावित तरीकों से भी एक साथ सेट किया जा सकता है (चित्रा 1 बी)। सभी परीक्षण किए गए और नियंत्रण संयोजनों के अनुरूप माध्य RLU मानचित्र 2A में दर्शाए गए हैं। सकारात्मक नियंत्रण भी शामिल है। एक चयनित परिणाम के लिए एक प्रारंभिक आवश्यकता को एक इंटरैक्शन का संकेत माना जाता है कि ब्याज के संयोजन के लिए प्राप्त आरएलयू मान संबंधित नियंत्रण संयोजन के लिए प्राप्त आरएलयू मूल्य की तुलना में सांख्यिकीय रूप से काफी अधिक है। चित्रा 2A में इस तरह के तीन संयोजन देखे गए हैं (LgBiT-SLC35A2 + SLC35A3-SmBiT, SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 और SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3)। परिणामों के विश्लेषण में अगले चरण में संबंधित नियंत्रणों के लिए प्राप्त RLU मानों द्वारा संबंधित RLU मानों को विभाजित करके ब्याज के संयोजन के लिए अनुपात मान प्राप्त करना शामिल है। इस तरह के विश्लेषण के परिणाम चित्र 2B में दिखाए गए हैं। निर्माता के सुझावों के अनुसार, 10 और 1000 के बीच के अनुपात विशिष्ट इंटरैक्शन के अत्यधिक संकेत हैं। दो संयोजन हैं जो इन मानदंडों को पूरा करते हैं (SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 और SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3) और इस विचार का समर्थन करते हैं कि SLC35A2 और SLC35A3 बातचीत करते हैं। हालांकि, तथ्य यह है कि अन्य छह संयोजन नकारात्मक हैं इसका मतलब यह नहीं है कि संबंधित संलयन प्रोटीन के बीच कोई बातचीत नहीं है, बल्कि यह सुझाव देता है कि टैगिंग रणनीति इन मामलों में इष्टतम नहीं थी। यह उदाहरण दिखाता है कि सभी संभावित संयोजनों का परीक्षण करना कितना महत्वपूर्ण है।

चित्रा 2 में प्रस्तुत डेटा को अतिरिक्त रूप से एचए-टैग किए गए SLC35A2 या SLC35A3 की सह-अभिव्यक्ति द्वारा संयोजन के साथ पुष्टि की गई थी, जिसके परिणामस्वरूप उच्चतम सापेक्ष ल्यूमिनेसेंस, अर्थात् SLC35A2-LgBiT + SmBiT-SLC35A3 शामिल थे। एचए-टैग किए गए एनएसटी वेरिएंट को एन्कोडिंग करने वाले प्लास्मिडों की अलग-अलग मात्रा का उपयोग सह-अभिकर्मक के लिए किया गया था। इसके परिणामस्वरूप RLU मानों (चित्रा 3) में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण, खुराक-निर्भर कमी हुई। HA-टैग किए गए NST वेरिएंट की एक साथ सह-अभिव्यक्ति द्वारा SLC35A2-LgBiT और SmBiT-SLC35A3 के बीच बातचीत के विशिष्ट और खुराक-निर्भर व्यवधान को तालिका 2 में दिखाया गया है।

यहां प्रस्तुत विधि से जुड़ी सबसे आम समस्या अभिकर्मक की खराब दक्षता है। यह सत्यापित करने के लिए कि क्या यह सबऑप्टिमल परिणामों का कारण है, सभी प्रयोगों में सकारात्मक नियंत्रण शामिल करें। यहां प्रस्तुत डेटा प्राप्त करने के लिए हमने जिस सकारात्मक नियंत्रण को नियोजित किया है, उसमें दो इंटरैक्शन फ्यूजन प्रोटीन शामिल हैं: सीएपीएम-निर्भर प्रोटीन किनेज उत्प्रेरक सबयूनिट अल्फा (PRKACA) छोटे टुकड़े और सीएपीएम-निर्भर प्रोटीन किनेज प्रकार II-अल्फा नियामक सबयूनिट (PRKAR2A) के साथ जुड़े हुए हैं। हमारे हाथों में, संबंधित RLU मान ~ 6 x 105 तक पहुंच गया। इस संख्या में एक महत्वपूर्ण (परिमाण के 2-3 आदेश) गिरावट निष्पादित अभिकर्मक की सबऑप्टिमल दक्षता का संकेत हो सकती है। ऐसे मामले में हम सुसंस्कृत कोशिकाओं की भलाई की जांच करने और यह सुनिश्चित करने की सलाह देते हैं कि अभिकर्मक के लिए कोशिकाओं की उचित संख्या को मढ़वाया जा रहा है।

Figure 1
चित्रा 1: झिल्ली टोपोलॉजी और टैगिंग की योजनाबद्धता। (ए) एसएलसी 35 ए 2 और एसएलसी 35 ए 3 प्रोटीन की झिल्ली टोपोलॉजी। (बी) विभाजित लूसिफेरस पूरक परख टुकड़े के साथ SLC35A2 और SLC35A3 प्रोटीन टैगिंग की संभावनाएं और परख के लिए परिणामी संलयन प्रोटीन के संयोजन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: चयनित प्रोटीन संयोजनों और इसी नकारात्मक नियंत्रण (संसाधित डेटा) के लिए HEK293T कोशिकाओं में प्रदर्शन विभाजित luciferase पूरक परख के परिणाम. (ए) चयनित प्रोटीन संयोजनों और संबंधित नकारात्मक नियंत्रणों के लिए प्राप्त आरएलयू मान। नकारात्मक, HaloTag SmBiT के साथ टैग की गईं; PRKAR2A, CAPM-निर्भर प्रोटीन किनेज प्रकार II-अल्फा नियामक सबयूनिट; PRKACA, CAPM-निर्भर प्रोटीन किनेज उत्प्रेरक सबयूनिट अल्फा। कई तुलनाओं के साथ एक तरफा एनोवा का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया था और तीन तकनीकी प्रतिकृतियों से मानक विचलन (एसडी) ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया गया था। पी < 0.1 *, पी < 0.05 **, पी < 0.01 ***. (बी) फोल्ड परिवर्तन ों की गणना परीक्षण किए गए संयोजन (आरएलयू नमूना) के लिए प्राप्त एक माध्य ल्यूमिनेसेंस को संबंधित नकारात्मक नियंत्रण (आरएलयू नियंत्रण) के लिए प्राप्त माध्य ल्यूमिनेसेंस द्वारा विभाजित करके की जाती है। थ्रेशोल्ड मान को एक इंटरैक्शन का संकेत माना जाता है, जिसे 10 पर सेट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: विशिष्ट और खुराक-निर्भर SLC35A2-LgBiT और SmBiT-SLC35A3 के बीच बातचीत के HA-टैग किए गए NST वेरिएंट की एक साथ सह-अभिव्यक्ति द्वारा। HEK293T कोशिकाओं को SLC35A2-LgBiT और SmBiT-SLC35A3 एन्कोडिंग प्लास्मिड के साथ संक्रमित किया गया था और इसके अतिरिक्त, या तो एक खाली pSelect प्लास्मिड (मॉक) के साथ या एचए-टैग किए गए SLC35A2 (बाएं पैनल) और SLC35A3 (दाएं पैनल) को एन्कोडिंग करने वाले pSelect plasmids की बढ़ती मात्रा के साथ। कई तुलनाओं के साथ एक तरफा एनोवा का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया था और तीन तकनीकी प्रतिकृतियों से मानक विचलन (एसडी) ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया गया था। पी < 0.05 **, पी < 0.001 **** कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: चयनित प्रोटीन संयोजनों और इसी नकारात्मक नियंत्रण (कच्चे डेटा) के लिए HEK293T कोशिकाओं में किए गए परख के परिणाम। चयनित प्रोटीन संयोजनों और संबंधित नकारात्मक नियंत्रणों के लिए प्राप्त असंसाधित RLU मान दिखाए गए हैं। नकारात्मक, HaloTag SmBiT के साथ टैग की गईं; PRKAR2A, CAPM-निर्भर प्रोटीन किनेज प्रकार II-अल्फा नियामक सबयूनिट; PRKACA, CAPM-निर्भर प्रोटीन किनेज उत्प्रेरक सबयूनिट अल्फा, टीआर, तकनीकी प्रतिकृति। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: SLC35A2-LgBiT और SmBiT-SLC35A3 के बीच बातचीत के विशिष्ट और खुराक-निर्भर व्यवधान HA-टैग किए गए NST वेरिएंट (कच्चे डेटा) की एक साथ सह-अभिव्यक्ति द्वारा। चयनित प्रोटीन संयोजनों के लिए प्राप्त असंसाधित RLU मान दिखाए गए हैं। मॉक, SLC35A2-LgBiT और SmBiT-SLC35A3 को-एक खाली pSelect वेक्टर के साथ सह-संक्रमित व्यक्त करने वाली कोशिकाएं; HA-SLC35A2, SLC35A2-LgBiT और SmBiT-SLC35A3 को व्यक्त करने वाली कोशिकाएं सह-एक pSelect प्लास्मिड एन्कोडिंग SLC35A2 की संकेतित मात्रा के साथ सह-संक्रमित एन-टर्मिनस पर एचए एपिटोप के साथ टैग की गई हैं; HA-SLC35A3, SLC35A2-LgBiT और SmBiT-SLC35A3 को व्यक्त करने वाली कोशिकाएं सह-एक pSelect प्लास्मिड एन्कोडिंग SLC35A3 की संकेतित मात्रा के साथ सह-संक्रमित एन-टर्मिनस पर एचए एपिटोप के साथ टैग की गई हैं; टीआर, तकनीकी प्रतिकृति। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहां हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो गोल्गी-निवासी प्रकार III झिल्ली प्रोटीन, जैसे कि एनएसटी के बीच गठित हेटरोलॉगस कॉम्प्लेक्स के प्रदर्शन को सक्षम करता है, जो विभाजित लूसिफेरस पूरक परख का उपयोग करता है। डेटा विश्लेषण और व्याख्या के लिए प्रस्तावित दृष्टिकोण में संबंधित नियंत्रण संयोजन के लिए प्राप्त ल्यूमिनेसेंस के लिए ब्याज के प्रोटीन संयोजन के लिए प्राप्त ल्यूमिनेसेंस से संबंधित ल्यूमिनेसेंस शामिल है, जो बड़े टुकड़े के साथ जुड़े ब्याज के प्रोटीन में से एक से बना है और एक जीवाणु मूल के नियंत्रण प्रोटीन को छोटे टुकड़े के साथ जोड़ा जाता है। उत्तरार्द्ध स्तनधारी कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में व्यक्त किया जाता है; इसलिए, इसे एक संदर्भ के रूप में उपयोग करने के लिए आवश्यक है कि प्रोटीन के एन- और / या सी-टर्मिनी, जिनकी बातचीत का विश्लेषण किया जाना है, गोल्गी झिल्ली के साइटोप्लाज्मिक पक्ष पर हैं।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम प्लास्मिड डिजाइन हैं, कोशिकाओं को ट्रांसफेक्टेड होने के लिए चढ़ाना, स्वयं अभिकर्मक, मध्यम विनिमय, फ्यूरिमाज़िन काम करने वाले समाधान की तैयारी और इसे कोशिकाओं में जोड़ना। प्लास्मिड डिजाइन को इस तरह से बनाया जाना चाहिए कि दोनों लूसिफेरस टुकड़े साइटोप्लाज्म का सामना कर रहे हैं, अन्यथा नियंत्रण संयोजन काम नहीं करेंगे और संदर्भ आरएलयू मूल्य गायब होंगे। संक्रमित होने वाली कोशिकाओं को प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट के रूप में मढ़वाया जाना चाहिए, अन्यथा अभिकर्मक दक्षता सबऑप्टिमल हो सकती है। हम पॉली-एल-लाइसिन-लेपित सतह के साथ मल्टीवेल प्लेटों का उपयोग करने की सलाह देते हैं ताकि सेल अनुलग्नक का समर्थन किया जा सके, जबकि माध्यम का आदान-प्रदान किया जा रहा है। अंत में, furimazine काम समाधान ताजा तैयार किया जाना चाहिए और तुरंत कोशिकाओं के लिए जोड़ा जाना चाहिए। एक बार जब इसे जोड़ा जाता है, तो रीडआउट को जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए।

अनिर्णायक परिणामों से बचने के लिए, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण हमेशा शामिल किए जाने चाहिए। सकारात्मक नियंत्रण को हमेशा नियोजित किया जाना चाहिए ताकि अभिकर्मक दक्षता की निगरानी की जा सके। यह बहुत महत्वपूर्ण है कि सभी संभावित संलयन प्रोटीन जो एक दूसरे के साथ-साथ हेलोटैग-आधारित नकारात्मक नियंत्रण के साथ-साथ टोपोलॉजिकल रूप से संगत हैं, उत्पन्न और संयुक्त हैं। यदि संभव हो, तो ब्याज के किसी भी प्रोटीन के साथ बातचीत करने वाले झिल्ली प्रोटीन से युक्त नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग किया जाना चाहिए। यहां, हमने इस तरह के नियंत्रण को नियोजित नहीं किया, क्योंकि इसका विकास अभी भी रास्ते पर है। इसके बजाय, हमने विश्लेषण किए गए प्रोटीनों में से एक की एक अतिरिक्त, अपरिवर्तित प्रतिलिपि को सह-व्यक्त करके ब्याज के परिसरों के एक विशिष्ट विघटन को मजबूर किया। हमारे द्वारा उपयोग किए जाने वाले अभिव्यक्ति वैक्टर अपेक्षाकृत कमजोर दाद सिंप्लेक्स वायरस-थाइमिडीन किनेज (एचएसवी-टीके) प्रमोटर को ले जाते हैं, जो कम अभिव्यक्ति के स्तर को सुनिश्चित करता है जो विशिष्ट परिणाम प्राप्त करने के लिए इष्टतम हैं। हालांकि, सबऑप्टिमल परिणामों के मामले में सीएमवी-आधारित वैक्टर का उपयोग करना फायदेमंद हो सकता है या वैकल्पिक रूप से, अभिकर्मक के लिए उपयोग किए जाने वाले प्लास्मिड की मात्रा को अनुकूलित करना।

प्रस्तुत विधि, हालांकि शक्तिशाली और सुविधाजनक, कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, यह विधि यह निष्कर्ष निकालने की अनुमति नहीं देती है कि क्या पहचाने गए परिसर डिमर या उच्च-क्रम के ओलिगोमर्स के अनुरूप हैं। इसके अलावा, बातचीत करने वाले प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण की निगरानी नहीं की जा सकती है। हालांकि, यह बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग के साथ बुनियादी प्रोटोकॉल के विस्तार पर संभव है, हालांकि प्रतिदीप्ति-आधारित दृष्टिकोणों की तुलना में ऐसी छवियों का स्थानिक संकल्प काफी कम होगा।

प्रस्तुत विधि बहुत तेज और कुशल है (माप में कई मिनट लगते हैं और डेटा हजारों कोशिकाओं से प्राप्त किया जाता है)। डेटा प्रसंस्करण और व्याख्या भी अपेक्षाकृत सरल है। बुनियादी प्रोटोकॉल के बहुत कम या कोई अनुकूलन की आवश्यकता नहीं है। आवश्यक एकमात्र विशिष्ट उपकरण एक ल्यूमिनोमीटर है। विभाजित लूसिफेरस पूरक परख और BiFC एक ही आवश्यक सिद्धांत पर काम करते हैं, यानी, अपने गैर कार्यात्मक टुकड़ों से एक कार्यात्मक प्रोटीन का पुनर्गठन। प्रतिदीप्ति के आधार पर लोगों पर बायोल्यूमिनेसेंस-आधारित दृष्टिकोण के सामान्य लाभ पहले से ही परिचय में सूचीबद्ध थे। BiFC पर विभाजित luciferase पूरक परख का एक विशिष्ट लाभ यह है कि पूर्व पूरी तरह से प्रतिवर्ती 15 है। BiFC में, एक बार एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पुनर्गठन किया जाता है, तो यह संबंधित गैर-फ्लोरोसेंट टुकड़ों में वापस अलग नहीं होगा। इसके विपरीत, नैनोलूक सबयूनिट्स की असेंबली प्रतिवर्ती है, जो पीपीआई की गतिशीलता का अध्ययन करने का एक अनूठा अवसर बनाता है। अंत में, प्रस्तुत विधि की असाधारण संवेदनशीलता यह मानने की अनुमति देती है कि इस दृष्टिकोण को सेल लाइनों के साथ भी काम करना चाहिए जो ट्रांसफेक्ट करना मुश्किल है।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल यह निर्धारित करने की अनुमति देता है कि क्या दो गोल्गी-निवासी प्रकार III झिल्ली प्रोटीन बातचीत करते हैं। जैसा कि पहले ही उल्लेख किया गया है, विधि के मूल सेटअप को ब्याज के पीपीआई के उपकोशिकीय स्थानीयकरण की पुष्टि करने के लिए बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग के साथ जोड़ा जा सकता है। इस विभाजित लूसिफेरस पूरक परख के उत्क्रमण वास्तविक समय में पीपीआई की गतिशीलता का अध्ययन करने की अनुमति देता है। Furimazine से व्युत्पन्न luminescent संकेत के बारे में 2 घंटे के लिए बनाए रखा जाता है। हालांकि, विभाजित लूसिफेरस पूरक परख के लिए substrates एक काफी लंबे समय तक (घंटे के लिए दिन) परिणामी संकेत की अवधि सुनिश्चित भी उपलब्ध हैं. यह विधि उन कारकों की पहचान के लिए अनुमति देती है जो ब्याज के पीपीआई को ट्रिगर या रोकते हैं। इसके आवेदन के सबसे हालिया उदाहरणों में से कुछ में जी प्रोटीन और जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स 18, प्रोटीन संरचनात्मक परिवर्तन 19, प्रोटीन के बीच बातचीत पर अध्ययन शामिल हैं, प्रोटीन 20, सेल सतह रिसेप्टर्स 21 का आंतरिककरण, और उन कारकों की पहचान जो पीपीआई 22,23 को संशोधित करते हैं। इसलिए, यह विधि एक बहुमुखी उपकरण प्रतीत होती है जिसमें बहुत चुनौतीपूर्ण प्रयोगात्मक लक्ष्यों को भी पूरा करने की उच्च क्षमता होती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र (एनसीएन), क्राको, पोलैंड से अनुदान संख्या 2016/23/D/NZ3/01314 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA solution
Adherent mammalian cell line
BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid Corning 356651
Cell culture centrifuge
Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin)
CO2 incubator
Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311
GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader) Promega GM3000
Growth medium dedicated to the cell line used
Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification)
NanoBiT MCS Starter System Promega N2014 This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair.
Nano-Glo Live Cell Assay System Promega N2011 This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red Gibco 11058021
Oribital shaker
Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism)
Thermocycler

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hadley, B., et al. Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress. Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).
  2. Puglielli, L., Hirschberg, C. B. Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).
  3. Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).
  4. Gao, X., Dean, N. Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).
  5. Olczak, M., Guillen, E. Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line. Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).
  6. Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane. FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).
  7. Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).
  8. Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer. Nature Communications. 10 (1), 4657 (2019).
  9. Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT. Analytical Biochemistry. 593, 113599 (2020).
  10. Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits. Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).
  11. Sosicka, P., et al. An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).
  12. Sprong, H., et al. Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum. Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).
  13. Maszczak-Seneczko, D., et al. UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats). Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).
  14. Khoder-Agha, F., et al. N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).
  15. Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
  16. Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001 (2016).
  17. Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
  18. Inoue, A., et al. Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs. Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).
  19. White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes. Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).
  20. Akinjiyan, F. A., et al. A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs). SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).
  21. Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization. SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).
  22. Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT). FEBS Journal. , 15275 (2020).
  23. Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time. Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).

Tags

जीव विज्ञान मुद्दा 163 विभाजित लूसिफेरस पूरक परख प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन पीपीआई ल्यूमिनेसेंस बायोल्यूमिनेसेंस हेटरोलॉगस कॉम्प्लेक्स गोल्गी उपकरण प्रकार III झिल्ली प्रोटीन न्यूक्लियोटाइड चीनी ट्रांसपोर्टर एनएसटी क्षणिक अभिकर्मक
गोल्गी-निवासी प्रकार III झिल्ली प्रोटीन द्वारा विभाजित Luciferase पूरक परख का उपयोग कर द्वारा गठित हेटरोलॉगस परिसरों का प्रदर्शन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wiertelak, W., Olczak, M.,… More

Wiertelak, W., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. Demonstration of Heterologous Complexes formed by Golgi-Resident Type III Membrane Proteins using Split Luciferase Complementation Assay. J. Vis. Exp. (163), e61669, doi:10.3791/61669 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter