Summary
El protocolo presentado aquí está destinado a demostrar la ocurrencia de interacciones heterólogas entre proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi con N- y/o C-termini expuestas citoplasmáticamente en células vivas de mamíferos utilizando la variante más reciente del ensayo de complementación de luciferasa dividida.
Abstract
El objetivo de este protocolo es explorar la aplicabilidad de la variante más reciente de complementación de luciferasa dividida para demostrar complejos heterólogos formados por transportadores de azúcar de nucleótidos (NST). Estas proteínas multitransmembrana residentes en ER y Golgi transportan los azúcares nucleótidos sintetizados citoplasmáticamente a través de las membranas de orgánulos para suministrar enzimas que median la glicosilación con sus sustratos. Los NST existen como dímeros y/oligómeros superiores. También se han reportado interacciones heterólogas entre diferentes NST. Para verificar si la técnica es adecuada para estudiar el fenómeno de heteromerización de NST, la probamos contra una combinación de los dos NST residentes en Golgi que previamente se ha demostrado que se asocian por varios otros medios. El ensayo de complementación con luciferasa parece ser particularmente adecuado para estudiar las interacciones entre las proteínas de membrana residentes en Golgi, ya que no requiere altos niveles de expresión, que a menudo desencadenan una mala localización de las proteínas y aumentan el riesgo de falsos positivos.
Introduction
Este manuscrito describe un protocolo paso a paso para verificar la presencia de interacciones heterólogas entre las proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi en células humanas transfectadas transitoriamente utilizando la variante más reciente del ensayo de complementación de luciferasa dividida. El procedimiento ha sido probado más extensamente contra transportadores de azúcar de nucleótidos (NST), pero también pudimos obtener resultados positivos para otras proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi cuyos N- y / o C-termini se enfrentan al citoplasma.
Nuestro grupo de investigación explora el papel de los NST en la glicosilación de macromoléculas. Los NST son proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi y/o ER con N- y C-termini frente al lado citoplasmático de la membrana organelástica1. Se cree que los NST transportan azúcares activados por nucleótidos a través de las membranas de orgánulos para suministrar glicosiltransferasas con sus sustratos. Los NST forman dímeros y/o oligómeros superiores2,3,4,5,6,7,8,9,10. Además, también se han reportado interacciones heterólogas entre diferentes NST6,11. También se demostró que los NST forman complejos con enzimas de glicosilación funcionalmente relacionadas12,13,14. Buscamos una alternativa a la técnica utilizada actualmente, el enfoque FRET basado en imágenes de fluorescencia de por vida (FLIM), para estudiar las interacciones de los NST y las proteínas residentes de Golgi funcionalmente relacionadas, por lo que decidimos probar el ensayo de complementación de luciferasa dividida. Nos permitió identificar una nueva interacción entre un NST y una enzima de glicosilación funcionalmente relacionada9.
La modificación más reciente del ensayo de complementación de luciferasa dividida, NanoBiT, se utiliza en el protocolo presentado aquí15. Se basa en la reconstitución de la enzima luciferasa (por ejemplo, NanoLuc) de los dos fragmentos: el grande, denominado como BiT grande o LgBiT, una proteína de 17,6 kDa, y el pequeño, compuesto de solo 11 aminoácidos, denominado BiT pequeño o SmBiT. Las dos proteínas de interés se fusionan con los fragmentos complementarios y se expresan transitoriamente en una línea celular humana. Si las dos proteínas de fusión interactúan, se produce una luminiscencia in situ tras la adición de un sustrato permeable a la célula. Estos dos fragmentos han sido optimizados para que se asocien con una afinidad mínima a menos que se unan mediante una interacción entre las proteínas de interés a las que se fusionan.
En general, los métodos basados en bioluminiscencia tienen algunas ventajas sobre los basados en la fluorescencia. Las señales bioluminiscentes tienen una mayor relación señal-ruido porque la luminiscencia de fondo es insignificante en comparación con la señal derivada de la luciferasa16. En contraste, los enfoques basados en la fluorescencia generalmente sufren de un fondo relativamente alto causado por el fenómeno de la autofluorescencia. Además, la bioluminiscencia es menos perjudicial para las células analizadas que la fluorescencia, ya que en el primer caso no hay necesidad de excitar la muestra. Por esas razones, los enfoques bioluminiscentes para estudiar los IBP in vivo superan a los métodos fluorescentes comúnmente utilizados como la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) o la complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC).
Nuestro protocolo se basa en referir la luminiscencia obtenida para la combinación proteica de interés a la luminiscencia obtenida para la combinación de control. Este último incluye la de las proteínas probadas que se fusiona con un fragmento más grande y una proteína de control (por ejemplo, HaloTag), fusionada con un fragmento más pequeño. Esta última es una proteína de origen bacteriano que no se espera que interactúe con ninguna de las proteínas de mamíferos. El uso de esta proteína como control plantea limitaciones a la topología de los pares de proteínas residentes de Golgi a analizar. Dado que en las células de mamíferos esta proteína se sintetiza en el citoplasma, ambas proteínas de interés deben tener al menos una cola citoplasmática.
Este enfoque puede ser particularmente útil para el cribado inicial de IBP. Puede convertirse en el método de elección cuando las proteínas de fusión de interés se expresan a niveles que son simplemente insuficientes para que se apliquen otros enfoques. Del mismo modo, el ensayo de complementación de luciferasa dividida puede ser la mejor opción si las proteínas de interés se expresan en niveles altos, pero esto afecta negativamente su localización subcelular o se sabe que fuerza interacciones no específicas. Dado que el fragmento más pequeño tiene solo 11 aminoácidos, el ensayo de complementación de luciferasa dividida se puede aplicar cuando el uso de etiquetas más grandes es imposible. Finalmente, se puede emplear para confirmar aún más los datos obtenidos utilizando otras técnicas, como en el caso presentado aquí.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generación de plásmidos de expresión
- Examinar la topología de membrana de las proteínas de interés utilizando una herramienta de predicción de topología.
- Diseñar la estrategia de clonación para que los fragmentos más grandes y más pequeños se enfrenten al citoplasma una vez que las proteínas de fusión se hayan insertado en las membranas de Golgi. Si, como en el caso aquí presentado, tanto N- como C-termini de las proteínas de interés están orientadas citoplasmáticamente, etiquete las proteínas de ocho maneras posibles (ver Figura 1B). Si N- o C-terminal de una o ambas proteínas de interés está orientada luminalmente, excluirla del etiquetado.
- Subclónea los genes de interés en vectores de expresión apropiados (ver Tabla de Materiales) siguiendo protocolos de clonación estándar.
NOTA: Se recomienda probar todas las orientaciones posibles, ya que algunas opciones de etiquetado pueden no funcionar debido a una proximidad insuficiente, orientación subóptima o restricciones espaciales.
2. Transfección transitoria de los plásmidos de expresión en las células
- Cosechar el cultivo celular adherente HEK293T por tripsinización y resuspendir las células en un medio de crecimiento completo dedicado. Coloque las celdas (2 x 104/100 μL/pozo) en una placa inferior transparente, de 96 pocillos. Ajuste el número total de pozos para acomodar todas las combinaciones y controles probados, incluidas las réplicas.
NOTA: Intente usar solo los 60 pocillos internos de la placa para minimizar los cambios térmicos y evitar la evaporación durante la noche. El uso de placas recubiertas de poli-D-lisina es muy recomendable, como las indicadas en la Tabla de Materiales, de lo contrario las celdas pueden desprenderse durante los pasos de lavado posteriores. - Cultive las células durante la noche en condiciones estándar (37 °C, 5% co2).
- Al día siguiente transfectar las células con las combinaciones deseadas de plásmidos de expresión obtenidos en el punto 1.1.
- Diluir los plásmidos de expresión en un medio libre de suero (ver Tabla de Materiales) a 6,25 ng/μL para cada constructo.
- Agregue el reactivo de transfección a base de lípidos en una proporción adecuada de lípidos a ADN e incube de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Añadir 8 μL de mezcla de lípidos:ADN a los pocillos designados. Mezcle el contenido de la placa mediante una rotación suave. Esto da como resultado la transfección de ambos constructos de expresión a 50 ng/pocillo.
- Cultive las células durante 20-24 h en condiciones estándar (37 °C, 5% CO2).
NOTA: El cultivo de las células durante más tiempo puede resultar en niveles más altos de expresión de proteínas de fusión, lo que puede promover una asociación no específica entre los fragmentos.
3. Intercambio medio
- Al día siguiente, reemplace el medio acondicionado con 100 μL de un medio sin suero en cada pozo. Asegúrese de que las células no se hayan desprendido tras el intercambio de medios.
NOTA: Este paso debe realizarse 2-3 h antes de la adición de la solución de trabajo de furimazina. La abstinencia sérica minimiza el fondo causado por la autoluminiscencia de furimazina.
4. Preparación de la solución de trabajo de furimazina
- Justo antes de la medición, mezcle 1 volumen de furimazina con 19 volúmenes de un tampón de dilución (una dilución de 20 veces).
NOTA: El volumen total de la solución de trabajo de furimazina a preparar depende del número de pocillos individuales a analizar (la solución de trabajo de furimazina se agrega al medio de cultivo celular en una proporción de 1:5, por lo tanto, a cada pozo previamente lleno con 100 μL de un medio libre de suero se deben agregar 25 μL de la solución de trabajo de furimazina). - Agregue la solución de trabajo de furimazina a los pozos designados (25 μL/pocillo). Mezcle suavemente la placa a mano o usando un agitador orbital (por ejemplo, 15 s a 300-500 rpm).
5. Medición de luminiscencia
- Inserte la placa en un lector de microplacas de luminiscencia.
- Para los experimentos que se van a realizar a 37 °C equilibrar la placa durante 10-15 min a la temperatura indicada.
- Seleccione los pozos a analizar.
- Luminiscencia de lectura con tiempo de integración de 0,3 s. Continúe monitoreando la luminiscencia hasta 2 h cuando sea necesario.
6. Análisis de datos
- Calcule los valores medios y las desviaciones estándar para todas las combinaciones probadas y de control.
- Analice datos utilizando ANOVA unidireccional con múltiples comparaciones.
- Calcular los valores de cambio de pliegue dividiendo una luminiscencia media obtenida para combinaciones de interés por una luminiscencia media obtenida para los controles negativos correspondientes. Evaluar los resultados.
NOTA: El enfoque de análisis de datos propuesto aquí asume que la interacción puede ser reclamada si la luminiscencia obtenida para la combinación probada es estadísticamente significativamente mayor que la luminiscencia obtenida para la combinación de control correspondiente y, al mismo tiempo, la relación de estos dos valores supera 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para obtener los datos más fiables en este enfoque se deben probar todas las combinaciones posibles (ver Figura 1). Paralelamente, deben incluirse controles positivos y negativos. El control positivo debe consistir en las dos proteínas que se sabe que interactúan, de las cuales una está fusionada con el fragmento más grande y la otra está fusionada con el fragmento más pequeño. El control negativo idealmente debería consistir en las dos proteínas de membrana de tipo III que no interactúan etiquetadas de la misma manera. Sin embargo, establecer dicho control puede ser un desafío, ya que la falta de interacción de las dos proteínas de control debe confirmarse a fondo utilizando varios enfoques alternativos. Por lo tanto, se podría emplear una proteína citosólica de origen no humano que no se espera que interactúe con ninguna proteína humana (por ejemplo, HaloTag) como control negativo, si N- y / o C-termini de las proteínas, cuya interacción debe determinarse, están expuestas citoplasmáticamente como en el caso presentado aquí. Recomendamos encarecidamente una verificación adicional de los resultados obtenidos utilizando este tipo de control mediante la coexpresión de las variantes no etiquetadas de cualquiera de las proteínas de interés combinadas con la titulación de los plásmidos correspondientes. Si las dos proteínas interactúan específicamente, una copia adicional de cualquiera de ellas que carezca del fragmento de luciferasa debería resultar en una disminución específica de la luminiscencia.
Los valores relativos de unidades de luminiscencia (RLU) típicos de las combinaciones positivas y negativas se enumeran en la Tabla 1. Los resultados se obtuvieron para los dos NST, SLC35A2 y SLC35A3, que demostraron asociarse por coinmunoprecipitación y FLIM-FRET6, así como por ensayo de ligadura de proximidad in situ11. Tanto SLC35A2 como SLC35A3 son proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi con N- y C-termini frente al citoplasma (Figura 1A). Por lo tanto, hay ocho opciones de etiquetado posibles y las proteínas de fusión resultantes se pueden juntar también de ocho maneras posibles (Figura 1B). Los valores medios de RLU correspondientes a todas las combinaciones probadas y de control se representan en la Figura 2A. También se incluye el control positivo. Un requisito inicial para que un resultado seleccionado se considere indicativo de una interacción es que el valor de RLU obtenido para la combinación de interés sea estadísticamente significativamente mayor que el valor de RLU obtenido para la combinación de control correspondiente. En la Figura 2A se ven tres combinaciones de este tipo (LgBiT-SLC35A2 + SLC35A3-SmBiT, SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 y SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3). El siguiente paso en el análisis de resultados consiste en obtener valores de relación para las combinaciones de interés dividiendo los valores de RLU correspondientes por los valores de RLU obtenidos para los controles respectivos. Los resultados de dicho análisis se muestran en la Figura 2B. Según las sugerencias del fabricante, las proporciones entre 10 y 1000 son altamente indicativas de interacciones específicas. Hay dos combinaciones que cumplen con estos criterios (SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 y SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3) y apoyan la idea de que SLC35A2 y SLC35A3 interactúan. Sin embargo, el hecho de que las otras seis combinaciones sean negativas no significa que no haya interacciones en absoluto entre las respectivas proteínas de fusión, sino que sugiere que la estrategia de etiquetado no fue óptima en estos casos. Este ejemplo muestra lo importante que es probar todas las combinaciones posibles.
Los datos presentados en la Figura 2 fueron confirmados adicionalmente por la coexpresión de SLC35A2 o SLC35A3 marcados con HA con la combinación que resultó en la mayor luminiscencia relativa, a saber, SLC35A2-LgBiT + SmBiT-SLC35A3. Se utilizaron cantidades variables de los plásmidos que codifican las variantes NST marcadas con HA para la cotransfección. Esto resultó en una disminución estadísticamente significativa, dependiente de la dosis en los valores de RLU (Figura 3). La interrupción específica y dependiente de la dosis de la interacción entre SLC35A2-LgBiT y SmBiT-SLC35A3 por la coexpresión simultánea de variantes NST marcadas con HA se muestra en la Tabla 2.
El problema más común asociado con el método presentado aquí es la baja eficiencia de la transfección. Para verificar si esta es la causa de resultados subóptimos, incluya un control positivo en todos los experimentos. El control positivo que empleamos para obtener los datos aquí presentados consiste en las dos proteínas de fusión que interactúan: la subunidad catalítica alfa de proteína quinasa dependiente de cAPM (PRKACA) fusionada con el fragmento más pequeño y la subunidad reguladora de proteína quinasa dependiente de cAPM tipo II-alfa (PRKAR2A) fusionada con el fragmento más grande. En nuestras manos, el valor RLU correspondiente alcanzó ~ 6 x 105. Una caída significativa (2-3 órdenes de magnitud) en este número podría ser indicativa de la eficiencia subóptima de la transfección realizada. En tal caso, recomendamos verificar el bienestar de las células cultivadas y asegurarse de que se está enchapando el número adecuado de células para la transfección.
Figura 1: Esquemas de topología de membrana y etiquetado. (A) Topología de membrana de las proteínas SLC35A2 y SLC35A3. (B) Posibilidades de etiquetar las proteínas SLC35A2 y SLC35A3 con los fragmentos de ensayo de complementación de luciferasa divididos y combinar las proteínas de fusión resultantes para el ensayo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados del ensayo de complementación de luciferasa dividida realizado en células HEK293T para las combinaciones de proteínas seleccionadas y los controles negativos correspondientes (datos procesados). A) Valores de RLU obtenidos para las combinaciones de proteínas seleccionadas y los controles negativos correspondientes. Negativo, HaloTag etiquetado con SmBiT; PRKAR2A, subunidad reguladora de la proteína quinasa dependiente de cAPM tipo II-alfa; PRKACA, proteína quinasa dependiente de cAPM subunidad catalítica alfa. Los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional con comparaciones múltiples y se presentan como una media ± desviación estándar (DE) de tres réplicas técnicas. p < 0,1 *, p < 0,05 **, p < 0,01 ***. B) Cambios de pliegue calculados dividiendo una luminiscencia media obtenida para la combinación ensayada (MUESTRA RLU) por una luminiscencia media obtenida para el control negativo correspondiente (RLU CONTROL). El valor umbral considerado indicativo de una interacción se fijó en 10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Interrupción específica y dependiente de la dosis de la interacción entre SLC35A2-LgBiT y SmBiT-SLC35A3 por coexpresión simultánea de variantes NST marcadas con HA. Las células HEK293T se transfectaron con plásmidos que codifican SLC35A2-LgBiT y SmBiT-SLC35A3 y, además, con un plásmido pSelect vacío (simulacro) o con cantidades crecientes de plásmidos pSelect que codifican SLC35A2 marcados con HA (panel izquierdo) y SLC35A3 (panel derecho). Los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional con comparaciones múltiples y se presentan como una media ± desviación estándar (DE) de tres réplicas técnicas. p < 0,05 **, p < 0,001 ****. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Resultados del ensayo realizado en células HEK293T para las combinaciones de proteínas seleccionadas y los controles negativos correspondientes (datos brutos). Se muestran los valores de RLU no procesados obtenidos para las combinaciones de proteínas seleccionadas y los controles negativos correspondientes. Negativo, HaloTag etiquetado con SmBiT; PRKAR2A, subunidad reguladora de la proteína quinasa dependiente de cAPM tipo II-alfa; PRKACA, proteína quinasa dependiente de cAPM subunidad catalítica alfa, TR, réplica técnica. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Interrupción específica y dependiente de la dosis de la interacción entre SLC35A2-LgBiT y SmBiT-SLC35A3 por coexpresión simultánea de variantes NST marcadas con HA (datos brutos). Se muestran los valores de RLU no procesados obtenidos para las combinaciones de proteínas seleccionadas. Mock, células que expresan SLC35A2-LgBiT y SmBiT-SLC35A3 co-transfectadas con un vector pSelect vacío; HA-SLC35A2, células que expresan SLC35A2-LgBiT y SmBiT-SLC35A3 co-transfectadas con las cantidades indicadas de un plásmido pSelect que codifica SLC35A2 marcado con el epítopo HA en el extremo N; HA-SLC35A3, células que expresan SLC35A2-LgBiT y SmBiT-SLC35A3 co-transfectadas con las cantidades indicadas de un plásmido pSelect que codifica SLC35A3 marcado con el epítopo HA en el extremo N; TR, réplica técnica. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aquí proporcionamos un protocolo detallado que permite la demostración de complejos heterólogos formados entre proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi, como los NST, utilizando el ensayo de complementación de luciferasa dividida. El enfoque propuesto para el análisis e interpretación de datos implica relacionar la luminiscencia obtenida para la combinación proteica de interés con la luminiscencia obtenida para la combinación de control correspondiente, que está compuesta por una de las proteínas de interés fusionadas con el fragmento más grande y la proteína de control de origen bacteriano fusionada con el fragmento más pequeño. Este último se expresa en el citoplasma de las células de mamíferos; por lo tanto, utilizarlo como referencia requiere que N- y/o C-termini de las proteínas, cuya interacción se va a analizar, estén en el lado citoplasmático de la membrana de Golgi.
Los pasos críticos en el protocolo son el diseño del plásmido, el recubrimiento de las células a transfectar, la transfección en sí, el intercambio de medio, la preparación de la solución de trabajo de furimazina y agregarla a las células. El diseño del plásmido debe hacerse de tal manera que ambos fragmentos de luciferasa estén frente al citoplasma, de lo contrario las combinaciones de control no funcionarán y faltarán los valores de RLU de referencia. Las células a transfectar deben estar chapadas como se especifica en el protocolo, de lo contrario la eficiencia de transfección podría ser subóptima. Recomendamos el uso de placas multipozo con la superficie recubierta de poli-L-lisina para soportar la fijación de la celda mientras se intercambia el medio. Finalmente, la solución de trabajo de furimazina debe prepararse recién y agregarse inmediatamente a las células. Una vez que se agrega, la lectura debe realizarse lo antes posible.
Para evitar resultados no concluyentes, siempre se deben incluir controles positivos y negativos. El control positivo debe emplearse siempre para que se controle la eficiencia de la transfección. Es muy importante que se generen y combinen todas las posibles proteínas de fusión que sean topológicamente compatibles entre sí, así como con el control negativo basado en HaloTag. Si es posible, se debe utilizar el control negativo que comprende una proteína de membrana que no interactúa con ninguna de las proteínas de interés. Aquí, no empleamos tal control, ya que su desarrollo aún está en camino. En cambio, forzamos un desmontaje específico de los complejos de interés coexpresando una copia adicional sin etiquetar de una de las proteínas analizadas. Los vectores de expresión que utilizamos llevan el promotor relativamente débil del virus del herpes simple-timidina quinasa (HSV-TK), que asegura bajos niveles de expresión que son óptimos para obtener un resultado específico. Sin embargo, en el caso de resultados subóptimos, podría ser beneficioso utilizar los vectores basados en CMV o, alternativamente, optimizar la cantidad de plásmidos utilizados para la transfección.
El método presentado, aunque potente y conveniente, tiene algunas limitaciones. En primer lugar, este método no permite concluir si los complejos identificados corresponden a dímeros u oligómeros de orden superior. Además, la localización subcelular de las proteínas que interactúan no puede ser monitoreada. Sin embargo, esto es posible tras la extensión del protocolo básico con imágenes bioluminiscentes, aunque la resolución espacial de tales imágenes sería significativamente menor en comparación con los enfoques basados en la fluorescencia.
El método presentado es muy rápido y eficiente (la medición tarda hasta varios minutos y los datos se obtienen de miles de células). El procesamiento y la interpretación de datos también son relativamente sencillos. Se necesita poca o ninguna optimización del protocolo básico. El único equipo específico requerido es un luminómetro. El ensayo de complementación de luciferasa dividida y BiFC trabajan sobre el mismo principio esencial, es decir, la reconstitución de una proteína funcional a partir de sus fragmentos no funcionales. Las ventajas generales de los enfoques basados en la bioluminiscencia sobre los basados en la fluorescencia ya se enumeraron en la Introducción. Una ventaja específica del ensayo de complementación de luciferasa dividida sobre BiFC es que el primero es totalmente reversible15. En BiFC, una vez reconstituida una proteína fluorescente, no se disociaría de nuevo en los fragmentos no fluorescentes correspondientes17. Por el contrario, el ensamblaje de las subunidades NanoLuc es reversible, lo que crea una oportunidad única para estudiar la dinámica de los IBP. Finalmente, la excepcional sensibilidad del método presentado permite suponer que este enfoque debe funcionar incluso con las líneas celulares que son difíciles de transfectar.
El protocolo presentado aquí permite determinar si las dos proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi interactúan. Como ya se mencionó, la configuración básica del método se puede combinar con imágenes de bioluminiscencia para confirmar la localización subcelular del IBP de interés. La reversibilidad de este ensayo de complementación de luciferasa dividida permite estudiar la dinámica de los IBP en tiempo real. La señal luminiscente derivada de la furimazina se mantiene durante aproximadamente 2 horas. Sin embargo, también están disponibles sustratos para el ensayo de complementación de luciferasa dividida que garantiza una duración sustancialmente más larga (de horas a días) de la señal resultante. Este método permite identificar los factores que desencadenan o impiden el IBP de interés. Algunos de los ejemplos más recientes de su aplicación incluyen estudios sobre interacciones entre proteínas G y receptores acoplados a proteínas G18, cambios conformacionales de proteínas19, ubiquitinación de proteínas20, internalización de receptores de superficie celular21 e identificación de factores que modulan los IBP22,23. Por lo tanto, este método parece ser una herramienta versátil con un alto potencial para cumplir incluso objetivos experimentales muy desafiantes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la subvención n.º 2016/23/D/NZ3/01314 del Centro Nacional de Ciencias (NCN), Cracovia, Polonia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA solution | |||
| Adherent mammalian cell line | |||
| BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid | Corning | 356651 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin) | |||
| CO2 incubator | |||
| Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments | |||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader) | Promega | GM3000 | |
| Growth medium dedicated to the cell line used | |||
| Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification) | |||
| NanoBiT MCS Starter System | Promega | N2014 | This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair. |
| Nano-Glo Live Cell Assay System | Promega | N2011 | This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Gibco | 11058021 | |
| Oribital shaker | |||
| Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism) | |||
| Thermocycler |
References
- Hadley, B., et al. Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress. Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).
- Puglielli, L., Hirschberg, C. B. Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).
- Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).
- Gao, X., Dean, N. Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).
- Olczak, M., Guillen, E. Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line. Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).
- Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane. FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).
- Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).
- Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer. Nature Communications. 10 (1), 4657 (2019).
- Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT. Analytical Biochemistry. 593, 113599 (2020).
- Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits. Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).
- Sosicka, P., et al. An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).
- Sprong, H., et al. Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum. Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).
- Maszczak-Seneczko, D., et al. UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats). Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).
- Khoder-Agha, F., et al. N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001 (2016).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Inoue, A., et al.
- White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes. Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).
- Akinjiyan, F. A., et al. A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs). SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).
- Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization. SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).
- Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT). FEBS Journal. , 15275 (2020).
- Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time. Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).
