Summary
MAPS-teknologi er utviklet for å undersøke målomet til en bestemt regulatorisk RNA in vivo. SRNA av interesse er merket med en MS2-aptamer som muliggjør samtidig rensing av sine RNA-partnere og deres identifikasjon ved RNA-sekvensering. Denne modifiserte protokollen er spesielt egnet for Gram-positive bakterier.
Abstract
Selv om små regulatoriske RNAer (sRNAer) er utbredt blant livets bakterielle domene, forblir funksjonene til mange av dem dårlig preget på grunn av vanskeligheten med å identifisere mRNA-målene. Her beskrev vi en modifisert protokoll for MS2-Affinity Purification kombinert med RNA Sequencing (MAPS)-teknologi, med sikte på å avsløre alle RNA-partnere til en bestemt sRNA in vivo. I stor grad er MS2-aptameren smeltet sammen til 5's ekstremitet av sRNA av interesse. Denne konstruksjonen uttrykkes deretter in vivo, slik at MS2-sRNA kan samhandle med sine cellulære partnere. Etter bakteriell høsting blir cellene mekanisk lyset. Råekstraktet lastes inn i en amylosebasert kromatografikolonne som tidligere var belagt med MS2-proteinet smeltet til maltosebindende protein. Dette gjør det mulig å fange MS2-sRNA og samhandle med RNAer. Etter elution identifiseres korensede RNAer ved RNA-sekvensering med høy gjennomstrømning og påfølgende bioinformatisk analyse. Følgende protokoll er implementert i Gram-positivt menneskelig patogen Staphylococcus aureus og er i prinsippet transponerbar til noen Gram-positive bakterier. For å oppsummere utgjør MAPS-teknologi en effektiv metode for å utforske det regulatoriske nettverket til en bestemt sRNA, og tilbyr et øyeblikksbilde av hele målomet. Det er imidlertid viktig å huske på at putative mål identifisert av MAPS fortsatt må valideres av komplementære eksperimentelle tilnærminger.
Introduction
Hundrevis, kanskje til og med tusenvis av små regulatoriske RNAer (sRNAer) har blitt identifisert i de fleste bakterielle genomer, men funksjonene til de aller fleste av dem forblir ukarakteriserte. Totalt sett er sRNAer korte ikke-kodende molekyler, som spiller hovedroller i bakteriefysiologi og tilpasning til svingende miljøer1,2,3. Faktisk er disse makromolekylene i sentrum av mange intrikate regulatoriske nettverk, som påvirker metabolske veier, stressresponser, men også virulens og antibiotikaresistens. Logisk sett utløses syntesen av spesifikke miljøstimuli (f.eks. næringssulten, oksidativ eller membranspenninger). De fleste sRNAer regulerer flere mål-mRNAer på posttranskripsjonsnivå gjennom kort og ikke-sammenhengende baseparing. De forhindrer vanligvis oversettelsesstart ved å konkurrere med ribosomer for oversettelsesstartregion4. Dannelsen av sRNA:mRNA duplekser resulterer også ofte i aktiv nedbrytning av målet mRNA ved rekruttering av spesifikke RNases.
Karakteriseringen av et sRNA-målome (dvs. hele settet av mål-RNAene) tillater identifisering av metabolske veier der den griper inn og det potensielle signalet det svarer på. Følgelig kan funksjonene til en bestemt sRNA generelt utledes fra målomet. Til dette formål er flere i silico prediksjonsverktøy utviklet som IntaRNA og CopraRNA5,6,7. De er spesielt avhengige av sekvens komplementaritet, paring energi og tilgjengelighet av det potensielle interaksjonsstedet for å bestemme putative sRNA-partnere. Prediksjonsalgoritmer integrerer imidlertid ikke alle faktorer som påvirker baseparing in vivo, for eksempel involvering av RNA-anstander8 som favoriserer sub-optimale interaksjoner eller begge partneres meduttrykk. På grunn av deres iboende begrensninger forblir den falske positive frekvensen av prediksjonsverktøy høye. De fleste eksperimentelle store tilnærminger er basert på korensing av sRNA: mRNA-par som samhandler med et merket RNA-bindende protein (RBP)6,9. Metoden RNA Interaction by Ligation and sequencing (RIL-seq) identifiserte for eksempel RNA-duplekser som ble renset sammen med RNA-anstander som Hfq og ProQ i Escherichia coli10,11. En lignende teknologi kalt UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) ble brukt på RNase E- og Hfq-tilknyttede sRNAer i E. coli12,13. Til tross for de godt beskrevne rollene til Hfq og ProQ i sRNA-mediert regulering i flere bakterier8,14,15, ser sRNA-basert regulering ut til å være RNA-chaperone-uavhengig i flere organismer som S. aureus16,17,18. Selv om rensing av RNA-duplekser i forbindelse med RNases er mulig som demonstrert av Waters og kolleger13, forblir dette vanskelig ettersom RNases utløser deres raske nedbrytning. Derfor utgjør MS2-Affinity Purification kombinert med RNA Sequencing (MAPS) tilnærming19,20 et solid alternativ i slike organismer.
I motsetning til ovennevnte metoder bruker MAPS en bestemt sRNA som agn for å fange alle interagerende RNAer og er derfor ikke avhengige av involvering av en RBP. Hele prosessen er avbildet i figur 1. Kort sagt, sRNA er merket på 5 ' med MS2 RNA aptamer som er spesielt anerkjent av MS2-frakkproteinet. Dette proteinet er smeltet sammen med maltosebindingsproteinet (MBP) som skal immobiliseres på en amyloseharpiks. Derfor beholdes MS2-sRNA og dets RNA-partnere på affinitetskromatografikolonnen. Etter elution med maltose identifiseres korensede RNAer ved hjelp av RNA-sekvensering med høy gjennomstrømning etterfulgt av bioinformatisk analyse (figur 2). MAPS-teknologien tegner til slutt et samhandlende kart over alle potensielle interaksjoner som forekommer in vivo.
MAPS-teknologi ble opprinnelig implementert i den ikke-patogene Gram-negative bakterien E. coli21. Bemerkelsesverdig nok bidro MAPS til å identifisere et tRNA-avledet fragment som spesifikt samhandler med både RyhB- og RybB-sRNAer og forhindrer sRNA-transkripsjonsstøy for å regulere mRNA-mål under ikke-induserende forhold. Deretter er MAPS brukt på andre E. coli sRNAer som DsrA22, RprA23, CyaR23 og GcvB24 (Tabell 1). I tillegg til å bekrefte tidligere kjente mål, utvidet MAPS målomet for disse kjente sRNAene. Nylig har MAPS blitt utført i Salmonella Typhimurium og avslørt at SraL sRNA binder seg til rho mRNA, koding for en transkripsjonsavslutningsfaktor25. Gjennom denne sammenkoblingen beskytter SraL rho mRNA mot den for tidlige transkripsjonsavslutningen utløst av Rho selv. Interessant nok er denne teknologien ikke begrenset til sRNAer og kan brukes på alle typer cellulære RNAer som eksemplifisert ved bruk av et tRNA-avledet fragment26 og en 5'-untranslated region av mRNA22 (Tabell 1).
MAPS-metoden er også tilpasset den patogene Gram-positive bakterien S. aureus19. Spesielt har lysisprotokollen blitt mye modifisert for effektivt å bryte celler på grunn av en tykkere cellevegg enn Gram-negative bakterier og for å opprettholde RNA-integritet. Denne tilpassede protokollen løste allerede interactomen til RsaA27, RsaI28 og RsaC29. Denne tilnærmingen ga innsikt i disse sRNAenes avgjørende rolle i regulatoriske mekanismer for celleoverflateegenskaper, glukoseopptak og oksidative stressresponser.
Protokollen utviklet og implementert i E. coli i 2015 har nylig blitt beskrevet i detalj30. Her tilbyr vi den modifiserte MAPS-protokollen, som er spesielt egnet for å studere sRNA-regulatoriske nettverk i Gram-positive (tykkere cellevegg) bakterier, enten ikke-patogene eller patogene (sikkerhetsforanstaltninger).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Buffere og medier
- For MAPS-eksperimenter klargjør du følgende buffere og medier:
- Buffer A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl2 og 1 mM DTT)
- Buffer E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltose, 0,1% Triton, 1 mM MgCl2 og 1 mM DTT)
- RNA-lastebuffer (0,025 % xylencyaniol og 0,025 % bromofenolblå i 8 M urea)
- Hjernehjerteinfusjon (BHI) medium (12,5 g kalvehjerne, 10 g pepton, 5 g biffhjerte, 5 g NaCl, 2,5 g Na2HPO4 og 2 g glukose for 1 L)
- Lysogeny Buljong (LB) medium (10 g peptone, 5 g gjærekstrakt og 10 g NaCl for 1 L) - For nordlige blotanalyser, lag følgende buffere:
- Blokkeringsløsning (1x malesyre og 1% blokkerende reagens)
- Hybridiseringsløsning (50% formamid, 5x SSC, 7% SDS, 1% blokkeringsløsning og 0,2% N-laurylsarkosin, 50 mM natriumfosfat). Varm med agitasjon for å oppløse.
FORSIKTIG: Følg nøye sikkerhetsforanstaltningene knyttet til hvert produkt.
- 1 M natriumfosfat (58 mM natriumfosfatdibasisk og 42 mM natriumfosfatmonobasisk)
- Saltvannsbuffer, natriumsitratbuffer (SSC), 20x konsentrat (3 M NaCl og 300 mM trinatriumsitrat)
2. Sikkerhetsproblemer
- Utfør alle trinn som involverer levedyktige patogene bakterier i et nivå 2 inneslutningslaboratorium.
MERK: Bare celleekstrakter kan tas utenfor etter lysis (trinn 5). - Ta på deg en labfrakk og hansker.
- Sørg for at håndleddene er dekket.
- Rengjør det biologiske sikkerhetsskapet (klasse II) med en desinfiserende løsning.
- Kast fast avfall som er utsatt for bakterier i den aktuelle biomedisinske beholderen.
- Behandle kolber som inneholder forurensede væsker med en desinfiserende løsning. Kast den deretter i en vask.
- Vask hendene og håndleddene forsiktig med såpe og fjern labfrakken før du forlater nivå 2 inneslutningslaboratoriet.
3. Plasmid konstruksjon
MERK: For kloningsformål er det avgjørende å først identifisere grensene for den endogene sRNA. pCN51-P3 og pCN51-P3-MS2 plasmider er beskrevet i Tomasini et al. (2017)27. P3-promotoren tillater høyt uttrykk for sRNA på en celletetthetsavhengig måte (dvs. når bakterier kommer inn i den stasjonære vekstfasen). Mange stafylokokker akkumuleres i denne vekstfasen.
- Forsterk SRNA-sekvensen av PCR ved hjelp av en dna-polymerase med høy kvalitet og en PCR-maskin. Følg produsentens instruksjoner nøye og les Garibyan og Avashia (2013)31 for mer informasjon.
- Bruk følgende maler til å utforme de bestemte primerne:
og 5'-CGCGGATCC(N)-3' for henholdsvis forover og bakover primere.
MERK: Disse oligonukleotidene gjør det mulig å smelte sammen MS2-sekvensen (i fet skrift) til 5' enden av sRNA av interesse. PST Jeg og BamHI restriksjonssteder (understreket) er lagt til på 5 ' og 3 'ekstremiteter av MS2-sRNA konstruert for å klone amplikon i pCN51-P3 plasmid27. (N) tilsvarer den genspesifikke sekvensen (15-20 nukleotider). - Fordøye 1 μg pCN51-P3 plasmid og 1 μg av MS2-sRNA PCR-produktet med 2 U pstI og 1 U av BamHI i riktig buffer i henhold til produsentens anbefalinger.
- Inkuber 1 time ved 37 °C og rens DNA ved hjelp av et PCR-rensesett (se Materialfortegnelse).
- Bland den fordøyde pCN51-P3-plasmiden (300 ng) og MS2-sRNA-amlikon (molarforhold for vektor:innsats = 1:3) i et 1,5 ml rør. Se Revie et al. (1988)32 for å maksimere ligasjonseffektiviteten. Tilsett 1 μL av Ligase Buffer og 10 U av T4 Ligase i hvert rør. Juster volumet til 10 μL med ultrarent vann.
- Inkuber ved 22 °C i minst 2 timer.
- Tilsett 5 μL ligasjonsblanding til 50 μL frossen DH5α kjemisk kompetente E. coli-celler. Les Seidman et al. (2001)33 for å lære mer om plasmidtransformasjon og kjemisk kompetente celler.
- Inkuber 30 min på is.
- Varmesjokk (45 s ved 42 °C) forvandlingsrøret ved hjelp av en varmeblokk eller et vannbad.
- Tilsett 900 μL LB medium og inkuber ved 37 °C i 30 minutter.
- Plate 100 μL av bakteriell suspensjon på en LB agar plate supplert med ampicillin (100 μg / μL).
MERK: pCN51-P3-vektoren koder et ampicillinresistensgen, som gjør det mulig å velge bare E. coli-kloner som bærer pCN51-P3-MS2-sRNA-plasmid. - Trekk ut pCN51-P3-MS2-sRNA-plasmid fra en bakteriekultur over natten (5 ml) som vokser i nærvær av ampicillin (100 μg/μL) ved hjelp av et plasmid DNA miniprep-sett (se Materialfortegnelse).
- Kontroller konstruksjonen ved sangersekvensering34 ved hjelp av følgende primer, 5'-TCTCGAAAATAATAGAGGG-3'.
- Forvandle pCN51-P3-MS2-sRNA-plasmid til DC10B kjemisk kompetente E. coli-celler. Gjenta trinn 3.7 til 3.11.
- Trekk ut pCN51-P3-MS2-sRNA-plasmiden (se trinn 3.12) og transformer 1-5 μg plasmid-DNA til HG001 ΔsRNA elektrokompetente S. aureusceller ved hjelp av et elektroporasjonsapparat. Følg produsentens instruksjoner nøye. Les Grosser og Richardson (2016)35 for å lære mer om metoder for å forberede elektrokompetent S. aureus.
FORSIKTIG: Dette trinnet innebærer håndtering av patogene bakterier (se trinn 2). - Tilsett 900 μL BHI medium og inkuber ved 37 °C i 3 timer.
- Sentrifuge 1 min ved 16 000 x g. Kast supernatanten.
- Resuspend pellet i 100 μL BHI og plate bakteriell suspensjon på BHI agar plater supplert med erytromycin (10 μg / μL).
MERK: pCN51-P3-vektoren koder også et erytromycinresistensgen, som gjør det mulig å velge bare S. aureus kloner som bærer pCN51-P3-MS2-sRNA plasmid.
4. Bakterier høsting
FORSIKTIG: Dette trinnet innebærer håndtering av patogene bakterier (se trinn 2).
- Vokse en koloni av stammer som bærer enten pCN51-P3-MS2-sRNA eller pCN51-P3-MS227 plasmider i 3 ml BHI medium supplert med erytromycin (10 μg / μL) i duplikater.
- Fortynn hver nattkultur i 50 ml (≈1/100) ferskt BHI-medium supplert med erytromycin (10 μg/μL) for å nå en OD600nm på 0,05. Bruk 250 ml steriliserte kolber (5:1 kolbe-til-middels-forhold).
MERK: Middels og vekstforhold bør stilles inn i henhold til uttrykksmønsteret til den studerte sRNA. - Vokse kulturer ved 37 °C med risting ved 180 o/min i 6 timer.
- Overfør hver kultur til et 50 ml sentrifugerør.
- Sentrifuge ved 2900 x g i løpet av 15 min ved 4 °C. Kast supernatanten.
- Hold pellets på is og utfør mekanisk cellelys (trinn 5) eller frys og oppbevar pellets ved -80 °C.
5. Mekanisk cellelys
FORSIKTIG: Følgende trinn må utføres på is og buffere må være ved 4 °C. Bruk hansker og ta alle forholdsregler for å beskytte prøver mot RNases.
- Resuspendpellets (trinn 4.6) i 5 ml buffer A.
- Overfør de resuspenderte cellene i 15 ml sentrifugerør med 3,5 g silikaperler (0,1 mm).
- Sett rørene inn i et mekanisk cellelysinstrument (se Materialtabell). Kjør en syklus på 40 s ved 4,0 m/s.
MERK: Hvis en syklus ikke er nok til å bryte celler, la enheten avkjøles i 5 minutter mens du holder prøver på is. Gjenta deretter en ny syklus på 40 s ved 4,0 m/s. Effektiviteten til cellelyset kan testes ved å plating supernatanten på BHI-agarplaten. - Sentrifuge ved 15 700 x g i 15 min. Gjenopprett supernatanten og hold den på is.
6. Kolonne forberedelse
FORSIKTIG: Pass på at amyloseharpiksen ikke tørker. Forsegle om nødvendig kolonnen med en endehette. Forbered alle løsningene før du starter affinitetsrensingen.
- Plasser en kromatografikolonne i et kolonnestativ (se Materialliste).
- Fjern kolonnespissen og vask kolonnen med ultrarent vann.
- Tilsett 300 μL amyloseharpiks.
- Vask kolonnen med 10 ml buffer A.
- Fortynn 1200 pmol av MBP-MS2 protein i 6 ml buffer A og last det inn i kolonnen.
- Vask kolonnen med 10 ml buffer A.
7. RENSing av MS2-affinitet (figur 1)
- Last inn cellelyset i kolonnen.
MERK: Hold 1 ml av cellelyset (rå ekstrakt, CE) for å trekke ut total RNA (trinn 8) og utfør northern blot (trinn 9) og transkripsjonsanalyse (trinn 10). - Samle gjennomstrømningsfraksjonen (FT) i et rent oppsamlingsrør.
- Vask kolonnen 3 ganger med 10 ml buffer A. Samle vaskefraksjonen (W).
- Elute kolonnen med 1 ml Buffer E og samle elution brøkdel (E) i en 2 ml mikrotube.
- Hold alle oppsamlede fraksjoner på is til RNA ekstraksjon (trinn 8) eller frys dem ved -20 °C for senere bruk.
8. RNA-ekstraksjon av innsamlede fraksjoner (CE, FT, W og E)
- Bruk 1 ml av hver brøkdel (inkludert FT og W) for RNA-ekstraksjon.
- Tilsett 1 volum fenol. Bland kraftig.
FORSIKTIG: Fenol er flyktig og etsende, vær oppmerksom og arbeid trygt under en avtrekkshette. - Sentrifuge ved 16.000 x g i 10 min ved 20 °C.
- Overfør den øvre fasen i et rent 2 ml mikrorør.
- Tilsett 1 volum kloroform/isoamylalkohol (24:1) og gjenta trinn 8,3 til 8,4.
FORSIKTIG: Arbeid trygt under en avtrekkshette. - Tilsett 2,5 volumer kaldt etanol 100% og 1/10 volum 3 M natriumacetat (NaOAc) pH 5,2.
- Utfelling over natten ved -20 °C.
MERK: Nedbør kan også utføres i et etanol/tørrisbad i løpet av 20 minutter eller ved -80 °C i løpet av 2 timer. - Sentrifuge ved 16.000 x g i 15 min ved 4 °C. Fjern etanol sakte med en pipette mens du er forsiktig så du ikke forstyrrer pelletsen.
FORSIKTIG: RNA-pelletsen er ikke alltid synlig og er noen ganger løs i nærvær av etanol. - Tilsett 500 μL 80% kaldt etanol.
- Sentrifuge ved 16.000 x g i 5 min ved 4 °C.
- Kast etanol ved å pipettere det sakte. Tørk pelletsen med en vakuumkonsentrator, 5 min i kjøremodus.
- Resuspend pellet i et passende volum (15-50 μL) av ultrapure vann. Frys pelletsen ved -20 °C for senere bruk.
- Vurder RNA-kvantitet (260 nm) og kvalitet (260/280 og 260/230 bølgelengdeforhold) ved hjelp av et spektrofotometer/fluorometer (se Materialtabell). Følg produsentens instruksjoner nøye.
MERK: 3-4 μg oppnås vanligvis i elutionfraksjonen (E). Dette avhenger hovedsakelig av testede forhold.
9. Analyse av MS2-affinitetsrensing ved northern blot36
- Fortynn 5 μg RNA CE, FT, W-fraksjoner og 500 ng E-fraksjon i 10 μL ultrarent vann og bland med 10 μL RNA-lastebuffer.
- Inkuber 3 min ved 90 °C.
- Last prøver i brønner av en 1% agarose gel supplert med 20 mM guanidium thiocyanat og kjør gelen ved 100-150 V i TBE 1x buffer ved 4 °C. Les Koontz (2013)37 for mer informasjon.
- Overfør RNAer på en nitrocellulosemembran ved vakuumoverføring for 1 t eller kapillæritetsoverføring over natten.
MERK: Kapillæritetsmetoden er mer effektiv for store RNAer. - UV-krysskoblings-RNAer på membranen (120 mJ ved 254 nm) ved hjelp av en ultrafiolett krysskobling.
- Sett membranen inn i en hybridiseringsflaske med RNA-siden vendt opp.
- Tilsett 10-20 ml forvarmet hybridiseringsløsning. Inkuber 30 min ved 68 °C.
- Kast oppløsningen og tilsett 10-20 ml fersk hybridiseringsløsning supplert med 1 μL av den sRNA-spesifikke sonden. Inkuber over natten ved 68 °C.
MERK: DEN DIG-merkede RNA-sonden syntetiseres ved hjelp av et DIG RNA-merkesett og i henhold til produsentens anvisninger. Alternativt kan en radiomerket sonde brukes. - Vask membranen med 10-20 ml vaskeoppløsning 1 (2x SSC og 0,1% SDS) i 5 min ved 20 °C. Gjenta én gang.
- Vask membranen med 10-20 ml vaskeoppløsning 2 (0,2x SSC og 0,1% SDS) i 15 min ved 68 °C. Gjenta én gang.
- Inkuber med 10-20 ml blokkeringsløsning i minst 30 min ved 20 °C.
- Kast oppløsningen og tilsett 10-20 ml av blokkeringsløsningen supplert med polyklonal anti-digoksigenin antistoff (1/1000), konjugert til alkalisk fosfatase. Inkuber 30 min ved 20 °C.
- Vask membranen med 10-20 ml vaskeoppløsning 3 (1x malesyre og 0,3% Tween 20) i 15 min ved 20 °C. Gjenta én gang.
- Inkuber membranen med 10-20 ml av deteksjonsløsningen (0,1 M Tris HCl og 0,1 M NaCl pH 9,5) 5 min ved 20 °C.
- Sett membranen på en plastfilm og suge den med substratet (se Tabell over materialer). Inkuber 5 min i mørket.
- Forsegle membranen i en plastfilm. Sett membranen i en autoradiografikassett.
- Utsett membranen for en autoradiografifilm i det dedikerte mørke rommet.
MERK: Eksponeringstiden avhenger av signalstyrken, fra få sekunder til minutter. - Avslør den eksponerte filmen i en automatisk utviklingsenhet.
10. Klargjøring av prøvene for RNA-sekvensering
MERK: Dette trinnet gjelder bare RNAer hentet fra E- og CE-brøker.
- Legg til hver prøve 10 μL 10x DNase buffer og DNase I (1 U/μg behandlede RNAer). Tilsett vann til et sluttvolum på 100 μL.
- Inkuber 1 time ved 37 °C.
- Trekk ut og rens RNAer som tidligere beskrevet (trinn 8.2 til 8.11).
- Resuspend RNA pellet i 20 μL ultrapure vann.
MERK: Tilstedeværelsen av gjenværende DNA kan kontrolleres ved hjelp av PCR og spesifikke primere (f.eks. 16S gen). - Vurdere RNA-kvantitet og kvalitet ved hjelp av et mikrofluidisk-basert elektroforeseanalysesystem (se Materialfortegnelse).
MERK: 1 μg oppnås vanligvis i elutionfraksjonen (E) etter DNase-behandling. - Fjern ribosomale RNAer med et bakterielt rRNA-uttømmingssett.
MERK: Store og rikelige RNAer (dvs. rRNAer) har en tendens til ikke-spesifikt å samhandle med affinitetskolonnen. 500 ng ekstrahert RNA kreves for å utføre dette trinnet. - Vurder igjen RNA-kvantitet og kvalitet ved hjelp av et mikrofluidisk-basert elektroforeseanalysesystem.
- Forbered cDNA-biblioteker med 10-20 ng ribodepleted RNA ved hjelp av et cDNA-bibliotekforberedelsessett og følg produsentens instruksjoner.
- Sekvenser de oppnådde bibliotekene ved hjelp av et sekvenseringsinstrument (f.eks. en-end, 150 bp; se Materialliste).
MERK: 5-10 millioner leseoperasjoner per prøve er generelt nok.
11. RNAseq dataanalyse (Figur 2)
- Last ned FastQ-sekvenseringsfilene fra sekvenseringsplattformen.
- Tilgang til Galaxy-forekomsten av Roscoff biologiske stasjon (https://galaxy.sb-roscoff.fr/) og logg inn.
MERK: Hver nevnte algoritme kan lett bli funnet ved hjelp av søkefeltet. Det finnes en brukerveiledning for hvert verktøy.
FORSIKTIG: Versjonen av nødvendige verktøy kan avvike fra den offentlige Galaxy-serveren38. - Klikk hent data-ikonet, og last deretter opp fil fra datamaskinen. Last opp FastQ-sekvenseringsfil for hver MS2-kontroll og MS2-sRNA-prøve. Last også opp FASTA referansegenomfil og GFF merknadsfil.
- Kjør Rapporter om lesekvalitet for FastQC (Galaxy Versjon 0.69).
MERK: Dette verktøyet gir en kvalitetsvurdering av råsekvenser (f.eks. kvalitetspoeng, tilstedeværelse av kortsekvenser). - Kjør Trimmomatic fleksibelt lesetrimmeverktøy (Galaxy Versjon 0.36.6) for å fjerne kortsekvenser og leseoperasjoner av dårlig kvalitet. Angi kortsekvenser som brukes til klargjøring av biblioteket (f.eks. Legg til følgende Trimmomatic-operasjoner: SLIDINGWINDOW (Antall baser=4; Gjennomsnittlig kvalitet=20) og MINLEN (Minimumslengde for lesing=20).
- Kjør igjen FastQC Read Quality-rapporter (Galaxy Versjon 0.69).
- Kjør Bowtie2 - kartet leser mot referansegenom (Galaxy Versjon 2.3.2.2). Bruk Genome Reference FASTA-filen fra historikken til å tilordne leseoperasjoner med standardinnstillinger (svært følsom lokal).
MERK: BAM-fil generert av Bowtie2-verktøyet kan visualiseres ved hjelp av Integrative Genomics Viewer (IGV). Tilknyttet BAI-fil vil også være nødvendig. - Eventuelt Kjør Flagstat som kompilerer statistikk for BAM-datasett (Galaxy Versjon 2.0).
- Kjør htseq-count - Count (Galaxy Versjon 0.6.1) som justerer lese overlappende funksjoner i GFF-merknadsfilen. Bruk skjæringspunktmodus (ikke tom).
- Arkiver alle raw counts-filer fra htseq-count-analyse til en enkelt Zip-fil.
- Kjør SARTools DESeq2 for å sammenligne data (Galaxy Versjon 1.6.3.0). Angi ZIP-filen som inneholder RAW-tellefiler og utformingsfilen, en tabulatordelt fil som beskriver eksperimentet. Følg nøye med instruksjonene for å generere designfilen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representative resultatene stammer fra studiet av RsaC-målom i S. aureus29. RsaC er en ukonvensjonell 1116 nt-lang sRNA. Dens 5' slutt inneholder flere gjentatte regioner mens dens 3' slutt (544 nt) er strukturelt uavhengig og inneholder alle anslåtte interaksjonssteder med sine mRNA-mål. Uttrykket av denne sRNA blir indusert når mangan (Mn) er knapp, noe som ofte oppstår i sammenheng med vertsimmun respons. Ved hjelp av MAPS-teknologi identifiserte vi flere mRNAer som samhandler direkte med RsaC, og avslører sin avgjørende rolle i oksidativt stress (sodA, ldh1 og sarA) og metallrelaterte (znuBC-zur og sufCDSUB) svar.
Validering av MS2-sRNA-konstruksjonen og eksperimentelle forhold
Før du utfører MAPS-eksperimenter, er det viktig å bestemme de optimale uttrykksbetingelsene for den studerte sRNA. Hvis en ikke-innfødt promotor brukes, vil den definitivt bidra til å produsere MS2-sRNA-konstruksjonen når målene er til stede. I tillegg bør MS2-sRNA-konstruksjonen valideres nøye med hensyn til størrelse, stabilitet, uttrykk og funksjon. MS2-aptameren ble smeltet sammen til 5' enden av enten RsaC i full lengde (MS2-RsaC1116) eller den kortere formen (MS2-RsaC544) som tilsvarer 3' delen av RsaC. Begge konstruksjonene ble uttrykt in vivo under kontroll av quorumet sensing avhengig P3 promotør i S. aureus HG001 ΔrsaC. Sletting av rsaC-gen unngår en konkurranse mellom den endogene RsaC og MS2-RsaC. Den ville stammen som inneholdt samme vektor med MS2-koden alene, ble brukt som kontroll. Med denne kontrollen kan du trekke fra uspesifiserte samhandlinger som forekommer med MS2-koden.
For å bekrefte konstruksjonene og visualisere deres uttrykksmønster ble bakterieceller høstet etter 2 t, 4 t og 6 h vekst i BHI-medium ved 37 °C. Etter RNA-ekstraksjon ble nordlig blotanalyse utført ved hjelp av RsaC-spesifikk DIG-sonde (figur 3A). Nivået på endogen RsaC (baner 1-3) økte betydelig etter 6 timers vekst, noe som rettferdiggjorde valget av dette tidspunktet for MAPS-eksperimenter. Viktigst, nivåene av MS2-RsaC544 (baner 7-9) og MS2-RsaC1,116 (baner 10-12) var sammenlignbare med endogen RsaC ved 6 timer. Derfor bør de etterligne det endogene uttrykksmønsteret til RsaC. En større, men mindre form for RsaC var distinkt og kan skyldes en ineffektiv slutt på transkripsjonen. Dette fenomenet observeres ofte når en MS2-sRNA uttrykkes under kontroll av en sterk promotor fra en plasmid21. Ingen kortere skjemaer som følge av avvikende transkripsjonsavslutning eller nedbrytning ble observert.
Tillegg av MS2-aptameren ved 5' av sRNAer kan også forstyrre riktig folding og påvirke deres funksjoner. Dette trinnet er kritisk for svært strukturerte sRNAer som RsaC. Derfor bør MS2-sRNA-aktivitet testes og sammenlignes med endogen sRNA når det er mulig. Et tidligere kjent mål eller en observerbar fenotype kan bidra til å overvåke det. For eksempel ble virkningen av RsaC på intracellulær ROS-akkumulering brukt til å validere MS2-RsaC544 og MS2-RsaC1,116 konstruksjoner29.
Analyse av innsamlede brøker under affinitetsrensing
RNAer ble ekstrahert fra CE-, FT- og E-fraksjoner i WT-stamme som uttrykte MS2-taggen alene og ΔrsaC-stammen som uttrykte MS2-RsaC544-konstruksjon. Vi viste ved hjelp av Northern blot analyse at den 1,116 nt-lange endogene RsaC ble beriket i elution brøkdelen, men viste seg å samhandle ikke-spesifikt med affinitetskolonnen (Figur 3B, baner 2-3). Vi observerte det samme fenomenet med MS2-RsaC1116 (data ikke vist). Dette skyldes absolutt lengden og den komplekse sekundære strukturen. Derfor ble bare en mindre strukturert og kortere form (544 nt) av RsaC tilsvarende dens 3 'del brukt til å utføre MAPS-eksperimenter. I figur 3Bble MS2-RsaC544 svært beriket i elutionfraksjonen som viste at den ble beholdt av MS2-MBP-fusjonsproteinet (bane 6). En større, men mindre form for MS2-RsaC544 ble observert som i figur 3A. Her kan strengheten og antall vasker justeres til enten redusert ikke-spesifikk binding eller tvert imot for å begrense tap av ekte interagerende partnere.
Validering av putative mRNA-mål etter MAPS-analyse
Etter bioinformatisk analyse er putative mRNA-mål oppført i henhold til Fold-endringen mellom MS2-sRNA- og MS2-kontroll, oppnådd ved hjelp av DeSeq2 (figur 2). For eksempel foreslo MS2-RsaC544 MAPS-data29 at sodA mRNA, koding for en superoksiddismutase i S. aureus, er et hovedmål (best hit, høyere Fold-change). En northern blot-analyse, utført med en sodA-spesifikkDIG-sonde etter MS2-affinitetsrensing, viser at sodA effektivt ble beriket med MS2-RsaC544 sammenlignet med MS2-kontrollen (figur 3C).
En global transkripsjonsanalyse utføres systematisk på CE-fraksjonen. Sammenligningen av MAPS-data og denne transkripsjonsanalysen bidrar til å justere berikelsesforholdet og avslører et potensielt målhierarki. Faktisk har en dårlig uttrykt mRNA, som er svært beriket etter MS2-affinitetsrensing absolutt en større bindende affinitet enn en svært beriket og høyt uttrykt mRNA.
Det er viktig å merke seg at alle kandidater identifisert av MAPS må valideres individuelt ved hjelp av in vitro- og/eller in vivo-eksperimenter som Electrophoresis Mobility Shift Assays (EMSA) eller reportergenanalyser (se Jagodnik et al. (2017)39 for mer informasjon).
Figur 1. Skjematisk illustrasjon av MAPS-protokollen tilpasset S. aureus. Fra plasmidkonstruksjon til dataanalyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. MAPS-analysearbeidsflyt og behandlede data. Hvert trinn, sjekkpunkt og filformat er representert (se også trinn 11). FastQ format er en tekstfil som består av DNA-sekvenser og tilsvarende kvalitetspoeng. BAM-format er en komprimert fil som inneholder justerte sekvenser. Tabellformat er en tabulatordelt tekstfil med tellinger for hvert gen. Resultatdiagrammet illustrerer hva slags data som innhentes etter bioinformatisk analyse. Presenterte resultater er oppdiktede og stammer ikke fra noen studie. For ytterligere detaljer er grunnleggende opplæringsprogrammer tilgjengelige på Galaxy Project-nettstedet (https://galaxyproject.org/). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Konstruerer validerings- og MAPS-kontroller. A. Northern blot analyse av endogene RsaC sRNA og relaterte MS2 konstruksjoner. WT-stammen bærer pCN51-P3-MS2 (kontroll) og ΔrsaC mutantstamme bære enten pCN51-P3-MS2, pCN51-P3-MS2-RsaC544 eller pCN51-P3-MS2-RsaC1,116. Prøver ble tatt etter 2 timer, 4 timer og 6 timers vekst i BHI ved 37 °C. Nordlige blotanalyser ble utført ved hjelp av en RsaC-spesifikk DIG-sonde. B. Nordlig flekkanalyse av MS2-affinitetsrensingsfraksjoner ved hjelp av en RsaC-spesifikk DIG-sonde. Samtidig rensing ble utført ved hjelp av WT-stammen + pCN51-P3-MS2 (kontroll) og ΔrsaC mutantstamme + pCN51-P3-MS2-RsaC544. Celler ble høstet etter 6 timers vekst i BHI ved 37 °C. Rå ekstrakt (CE), gjennomstrømning (FT), elution (E). C. Northern blot analyse av MS2-affinitet rensing fraksjoner (CE og E) ved hjelp av en sodA-spesifikk DIG sonde. Se (B) hvis du vil ha mer informasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| RNA | type | referanse |
| Escherichia coli | ||
| RyhB | sRNA | Lalaouna et al. (2015)21 |
| RybB | sRNA | Lalaouna et al. (2015) 21 |
| 3'ETSleuZ | tRNA-avledet fragment | Lalaouna og Massé (2015)26 |
| DsrA | sRNA | Lalaouna et al. (2015) 22 |
| Hns | mRNA (5'UTR) | Lalaouna et al. (2015) 22 |
| CyaR | sRNA | Lalaouna et al. (2018) 23 |
| RprA | sRNA | Lalaouna et al. (2018) 23 |
| GcvB | sRNA | Lalaouna et al. (2019) 24 |
| Salmonella Typhimurium | ||
| SraL | sRNA | Silva et al. (2019) 25 |
| Stafylokokker aureus | ||
| RsaA | sRNA | Tomasini et al. (2017) 27 |
| RsaC | sRNA | Lalaouna et al. (2019) 29 |
| RsaI | sRNA | Bronesky et al. (2019) 28 |
Tabell 1. MAPS-teknologi avslørte målgruppen til flere RNAer i ulike organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En modifisert protokoll for Gram-positive bakterier
Den første protokollen til MAPS ble utviklet for å studere sRNA interactome i modellorganismen E. coli20,30. Her beskriver vi en modifisert protokoll som er egnet for karakterisering av sRNA-avhengige regulatoriske nettverk i det opportunistiske menneskelige patogenet S. aureus og er absolutt transponerbart for andre Gram-positive bakterier, patogene eller ikke.
Spesiell oppmerksomhet ble gitt til cellelyset. Den franske pressen har blitt erstattet av et mekanisk cellelysinstrument. Denne metoden er effektiv for å bryte Gram-positive celler og for å begrense risikoen forbundet med håndtering av patogene stammer. For å forbedre utbyttet av MS2-affinitetsrensingen har mengden MS2-MBP immobilisert på amyloseharpiksen blitt drastisk økt. Dette har nødvendig for å justere strengheten og antall vasker.
I motsetning til den første protokollen, utføres MAPS her i duplikat, fra to biologiske replikeringer. Det er utviklet en arbeidsflyt for å implementere statistisk analyse (figur 2), som definitivt øker robustheten til innhentede data.
MS2-konstruksjon og uttrykk
Denne MAPS-protokollen ble opprettet for å identifisere målsonen for stafylokokker. MS2-sRNA-konstruksjonen uttrykkes fra en lavkopiert tallplasmid (pCN51, 20 til 25 kopier/celle) og under kontroll av den quorumssensoravhengige P3-promotoren, hovedsakelig indusert i stasjonær fase. Dette uttrykksmønsteret tilsvarer studerte sRNAer i S. aureus (dvs. RsaA, RsaI og RsaC) og sikrer en ganske sterk MS2-sRNA-syntese. Vi kan imidlertid ikke utelukke at P3-promotoren i andre tilfeller kanskje ikke er hensiktsmessig og ikke gjenspeiler den naturlige fysiologiske tilstanden til bakterier når sRNA induseres. En annen måte å kontrollere MS2-sRNA-produksjonen på er å bruke kjemisk inducible promotorer (f.eks. tetracyklin-inducible promotorer). Disse verktøyene tillater et pulsuttrykk av MS2-sRNA-konstruksjonen, men denne innstillingen garanterer ikke at RNA-mål vil bli uttrykt samtidig. En annen ulempe er at uttrykk fra en plasmid kan føre til overproduksjon av den studerte sRNA, enda mer understreket med høy kopinummervektor. Dette kan potensielt føre til artefaktuelle interaksjoner eller forstyrrelse av tilknyttede RNA-anstandsfunksjoner. Det mest hensiktsmessige alternativet er å sette inn en MS2-tag i 5' enden av det endogene sRNA-genet. Dermed ville MS2-sRNA være kromosomalt kodet og under kontroll av sin opprinnelige promotor. Dette bør bedre etterligne det endogene uttrykket av studert sRNA og unngå skjevhet på grunn av overproduksjon av den studerte sRNA. I alle fall er det avgjørende trinnet å nøye verifisere lengden, stabiliteten og funksjonaliteten til MS2-sRNA-konstruksjonen, spesielt ved hjelp av nordlige blotanalyser med total RNA hentet fra kulturer dyrket under forhold som utløser den endogene sRNA-produksjonen og funksjonen. Unektelig kan bruken av en feil/ufunksjonell MS2-sRNA-konstruksjon drastisk påvirke genererte resultater, noe som støtter betydningen av kontroller beskrevet ovenfor. Til slutt produseres MS2-sRNA alltid i en ΔsRNA-bakgrunn for å maksimere berikelsen av mRNA-mål. Videre kan eksperimenter utføres i vertsstammer med spesifikke mutasjoner i RNases (f.eks. sletting av mutanter eller temperaturfølsomme mutanter) for å unngå at mRNA-mål forringes ved sRNA-avhengig rekruttering av RNases.
Den eksperimentelle valideringen av kandidater identifisert av MAPS er fortsatt nødvendig
Et poeng som må vurderes er at MAPS gir en liste over putative RNA-mål. Noen RNAer kan imidlertid indirekte berikes via interaksjon med et delt mRNA-mål eller et RNA-bindende protein. Derfor må avslørte kandidater bekreftes av andre eksperimentelle tilnærminger. EMSA og fotavtrykk eksperimenter brukes ofte til å visualisere direkte binding av en sRNA til putative RNA mål in vitro. Deretter bidrar in vitro toeprinting-analyser til å overvåke virkningen av en sRNA på oversettelsesinitiering av mRNA-målet. Til slutt utfyller Northern blot and/or gene reporter assays (lacZ eller gfp) denne eksperimentelle valideringen in vivo. Alle disse tilnærmingene er beskrevet i Jagodnik et al. (2017)39.
I motsetning til RIL-seq- og CLASH-teknologier gir MAPS ikke direkte informasjon om samhandlingsnettstedene. Likevel observeres ofte en topp av kartlagte lesninger i en begrenset region av RNA-målet (f.eks. den 3' enden av glyW-cysT-leuZ operon21), noe som letter identifiseringen av paringsstedet. Alternativt kan flere prediksjonsverktøy brukes til å forutsi det putative bindingsstedet på det identifiserte målet, for eksempel IntaRNA40.
MAPS gransker målomet til en bestemt sRNA
MAPS-teknologi er egnet for studiet av sRNA-målom i Gram-negative bakterier som E. coli og S. Typhimurium, men også nå med denne modifiserte protokollen i Gram-positive bakterier som S. aureus. I utgangspunktet tilbyr MAPS et øyeblikksbilde av RNA: sRNA-duplekser dannet på et gitt tidspunkt og under spesifikke vekstforhold. Dessverre kan listen over mRNA-mål være ufullstendig. For eksempel kan et cognate mRNA-mål gå glipp av på grunn av upassende eksperimentelle forhold, noe som rettferdiggjør de ovennevnte forholdsreglene.
Sammenlignet med andre ofte brukte metoder som RIL-seq eller CLASH, bruker MAPS en bestemt sRNA for å rense alle interagerende RNA-mål samtidig. Her fortynnes ikke sRNA:RNA-interaksjon blant andre RBP-assosierte duplekser, slik at teoretisk sett kan karakterisere målomet dypere. Det ser imidlertid ut til at RIL-seq / CLASH og MAPS-metoder avslørte forskjellige sett med putative sRNA-mål12,41, noe som tyder på at disse eksperimentelle tilnærmingene er komplementære. Dette avviket kan forklares med variasjoner i vekstforhold og/eller skjevheter generert av hver metode.
Følgelig bør formålet med studien påvirke valget av metoden. For en global analyse av sRNA-målomer og når en RBP er involvert i sRNA-mediert regulering, bør RIL-seq- og CLASH-metoder foretrekkes. Begge tilnærmingene gir en oversikt over regulatoriske nettverk som er avhengige av en bestemt RBP og dermed avdekker et bredt spekter av sRNAer og tilknyttede mål. Tvert imot, for studiet av en bestemt sRNA eller når ingen RBP er kjent / involvert, representerer MAPS et passende alternativ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av "Agence Nationale de la Recherche" (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH og ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, til PR). Det har også blitt publisert under rammen av labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 og anr-17-EURE- 0023 (til PR), som finansiering fra staten administrert av ANR som en del av investeringene for det fremtidige programmet. DL ble støttet av EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 under Marie Skłodowska-Curie Grant Agreement No. 753137-SaRNAReg. Arbeidet i E. Massé Lab har blitt støttet av driftsstipend fra Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) og National Institutes of Health NIH Team Grant R01 GM092830-06A1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Starstedt | 72.691 | |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | RNA quantity and quality |
| 250 mL culture flask | Dominique Dutscher | 2515074 | Bacterial cultures |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | 352051 | Culture centrifugation |
| Absolute ethanol | VWR Chemicals | 20821.321 | RNA extraction and purification |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | Bacterial pelleting | |
| Ampicilin (amp) | Sigma-Aldrich | A9518-5G | Growth medium |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | MS2-affinity purification |
| Anti-dioxigenin AP Fab fragment | Sigma Aldrich | 11093274910 | Northern blot assays |
| Autoradiography cassette | ThermoFisher Scientific | 50-212-726 | Northern blot assays |
| BamHI | ThermoFisher Scientific | ER0051 | Plasmid construction |
| BHI (Brain Heart Infusion) Broth | Sigma-Aldrich | 53286 | Growth medium |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | Northern blot assays |
| CDP-Star | Sigma Aldrich | 11759051001 | Northern blot assays (substrate) |
| Centrifuge 5415 R | Eppendorf | RNA extraction and purification | |
| Chloroform | Dominique Dutscher | 508320-CER | RNA extraction and purification |
| DIG-RNA labelling mix | Sigma-Aldrich | 11277073910 | Northern blot assays |
| DNase I | Roche | 4716728001 | DNase treatment |
| Erythromycin (ery) | Sigma-Aldrich | Fluka 45673 | Growth medium |
| FastPrep device | MP Biomedicals | 116004500 | Mechanical lysis |
| Guanidium Thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277-250G | Northern blot assays |
| Hybridization Hoven Hybrigene | Techne | FHB4DD | Northern blot assays |
| Hybridization tubes | Techne | FHB16 | Northern blot assays |
| Isoamyl alcohol | Fisher Scientific | A/6960/08 | RNA extraction and purification |
| LB (Lysogeny Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | Growth medium |
| Lysing Matrix B Bulk | MP Biomedicals | 6540-428 | Mechanical lysis |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | Plasmid construction |
| Milli-Q water device | Millipore | Z00QSV0WW | Ultrapure water |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | RNA/DNA quantity and quality | |
| Nitrocellulose membrane | Dominique Dutsher | 10600002 | Northern blot assays |
| Phembact Neutre | PHEM Technologies | BAC03-5-11205 | Cleaning and decontamination |
| Phenol | Carl Roth | 38.2 | RNA extraction and purification |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | Plasmid construction |
| pMBP-MS2 | Addgene | 65104 | MS2-MBP production |
| Poly-Prep chromatography column | BioRad | 7311550 | MS2-affinity purification |
| PstI | ThermoFisher Scientific | ER0615 | Plasmid construction |
| Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | RNA quantity |
| RNAPro Solution | MP Biomedicals | 6055050 | Mechanical lysis |
| ScriptSeq Complete Kit | Illumina | BB1224 | Preparation of cDNA librairies |
| Spectrophotometer Genesys 20 | ThermoFisher Scientific | 11972278 | Bacterial cultures |
| SpeedVac Savant vacuum device | ThermoFisher Scientific | DNA120 | RNA extraction and purification |
| Stratalinker UV Crosslinker 1800 | Stratagene | 400672 | Northern blot assays |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher Scientific | EL0014 | Plasmid construction |
| TBE (Tris-Borate-EDTA) | Euromedex | ET020-C | Northern blot assays |
| ThermalCycler T100 | BioRad | 1861096 | Plasmid construction |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416-100ML | Northern blot assays |
| X-ray film processor | hu.q | HQ-350XT | Northern blot assays |
| X-ray films Super RX-N | FujiFilm | 4741019318 | Northern blot assays |
References
- Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action. Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).
- Hör, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G. Trans-Acting Small RNAs and Their Effects on Gene Expression in Escherichia coli and Salmonella enterica. EcoSal Plus. 9 (1), (2020).
- Desgranges, E., Marzi, S., Moreau, K., Romby, P., Caldelari, I.
- Adams, P. P., Storz, G. Prevalence of small base-pairing RNAs derived from diverse genomic loci. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (7), 194524 (2020).
- Pain, A., et al. An assessment of bacterial small RNA target prediction programs. RNA Biology. 12 (5), 509-513 (2015).
- Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S., Lalaouna, D. Navigation through the twists and turns of RNA sequencing technologies: Application to bacterial regulatory RNAs. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. , 194506 (2020).
- Wright, P. R., et al. CopraRNA and IntaRNA: predicting small RNA targets, networks and interaction domains. Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 119-123 (2014).
- Smirnov, A., Schneider, C., Hor, J., Vogel, J. Discovery of new RNA classes and global RNA-binding proteins. Current Opinion in Microbiology. 39, 152-160 (2017).
- Saliba, A. E., Santos, S., Vogel, J. New RNA-seq approaches for the study of bacterial pathogens. Current Opinion in Microbiology. 35, 78-87 (2017).
- Melamed, S., Adams, P. P., Zhang, A., Zhang, H., Storz, G. RNA-RNA Interactomes of ProQ and Hfq Reveal Overlapping and Competing Roles. Molecular Cell. 77 (2), 411-425 (2020).
- Melamed, S., et al. Global Mapping of Small RNA-Target Interactions in Bacteria. Molecular Cell. 63 (5), 884-897 (2016).
- Iosub, I. A., et al. Hfq CLASH uncovers sRNA-target interaction networks linked to nutrient availability adaptation. Elife. 9, (2020).
- Waters, S. A., et al. Small RNA interactome of pathogenic E. revealed through crosslinking of RNase E. The EMBO Journal. 36 (3), 374-387 (2017).
- Dos Santos, R. F., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. New molecular interactions broaden the functions of the RNA chaperone Hfq. Current Genetics. , (2019).
- Kavita, K., de Mets, F., Gottesman, S. New aspects of RNA-based regulation by Hfq and its partner sRNAs. Current Opinion in Microbiology. 42, 53-61 (2018).
- Bohn, C., Rigoulay, C., Bouloc, P. No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus. BMC Microbiology. 7, 10 (2007).
- Jousselin, A., Metzinger, L., Felden, B. On the facultative requirement of the bacterial RNA chaperone, Hfq. Trends in Microbiology. 17 (9), 399-405 (2009).
- Olejniczak, M., Storz, G. ProQ/FinO-domain proteins: another ubiquitous family of RNA matchmakers. Molecular Microbiology. 104 (6), 905-915 (2017).
- Lalaouna, D., Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S. Chapter Sixteen - MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach in the Human Pathogen Staphylococcus aureus. Methods in Enzymology. 612, 393-411 (2018).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. Identification of unknown RNA partners using MAPS. Methods. 117, 28-34 (2017).
- Lalaouna, D., et al. A 3' external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise. Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).
- Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli. Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).
- Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome. Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).
- Silva, I. J., et al. SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).
- Lalaouna, D., Masse, E. Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology. Genomics Data. 5, 136-138 (2015).
- Tomasini, A., et al. The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms. Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).
- Bronesky, D., et al. A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus. The EMBO Journal. 38 (6), (2019).
- Lalaouna, D., et al. RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation. Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).
- Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).
- Garibyan, L., Avashia, N.
- Revie, D., Smith, D. W., Yee, T. W. Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions. Nucleic Acids Research. 16 (21), 10301-10321 (1988).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 1 Unit 1.8 (2001).
- Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
- Grosser, M. R., Richardson, A. R. Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis. Methods in Molecular Biology. 1373, 51-57 (2016).
- Krumlauf, R.
- Koontz, L.
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Reseaerch. 44, 3-10 (2016).
- Jagodnik, J., Brosse, A., Le Lam, T. N., Chiaruttini, C., Guillier, M. Mechanistic study of base-pairing small regulatory RNAs in bacteria. Methods. 117, 67-76 (2017).
- Mann, M., Wright, P. R., Backofen, R. IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions. Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).
- Georg, J., et al. The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs. Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).
