Summary
Технология MAPS была разработана для тщательного изучения мишеня конкретной регуляторной РНК in vivo. Интересующая сРНК помечена аптамером MS2, позволяющим совместно очищать своих партнеров по РНК и их идентификацию путем секвенирования РНК. Этот модифицированный протокол особенно подходит для грамположительных бактерий.
Abstract
Хотя малые регуляторные РНК (сРНК) широко распространены среди бактериальной области жизни, функции многих из них остаются плохо охарактеризованными, особенно из-за сложности идентификации их мишеней мРНК. Здесь мы описали модифицированный протокол MS2-Affinity Purification в сочетании с технологией секвенирования РНК (MAPS), направленный на выявление всех партнеров РНК конкретной сРНК in vivo. В широком смысле, аптамер MS2 слит с 5' конечностью интересуемой сРНК. Эта конструкция затем экспрессируется in vivo, позволяя MS2-сРНК взаимодействовать со своими клеточными партнерами. После сбора бактерий клетки механически лизируются. Сырой экстракт загружается в хроматографическую колонку на основе амилозы, предварительно покрытую белком MS2, слитым с мальтозосвязывающим белком. Это позволяет специфически захватывать MS2-сРНК и взаимодействующие РНК. После элюирования совместно очищенные РНК идентифицируются методом высокопроизводительного секвенирования РНК и последующего биоинформационного анализа. Следующий протокол был реализован в грамположительном патогене человека Staphylococcus aureus и, в принципе, транспонируется любым грамположительным бактериям. Подводя итог, можно сказать, что технология MAPS представляет собой эффективный метод глубокого изучения регуляторной сети конкретной сРНК, предлагая снимок всего ее мишени. Однако важно иметь в виду, что мнило, что мнило цели, определенные МАПО, по-прежнему нуждаются в подтверждении взаимодополняющими экспериментальными подходами.
Introduction
Сотни, возможно, даже тысячи мелких регуляторных РНК (сРНК) были идентифицированы в большинстве бактериальных геномов, но функции подавляющего большинства из них остаются нехарактеризованными. В целом, сРНК представляют собой короткие некодирующие молекулы, играющие важную роль в бактериальной физиологии и адаптации к флуктуирующим средам1,2,3. Действительно, эти макромолекулы находятся в центре многочисленных сложных регуляторных сетей, влияющих на метаболические пути, стрессовые реакции, а также на вирулентность и устойчивость к антибиотикам. Логично, что их синтез запускается специфическими раздражителями окружающей среды (например, питательным голоданием, окислительными или мембранными стрессами). Большинство сРНК регулируют множественные целевые мРНК на посткрипционном уровне посредством короткого и несмежного спаривания оснований. Они обычно предотвращают инициацию трансляции, конкурируя с рибосомами за области инициации трансляции4. Образование дуплексов сРНК:мРНК также часто приводит к активной деградации целевой мРНК путем рекрутинга специфических РНК.
Характеристика мишени сРНК (т.е. всего набора ее целевых РНК) позволяет идентифицировать метаболические пути, в которые она вмешивается, и потенциальный сигнал, на который она отвечает. Следовательно, функции конкретной сРНК обычно могут быть выведены из ее мишени. Для этой цели было разработано несколько инструментов прогнозирования in silico, таких как IntaRNA и CopraRNA5,6,7. Они, в частности, полагаются на комплементарность последовательностей, энергию сопряжения и доступность потенциального места взаимодействия для определения предполагаемого партнера сРНК. Однако алгоритмы прогнозирования не интегрируют все факторы, влияющие на парирование оснований in vivo, такие как участие РНК-шаперонов8, благоприятствующих неоптимальным взаимодействиям или совместной экспрессии обоих партнеров. Из-за присущих им ограничений частота ложных срабатываний инструментов прогнозирования остается высокой. Большинство экспериментальных крупномасштабных подходов основаны на совместной очистке пар сРНК:мРНК, взаимодействующих с помеченным РНК-связывающим белком (RBP)6,9. Например, методом взаимодействия РНК путем лигирования и секвенирования (RIL-seq) идентифицировал дуплексы РНК, совместно очищенные с РНК-шаперонами, такими как Hfq и ProQ в Escherichia coli10,11. Аналогичная технология, называемая УФ-сшиванием, лигированием и секвенированием гибридов (CLASH), была применена к RNase E- и Hfq-ассоциированным сРНК в E. coli12,13. Несмотря на хорошо описанную роль Hfq и ProQ в сРН-опосредоточенной регуляции у нескольких бактерий8,14,15,регуляция на основе сРНК, по-видимому, не зависит от РНК-шаперона в нескольких организмах, таких как S. aureus16,17,18. Даже если очистка дуплексов РНК в сочетании с РНКазами осуществима, как показали Уотерс и коллеги13,это остается сложным, поскольку РНКазы вызывают их быструю деградацию. Следовательно, MS2-аффинная очистка в сочетании с подходом19,20 секвенирования РНК (MAPS) представляет собой надежную альтернативу в таких организмах.
В отличие от вышеупомянутых методов, MAPS использует конкретную сРНК в качестве приманки для захвата всех взаимодействующих РНК и, следовательно, не полагается на участие RBP. Весь процесс показан на рисунке 1. Короче говоря, сРНК помечена на 5' аптамером РНК MS2, который специально распознается белком оболочки MS2. Этот белок сливается с мальтозосвязывающим белком (MBP) для иммобилизации на амилозной смоле. Поэтому MS2-сРНК и ее РНК-партнеры сохраняются на колонке аффинной хроматографии. После элюирования мальтозой коочищенные РНК идентифицируют с помощью высокопроизводительного секвенирования РНК с последующим биоинформатическим анализом(рисунок 2). Технология MAPS в конечном итоге рисует интерактивную карту всех потенциальных взаимодействий, происходящих in vivo.
Технология MAPS изначально была реализована в непатогенной грамотрицательной бактерии E. coli21. Примечательно, что MAPS помог идентифицировать фрагмент, полученный из тРНК, специфически взаимодействующий как с RyhB, так и с RybB sRNAs и предотвращающий любой транскрипционный шум сРНК для регулирования мишеней мРНК в неиндуцирующие условиях. После этого MAPS был успешно применен к другим РНК E. coli, таким как DsrA22,RprA23,CyaR23 и GcvB24 (таблица 1). В дополнение к подтверждению ранее известных целей, MAPS расширил мишень этих хорошо известных сРНК. Недавно MAPS был выполнен в Salmonella Typhimurium и показал, что SraL sRNA связывается с rho mRNA, кодируя фактор прекращения транскрипции25. Благодаря этому спариванию SraL защищает мРНК ро от преждевременного прекращения транскрипции, вызванного самим Ро. Интересно, что эта технология не ограничивается сРНК и может быть применена к любому типу клеточных РНК, примером которого является использование фрагмента26, полученного из тРНК, и 5'-нетранслированнойобласти мРНК 22 (таблица 1).
Метод MAPS также был адаптирован к патогенной грамположительной бактерии S. aureus19. В частности, протокол лизиса был широко модифицирован для эффективного разрыва клеток из-за более толстой клеточной стенки, чем грамотрицательные бактерии, и для поддержания целостности РНК. Этот адаптированный протокол уже разгадал интерактом RsaA27,RsaI28 и RsaC29. Этот подход дал представление о решающей роли этих сРНК в регуляторных механизмах свойств клеточной поверхности, поглощения глюкозы и реакций на окислительный стресс.
Протокол, разработанный и реализованный в E. coli в 2015 году, был недавно подробно описан30. Здесь мы предоставляем модифицированный протокол MAPS, который особенно подходит для изучения регуляторных сетей сРНК у грамположительных (более толстых клеточных стенк) бактерий, будь то непатогенные или патогенные (меры предосторожности).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Буферы и носители
- Для экспериментов MAPS подготовьте следующие буферы и носители:
- Буфер A (150 мМ KCl, 20 мМ Tris-HCl pH 8, 1 мМ MgCl2 и 1 мМ DTT)
- Буфер E (250 мМ KCl, 20 мМ Tris-HCl pH 8, 12 мМ мальтоза, 0,1% Тритон, 1 мМ MgCl2 и 1 мМ DTT)
- буфер загрузки РНК (0,025% ксилолцианола и 0,025% бромфенола синего в 8 М мочевины)
- Мозговая сердечная инфузия (BHI) среда (12,5 г тележного мозга, 10 г пептона, 5 г говяжьего сердца, 5 г NaCl, 2,5 г Na2HPO4 и 2 г глюкозы на 1 л)
- Лизогенный бульон (LB) среда (10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г NaCl на 1 л) - Для анализа Северного пятна подготовьте следующие буферы:
- Блокирующий раствор (1x малеиновая кислота и 1% блокирующий реагент)
- Гибридизационный раствор (50% формамид, 5x SSC, 7% SDS, 1% блокирующий раствор и 0,2% N-лаурилсарнкозин, 50 мМ фосфат натрия). Нагревать с перемешиванием до растворения.
ВНИМАНИЕ: Тщательно соблюдайте меры предосторожности, связанные с каждым продуктом.
- 1 М фосфата натрия (58 мМ фосфата натрия двухосновного и 42 мМ фосфата натрия моноосновного)
- Физиологический раствор, буфер цитрата натрия (SSC), 20x концентрат (3 M NaCl и 300 мМ тринатрийцитрата)
2. Вопросы безопасности
- Выполните все этапы с участием жизнеспособных патогенных бактерий в лаборатории сдерживания уровня 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Только экстракты клеток можно вывозить на улицу после лизиса (шаг 5). - Наденьте лабораторный халат и перчатки.
- Убедитесь, что запястья закрыты.
- Очистите шкаф биологической безопасности (класс II) дезинфицирующим раствором.
- Утилизируйте твердые отходы, подвергшиеся воздействию бактерий, в соответствующий биомедицинский бункер.
- Обработать колбы, содержащие загрязненные жидкости, дезинфицирующим раствором. Затем выбросьте его в раковину.
- Тщательно вымойте руки и запястья с мылом и снимите лабораторный халат, прежде чем покинуть лабораторию сдерживания уровня 2.
3. Плазмидная конструкция
ПРИМЕЧАНИЕ: Для целей клонирования крайне важно сначала определить границы эндогенной сРНК. Плазмиды pCN51-P3 и pCN51-P3-MS2 описаны в Tomasini et al. (2017)27. Промотор P3 обеспечивает высокую экспрессию сРНК в зависимости от плотности клеток (т. Е. Когда бактерии входят в стационарную фазу роста). Многие стафилококковые сРНК накапливаются во время этой фазы роста.
- Амплифицируйте последовательность сРНК с помощью ПЦР с использованием высокоточной ДНК-полимеразы и аппарата ПЦР. Внимательно следуйте инструкциям производителя и прочитайте Garibyan and Avashia (2013)31 для получения более подробной информации.
- Используйте следующие шаблоны для разработки конкретных грунтовок:
и 5'-CGCGGATCC(N)-3' для прямой и обратной грунтовок, соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти олигонуклеотиды позволяют слить последовательность MS2 (выделена жирным шрифтом) с 5' концом интересуемой сРНК. Пст Сайты ограничения I и BamHI (подчеркнутые) добавляются на 5' и 3' конечностях конструкции MS2-sRNA для клонирования ампликона в плазмиду pCN51-P327. (N) соответствует геноспецифической последовательности (15-20 нуклеотидов). - Переварить 1 мкг плазмиды pCN51-P3 и 1 мкг продукта ПЦР MS2-сРНК с 2 U PstI и 1 U Bam HI в соответствующембуфере в соответствии с рекомендациями производителя.
- Инкубировать 1 ч при 37 °C и очищать ДНК с помощью набора для очистки ПЦР (см. Таблицу материалов).
- Смешайте переваренные плазмиды pCN51-P3 (300 нг) и ампликон MS2-сРНК (молярное отношение для вектора:вставка = 1:3) в пробирке объемом 1,5 мл. См. Revie et al. (1988)32 для максимизации эффективности лигирования. Добавьте 1 мкл буфера лигазы и 10 ЕД Т4-лигазы в каждую пробирку. Отрегулируйте объем до 10 мкл со сверхчистой водой.
- Инкубировать при 22 °C в течение не менее 2 ч.
- Добавьте 5 мкл лигационной смеси к 50 мкл замороженных клеток DH5α с химической компетенцией E. coli. Прочитайте Seidman et al. (2001)33, чтобы узнать больше о плазмидной трансформации и химически компетентных клетках.
- Инкубировать 30 мин на льду.
- Тепловой удар (45 с при 42 °C) трансформационной трубки с использованием теплового блока или водяной бани.
- Добавьте 900 мкл среды LB и инкубируют при 37 °C в течение 30 мин.
- Пластина 100 мкл бактериальной суспензии на агартовой пластине LB, дополненная ампициллином (100 мкг/мкл).
ПРИМЕЧАНИЕ: вектор pCN51-P3 кодирует ген резистентности к ампициллину, который позволяет отбирать только клоны E. coli, несущие плазмиду pCN51-P3-MS2-sRNA. - Экстрагментация плазмиды pCN51-P3-MS2-sRNA из ночной бактериальной культуры (5 мл), выращенной в присутствии ампициллина (100 мкг/мкл), с использованием набора минипрепа плазмидной ДНК (см. Таблицу материалов).
- Проверьте конструкцию с помощью секвенирования Сэнгера34, используя следующий праймер, 5'-TCTCGAAAATAGAGGG-3'.
- Трансформируйте плазмиду pCN51-P3-MS2-sRNA в химически компетентные клетки E. coli DC10B. Повторите шаги с 3.7 по 3.11.
- Извлеките плазмиду pCN51-P3-MS2-sRNA (см. шаг 3.12) и преобразуйте 1-5 мкг плазмидной ДНК в электрокомпетентные клетки S. aureus ΔsRNA HG001 с помощью электропорационного аппарата. Внимательно следуйте инструкциям производителя. Прочитайте Grosser and Richardson (2016)35, чтобы узнать больше о методах получения электрокомпетентного S. aureus.
ВНИМАНИЕ: Этот шаг включает в себя обработку патогенных бактерий (см. шаг2). - Добавьте 900 мкл среды BHI и инкубируют при 37 °C в течение 3 ч.
- Центрифуга 1 мин при 16 000 х г. Выбросьте супернатант.
- Повторно суспендируют гранулу в 100 мкл BHI и накладываем бактериальную суспензию на пластины агара BHI, дополненные эритромицином (10 мкг/мкл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Вектор pCN51-P3 также кодирует ген резистентности к эритромицину, который позволяет выбирать только клоны S. aureus, несущие плазмиду pCN51-P3-MS2-sRNA.
4. Сбор бактерий
ВНИМАНИЕ: Этот шаг включает в себя обработку патогенных бактерий (см. шаг 2).
- Вырастите одну колонию штаммов, несущих либо pCN51-P3-MS2-sRNA, либо pCN51-P3-MS227 плазмид в 3 мл среды BHI, дополненной эритромицином (10 мкг/мкл) в дубликатах.
- Разбавлять каждую культуру на ночь в 50 мл (≈1/100) свежей среды BHI, дополненной эритромицином (10 мкг/мкл), чтобы достичь OD600 нм 0,05. Используйте стерилизованные колбы 250 мл (соотношение колбы к среде 5:1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Условия среды и роста должны быть установлены в соответствии с моделью экспрессии исследуемой сРНК. - Выращивать культуры при 37 °C с встряхиванием при 180 об/мин в течение 6 ч.
- Переложите каждую культуру в центрифужную трубку 50 мл.
- Центрифуга при 2 900 х г в течение 15 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант.
- Храните гранулы на льду и непосредственно выполняйте механический лизис клеток (этап 5) или замораживайте и храните гранулы при -80 °C.
5. Механический лизис клеток
ВНИМАНИЕ: Следующие шаги должны быть выполнены на льду, а буферы должны быть при 4 °C. Используйте перчатки и примите все меры предосторожности для защиты образцов от РНК.
- Повторное суспендирование гранул (этап 4.6) в 5 мл буфера А.
- Переложите повторно суспендированные ячейки в центрифужные трубки по 15 мл с 3,5 г кварцевых шариков (0,1 мм).
- Вставьте трубки в инструмент для лизиса механических клеток (см. Таблицу материалов). Цикл продолжительность 40 с при 4,0 м/с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если одного цикла недостаточно для разрыва ячеек, дайте устройству остыть в течение 5 минут, сохраняя образцы на льду. Затем повторите еще один цикл продолжительность 40 с при 4,0 м/с. Эффективность лизиса клеток может быть проверена путем нанесения покрытия супернатанта на пластину BHI-агара. - Центрифуга при 15 700 х г в течение 15 мин. Восстановите супернатант и держите его на льду.
6. Подготовка колонны
ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не дать амилозной смоле высохнуть. При необходимости запечатайте колонну торцевой крышкой. Подготовьте все растворы перед началом аффинной очистки.
- Поместите хроматографическую колонку в стойку для колонки (см. Таблицу материалов).
- Снимите кончик колонны и промойте колонну сверхчистой водой.
- Добавьте 300 мкл амилозной смолы.
- Промыть колонну 10 мл буфера А.
- Развести 1 200 пмоль белка MBP-MS2 в 6 мл буфера А и загрузить его в колонку.
- Промыть колонну 10 мл буфера А.
7. MS2-аффинная очистка (Рисунок 1)
- Загрузите ячейку лисата в колонну.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраните 1 мл клеточного лизата (сырой экстракт, CE) для извлечения общей РНК (шаг 8) и выполните анализ северного пятна (шаг 9) и транскриптома (шаг 10). - Соберите проточная фракция (FT) в чистую коллекторную трубку.
- Промыть колонку 3 раза 10 мл буфера А. Собрать промывную фракцию (W).
- Элюируют столбик 1 мл буфера Е и собирают фракцию элюирования (Е) в микропробирку 2 мл.
- Храните все собранные фракции на льду до экстракции РНК (этап 8) или замораживайте их при -20 °C для последующего использования.
8. Экстракция РНК собранных фракций (CE, FT, W и E)
- Используйте 1 мл каждой фракции (включая FT и W) для экстракции РНК.
- Добавьте 1 объем фенола. Энергично перемешать.
ВНИМАНИЕ: Фенол летучий и коррозионный, обратите внимание и безопасно работайте под вытяжным капотом. - Центрифуга при 16 000 х г в течение 10 мин при 20 °C.
- Переведите верхнюю фазу в чистую микропробирку 2 мл.
- Добавьте 1 объем хлороформа/изоамилового спирта (24:1) и повторите шаги 8.3-8.4.
ВНИМАНИЕ: Работайте безопасно под вытяжным капотом. - Добавьте 2,5 объема холодного этанола 100% и 1/10 объема 3 М ацетата натрия (NaOAc) рН 5,2.
- Осадк в течение ночи при -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осаждение также может быть выполнено в ванне с этанолом/сухим льдом в течение 20 мин или при -80 °C в течение 2 ч. - Центрифуга при 16 000 х г в течение 15 мин при 4 °C. Медленно удалите этанол пипеткой, стараясь не потревожить гранулу.
ВНИМАНИЕ: Гранула РНК не всегда видна и иногда ослабевает в присутствии этанола. - Добавьте 500 мкл 80% холодного этанола.
- Центрифуга при 16 000 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Выбросьте этанол, медленно пипетируя его. Высушите гранулы с помощью вакуумного концентратора, 5 мин в режиме работы.
- Повторно суспендировать гранулу в соответствующем объеме (15-50 мкл) сверхчистой воды. Заморозьте гранулы при -20 °C для последующего использования.
- Оцените количество и качество РНК (260 нм) и качество (соотношения длин волн 260/280 и 260/230) с помощью спектрофотометра/флуорометра (см. Таблицу материалов). Внимательно следуйте инструкциям производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: 3-4 мкг обычно получают в элюируляционной фракции (Е). Это в основном зависит от тестируемых условий.
9. Анализ MS2-аффинной очистки Северным пятном36
- Разбавляют 5 мкг РНК фракций CE, FT, W и 500 нг фракции E в 10 мкл сверхчистой воды и смешивают с 10 мкл нагрузочного буфера РНК.
- Инкубировать 3 мин при 90 °C.
- Загрузите образцы в скважины 1% агарозного геля, дополненного 20 мМ тиоцианата гуанидия, и запустите гель при 100-150 В в буфере TBE 1x при 4 °C. Прочитайте Koontz (2013)37 для получения более подробной информации.
- Перенос РНК на нитроцеллюлозную мембрану вакуумным переносом в течение 1 ч или капиллярным переносом в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Метод капиллярности более эффективен для больших РНК. - УФ-сшивки РНК на мембране (120 мДж при 254 нм) с использованием ультрафиолетового сшивателя.
- Вставьте мембрану в флакон гибридизации стороной РНК вверх.
- Добавьте 10-20 мл предварительно нагретого гибридизационного раствора. Инкубировать 30 мин при 68 °C.
- Отбросьте раствор и добавьте 10-20 мл свежего гибридизационный раствор, дополненный 1 мкл сРНК-специфического зонда. Инкубировать в течение ночи при 68 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Меченый DIG РНК-зонд синтетизируется с использованием набора для маркировки РНК DIG и в соответствии с инструкциями производителя. В качестве альтернативы может использоваться зонд с радиомаркированной маркировкой. - Промыть мембрану 10-20 мл промывного раствора 1 (2x SSC и 0,1% SDS) в течение 5 мин при 20 °C. Повторите один раз.
- Промывайте мембрану 10-20 мл промывного раствора 2 (0,2x SSC и 0,1% SDS) в течение 15 мин при 68 °C. Повторите один раз.
- Инкубировать с 10-20 мл блокирующего раствора в течение не менее 30 мин при 20 °С.
- Откажитесь от раствора и добавьте 10-20 мл блокирующего раствора, дополненного поликлональным антидигоксигениновым антителом (1/1000), конъюгированного со щелочной фосфатазой. Инкубировать 30 мин при 20 °C.
- Промыть мембрану 10-20 мл промывного раствора 3 (1x малеиновая кислота и 0,3% Tween 20) в течение 15 мин при 20 °C. Повторите один раз.
- Инкубируют мембрану с 10-20 мл детектируемого раствора (0,1 М Tris HCl и 0,1 М NaCl рН 9,5) 5 мин при 20 °C.
- Поместите мембрану на полиэтиленовую пленку и замочите ее подложкой (см. Таблицу материалов). Инкубировать 5 мин в темноте.
- Запечатайте мембрану в полиэтиленовую пленку. Поместите мембрану в авторадиографическую кассету.
- Подвергайте мембрану воздействию авторадиографической пленки в специальной темной комнате.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время экспозиции зависит от силы сигнала, от нескольких секунд до минут. - Раскройте экспонированную пленку в автоматическом развивающем устройстве.
10. Подготовка образцов для секвенирования РНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг касается только РНК, извлеченных из фракций E и CE.
- Добавьте к каждому образцу 10 мкл 10x ДНКазного буфера и ДНКазы I (1 ЕД/мкг обработанных РНК). Добавьте воду для конечного объема 100 мкл.
- Насыщать 1 ч при 37 °C.
- Экстрагируйте и очищайте РНК, как описано ранее (этапы 8.2-8.11).
- Повторное суспендирование гранулы РНК в 20 мкл сверхчистой воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие оставшейся ДНК может быть проверено с помощью ПЦР и специфических праймеров (например, гена 16S). - Оценка количества и качества РНК с помощью системы анализа электрофореза на основе микрофлюидики (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: 1 мкг обычно получают в элюационной фракции (E) после обработки ДНКазой. - Удалите рибосомные РНК с помощью бактериального набора для истощения рРНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Большие и обильные РНК (т.е. рРНК), как правило, не специфически взаимодействуют с колонкой аффинности. Для выполнения этого шага требуется 500 нг экстрагированной РНК. - Опять же оцените количество и качество РНК с помощью системы анализа электрофореза на основе микрофлюидики.
- Подготавливайте библиотеки кДНК с 10-20 нг рибодепледной РНК с помощью комплекта подготовки библиотеки кДНК и следуя инструкциям производителя.
- Упорядочить полученные библиотеки с помощью инструмента секвенирования (например, одностороннего, 150 bp; см. Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: 5-10 миллионов считывания на выборку, как правило, достаточно.
11. Анализ данных RNAseq (Рисунок 2)
- Загрузите файлы виртуализации FastQ с платформы виртуализации.
- Доступ к экземпляру Галактики биологической станции Роскофф(https://galaxy.sb-roscoff.fr/)и авторизуйтесь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый упомянутый алгоритм можно легко найти с помощью строки поиска. Для каждого инструмента предоставляется руководство пользователя.
ВНИМАНИЕ: Версия необходимых инструментов может отличаться от общедоступного сервера Galaxy38. - Нажмите на значок «Получить данные», а затем «Загрузить файл с вашего компьютера». Загрузите файл секвенирования FastQ каждого элемента управления MS2 и образцов MS2-sRNA. Загрузите также файл генома FASTA и файл аннотации GFF.
- Запустите FastQC Отчеты о качестве чтения (Galaxy Version 0.69).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот инструмент обеспечивает оценку качества необработанных последовательностей (например, показатель качества, наличие последовательностей адаптера). - Запустите инструмент обрезки чтения Trimmomatic flexible (Galaxy Version 0.36.6), чтобы удалить последовательности адаптеров и некачественные чтения. Укажите последовательности адаптеров, используемые для подготовки библиотеки (например, TruSeq 3, несимметричные). Добавьте следующие тримммоматические операции: SLIDINGWINDOW (Количество оснований=4; Среднее качество=20) и MINLEN (Минимальная длина чтения=20).
- Запустите снова FastQC Чтение отчетов о качестве (Galaxy Version 0.69).
- Run Bowtie2 - карта считывается с эталонным геномом (Galaxy Version 2.3.2.2). Используйте файл Genome Reference FASTA из истории для сопоставления чтения с настройками по умолчанию (очень чувствительными локальными).
ПРИМЕЧАНИЕ: Файл BAM, сгенерированный инструментом Bowtie2, можно визуализировать с помощью Integrative Genomics Viewer (IGV). Также потребуется связанный файл BAI. - Опционально запустите Flagstat, который собирает статистику для набора данных BAM (Galaxy Version 2.0).
- Запустите htseq-count - Count (Galaxy Version 0.6.1), который выравнивает чтение перекрывающихся объектов в файле аннотации GFF. Используйте режим пересечения (не пустой).
- Архивируйте все необработанные файлы подсчета из анализа htseq-count в один Zip-файл.
- Запустите SARTools DESeq2 для сравнения данных (Galaxy Version 1.6.3.0). Предоставьте ZIP-файл, содержащий необработанные файлы подсчета, и файл конструктора, файл с разделителями табуляции, описывающий эксперимент. Внимательно следуйте инструкциям по созданию файла проекта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Репрезентативные результаты получены в результате исследования мигетома RsaC у S. aureus29. RsaC представляет собой нетрадиционную сРНК длиной 1 116 нт. Его 5'-конец содержит несколько повторяющихся областей, в то время как его 3'-конец (544 nt) структурно независим и содержит все прогнозируемые сайты взаимодействия с его мишенями мРНК. Экспрессия этой сРНК индуцируется, когда марганца (Mn) мало, что часто встречается в контексте иммунного ответа хозяина. Используя технологию MAPS, мы идентифицировали несколько мРНК, взаимодействующих непосредственно с RsaC, выявляя их решающую роль в окислительном стрессе(sodA, ldh1 и sarA)и связанных с металлами(znuBC-zur и sufCDSUB)реакциях.
Валидация конструкции MS2-sRNA и экспериментальных условий
Перед проведением экспериментов MAPS важно определить оптимальные условия экспрессии исследуемой сРНК. Если используется ненативный промотор, он определенно поможет создать конструкцию MS2-sRNA при наличии ее целей. Кроме того, конструкция MS2-sRNA должна быть тщательно проверена с точки зрения размера, стабильности, экспрессии и функции. Аптамер MS2 был сплавлен до 5'-го конца либо полноразмерного RsaC (MS2-RsaC1116),либо более короткой формы (MS2-RsaC544),соответствующей 3'-й части RsaC. Обе конструкции были выражены in vivo под контролем зависящего от кворума промотора P3 в S. aureus HG001 ΔrsaC. Делеция гена rsaC позволяет избежать конкуренции между эндогенными RsaC и MS2-RsaC. В качестве контроля использовался штамм дикого типа, содержащий один и тот же вектор только с тегом MS2. Этот элемент управления позволяет вычитать неспецифические взаимодействия, происходящие с тегом MS2.
Чтобы подтвердить конструкции и визуализировать их паттерн экспрессии, бактериальные клетки собирали через 2 ч, 4 ч и 6 ч роста в среде BHI при 37 °C. После экстракции РНК анализ Северного пятна проводили с использованием RsaC-специфического зонда DIG(рисунок 3A). Уровень эндогенного RsaC (полосы 1-3) значительно повышался после 6 ч роста, что обосновывало выделение этой временной точки для экспериментов MAPS. Важно отметить, что уровни MS2-RsaC544 (полосы 7-9) и MS2-RsaC1,116 (полосы 10-12) были сопоставимы с эндогенными RsaC через 6 ч. Следовательно, они должны имитировать эндогенную модель экспрессии RsaC. Более крупная, но незначительная форма RsaC была различима и могла быть вызвана неэффективным концом транскрипции. Это явление часто наблюдается, когда MS2-сРНК экспрессируется под контролем сильного промотора из плазмиды21. Более коротких форм, возникающих в результате прекращения или деградации аберрантной транскрипции, не наблюдалось.
Добавление аптамера MS2 в 5' сРНК также может нарушить их правильное складывание и повлиять на их функции. Этот шаг имеет решающее значение для высокоструктурированных sRNAs, как RsaC. Следовательно, активность MS2-сРНК должна быть проверена и сопоставлена с эндогенной сРНК, когда это возможно. Ранее известная цель или наблюдаемый фенотип могут помочь контролировать ее. Например, влияние RsaC на внутриклеточное накопление АФК было использовано для проверки MS2-RsaC544 и MS2-RsaC1,116 конструкций29.
Анализ собранных фракций при аффинной очистке
РНК экстрагировали из фракций CE, FT и E в штамме WT, экспрессии которого была выражена только метка MS2, и штамме ΔrsaC, экспрессии которого был построен MS2-RsaC544. С помощью анализа Северного Блота мы показали, что эндогенный RsaC длиной 1 116 nt обогащался фракцией элюирования, но оказалось, что он не взаимодействует со сродством столбца(рисунок 3B,полосы 2-3). Мы наблюдали то же явление с MS2-RsaC1,116 (данные не показаны). Это, безусловно, связано с его длиной и сложной вторичной структурой. Поэтому для проведения экспериментов MAPS использовалась только менее структурированная и более короткая форма (544 нт) RsaC, соответствующая его 3'-ной части. На фиг.3BMS2-RsaC544 был высокообогащен фракцией элюирования, демонстрирующей, что он успешно удерживается слитым белком MS2-MBP (полоса 6). Наблюдалась более крупная, но незначительная форма MS2-RsaC544, как показано на рисунке 3A. Здесь жесткость и количество стирок могут быть скорректированы либо на уменьшенную неспецифическую привязку, либо, наоборот, на ограничение потери истинных взаимодействующих партнеров.
Валидация мишеней мРНК после анализа MAPS
После биоинформационного анализа мишени мРНК перечисляются в соответствии с Fold-изменением между MS2-сРНК и контролем MS2, полученным с помощью DeSeq2(рисунок 2). Например, данные MS2-RsaC544 MAPS29 свидетельствуют о том, что мРНК sodA, кодирующая супероксиддисмутазу в S. aureus,является основной мишенью (наилучший удар, более высокое Fold-изменение). Анализ Северного пятна, выполненный с помощью sodA-специфическогозонда DIG после очистки MS2-аффинности, показывает, что sodA был эффективно обогащен MS2-RsaC544 по сравнению с контролем MS2(рисунок 3C).
Систематически проводится глобальный транскриптомный анализ фракции СЕ. Сравнение данных MAPS и этого транскриптомного анализа помогает скорректировать коэффициент обогащения и выявляет потенциальную целевую иерархию. Действительно, плохо экспрессированная мРНК, которая высоко обогащается после очистки MS2-аффинности, безусловно, имеет большее сродство связывания, чем высокообогащенная и высоко экспрессируемая мРНК.
Важно отметить, что все кандидаты, идентифицированные MAPS, должны быть индивидуально проверены с использованием экспериментов in vitro и / или in vivo, таких как electrophoresis Mobility Shift Assays (EMSA) или репортерные генные анализы (см. Jagodnik et al. (2017)39 для получения более подробной информации).
Рисунок 1. Схематическая иллюстрация протокола MAPS, адаптированного к S. aureus. От построения плазмид до анализа данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Рабочий процесс анализа MAPS и обработанные данные. Каждый шаг, контрольная точка и формат файла представлены (см. также шаг 11). Формат FastQ представляет собой текстовый файл, состоящий из последовательностей ДНК и соответствующих показателей качества. Формат BAM представляет собой сжатый файл, содержащий выровненные последовательности. Табличный формат представляет собой текстовый файл с разделителями табуляции с подсчетами для каждого гена. Диаграмма результатов иллюстрирует вид данных, полученных после биоинформатического анализа. Представленные результаты являются вымышленными и не являются результатами какого-либо исследования. Для получения более подробной информации основные учебные пособия доступны на веб-сайте Galaxy Project (https://galaxyproject.org/). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Конструирует валидацию и элементы управления MAPS. Северныйблот-анализ эндогенной RsaC sRNA и связанных с ней конструкций MS2. Штамм WT несет pCN51-P3-MS2 (контроль), а ΔrsaC мутантный штамм несет либо pCN51-P3-MS2, pCN51-P3-MS2-RsaC544 или pCN51-P3-MS2-RsaC1,116. Образцы брали через 2 ч, 4 ч и 6 ч роста BHI при 37 °C. Анализы северного пятна были выполнены с использованием специфического для RsaC зонда DIG. B.Северный блот-анализ фракций очистки MS2-аффинности с использованием RsaC-специфического зонда DIG. Коочистку проводили с использованием штамма WT + pCN51-P3-MS2 (контроль) и ΔrsaC мутантного штамма + pCN51-P3-MS2-RsaC544. Клетки собирали после 6 ч роста в BHI при 37 °C. Сырая добыча (CE), проточные (FT), элюидные (E). C. Северный блот-анализ фракций очистки MS2-аффинности (CE и E) с использованием sodA-специфическогозонда DIG. Подробности см. в разделе(B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| РНК | тип | ссылка |
| Кишечно-кишечное кишечное | ||
| РыхБ | сРНК | Лалауна и др. (2015)21 |
| РыбБ | сРНК | Лалауна и др. (2015) 21 21 |
| 3'ETSлейЗ | Фрагмент, полученный из тРНК | Лалауна и Массе (2015)26 |
| DsrA | сРНК | Лалауна и др. (2015) 22 22 |
| гнс | мРНК (5'UTR) | Лалауна и др. (2015) 22 22 |
| ЦяР | сРНК | Лалауна и др. (2018) 23 23 |
| Рпра | сРНК | Лалауна и др. (2018) 23 23 |
| ГквБ | сРНК | Лалауна и др. (2019) 24 24 |
| Сальмонелла Тифимуриум | ||
| сРНК | Сильва и др. (2019) 25 25 | |
| Зооретокк стафилококка | ||
| Рсая | сРНК | Томасини и др. (2017) 27 27 |
| РсаС | сРНК | Лалауна и др. (2019) 29 29 |
| RsaI | сРНК | Бронески и др. (2019) 28 28 |
Таблица 1. Технология MAPS выявила мишень нескольких РНК в различных организмах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модифицированный протокол для грамположительных бактерий
Исходный протокол МАПС был разработан для изучения интерактома сРНК в модельном организме E. coli20,30. Здесь мы описываем модифицированный протокол, который подходит для характеристики сРНК-зависимых регуляторных сетей в оппортунистическом патогене человека S. aureus и, безусловно, транспонируется другим грамположительным бактериям, патогенным или нет.
Особое внимание было уделено этапу лизиса клеток. Французский пресс был заменен механическим инструментом лизиса клеток. Этот метод эффективен для разрыва грамположительных клеток и ограничения рисков, связанных с обращением с патогенными штаммами. Для повышения выхода MS2-аффинной очистки количество MS2-MBP, иммобилизованного на амилозной смоле, было резко увеличено. Для этого требовалось отрегулировать строгость и количество стирок.
В отличие от первоначального протокола, MAPS здесь выполняется в двух экземплярах, из двух биологических реплик. Разработан рабочий процесс для реализации статистического анализа(рисунок 2),который окончательно повышает надежность получаемых данных.
Конструкция MS2 и ее выражение
Этот протокол MAPS был создан для идентификации мишени стафилококковых сРНК. Конструкция MS2-sRNA экспрессируется из плазмиды с низким числом копий (pCN51, от 20 до 25 копий на клетку) и под контролем кворум-чувствительного промотора P3, в основном индуцированного во время стационарной фазы. Эта картина экспрессии соответствует изученным сРНК в S. aureus (т.е. RsaA, RsaI и RsaC) и обеспечивает довольно сильный синтез MS2-sRNA. Однако нельзя исключать, что в других случаях промотор Р3 может быть нецелесообразным и не отражает естественное физиологическое состояние бактерий при индуцировании сРНК. Другим способом контроля производства MS2-сРНК является использование химически индуцируемых промоторов (например, тетрациклин-индуцируемых промоторов). Эти инструменты позволяют импульсную экспрессию конструкции MS2-sRNA, но эта настройка не гарантирует, что мишени РНК будут одновременно экспрессироваться. Другим недостатком является то, что экспрессия от плазмиды может привести к перепроизводству исследуемой сРНК, еще более подчеркнутой с помощью вектора с высоким числом копий. Это может потенциально привести к артефактным взаимодействиям или нарушению связанных функций РНК-шаперонов. Наиболее подходящей альтернативой является вставка метки MS2 в 5'-конце эндогенного гена сРНК. Таким образом, MS2-сРНК будет хромосомно кодироваться и находиться под контролем своего собственного промотора. Это должно лучше имитировать эндогенную экспрессию изученной сРНК и избегать смещения из-за перепроизводства изученной сРНК. В любом случае, решающим шагом является тщательная проверка длины, стабильности и функциональности конструкции MS2-sRNA, в частности, с использованием анализов Северного пятна с общей РНК, извлеченной из культур, выращенных в условиях, которые запускают эндогенную выработку и функцию рНК. Бесспорно, использование неправильной/нефункциональной конструкции MS2-sRNA может существенно повлиять на полученные результаты, подтверждая значимость элементов управления, описанных выше. Наконец, MS2-сРНК всегда производится на фонеΔ-сРНК для максимального обогащения мишеней мРНК. Кроме того, эксперименты могут быть проведены на штаммах-хозяевах со специфическими мутациями в РНКаз (например, мутанты делеции или чувствительные к температуре мутанты), чтобы избежать деградации мРНК-мишеней путем сРНК-зависимого набора РНК.
По-прежнему требуется экспериментальная валидация кандидатов, идентифицированных MAPS.
Один момент, который необходимо учитывать, заключается в том, что MAPS предоставляет список предполагаемой мишени РНК. Однако некоторые РНК могут быть косвенно обогащены взаимодействием с общей мишенью мРНК или РНК-связывающим белком. Следовательно, выявленные кандидаты должны быть подтверждены другими экспериментальными подходами. EMSA и эксперименты с следом обычно используются для визуализации прямого связывания сРНК с предполагаемой РНК-мишенями in vitro. Затем анализы in vitro toeprinting помогают контролировать влияние сРНК на инициацию трансляции ее мишени мРНК. Наконец, анализы северного пятна и/или репортера генов(lacZ или gfp)дополняют эту экспериментальную валидацию in vivo. Все эти подходы описаны в Jagodnik et al. (2017)39.
В отличие от технологий RIL-seq и CLASH, MAPS напрямую не предоставляет информацию о сайтах взаимодействия. Тем не менее, пик картографических считываний часто наблюдается в ограниченной области мишени РНК (например, 3' конце glyW-cysT-leuZ оперона21),облегчая идентификацию сайта спаривания. Альтернативно, несколько инструментов прогнозирования могут быть использованы для прогнозирования предполагаемого сайта связывания на идентифицированной цели, такой как IntaRNA40.
MAPS тщательно изучает мишень конкретной сРНК
Технология MAPS подходит для изучения мишени сРНК у грамотрицательных бактерий, таких как E. coli и S. Typhimurium, но также теперь с этим модифицированным протоколом у грамположительных бактерий, таких как S. aureus. По сути, MAPS предлагает снимок дуплексов РНК:сРНК, сформированных в данный момент времени и в конкретных условиях роста. К сожалению, список мишеней мРНК может быть неполным. Например, родственная мишень мРНК может быть пропущена из-за неподходящих экспериментальных условий, что оправдывает вышеупомянутые меры предосторожности.
По сравнению с другими широко используемыми методами, такими как RIL-seq или CLASH, MAPS использует специфическую сРНК для совместной очистки всех взаимодействующих мишеней РНК. Здесь взаимодействие сРНК:РНК не разбавляется среди других RBP-ассоциированных дуплексов, что позволяет теоретически охарактеризовать ее мишень более глубоко. Однако, по-видимому, методы RIL-seq/CLASH и MAPS выявили различные наборы предполагаемой цели сРНК12,41,предполагая, что эти экспериментальные подходы дополняют друг друга. Это несоответствие может быть объяснено изменениями условий роста и/или смещением, вызванным каждым методом.
Соответственно, цель исследования должна влиять на выбор метода. Для глобального анализа мишеней сРНК и когда RBP участвует в сРН-опосредооченной регуляции, следует отдавать предпочтение методам RIL-seq и CLASH. Оба подхода обеспечивают обзор регулирующих сетей, опирающихся на конкретный РБП, и, следовательно, раскрывают широкий спектр сРНК и связанных с ними целевых показателей. Напротив, для изучения конкретной сРНК или когда RBP не известен/не участвует, MAPS представляет собой подходящий вариант.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана «Национальным агентством решершей» (ANR, Грант ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH и ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, для PR). Он также был опубликован в рамках labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 и ANR-17-EURE-0023 (для PR), в качестве финансирования от государства, управляемого ANR в рамках инвестиций в будущую программу. DL была поддержана исследовательской и инновационной программой Европейского Союза Horizon 2020 в рамках Грантового соглашения Марии Склодовской-Кюри No 753137-SaRNAReg. Работа в E. Massé Lab была поддержана действующими грантами от Канадских институтов исследований в области здравоохранения (CIHR), Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) и Гранта команды Национальных институтов здравоохранения NIH R01 GM092830-06A1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Starstedt | 72.691 | |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | RNA quantity and quality |
| 250 mL culture flask | Dominique Dutscher | 2515074 | Bacterial cultures |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | 352051 | Culture centrifugation |
| Absolute ethanol | VWR Chemicals | 20821.321 | RNA extraction and purification |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | Bacterial pelleting | |
| Ampicilin (amp) | Sigma-Aldrich | A9518-5G | Growth medium |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | MS2-affinity purification |
| Anti-dioxigenin AP Fab fragment | Sigma Aldrich | 11093274910 | Northern blot assays |
| Autoradiography cassette | ThermoFisher Scientific | 50-212-726 | Northern blot assays |
| BamHI | ThermoFisher Scientific | ER0051 | Plasmid construction |
| BHI (Brain Heart Infusion) Broth | Sigma-Aldrich | 53286 | Growth medium |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | Northern blot assays |
| CDP-Star | Sigma Aldrich | 11759051001 | Northern blot assays (substrate) |
| Centrifuge 5415 R | Eppendorf | RNA extraction and purification | |
| Chloroform | Dominique Dutscher | 508320-CER | RNA extraction and purification |
| DIG-RNA labelling mix | Sigma-Aldrich | 11277073910 | Northern blot assays |
| DNase I | Roche | 4716728001 | DNase treatment |
| Erythromycin (ery) | Sigma-Aldrich | Fluka 45673 | Growth medium |
| FastPrep device | MP Biomedicals | 116004500 | Mechanical lysis |
| Guanidium Thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277-250G | Northern blot assays |
| Hybridization Hoven Hybrigene | Techne | FHB4DD | Northern blot assays |
| Hybridization tubes | Techne | FHB16 | Northern blot assays |
| Isoamyl alcohol | Fisher Scientific | A/6960/08 | RNA extraction and purification |
| LB (Lysogeny Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | Growth medium |
| Lysing Matrix B Bulk | MP Biomedicals | 6540-428 | Mechanical lysis |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | Plasmid construction |
| Milli-Q water device | Millipore | Z00QSV0WW | Ultrapure water |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | RNA/DNA quantity and quality | |
| Nitrocellulose membrane | Dominique Dutsher | 10600002 | Northern blot assays |
| Phembact Neutre | PHEM Technologies | BAC03-5-11205 | Cleaning and decontamination |
| Phenol | Carl Roth | 38.2 | RNA extraction and purification |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | Plasmid construction |
| pMBP-MS2 | Addgene | 65104 | MS2-MBP production |
| Poly-Prep chromatography column | BioRad | 7311550 | MS2-affinity purification |
| PstI | ThermoFisher Scientific | ER0615 | Plasmid construction |
| Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | RNA quantity |
| RNAPro Solution | MP Biomedicals | 6055050 | Mechanical lysis |
| ScriptSeq Complete Kit | Illumina | BB1224 | Preparation of cDNA librairies |
| Spectrophotometer Genesys 20 | ThermoFisher Scientific | 11972278 | Bacterial cultures |
| SpeedVac Savant vacuum device | ThermoFisher Scientific | DNA120 | RNA extraction and purification |
| Stratalinker UV Crosslinker 1800 | Stratagene | 400672 | Northern blot assays |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher Scientific | EL0014 | Plasmid construction |
| TBE (Tris-Borate-EDTA) | Euromedex | ET020-C | Northern blot assays |
| ThermalCycler T100 | BioRad | 1861096 | Plasmid construction |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416-100ML | Northern blot assays |
| X-ray film processor | hu.q | HQ-350XT | Northern blot assays |
| X-ray films Super RX-N | FujiFilm | 4741019318 | Northern blot assays |
References
- Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action. Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).
- Hör, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G. Trans-Acting Small RNAs and Their Effects on Gene Expression in Escherichia coli and Salmonella enterica. EcoSal Plus. 9 (1), (2020).
- Desgranges, E., Marzi, S., Moreau, K., Romby, P., Caldelari, I.
- Adams, P. P., Storz, G. Prevalence of small base-pairing RNAs derived from diverse genomic loci. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (7), 194524 (2020).
- Pain, A., et al. An assessment of bacterial small RNA target prediction programs. RNA Biology. 12 (5), 509-513 (2015).
- Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S., Lalaouna, D. Navigation through the twists and turns of RNA sequencing technologies: Application to bacterial regulatory RNAs. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. , 194506 (2020).
- Wright, P. R., et al. CopraRNA and IntaRNA: predicting small RNA targets, networks and interaction domains. Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 119-123 (2014).
- Smirnov, A., Schneider, C., Hor, J., Vogel, J. Discovery of new RNA classes and global RNA-binding proteins. Current Opinion in Microbiology. 39, 152-160 (2017).
- Saliba, A. E., Santos, S., Vogel, J. New RNA-seq approaches for the study of bacterial pathogens. Current Opinion in Microbiology. 35, 78-87 (2017).
- Melamed, S., Adams, P. P., Zhang, A., Zhang, H., Storz, G. RNA-RNA Interactomes of ProQ and Hfq Reveal Overlapping and Competing Roles. Molecular Cell. 77 (2), 411-425 (2020).
- Melamed, S., et al. Global Mapping of Small RNA-Target Interactions in Bacteria. Molecular Cell. 63 (5), 884-897 (2016).
- Iosub, I. A., et al. Hfq CLASH uncovers sRNA-target interaction networks linked to nutrient availability adaptation. Elife. 9, (2020).
- Waters, S. A., et al. Small RNA interactome of pathogenic E. revealed through crosslinking of RNase E. The EMBO Journal. 36 (3), 374-387 (2017).
- Dos Santos, R. F., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. New molecular interactions broaden the functions of the RNA chaperone Hfq. Current Genetics. , (2019).
- Kavita, K., de Mets, F., Gottesman, S. New aspects of RNA-based regulation by Hfq and its partner sRNAs. Current Opinion in Microbiology. 42, 53-61 (2018).
- Bohn, C., Rigoulay, C., Bouloc, P. No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus. BMC Microbiology. 7, 10 (2007).
- Jousselin, A., Metzinger, L., Felden, B. On the facultative requirement of the bacterial RNA chaperone, Hfq. Trends in Microbiology. 17 (9), 399-405 (2009).
- Olejniczak, M., Storz, G. ProQ/FinO-domain proteins: another ubiquitous family of RNA matchmakers. Molecular Microbiology. 104 (6), 905-915 (2017).
- Lalaouna, D., Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S. Chapter Sixteen - MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach in the Human Pathogen Staphylococcus aureus. Methods in Enzymology. 612, 393-411 (2018).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. Identification of unknown RNA partners using MAPS. Methods. 117, 28-34 (2017).
- Lalaouna, D., et al. A 3' external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise. Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).
- Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli. Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).
- Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome. Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).
- Silva, I. J., et al. SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).
- Lalaouna, D., Masse, E. Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology. Genomics Data. 5, 136-138 (2015).
- Tomasini, A., et al. The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms. Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).
- Bronesky, D., et al. A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus. The EMBO Journal. 38 (6), (2019).
- Lalaouna, D., et al. RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation. Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).
- Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).
- Garibyan, L., Avashia, N.
- Revie, D., Smith, D. W., Yee, T. W. Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions. Nucleic Acids Research. 16 (21), 10301-10321 (1988).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 1 Unit 1.8 (2001).
- Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
- Grosser, M. R., Richardson, A. R. Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis. Methods in Molecular Biology. 1373, 51-57 (2016).
- Krumlauf, R.
- Koontz, L.
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Reseaerch. 44, 3-10 (2016).
- Jagodnik, J., Brosse, A., Le Lam, T. N., Chiaruttini, C., Guillier, M. Mechanistic study of base-pairing small regulatory RNAs in bacteria. Methods. 117, 67-76 (2017).
- Mann, M., Wright, P. R., Backofen, R. IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions. Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).
- Georg, J., et al. The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs. Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).
