يهدف البروتوكول المعروض هنا إلى إثبات حدوث تفاعلات غير متجانسة بين بروتينات الغشاء من النوع الثالث المقيمة في غولجي مع N- و / أو C-termini المعرضة للسيتوبلازما في خلايا الثدييات الحية باستخدام أحدث متغير من فحص تكملة luciferase المنقسمة.
الهدف من هذا البروتوكول هو استكشاف إمكانية تطبيق أحدث متغير من تكملة لوسيفيراز المنقسمة لإظهار المجمعات غير المتجانسة التي شكلتها ناقلات السكر النيوكليوتيدات (NSTs). تحمل هذه البروتينات متعددة الأغشية المقيمة في ER- و Golgi سكريات النيوكليوتيد المركبة من السيتوبلازم عبر أغشية العضيات لتزويد الإنزيمات التي تتوسط في الغليكوزيل مع ركائزها. توجد NSTs كدايمرات و / أو أوليغومرات أعلى. كما تم الإبلاغ عن تفاعلات غير متجانسة بين NSTs المختلفة. للتحقق مما إذا كانت هذه التقنية مناسبة لدراسة ظاهرة التباين NST ، اختبرناها مقابل مزيج من NSTs المقيمين في Golgi والتي ثبت سابقا أنها مرتبطة بعدة وسائل أخرى. يبدو أن اختبار تكملة luciferase مناسب بشكل خاص لدراسة التفاعلات بين بروتينات الغشاء المقيمة في Golgi ، لأنه لا يتطلب مستويات تعبير عالية ، والتي غالبا ما تؤدي إلى سوء توطين البروتين وتزيد من خطر الإيجابيات الكاذبة.
تصف هذه المخطوطة بروتوكولا خطوة بخطوة للتحقق من وجود تفاعلات غير متجانسة بين بروتينات الغشاء من النوع الثالث المقيمة في غولجي في الخلايا البشرية المنقولة بشكل عابر باستخدام أحدث متغير من فحص تكملة لوسيفيراز المنقسمة. تم اختبار الإجراء على نطاق واسع ضد ناقلات السكر النيوكليوتيدات (NSTs) ولكننا تمكنا أيضا من الحصول على نتائج إيجابية لبروتينات الغشاء الأخرى من النوع الثالث المقيمة في غولجي والتي تواجه N- و / أو C-termini السيتوبلازم.
تستكشف مجموعتنا البحثية دور NSTs في غليكوزيل الجزيئات الكبيرة. NSTs هي بروتينات غشائية من النوع الثالث من Golgi و / أو ER مع N- و C-termini تواجه الجانب السيتوبلازمي من الغشاء العضوي 1. يعتقد أن NSTs تحمل السكريات المنشطة بالنيوكليوتيدات عبر أغشية العضيات لتزويد الجليكوسيل ترانسفيراز بركائزها. تشكل NSTs dimers و / أو oligomers أعلى 2,3,4,5,6,7,8,9,10. علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ أيضا عن تفاعلات غير متجانسة بين NSTs المختلفة 6,11. كما ثبت أن NSTs تشكل مجمعات مع إنزيمات غليكوزيل ذات صلة وظيفية12،13،14. بحثنا عن بديل للتقنية المستخدمة حاليا ، نهج FRET القائم على التصوير الفلوري مدى الحياة (FLIM) ، لدراسة تفاعلات NSTs والبروتينات المقيمة في Golgi ذات الصلة وظيفيا ، لذلك قررنا اختبار اختبار اختبار اختبار تكامل luciferase المنقسم. سمح لنا بتحديد تفاعل جديد بين NST وإنزيم غليكوزيل مرتبط وظيفيا9.
ويستخدم أحدث تعديل لفحص تكملة لوسيفيراز المنقسمة، NanoBiT، في البروتوكول المعروض هنا15. وهو يعتمد على إعادة تكوين إنزيم لوسيفيراز (على سبيل المثال ، نانولوك) من الشظيتين – الجزء الكبير ، الذي يطلق عليه اسم BiT أو LgBiT الكبير ، وهو بروتين 17.6 kDa ، والصغير ، الذي يتكون من 11 حمضا أمينيا فقط ، يطلق عليه اسم BiT الصغير أو SmBiT. يتم دمج البروتينين المهمين مع الشظايا التكميلية ويتم التعبير عنهما بشكل عابر في خط خلية بشرية. إذا تفاعل البروتينان الانصهاري ، يتم إنتاج لمعان في الموقع عند إضافة ركيزة نفاذة للخلية. تم تحسين هذين الشظيتين بحيث يرتبطان بالحد الأدنى من التقارب ما لم يتم جمعهما معا من خلال التفاعل بين البروتينات ذات الأهمية التي يتم دمجها فيها.
بشكل عام ، تتمتع الطرق القائمة على التلألؤ الحيوي ببعض المزايا على الطرق القائمة على التألق. تحتوي إشارات اللمعان الحيوي على نسبة إشارة إلى ضوضاء أعلى لأن لمعان الخلفية لا يكاد يذكر مقارنة بالإشارة المشتقة من luciferase16. في المقابل ، عادة ما تعاني النهج القائمة على التألق من خلفية عالية نسبيا ناجمة عن ظاهرة التألق الذاتي. إلى جانب ذلك ، فإن التلألؤ الحيوي أقل ضررا على الخلايا التي تم تحليلها من التألق ، كما هو الحال في الحالة الأولى ليست هناك حاجة لإثارة العينة. لهذه الأسباب ، تتفوق مناهج اللمعان الحيوي لدراسة PPIs في الجسم الحي على طرق الفلورسنت الشائعة الاستخدام مثل Förster Resonance Energy Transfer (FRET) أو Molecular Fluorescence Complementation (BiFC).
يعتمد بروتوكولنا على إحالة التلألؤ الذي تم الحصول عليه لمزيج البروتين ذي الأهمية إلى التلألؤ الذي تم الحصول عليه لمجموعة التحكم. ويشمل هذا الأخير أحد البروتينات التي تم اختبارها والتي يتم دمجها مع جزء أكبر وبروتين تحكم (على سبيل المثال ، HaloTag) ، يندمج مع جزء أصغر. هذا الأخير هو بروتين من أصل بكتيري لا يتوقع أن يتفاعل مع أي من بروتينات الثدييات. استخدام هذا البروتين كعنصر تحكم يضع قيودا على طوبولوجيا أزواج البروتينات المقيمة في غولجي المراد تحليلها. نظرا لأنه في خلايا الثدييات يتم تصنيع هذا البروتين في السيتوبلازم ، يجب أن يكون لكل من البروتينين محل الاهتمام ذيل سيتوبلازمي واحد على الأقل.
ويمكن أن يكون هذا النهج مفيدا بشكل خاص للفحص الأولي لمؤشرات أسعار المنتجين. قد تصبح الطريقة المفضلة عندما يتم التعبير عن بروتينات الاندماج ذات الأهمية عند مستويات غير كافية ببساطة لتطبيق نهج أخرى. وبالمثل ، يمكن أن يكون اختبار تكملة luciferase المجزأة هو الخيار الأفضل إذا تم التعبير عن البروتينات ذات الأهمية بمستويات عالية ، ولكن هذا يؤثر سلبا على توطينها تحت الخلوي أو من المعروف أنه يفرض تفاعلات غير محددة. نظرا لأن الجزء الأصغر يحتوي على 11 حمضا أمينيا فقط ، يمكن تطبيق اختبار تكملة luciferase المنقسم عند استخدام علامات أكبر أمر مستحيل. وأخيرا، يمكن استخدامه لزيادة تأكيد البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام تقنيات أخرى، كما هو الحال في الحالة المعروضة هنا.
هنا نقدم بروتوكولا مفصلا يتيح عرض المجمعات غير المتجانسة التي تشكلت بين بروتينات الغشاء من النوع الثالث المقيمة في غولجي ، مثل NSTs ، باستخدام فحص تكملة luciferase المنقسمة. يتضمن النهج المقترح لتحليل البيانات وتفسيرها ربط التلألؤ الذي تم الحصول عليه لمزيج البروتين ذي الأهمية بالتلألؤ الذي تم ?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من خلال المنحة رقم 2016/23/D/NZ3/01314 من المركز الوطني للعلوم (NCN) ، كراكوف ، بولندا.
0.25% trypsin-EDTA solution | |||
Adherent mammalian cell line | |||
BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid | Corning | 356651 | |
Cell culture centrifuge | |||
Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin) | |||
CO2 incubator | |||
Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments | |||
FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader) | Promega | GM3000 | |
Growth medium dedicated to the cell line used | |||
Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification) | |||
NanoBiT MCS Starter System | Promega | N2014 | This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair. |
Nano-Glo Live Cell Assay System | Promega | N2011 | This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer. |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Gibco | 11058021 | |
Oribital shaker | |||
Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism) | |||
Thermocycler |