MS2-affinitetsrensing kombinert med RNA-sekvensering i Gram-positive bakterier
Summary
MAPS-teknologi er utviklet for å undersøke målomet til en bestemt regulatorisk RNA in vivo. SRNA av interesse er merket med en MS2-aptamer som muliggjør samtidig rensing av sine RNA-partnere og deres identifikasjon ved RNA-sekvensering. Denne modifiserte protokollen er spesielt egnet for Gram-positive bakterier.
Abstract
Selv om små regulatoriske RNAer (sRNAer) er utbredt blant livets bakterielle domene, forblir funksjonene til mange av dem dårlig preget på grunn av vanskeligheten med å identifisere mRNA-målene. Her beskrev vi en modifisert protokoll for MS2-Affinity Purification kombinert med RNA Sequencing (MAPS)-teknologi, med sikte på å avsløre alle RNA-partnere til en bestemt sRNA in vivo. I stor grad er MS2-aptameren smeltet sammen til 5’s ekstremitet av sRNA av interesse. Denne konstruksjonen uttrykkes deretter in vivo, slik at MS2-sRNA kan samhandle med sine cellulære partnere. Etter bakteriell høsting blir cellene mekanisk lyset. Råekstraktet lastes inn i en amylosebasert kromatografikolonne som tidligere var belagt med MS2-proteinet smeltet til maltosebindende protein. Dette gjør det mulig å fange MS2-sRNA og samhandle med RNAer. Etter elution identifiseres korensede RNAer ved RNA-sekvensering med høy gjennomstrømning og påfølgende bioinformatisk analyse. Følgende protokoll er implementert i Gram-positivt menneskelig patogen Staphylococcus aureus og er i prinsippet transponerbar til noen Gram-positive bakterier. For å oppsummere utgjør MAPS-teknologi en effektiv metode for å utforske det regulatoriske nettverket til en bestemt sRNA, og tilbyr et øyeblikksbilde av hele målomet. Det er imidlertid viktig å huske på at putative mål identifisert av MAPS fortsatt må valideres av komplementære eksperimentelle tilnærminger.
Introduction
Hundrevis, kanskje til og med tusenvis av små regulatoriske RNAer (sRNAer) har blitt identifisert i de fleste bakterielle genomer, men funksjonene til de aller fleste av dem forblir ukarakteriserte. Totalt sett er sRNAer korte ikke-kodende molekyler, som spiller hovedroller i bakteriefysiologi og tilpasning til svingende miljøer1,2,3. Faktisk er disse makromolekylene i sentrum av mange intrikate regulatoriske nettverk, som påvirker metabolske veier, stressresponser, men også virulens og antibiotikaresistens. Logisk sett utløses syntesen av spesifikke miljøstimuli (f.eks. næringssulten, oksidativ eller membranspenninger). De fleste sRNAer regulerer flere mål-mRNAer på posttranskripsjonsnivå gjennom kort og ikke-sammenhengende baseparing. De forhindrer vanligvis oversettelsesstart ved å konkurrere med ribosomer for oversettelsesstartregion4. Dannelsen av sRNA:mRNA duplekser resulterer også ofte i aktiv nedbrytning av målet mRNA ved rekruttering av spesifikke RNases.
Karakteriseringen av et sRNA-målome (dvs. hele settet av mål-RNAene) tillater identifisering av metabolske veier der den griper inn og det potensielle signalet det svarer på. Følgelig kan funksjonene til en bestemt sRNA generelt utledes fra målomet. Til dette formål er flere i silico prediksjonsverktøy utviklet som IntaRNA og CopraRNA5,6,7. De er spesielt avhengige av sekvens komplementaritet, paring energi og tilgjengelighet av det potensielle interaksjonsstedet for å bestemme putative sRNA-partnere. Prediksjonsalgoritmer integrerer imidlertid ikke alle faktorer som påvirker baseparing in vivo, for eksempel involvering av RNA-anstander8 som favoriserer sub-optimale interaksjoner eller begge partneres meduttrykk. På grunn av deres iboende begrensninger forblir den falske positive frekvensen av prediksjonsverktøy høye. De fleste eksperimentelle store tilnærminger er basert på korensing av sRNA: mRNA-par som samhandler med et merket RNA-bindende protein (RBP)6,9. Metoden RNA Interaction by Ligation and sequencing (RIL-seq) identifiserte for eksempel RNA-duplekser som ble renset sammen med RNA-anstander som Hfq og ProQ i Escherichia coli10,11. En lignende teknologi kalt UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) ble brukt på RNase E- og Hfq-tilknyttede sRNAer i E. coli12,13. Til tross for de godt beskrevne rollene til Hfq og ProQ i sRNA-mediert regulering i flere bakterier8,14,15, ser sRNA-basert regulering ut til å være RNA-chaperone-uavhengig i flere organismer som S. aureus16,17,18. Selv om rensing av RNA-duplekser i forbindelse med RNases er mulig som demonstrert av Waters og kolleger13, forblir dette vanskelig ettersom RNases utløser deres raske nedbrytning. Derfor utgjør MS2-Affinity Purification kombinert med RNA Sequencing (MAPS) tilnærming19,20 et solid alternativ i slike organismer.
I motsetning til ovennevnte metoder bruker MAPS en bestemt sRNA som agn for å fange alle interagerende RNAer og er derfor ikke avhengige av involvering av en RBP. Hele prosessen er avbildet i figur 1. Kort sagt, sRNA er merket på 5 ‘ med MS2 RNA aptamer som er spesielt anerkjent av MS2-frakkproteinet. Dette proteinet er smeltet sammen med maltosebindingsproteinet (MBP) som skal immobiliseres på en amyloseharpiks. Derfor beholdes MS2-sRNA og dets RNA-partnere på affinitetskromatografikolonnen. Etter elution med maltose identifiseres korensede RNAer ved hjelp av RNA-sekvensering med høy gjennomstrømning etterfulgt av bioinformatisk analyse (figur 2). MAPS-teknologien tegner til slutt et samhandlende kart over alle potensielle interaksjoner som forekommer in vivo.
MAPS-teknologi ble opprinnelig implementert i den ikke-patogene Gram-negative bakterien E. coli21. Bemerkelsesverdig nok bidro MAPS til å identifisere et tRNA-avledet fragment som spesifikt samhandler med både RyhB- og RybB-sRNAer og forhindrer sRNA-transkripsjonsstøy for å regulere mRNA-mål under ikke-induserende forhold. Deretter er MAPS brukt på andre E. coli sRNAer som DsrA22, RprA23, CyaR23 og GcvB24 (Tabell 1). I tillegg til å bekrefte tidligere kjente mål, utvidet MAPS målomet for disse kjente sRNAene. Nylig har MAPS blitt utført i Salmonella Typhimurium og avslørt at SraL sRNA binder seg til rho mRNA, koding for en transkripsjonsavslutningsfaktor25. Gjennom denne sammenkoblingen beskytter SraL rho mRNA mot den for tidlige transkripsjonsavslutningen utløst av Rho selv. Interessant nok er denne teknologien ikke begrenset til sRNAer og kan brukes på alle typer cellulære RNAer som eksemplifisert ved bruk av et tRNA-avledet fragment26 og en 5′-untranslated region av mRNA22 (Tabell 1).
MAPS-metoden er også tilpasset den patogene Gram-positive bakterien S. aureus19. Spesielt har lysisprotokollen blitt mye modifisert for effektivt å bryte celler på grunn av en tykkere cellevegg enn Gram-negative bakterier og for å opprettholde RNA-integritet. Denne tilpassede protokollen løste allerede interactomen til RsaA27, RsaI28 og RsaC29. Denne tilnærmingen ga innsikt i disse sRNAenes avgjørende rolle i regulatoriske mekanismer for celleoverflateegenskaper, glukoseopptak og oksidative stressresponser.
Protokollen utviklet og implementert i E. coli i 2015 har nylig blitt beskrevet i detalj30. Her tilbyr vi den modifiserte MAPS-protokollen, som er spesielt egnet for å studere sRNA-regulatoriske nettverk i Gram-positive (tykkere cellevegg) bakterier, enten ikke-patogene eller patogene (sikkerhetsforanstaltninger).
Protocol
Representative Results
Discussion
En modifisert protokoll for Gram-positive bakterier
Den første protokollen til MAPS ble utviklet for å studere sRNA interactome i modellorganismen E. coli20,30. Her beskriver vi en modifisert protokoll som er egnet for karakterisering av sRNA-avhengige regulatoriske nettverk i det opportunistiske menneskelige patogenet S. aureus og er absolutt transponerbart for andre Gram-positive bakterier, patogene eller ikke.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av “Agence Nationale de la Recherche” (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH og ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, til PR). Det har også blitt publisert under rammen av labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 og anr-17-EURE- 0023 (til PR), som finansiering fra staten administrert av ANR som en del av investeringene for det fremtidige programmet. DL ble støttet av EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 under Marie Skłodowska-Curie Grant Agreement No. 753137-SaRNAReg. Arbeidet i E. Massé Lab har blitt støttet av driftsstipend fra Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) og National Institutes of Health NIH Team Grant R01 GM092830-06A1.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Starstedt | 72.691 | |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | RNA quantity and quality |
| 250 mL culture flask | Dominique Dutscher | 2515074 | Bacterial cultures |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | 352051 | Culture centrifugation |
| Absolute ethanol | VWR Chemicals | 20821.321 | RNA extraction and purification |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | Bacterial pelleting | |
| Ampicilin (amp) | Sigma-Aldrich | A9518-5G | Growth medium |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | MS2-affinity purification |
| Anti-dioxigenin AP Fab fragment | Sigma Aldrich | 11093274910 | Northern blot assays |
| Autoradiography cassette | ThermoFisher Scientific | 50-212-726 | Northern blot assays |
| BamHI | ThermoFisher Scientific | ER0051 | Plasmid construction |
| BHI (Brain Heart Infusion) Broth | Sigma-Aldrich | 53286 | Growth medium |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | Northern blot assays |
| CDP-Star | Sigma Aldrich | 11759051001 | Northern blot assays (substrate) |
| Centrifuge 5415 R | Eppendorf | RNA extraction and purification | |
| Chloroform | Dominique Dutscher | 508320-CER | RNA extraction and purification |
| DIG-RNA labelling mix | Sigma-Aldrich | 11277073910 | Northern blot assays |
| DNase I | Roche | 4716728001 | DNase treatment |
| Erythromycin (ery) | Sigma-Aldrich | Fluka 45673 | Growth medium |
| FastPrep device | MP Biomedicals | 116004500 | Mechanical lysis |
| Guanidium Thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277-250G | Northern blot assays |
| Hybridization Hoven Hybrigene | Techne | FHB4DD | Northern blot assays |
| Hybridization tubes | Techne | FHB16 | Northern blot assays |
| Isoamyl alcohol | Fisher Scientific | A/6960/08 | RNA extraction and purification |
| LB (Lysogeny Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | Growth medium |
| Lysing Matrix B Bulk | MP Biomedicals | 6540-428 | Mechanical lysis |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | Plasmid construction |
| Milli-Q water device | Millipore | Z00QSV0WW | Ultrapure water |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | RNA/DNA quantity and quality | |
| Nitrocellulose membrane | Dominique Dutsher | 10600002 | Northern blot assays |
| Phembact Neutre | PHEM Technologies | BAC03-5-11205 | Cleaning and decontamination |
| Phenol | Carl Roth | 38.2 | RNA extraction and purification |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | Plasmid construction |
| pMBP-MS2 | Addgene | 65104 | MS2-MBP production |
| Poly-Prep chromatography column | BioRad | 7311550 | MS2-affinity purification |
| PstI | ThermoFisher Scientific | ER0615 | Plasmid construction |
| Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | RNA quantity |
| RNAPro Solution | MP Biomedicals | 6055050 | Mechanical lysis |
| ScriptSeq Complete Kit | Illumina | BB1224 | Preparation of cDNA librairies |
| Spectrophotometer Genesys 20 | ThermoFisher Scientific | 11972278 | Bacterial cultures |
| SpeedVac Savant vacuum device | ThermoFisher Scientific | DNA120 | RNA extraction and purification |
| Stratalinker UV Crosslinker 1800 | Stratagene | 400672 | Northern blot assays |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher Scientific | EL0014 | Plasmid construction |
| TBE (Tris-Borate-EDTA) | Euromedex | ET020-C | Northern blot assays |
| ThermalCycler T100 | BioRad | 1861096 | Plasmid construction |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416-100ML | Northern blot assays |
| X-ray film processor | hu.q | HQ-350XT | Northern blot assays |
| X-ray films Super RX-N | FujiFilm | 4741019318 | Northern blot assays |
References
- Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action. Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).
- Hör, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G. Trans-Acting Small RNAs and Their Effects on Gene Expression in Escherichia coli and Salmonella enterica. EcoSal Plus. 9 (1), (2020).
- Desgranges, E., Marzi, S., Moreau, K., Romby, P., Caldelari, I. Noncoding RNA. Microbiology Spectrum. 7 (2), (2019).
- Adams, P. P., Storz, G. Prevalence of small base-pairing RNAs derived from diverse genomic loci. Biochimica et Biophysica Acta – Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (7), 194524 (2020).
- Pain, A., et al. An assessment of bacterial small RNA target prediction programs. RNA Biology. 12 (5), 509-513 (2015).
- Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S., Lalaouna, D. Navigation through the twists and turns of RNA sequencing technologies: Application to bacterial regulatory RNAs. Biochimica et Biophysica Acta – Gene Regulatory Mechanisms. , 194506 (2020).
- Wright, P. R., et al. CopraRNA and IntaRNA: predicting small RNA targets, networks and interaction domains. Nucleic Acids Research. 42, 119-123 (2014).
- Smirnov, A., Schneider, C., Hor, J., Vogel, J. Discovery of new RNA classes and global RNA-binding proteins. Current Opinion in Microbiology. 39, 152-160 (2017).
- Saliba, A. E., Santos, S., Vogel, J. New RNA-seq approaches for the study of bacterial pathogens. Current Opinion in Microbiology. 35, 78-87 (2017).
- Melamed, S., Adams, P. P., Zhang, A., Zhang, H., Storz, G. RNA-RNA Interactomes of ProQ and Hfq Reveal Overlapping and Competing Roles. Molecular Cell. 77 (2), 411-425 (2020).
- Melamed, S., et al. Global Mapping of Small RNA-Target Interactions in Bacteria. Molecular Cell. 63 (5), 884-897 (2016).
- Iosub, I. A., et al. Hfq CLASH uncovers sRNA-target interaction networks linked to nutrient availability adaptation. Elife. 9, (2020).
- Waters, S. A., et al. Small RNA interactome of pathogenic E. revealed through crosslinking of RNase E. The EMBO Journal. 36 (3), 374-387 (2017).
- Dos Santos, R. F., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. New molecular interactions broaden the functions of the RNA chaperone Hfq. Current Genetics. , (2019).
- Kavita, K., de Mets, F., Gottesman, S. New aspects of RNA-based regulation by Hfq and its partner sRNAs. Current Opinion in Microbiology. 42, 53-61 (2018).
- Bohn, C., Rigoulay, C., Bouloc, P. No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus. BMC Microbiology. 7, 10 (2007).
- Jousselin, A., Metzinger, L., Felden, B. On the facultative requirement of the bacterial RNA chaperone, Hfq. Trends in Microbiology. 17 (9), 399-405 (2009).
- Olejniczak, M., Storz, G. ProQ/FinO-domain proteins: another ubiquitous family of RNA matchmakers. Molecular Microbiology. 104 (6), 905-915 (2017).
- Lalaouna, D., Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S. Chapter Sixteen – MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach in the Human Pathogen Staphylococcus aureus. Methods in Enzymology. 612, 393-411 (2018).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. Identification of unknown RNA partners using MAPS. Methods. 117, 28-34 (2017).
- Lalaouna, D., et al. A 3′ external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise. Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).
- Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli. Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).
- Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome. Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).
- Silva, I. J., et al. SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).
- Lalaouna, D., Masse, E. Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology. Genomics Data. 5, 136-138 (2015).
- Tomasini, A., et al. The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms. Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).
- Bronesky, D., et al. A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus. The EMBO Journal. 38 (6), (2019).
- Lalaouna, D., et al. RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation. Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).
- Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).
- Garibyan, L., Avashia, N. Polymerase chain reaction. Journal of Investigative Dermatology. 133 (3), 1-4 (2013).
- Revie, D., Smith, D. W., Yee, T. W. Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions. Nucleic Acids Research. 16 (21), 10301-10321 (1988).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).
- Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
- Grosser, M. R., Richardson, A. R. Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis. Methods in Molecular Biology. 1373, 51-57 (2016).
- Krumlauf, R. Northern blot analysis. Methods in Molecular Biology. 58, 113-128 (1996).
- Koontz, L. Agarose gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 529, 35-45 (2013).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Reseaerch. 44, 3-10 (2016).
- Jagodnik, J., Brosse, A., Le Lam, T. N., Chiaruttini, C., Guillier, M. Mechanistic study of base-pairing small regulatory RNAs in bacteria. Methods. 117, 67-76 (2017).
- Mann, M., Wright, P. R., Backofen, R. IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions. Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).
- Georg, J., et al. The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs. Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).
