Summary
MAPS-tekniken har utvecklats för att granska målbilden för ett specifikt regulatoriskt RNA in vivo. SRNA av intresse är märkt med en MS2 aptamer som möjliggör samrening av sina RNA-partners och deras identifiering genom RNA-sekvensering. Detta modifierade protokoll är särskilt lämpat för grampositiva bakterier.
Abstract
Även om små regulatoriska RNAs (sRNAs) är utbredda bland livets bakteriella domän, är funktionerna hos många av dem fortfarande dåligt karakteriserade, särskilt på grund av svårigheten att identifiera deras mRNA-mål. Här beskrev vi ett modifierat protokoll av MS2-Affinity Rening i kombination med RNA Sekvensering (MAPS) teknik, syftar till att avslöja alla RNA-partners av en specifik sRNA in vivo. I stort sett är MS2 aptamer smält till 5' änden av sRNA av intresse. Denna konstruktion uttrycks sedan in vivo, vilket gör det möjligt för MS2-sRNA att interagera med sina cellulära partners. Efter bakterieskörden lyss cellerna mekaniskt. Råextraktet laddas i en amylosbaserad kromatografikolonn som tidigare belagts med MS2-proteinet som smälts till maltosbindningsproteinet. Detta möjliggör specifik fångst av MS2-sRNA och interagerande RNAs. Efter eluering identifieras co-purified RNAs av hög genomströmning RNA sekvensering och efterföljande bioinformatic analys. Följande protokoll har implementerats i den Gram-positiva humanpatogenen Staphylococcus aureus och kan i princip överföras till alla Grampositiva bakterier. Sammanfattningsvis utgör MAPS-tekniken en effektiv metod för att djupt utforska det regulatoriska nätverket av ett visst sRNA och erbjuda en ögonblicksbild av hela sin målometer. Det är dock viktigt att komma ihåg att de förmodade mål som identifierats av MAPS fortfarande måste valideras genom kompletterande experimentella metoder.
Introduction
Hundratals, kanske till och med tusentals små regulatoriska RNAs (sRNAs) har identifierats i de flesta bakteriella genom, men funktionerna hos de allra flesta av dem förblir okarakteriserade. Sammantaget är sRNAs korta icke-kodande molekyler, spelar stora roller i bakteriefysiologi och anpassning till fluktuerande miljöer1,2,3. Faktum är att dessa makromolekyler är i centrum för många invecklade regleringsnätverk, vilket påverkar metaboliska vägar, stressresponser men också virulens och antibiotikaresistens. Logiskt utlöses deras syntes av specifika miljöstimulanser (t.ex. näringssvält, oxidativa eller membranspänningar). De flesta sRNAs reglerar flera mål mRNAs på post-transkriptionsnivå genom kort och icke-sammanhängande bas parning. De förhindrar vanligtvis översättningsinitiering genom att konkurrera med ribosomer för översättningsinitieringsregioner4. Bildandet av sRNA: mRNA duplexer resulterar också ofta i aktiv nedbrytning av mål mRNA genom rekrytering av specifika RNases.
Karakteriseringen av en sRNA-målome (dvs. hela uppsättningen av dess mål-RNAs) gör det möjligt att identifiera de metaboliska vägar där den ingriper och den potentiella signalen den svarar på. Följaktligen kan funktionerna hos ett specifikt sRNA i allmänhet härledas från dess targetome. För detta ändamål har flera i silico-förutsägelseverktyg utvecklats som IntaRNA och CopraRNA5,6,7. De förlitar sig särskilt på sekvenskomplementaritet, parning av energi och tillgänglighet på den potentiella interaktionsplatsen för att bestämma förmodade sRNA-partners. Förutsägelsealgoritmer integrerar dock inte alla faktorer som påverkar basparning in vivo, såsom inblandning av RNA-förkläde8 som gynnar suboptimala interaktioner eller samuttryck av båda partnerna. På grund av deras inneboende begränsningar är den falska positiva frekvensen av förutsägelseverktyg fortfarande hög. De flesta experimentella storskaliga metoder är baserade på samrening av sRNA: mRNA-par som interagerar med ett märkt RNA-bindande protein (RBP)6,9. Till exempel identifierade RNA-interaktionen genom ligation och sekvensering (RIL-seq) -metoden RNA-duplex som samrenade med RNA-förkläden som Hfq och ProQ i Escherichia coli10,11. En liknande teknik som kallas UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) tillämpades på RNase E- och Hfq-associerade sRNAs i E. coli12,13. Trots de välbeskrivna rollerna av Hfq och ProQ i sRNA-medierad reglering i flera bakterier8,14,15, sRNA-baserad reglering verkar vara RNA förkläde-oberoende i flera organismer som S. aureus16,17,18. Även om reningen av RNA-duplex i samband med RNases är möjlig som visas av Waters och medarbetare13, är detta fortfarande svårt eftersom RNases utlöser deras snabba nedbrytning. Därför utgör MS2-Affinity Rening i kombination med RNA Sekvensering (MAPS)strategi 19,20 ett fast alternativ i sådana organismer.
Till skillnad från ovan nämnda metoder använder MAPS ett specifikt sRNA som bete för att fånga alla interagerande RNAs och förlitar sig därför inte på inblandning av en RBP. Hela processen visas i figur 1. I korthet är sRNA märkt på 5' med MS2 RNA aptamer som är specifikt erkänd av MS2 coat protein. Detta protein smälts med maltosbindande protein (MBP) för att immobiliseras på ett amylosharts. Därför behålls MS2-sRNA och dess RNA-partners på affinitetskromatografikolonnen. Efter eluering med maltos identifieras samrenade RNAs med hjälp av RNA-sekvensering med hög genomströmning följt av bioinformatisk analys (figur 2). MAPS-tekniken ritar i slutändan en interagerande karta över alla potentiella interaktioner som förekommer in vivo.
MAPS-tekniken implementerades ursprungligen i den icke-patogena Gramnegativa bakterien E. coli21. Anmärkningsvärt nog hjälpte MAPS till att identifiera ett tRNA-härlett fragment som specifikt interagerade med både RyhB och RybB sRNAs och förhindrade sRNA-transkriptionsljud för att reglera mRNA-mål under icke-inducerande förhållanden. Därefter har MAPS framgångsrikt tillämpats på andra E. coli sRNAs som DsrA22,RprA23,CyaR23 och GcvB24 (tabell 1). Förutom att bekräfta tidigare kända mål förlängde MAPS målbilden för dessa välkända sRNAs. Nyligen har MAPS utförts i Salmonella Typhimurium och avslöjat att SraL sRNA binder till rho mRNA, kodning för en transkription uppsägning faktor25. Genom denna parning skyddar SraL rho mRNA från den för tidiga transkriptionsavslutningen som utlöses av Rho själv. Intressant nog är denna teknik inte begränsad till sRNAs och kan tillämpas på alla typer av cellulära RNAs som exemplifieras med användning av ett tRNA-härlett fragment26 och en 5'-oöversatt region av mRNA22 (Tabell 1).
MAPS-metoden har också anpassats till den patogena Grampositiva bakterien S. aureus19. Specifikt har lysisprotokollet modifierats för att effektivt bryta celler på grund av en tjockare cellvägg än gramnegativa bakterier och för att upprätthålla RNA-integriteten. Detta anpassade protokoll har redan avslöjat interactomen av RsaA27,RsaI28 och RsaC29. Detta tillvägagångssätt gav insikter om den avgörande rollen av dessa sRNAs i reglerande mekanismer för cellytans egenskaper, glukos upptag och oxidativa stress svar.
Protokollet som utvecklades och implementerades i E. coli 2015 har nyligen beskrivits i detalj30. Här tillhandahåller vi det modifierade MAPS-protokollet, som är särskilt lämpligt för att studera sRNA-regleringsnätverk i Grampositiva (tjockare cellvägg) bakterier oavsett om de är icke-patogena eller patogena (säkerhetsåtgärder).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Buffertar och media
- Förbered följande buffertar och media för MAPS-experiment:
- Buffert A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl2 och 1 mM DTT)
- Buffert E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltos, 0,1% Triton, 1 mM MgCl2 och 1 mM DTT)
- RNA-belastningsbuffert (0,025% xylencyanol och 0,025% bromfenolblå i 8 M urea)
- BHI-medium (Brain Heart Infusion) (12,5 g vadhjärna, 10 g pepton, 5 g nötköttshjärta, 5 g NaCl, 2,5 g Na2HPO4 och 2 g glukos för 1 L)
- Lysogeny Broth (LB) medium (10 g pepton, 5 g jästextrakt och 10 g NaCl för 1 L) - För northern blot-analyser bereder du följande buffertar:
- Blockerande lösning (1x maleinsyra och 1% blockerande reagens)
- Hybridiseringslösning (50% formamid, 5x SSC, 7% SDS, 1% blockeringslösning och 0,2% N-lauryl sarkosin, 50 mM natriumfosfat). Värm med agitation för att lösa upp.
VARNING: Följ noga de säkerhetsåtgärder som är relaterade till varje produkt.
- 1 M natriumfosfat (58 mM natriumfosfatdikar och 42 mM natriumfosfatmonobasiskt)
- Saltlösning, natriumcitratbuffert (SSC), 20x koncentrat (3 M NaCl och 300 mM trinatriumcitrat)
2. Säkerhetsproblem
- Utför alla steg som involverar livskraftiga patogena bakterier i ett nivå 2 inneslutningslabb.
OBS: Endast cellextrakt kan tas utomhus efter lysis (steg 5). - Ta på dig en labbrock och handskar.
- Se till att handlederna är täckta.
- Rengör det biologiska säkerhetsskåpet (klass II) med en desinfektionslösning.
- Kassera fast avfall som exponeras för bakterier i lämplig biomedicinsk behållare.
- Behandla flaskor som innehåller förorenade vätskor med desinfektionslösning. Kassera den sedan i ett handfat.
- Tvätta noggrant händer och handleder med tvål och ta bort labbrocken innan du lämnar nivå 2-inneslutningslabbet.
3. Plasmid konstruktion
OBS: För kloningsändamål är det viktigt att först identifiera gränserna för det endogena sRNA. PCN51-P3 och pCN51-P3-MS2 plasmider beskrivs i Tomasini et al. (2017)27. P3-promotorn tillåter högt uttryck av sRNA på ett celltäthetsberoende sätt (dvs. när bakterier kommer in i den stationära tillväxtfasen). Många stafylokocksRNAs ackumuleras under denna tillväxtfas.
- Förstärk sRNA-sekvensen med PCR med hjälp av en DNA-polymeras med hög återgivning och en PCR-maskin. Följ noggrant tillverkarens instruktioner och läs Garibyan och Avashia (2013)31 för mer information.
- Använd följande mallar för att utforma de specifika primers:
och 5'-CGCGGATCC(N)-3' för framåt- respektive omvända primers.
OBS: Dessa oligonukleotider gör det möjligt att smälta MS2-sekvensen (i fetstil) till 5' änden av sRNA av intresse. Pst (pst) I och BamHI begränsningsplatser (understrukna) läggs till vid 5' och 3 ' extremiteterna i MS2-sRNA-konstruktionen för att klona ampliconen i pCN51-P3 plasmid27. (N) motsvarar den genspecifika sekvensen (15–20 nukleotider). - Smält 1 μg pCN51-P3-plasmid och 1 μg MS2-sRNA PCR-produkt med 2 U PstI och 1 U BamHI i lämplig buffert enligt tillverkarens rekommendationer.
- Inkubera 1 timme vid 37 °C och rena DNA med hjälp av ett PCR-reningskit (se materialförteckning ).
- Blanda den smälta pCN51-P3-plasmiden (300 ng) och MS2-sRNA amplicon (molar ratio for vector:insert = 1:3) i ett 1,5 ml-rör. Se Revie et al. (1988)32 för att maximera ligatureffektiviteten. Tillsätt 1 μL av Ligase Buffer och 10 U T4 Ligase i varje rör. Justera volymen till 10 μL med ultrapurvatten.
- Inkubera vid 22 °C i minst 2 timmar.
- Tillsätt 5 μL ligationsblandning till 50 μL frysta DH5α kemiskt kompetenta E. coli-celler. Läs Seidman et al. (2001)33 för att lära dig mer om plasmidtransformation och kemiskt kompetenta celler.
- Inkubera 30 min på is.
- Värmestöt (45 s vid 42 °C) omvandlingsröret med hjälp av ett värmeblock eller vattenbad.
- Tillsätt 900 μL LB medium och inkubera vid 37 °C i 30 min.
- Platta 100 μL av bakteriesuspensionen på en LB-agarplatta kompletterad med ampicillin (100 μg/μL).
OBS: pCN51-P3 vektorn kodar en ampicillin resistens gen, vilket gör det möjligt att välja endast E. coli kloner som bär pCN51-P3-MS2-sRNA plasmid. - Extrahera pCN51-P3-MS2-sRNA-plasmiden från en bakteriekultur över natten (5 ml) som odlas i närvaro av ampicillin (100 μg/μL) med hjälp av ett plasmid DNA-miniprep-kit (se Materialförteckning).
- Kontrollera konstruktionen medSanger-sekvensering 34 med följande primer, 5'-TCTCGAAAATAATAGAGGG-3'.
- Omvandla pCN51-P3-MS2-sRNA-plasmiden till DC10B kemiskt kompetenta E. coli-celler. Upprepa steg 3.7 till 3.11.
- Extrahera pCN51-P3-MS2-sRNA-plasmiden (se steg 3.12) och omvandla 1-5 μg plasmid-DNA till HG001 ΔSRNA elektrokompetenta S. aureusceller med hjälp av en elektroporationsapparat. Följ noga tillverkarens instruktioner. Läs Grosser och Richardson (2016)35 för att lära dig mer om metoder för att förbereda elektrokompetenta S. aureus.
VARNING: Detta steg innebär hantering av patogena bakterier (se steg 2). - Tillsätt 900 μL BHI-medium och inkubera vid 37 °C i 3 timmar.
- Centrifugera 1 min vid 16 000 x g. Kassera supernaten.
- Återanvänd pelleten i 100 μL BHI och plätera bakteriesuspensionen på BHI-agarplattor kompletterade med erytromycin (10 μg/μL).
OBS: PCN51-P3 vektorn kodar också en erytromycinresistens gen, vilket gör det möjligt att välja endast S. aureus kloner som bär pCN51-P3-MS2-sRNA plasmid.
4. Bakterieskörd
VARNING: Detta steg innebär hantering av patogena bakterier (se steg 2).
- Odla en koloni av stammar som bär antingen pCN51-P3-MS2-sRNA eller pCN51-P3-MS227 plasmider i 3 ml BHI-medium kompletterat med erytromycin (10 μg/μL) i duplikat.
- Späd varje nattkultur i 50 ml (≈1/100) färskt BHI-medium kompletterat med erytromycin (10 μg/μL) för att nå en OD600nm på 0,05. Använd 250 mL steriliserade flaskor (förhållandet mellan kolv och medium).
OBS: Medel- och tillväxtförhållanden bör ställas in enligt uttrycksmönstret för det studerade sRNA. - Odla kulturer vid 37 °C med skakningar vid 180 varv/min i 6 timmar.
- Överför varje kultur till ett 50 ml centrifugeringsrör.
- Centrifugera vid 2 900 x g under 15 min vid 4 °C. Kassera supernaten.
- Håll pellets på is och utför direkt mekanisk celllys (steg 5) eller frys och förvara pellets vid -80 °C.
5. Mekanisk celllys
VARNING: Följande steg måste utföras på is och buffertar måste vara vid 4 °C. Använd handskar och vidta alla försiktighetsåtgärder för att skydda prover från RNases.
- Återanvänd pellets (steg 4,6) i 5 ml buffert A.
- Överför de återanvända cellerna i 15 ml centrifugeringsrör med 3,5 g kiseldioxidpärlor (0,1 mm).
- För in rör i ett mekaniskt celllysinstrument (se Materialförteckning ). Kör en cykel på 40 s vid 4,0 m/s.
OBS: Om en cykel inte räcker för att bryta celler, låt enheten svalna i 5 minuter medan du håller prover på is. Upprepa sedan en annan cykel på 40 s vid 4,0 m/s. Celllysens effektivitet kan testas genom att plätera supernaten på BHI-agarplattan. - Centrifugera vid 15 700 x g i 15 min. Återställ supernaten och håll den på is.
6. Förberedelse av kolumn
VARNING: Var försiktig så att amyloshartset inte torkar. Försegla vid behov kolonnen med ett ändlock. Förbered alla lösningar innan du påbörjar affinitetsreningen.
- Placera en kromatografikolumn i ett kolumnställ (se Materialförteckning).
- Ta bort spaltspetsen och tvätta kolonnen med ultrapurevatten.
- Tillsätt 300 μL amylosharts.
- Tvätta kolonnen med 10 ml buffert A.
- Späd 1200 pmol MBP-MS2-protein i 6 ml buffert A och ladda det i kolumnen.
- Tvätta kolonnen med 10 ml buffert A.
7. MS2-affinitetsrening (figur1)
- Läs in celllysset i kolumnen.
OBS: Behåll 1 ml av celllyatet (Råextrakt, CE) för att extrahera totalt RNA (steg 8) och utföra Northern blot (steg 9) och transkriptomisk (steg 10) analys. - Samla in den genomflödesfraktionen (FT) i ett rent uppsamlingsrör.
- Tvätta kolonnen 3 gånger med 10 ml buffert A. Samla upp tvättfraktionen (W).
- Eluera kolonnen med 1 ml buffert E och samla elueringsfraktionen (E) i ett 2 ml mikrorör.
- Förvara alla insamlade fraktioner på is tills RNA-extraktion (steg 8) eller frys dem vid -20 °C för senare användning.
8. RNA-extraktion av insamlade fraktioner (CE, FT, W och E)
- Använd 1 ml av varje fraktion (inklusive FT och W) för RNA-extraktion.
- Tillsätt 1 volym fenol. Blanda kraftigt.
VARNING: Fenol är flyktig och frätande, var uppmärksam och arbeta säkert under en rökhuv. - Centrifugera vid 16 000 x g i 10 min vid 20 °C.
- Överför den övre fasen i ett rent 2 ml mikrorör.
- Tillsätt 1 volym kloroform/isoamylalkohol (24:1) och upprepa steg 8.3 till 8.4.
VARNING: Arbeta säkert under en rökhuv. - Tillsätt 2,5 volymer kall etanol 100% och 1/10 volym av 3 M natriumacetat (NaOAc) pH 5,2.
- Fäll ut över natten vid -20 °C.
OBS: Nederbörd kan också utföras i ett etanol/torrt isbad under 20 min eller vid -80 °C under 2 timmar. - Centrifugera vid 16 000 x g i 15 min vid 4 °C. Avlägsna långsamt etanol med en pipett samtidigt som du är försiktig så att du inte stör pelleten.
VARNING: RNA-pelleten är inte alltid synlig och är ibland lös i närvaro av etanol. - Tillsätt 500 μL 80% kall etanol.
- Centrifugera vid 16 000 x g i 5 min vid 4 °C.
- Kassera etanol genom att pipetting det långsamt. Torka pelleten med en vakuumkoncentrator, 5 min i körläge.
- Återanvänd pelleten i en lämplig volym (15-50 μL) ultrapurevatten. Frys in pelleten vid -20 °C för senare användning.
- Bedöma RNA-kvantitet (260 nm) och kvalitet (260/280 och 260/230 våglängdsförhållanden) med hjälp av en spektrofotometer/fluorometer (se materialförteckning). Följ noga tillverkarens instruktioner.
OBS: 3-4 μg erhålls i allmänhet i elueringsfraktionen (E). Detta beror främst på testade förhållanden.
9. Analys av MS2-affinitet rening av Northern blot36
- Späd 5 μg RNA av CE- , FT- , W-fraktioner och 500 ng E-fraktion i 10 μL ultrapurevatten och blanda med 10 μL RNA-belastningsbuffert.
- Inkubera 3 min vid 90 °C.
- Ladda prover i brunnar av en 1% agarosgel kompletterad med 20 mM guanidiumtiocyanat och kör gelén vid 100-150 V i TBE 1x buffert vid 4 °C. Läs Koontz (2013)37 för mer information.
- Överför RNAs på ett nitrocellulosamembran genom vakuumöverföring för 1h eller kapilläröverföring över natten.
OBS: Kapillritetsmetoden är effektivare för stora RNAs. - UV-korslänkning av RNAs på membranet (120 mJ vid 254 nm) med hjälp av en ultraviolett tvärlänk.
- Sätt in membranet i en hybridiseringsflaska med RNA-sidan vänd uppåt.
- Tillsätt 10-20 ml förvärmd hybridiseringslösning. Inkubera 30 min vid 68 °C.
- Kassera lösningen och tillsätt 10-20 ml färsk hybridiseringslösning kompletterad med 1 μL av den sRNA-specifika sonden. Inkubera över natten vid 68 °C.
OBS: Den DIG-märkta RNA-sonden syntetiseras med hjälp av ett DIG RNA-märkningssats och följer tillverkarens instruktioner. Alternativt kan en radioaktivt märkt sond användas. - Tvätta membranet med 10-20 ml tvättlösning 1 (2x SSC och 0,1% SDS) i 5 min vid 20 °C. Upprepa en gång.
- Tvätta membranet med 10-20 ml tvättlösning 2 (0,2x SSC och 0,1% SDS) i 15 min vid 68 °C. Upprepa en gång.
- Inkubera med 10-20 ml blockeringslösning i minst 30 min vid 20 °C.
- Kassera lösningen och tillsätt 10-20 ml av blockeringslösningen kompletterad med polyklonal anti-digoxigeninantikropp (1/1000), konjugerad till alkaliskt fosfatas. Inkubera 30 min vid 20 °C.
- Tvätta membranet med 10-20 ml tvättlösning 3 (1x maleinsyra och 0,3% interpolering 20) i 15 min vid 20 °C. Upprepa en gång.
- Inkubera membranet med 10-20 ml detektionslösning (0,1 M Tris HCl och 0,1 M NaCl pH 9,5) 5 min vid 20 °C.
- Sätt membranet på en plastfilm och blötlägg det med substratet (se Materialförteckning ). Inkubera 5 min i mörkret.
- Försegla membranet i en plastfilm. Lägg membranet i en autoradiografikassett.
- Exponera membranet för en autoradiografifilm i det dedikerade mörka rummet.
OBS: Utställningstiden beror på signalstyrkan, från några sekunder till minuter. - Avslöja den exponerade filmen i en automatisk utvecklingsanordning.
10. Beredning av proverna för RNA-sekvensering
OBS: Det här steget gäller endast RNAs extraherade från E- och CE-fraktioner.
- Tillsätt 10 μL 10x DNase-buffert och DNase I (1 U/μg behandlade RNAs) i varje prov. Tillsätt vatten för en slutlig volym på 100 μL.
- Inkubera 1 h vid 37 °C.
- Extrahera och rena RNAs enligt tidigare beskrivna (steg 8.2 till 8.11).
- Återanvänd RNA-pelleten i 20 μL ultrapurevatten.
OBS: Förekomsten av återstående DNA kan kontrolleras med PCR och specifika primers (t.ex. 16S-genen). - Utvärdera RNA-kvantitet och kvalitet med hjälp av ett mikrofluidikbaserat elektroforesanalyssystem (se Materialförteckning ).
OBS: 1 μg erhålls i allmänhet i elueringsfraktionen (E) efter DNase-behandling. - Ta bort ribosomala RNAs med en bakteriell rRNA utarmningssats.
OBS: Stora och rikliga RNAs (dvs. rRNAs) tenderar att icke-specifikt interagera med tillhörighetskolumnen. 500 ng extraherat RNA krävs för att utföra detta steg. - Återigen bedöma RNA mängd och kvalitet med hjälp av ett mikrofluidics-baserade elektrofores analyssystem.
- Förbered cDNA-bibliotek med 10-20 ng ribodepleted RNA med hjälp av ett cDNA-biblioteksförberedande kit och följa tillverkarens instruktioner.
- Sekvensera de erhållna biblioteken med hjälp av ett sekvenseringsinstrument (t.ex. enslutsbibliotek, 150 bp; se Materialförteckning).
OBS: 5-10 miljoner läsningar per prov är i allmänhet tillräckligt.
11. RNAseqs dataanalys (figur 2)
- Ladda ner FastQ-sekvenseringsfilerna från sekvenseringsplattformen.
- Tillgång till Galaxy-instansen av Roscoffs biologiskastation ( https://galaxy.sb-roscoff.fr/) och logga in.
Obs: Varje nämnda algoritm kan lätt hittas med hjälp av sökfältet. En användarhandbok finns för varje verktyg.
VARNING: Versionen av nödvändiga verktyg kan skilja sig från den offentliga Galaxy-servern38. - Klicka på ikonen Hämta data och ladda sedan upp fil från datorn. Ladda upp FastQ-sekvenseringsfil för varje MS2-kontroll och MS2-sRNA-exempel. Ladda upp även FASTA referensgenomfil och GFF-anteckningsfil.
- Kör FastQC Läskvalitetsrapporter (Galaxy Version 0.69).
OBS: Detta verktyg ger en kvalitetsbedömning av råa sekvenser (t.ex. kvalitetspoäng, närvaro av adaptersekvenser). - Kör Trimmomatic flexibelt läsklippverktyg (Galaxy Version 0.36.6) för att särskilt ta bort adaptersekvenser och läsningar av dålig kvalitet. Ange adaptersekvenser som används för biblioteksberedning (t.ex. TruSeq 3, enkelsed). Lägg till följande trimmomatiska åtgärder: SLIDINGWINDOW (Antal baser=4; Genomsnittlig kvalitet=20) och MINLEN (Minsta längd på reads=20).
- Kör igen FastQC Läskvalitetsrapporter (Galaxy Version 0.69).
- Kör Bowtie2 - karta läser mot referensgenom (Galaxy Version 2.3.2.2). Använd FAST-filen Genome Reference från historiken för att mappa läsningar med standardinställningar (mycket känsliga lokala).
BAM-fil som genereras av Bowtie2-verktyget kan visualiseras med integrativ genomikvisare (IGV). Associerad BAI-fil kommer också att krävas. - Du kan också köra Flagstat som sammanställer statistik för BAM-datauppsättning (Galaxy Version 2.0).
- Kör htseq-count - Count (Galaxy Version 0.6.1) som justerar läsningar överlappande funktioner i GFF-anteckningsfilen. Använd läget Skärningspunkt (ej tom).
- Arkivera alla raw count-filer från htseq-count-analys till en enda Zip-fil.
- Kör SARTools DESeq2 för att jämföra data (Galaxy Version 1.6.3.0). Ange zip-filen som innehåller råräkningsfiler och designfilen, en tabbavgränsad fil som beskriver experimentet. Följ noggrant medföljande instruktioner för att generera designfilen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representativa resultaten härrör från studien av RsaC targetome i S. aureus29. RsaC är ett okonventionellt 1 116 nt-långt sRNA. Dess 5' innehåller flera upprepade regioner medan dess 3' (544 nt) är strukturellt oberoende och innehåller alla förväntade interaktionsplatser med sina mRNA-mål. Uttrycket av detta sRNA induceras när mangan (Mn) är knapp, vilket ofta påträffas i samband med värd immunsvar. Med hjälp av MAPS-teknik identifierade vi flera mRNAs som interagerar direkt med RsaC, vilket avslöjar dess avgörande roll i oxidativ stress (sodA, ldh1 och sarA) och metallrelaterade (znuBC-zur och sufCDSUB) svar.
Validering av MS2-sRNA-konstruktionen och experimentella förhållanden
Innan du utför MAPS-experiment är det viktigt att bestämma de optimala uttrycksförhållandena för det studerade sRNA. Om en icke-infödd promotor används kommer den definitivt att hjälpa till att producera MS2-sRNA-konstruktionen när dess mål finns. Dessutom bör MS2-sRNA-konstruktionen valideras noggrant med avseende på storlek, stabilitet, uttryck och funktion. MS2-aptameren smältes till slutet av 5' antingen RsaC i full längd (MS2-RsaC1116) eller den kortare formen (MS2-RsaC544) motsvarande 3' delen av RsaC. Båda konstruktionerna uttrycktes in vivo under kontroll av kvorumkännande beroende P3 promotor i S. aureus HG001 ΔrsaC. Borttagning av rsaC genen undviker en konkurrens mellan den endogena RsaC och MS2-RsaC. Den vilda stammen som innehåller samma vektor med enbart MS2-taggen användes som kontroll. Den här kontrollen gör det möjligt att subtrahera ospecificerade interaktioner som sker med MS2-taggen.
För att bekräfta konstruktionerna och visualisera deras uttrycksmönster skördades bakterieceller efter 2 h, 4 h och 6 h tillväxt i BHI medium vid 37 °C. Efter RNA-extraktion utfördes Northern blot-analys med hjälp av RsaC-specifik DIG-sond (Figur 3A). Nivån på endogen RsaC (körfält 1-3) ökade avsevärt efter 6 h tillväxt, vilket motiverar valet av denna tidpunkt för MAPS-experiment. Det är viktigt att nivåerna i MS2-RsaC544 (körfälten 7-9) och MS2-RsaC1 116 (körfält 10-12) var jämförbara med endogen RsaC vid 6 h. Därför bör de efterlikna det endogena uttrycksmönstret för RsaC. En större men mindre form av RsaC kunde urskiljas och kan bero på en ineffektiv på transkription. Detta fenomen observeras ofta när en MS2-sRNA uttrycks under kontroll av en stark promotor från en plasmid21. Inga kortare blanketter till följd av avvikande transkription eller nedbrytning observerades.
Tillägget av MS2-aptameren vid 5' av sRNAs kan också störa deras korrekta vikning och påverka deras funktioner. Det här steget är avgörande för högstrukturerade sRNAs som RsaC. Därför bör MS2-sRNA-aktivitet testas och jämföras med endogent sRNA när det är möjligt. Ett tidigare känt mål eller en observerbar fenotyp kan hjälpa till att övervaka det. RsaC:s inverkan på intracellulär ACKUMULERING användes till exempel för att validera MS2-RsaC544 och MS2-RsaC1 116 konstruktioner 29.
Analys av insamlade fraktioner under affinitetsrening
RNAs extraherades från CE, FT och E fraktioner i WT stam uttrycker MS2 tagg ensam och ΔrsaC stam uttrycker MS2-RsaC544 konstruktion. Vi visade med hjälp av Northern blot analys att den 1,116 nt-långa endogena RsaC berikades i elutionsfraktionen men visade sig interagera icke-specifikt med affinitetskolonnen (Figur 3B, körfält 2-3). Vi observerade samma fenomen med MS2-RsaC1 116 (data visas inte). Detta beror verkligen på dess längd och komplexa sekundära struktur. Därför användes endast en mindre strukturerad och kortare form (544 nt) av RsaC som motsvarar dess 3" del för att utföra MAPS-experiment. I figur 3Bberikades MS2-RsaC544 mycket i elueringsfraktionen, vilket visade att det framgångsrikt behölls av fusionsproteinet MS2-MBP (bana 6). En större men mindre form av MS2-RsaC544 observerades i figur 3A. Här kan strängheten och antalet tvättar justeras till antingen minskad icke-specifik bindning eller tvärtom för att begränsa förlusten av sanna interagerande partner.
Validering av förmodade mRNA-mål efter MAPS-analys
Efter bioinformatisk analys listas förmodade mRNA-mål enligt fold-change mellan MS2-sRNA och MS2-kontroll, som erhållits med DeSeq2 (figur 2). Till exempel föreslog MS2-RsaC544 MAPS data29 att sodA mRNA, kodning för en superoxiddemutas i S. aureus, är ett huvudmål (bästa träff, högre Fold-change). En nordlig fläckanalys, utförd med en sodA-specifikDIG-sond efter MS2-affinitetsrening, visar att sodA var effektivt samberikat med MS2-RsaC544 jämfört med MS2-kontrollen (figur 3C).
En global transkriptomisk analys utförs systematiskt på CE-fraktionen. Jämförelsen av MAPS-data och denna transkriptionsomiska analys hjälper till att justera anrikningsförhållandet och avslöjar en potentiell målhierarki. Faktum är att en dåligt uttryckt mRNA, som är mycket berikad efter MS2-affinitet rening har verkligen en större bindande affinitet än en mycket berikad och högt uttryckt mRNA.
Det är viktigt att notera att alla kandidater som identifieras av MAPS måste valideras individuellt med hjälp av in vitro- och/eller in vivo-experiment som Electrophoresis Mobility Shift Assays (EMSA) eller reportergenanalyser (se Jagodnik et al. (2017)39 för mer information).
Figur 1. Schematisk illustration av MAPS-protokollet anpassat till S. aureus. Från plasmidkonstruktion till dataanalys. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2. MAPS-analysarbetsflöde och bearbetade data. Varje steg, kontrollpunkt och filformat representeras (se även steg 11). FastQ-format är en textfil som består av DNA-sekvenser och motsvarande kvalitetspoäng. BAM-format är en komprimerad fil som innehåller justerade sekvenser. Tabellformat är en tabbavgränsad textfil med antal för varje gen. Resultat diagrammet illustrerar den typ av data som erhållits efter bioinformatisk analys. Presenterade resultat är fiktiva och kommer inte från någon studie. För ytterligare information finns grundläggande handledningar tillgängliga på Galaxy Project webbplats (https://galaxyproject.org/). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3: Konstruerar validerings- och MAPS-kontroller. A.Northern blot analys av endogena RsaC sRNA och relaterade MS2 konstruktioner. WT-stammen bär pCN51-P3-MS2 (kontroll) och ΔrsaC mutantstam bär antingen pCN51-P3-MS2, pCN51-P3-MS2-RsaC544 eller pCN51-P3-MS2-RsaC1,116. Prover togs efter 2 h, 4 h och 6 h tillväxt i BHI vid 37 °C. Northern blot analyser utfördes med hjälp av en RsaC-specifik DIG sond. B.Northern blot analys av MS2-affinitet rening fraktioner med hjälp av en RsaC-specifik DIG-sond. Co-purification utfördes med WT stam + pCN51-P3-MS2 (kontroll) och ΔrsaC mutant stam + pCN51-P3-MS2-RsaC544. Celler skördades efter 6 h tillväxt i BHI vid 37 °C. Råextrakt (CE), genomflöde (FT), eluering (E). C. Northern blot analys av MS2-affinitet rening fraktioner (CE och E) med hjälp av en sodA-specifikDIG sond. Se (B) för mer information. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Rna | typ | hänvisning |
| Escherichia coli (Escherichia coli) | ||
| RyhB (olika) | sRNA (sRNA) | Lalaouna et al. (2015)21 |
| RybB (olika) | sRNA (sRNA) | Lalaouna et al. (2015) 21 (21) |
| 3'ETSleuZ | tRNA-härlett fragment | Lalaouna och Massé (2015)26 |
| DsrA (DsrA) | sRNA (sRNA) | Lalaouna et al. (2015) 22 (på 22) |
| Hns | mRNA (5'UTR) | Lalaouna et al. (2015) 22 (på 22) |
| CyaR (cyar) | sRNA (sRNA) | Lalaouna et al. (2018) 23 (23) |
| RprA (på andra) | sRNA (sRNA) | Lalaouna et al. (2018) 23 (23) |
| GcvB (GcvB) | sRNA (sRNA) | Lalaouna et al. (2019) 24 (24) |
| Salmonella Typhimurium | ||
| SraL (SraL) | sRNA (sRNA) | Silva et al. (2019) 25 (på 25) |
| Staphylococcus aureus (olika betydelser) | ||
| RsaA (RsaA) | sRNA (sRNA) | Tomasini et al. (2017) 27 (på 27) |
| RsaC (RsaC) | sRNA (sRNA) | Lalaouna et al. (2019) 29 (på 29) |
| RsaI (på RsaI) | sRNA (sRNA) | Bronesky et al. (2019) 28 (28) |
Tabell 1. MAPS-tekniken avslöjade målbilden för flera RNAs i olika organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett modifierat protokoll för grampositiva bakterier
Det ursprungliga protokollet för MAPS utvecklades för att studera sRNA interactome i modellorganismen E. coli20,30. Här beskriver vi ett modifierat protokoll som är lämpligt för karakterisering av sRNA-beroende regleringsnätverk i den opportunistiska mänskliga patogenen S. aureus och är säkert överförbar till andra Gram-positiva bakterier, patogena eller inte.
Särskild uppmärksamhet ägnades åt cell lysis steg. Den franska pressen har ersatts av ett mekaniskt celllysinstrument. Denna metod är effektiv för att bryta Gram-positiva celler och begränsa risker i samband med hantering av patogena stammar. För att förbättra utbytet av MS2-affinitet rening, mängden MS2-MBP immobilized på amylose harts ökat drastiskt. Detta har krävts för att justera strängheten och antalet tvättar.
Till skillnad från det ursprungliga protokollet utförs MAPS här i duplicerat, från två biologiska replikat. Ett arbetsflöde har utvecklats för att genomföra statistisk analys (figur 2), vilket definitivt ökar robustheten hos erhållna data.
MS2-konstruktion och dess uttryck
Detta MAPS protokoll inrättades för att identifiera målomet för staphylococcal sRNAs. MS2-sRNA-konstruktionen uttrycks från ett lågkopia nummerplasmid (pCN51, 20 till 25 kopior/cell) och under kontroll av kvorumavkännande beroende P3 promotor, främst inducerad under stationär fas. Detta uttryck mönster motsvarar studerade sRNAs i S. aureus (dvs. RsaA, RsaI och RsaC) och säkerställer en ganska stark MS2-sRNA syntes. Vi kan dock inte utesluta att P3-promotorn i andra fall kanske inte är lämplig och inte återspeglar bakteriernas naturliga fysiologiska tillstånd när sRNA induceras. Ett annat sätt att kontrollera MS2-sRNA-produktionen är att använda kemiskt inducerbara promotors (t.ex. tetracyklinducerbara promotors). Dessa verktyg tillåter ett pulsuttryck av MS2-sRNA-konstruktionen, men den här inställningen garanterar inte att RNA-mål kommer att uttryckas samtidigt. En annan nackdel är att uttryck från en plasmid kan leda till överproduktion av det studerade sRNA, ännu mer betonat med hög kopia nummer vektor. Detta kan potentiellt leda till artefaktiska interaktioner eller störningar av associerade RNA-förkläde funktioner. Det lämpligaste alternativet är att sätta in en MS2-tagg i slutet av den endogena sRNA-genen. Således skulle MS2-sRNA vara kromosomally kodas och under kontroll av dess inhemska promotor. Detta bör bättre efterlikna det endogena uttrycket av studerade sRNA och undvika partiskhet på grund av överproduktion av det studerade sRNA. I vilket fall som helst är det avgörande steget att noggrant verifiera längden, stabiliteten och funktionaliteten hos MS2-sRNA-konstruktionen, särskilt med hjälp av northern blot-analyser med totalt RNA extraherat från kulturer som odlas under förhållanden som utlöser den endogena sRNA-produktionen och funktionen. Onekligen kan användningen av en felaktig/ofunktionell MS2-sRNA-konstruktion drastiskt påverka genererade resultat, vilket stöder betydelsen av kontroller som beskrivs ovan. Slutligen produceras MS2-sRNA alltid i en ΔsRNA-bakgrund för att maximera anrikningen av mRNA-mål. Dessutom kan experiment utföras i värdstammar med specifika mutationer i RNases (t.ex. borttagningsmutanter eller temperaturkänsliga mutanter) för att undvika mRNA-målförsämring genom sRNA-beroende rekrytering av RNases.
Den experimentella valideringen av kandidater som identifierats av MAPS krävs fortfarande
En punkt som måste beaktas är att MAPS tillhandahåller en lista över förmodade RNA-mål. Vissa RNAs kan dock indirekt berikas via interaktion med ett delat mRNA-mål eller ett RNA-bindande protein. Följaktligen måste avslöjade kandidater bekräftas genom andra experimentella metoder. EMSA- och fotavtrycksexperiment används ofta för att visualisera direktbindning av ett sRNA till förmodade RNA-mål in vitro. Sedan hjälper in vitro toeprinting analyser att övervaka effekten av ett sRNA på översättningsinitiering av dess mRNA-mål. Slutligen kompletterar Northern blot and/or gene reporter assays (lacZ eller gfp) denna experimentella validering in vivo. Alla dessa tillvägagångssätt beskrivs i Jagodnik et al. (2017)39.
Till skillnad från RIL-seq- och CLASH-teknik ger MAPS inte direkt information om interaktionswebbplatserna. Ändå observeras en topp av kartlagda läsningar ofta i en begränsad region av RNA-målet (t.ex. 3' slutet av glyW-cysT-leuZ operon21), vilket underlättar identifieringen av parningsplatsen. Alternativt kan flera förutsägelseverktyg användas för att förutsäga den förmodade bindningsplatsen på det identifierade målet, till exempel IntaRNA40.
MAPS granskar målbilden för ett visst sRNA
MAPS-tekniken är lämplig för studier av sRNA-targetome i gramnegativa bakterier som E. coli och S. Typhimurium, men också nu med detta modifierade protokoll i grampositiva bakterier som S. aureus. I grund och botten erbjuder MAPS en ögonblicksbild av RNA: sRNA-duplex som bildas vid en given tidpunkt och under specifika tillväxtförhållanden. Tyvärr kan listan över mRNA-mål vara ofullständig. Till exempel kan ett cognate mRNA-mål missas på grund av olämpliga experimentella tillstånd, vilket motiverar ovannämnda försiktighetsåtgärder.
Jämfört med andra vanliga metoder som RIL-seq eller CLASH använder MAPS ett specifikt sRNA för att förena alla samverkande RNA-mål. Här sRNA: RNA interaktion späds inte bland andra RBP-associerade duplex, vilket teoretiskt tillåter att karakterisera sin targetome djupare. Det verkar dock som om RIL-seq/ CLASH och MAPS metoder avslöjade olika uppsättningar av förmodade sRNA mål12,41, vilket tyder på att dessa experimentella metoder kompletterar varandra. Denna diskrepans kan förklaras av variationer i tillväxtförhållanden och/eller partiskhet som genereras av varje metod.
Syftet med studien bör därför påverka valet av metod. För en global analys av sRNA-målomer och när en RBP är involverad i sRNA-medierad reglering bör RIL-seq- och CLASH-metoder föredras. Båda metoderna ger en översikt över regleringsnätverk som bygger på en viss RBP och avslöjar följaktligen en mängd olika sRNAs och tillhörande mål. Tvärtom, för studier av ett specifikt sRNA eller när ingen RBP är känd / involverad, representerar MAPS ett lämpligt alternativ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av "Agence Nationale de la Recherche" (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH och ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, till PR). Det har också publicerats inom ramen för labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 och ANR-17-EURE- 0023 (till PR), som finansiering från staten som förvaltas av ANR som en del av investeringarna för det framtida programmet. DL stöddes av EU:s forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 inom ramen för Marie Skłodowska-Curie Grant Agreement nr 753137-SaRNAReg. Arbetet i E. Massé Lab har fått stöd av driftsbidrag från Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) och National institutes of Health NIH Team Grant R01 GM092830-06A1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Starstedt | 72.691 | |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | RNA quantity and quality |
| 250 mL culture flask | Dominique Dutscher | 2515074 | Bacterial cultures |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | 352051 | Culture centrifugation |
| Absolute ethanol | VWR Chemicals | 20821.321 | RNA extraction and purification |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | Bacterial pelleting | |
| Ampicilin (amp) | Sigma-Aldrich | A9518-5G | Growth medium |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | MS2-affinity purification |
| Anti-dioxigenin AP Fab fragment | Sigma Aldrich | 11093274910 | Northern blot assays |
| Autoradiography cassette | ThermoFisher Scientific | 50-212-726 | Northern blot assays |
| BamHI | ThermoFisher Scientific | ER0051 | Plasmid construction |
| BHI (Brain Heart Infusion) Broth | Sigma-Aldrich | 53286 | Growth medium |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | Northern blot assays |
| CDP-Star | Sigma Aldrich | 11759051001 | Northern blot assays (substrate) |
| Centrifuge 5415 R | Eppendorf | RNA extraction and purification | |
| Chloroform | Dominique Dutscher | 508320-CER | RNA extraction and purification |
| DIG-RNA labelling mix | Sigma-Aldrich | 11277073910 | Northern blot assays |
| DNase I | Roche | 4716728001 | DNase treatment |
| Erythromycin (ery) | Sigma-Aldrich | Fluka 45673 | Growth medium |
| FastPrep device | MP Biomedicals | 116004500 | Mechanical lysis |
| Guanidium Thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277-250G | Northern blot assays |
| Hybridization Hoven Hybrigene | Techne | FHB4DD | Northern blot assays |
| Hybridization tubes | Techne | FHB16 | Northern blot assays |
| Isoamyl alcohol | Fisher Scientific | A/6960/08 | RNA extraction and purification |
| LB (Lysogeny Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | Growth medium |
| Lysing Matrix B Bulk | MP Biomedicals | 6540-428 | Mechanical lysis |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | Plasmid construction |
| Milli-Q water device | Millipore | Z00QSV0WW | Ultrapure water |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | RNA/DNA quantity and quality | |
| Nitrocellulose membrane | Dominique Dutsher | 10600002 | Northern blot assays |
| Phembact Neutre | PHEM Technologies | BAC03-5-11205 | Cleaning and decontamination |
| Phenol | Carl Roth | 38.2 | RNA extraction and purification |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | Plasmid construction |
| pMBP-MS2 | Addgene | 65104 | MS2-MBP production |
| Poly-Prep chromatography column | BioRad | 7311550 | MS2-affinity purification |
| PstI | ThermoFisher Scientific | ER0615 | Plasmid construction |
| Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | RNA quantity |
| RNAPro Solution | MP Biomedicals | 6055050 | Mechanical lysis |
| ScriptSeq Complete Kit | Illumina | BB1224 | Preparation of cDNA librairies |
| Spectrophotometer Genesys 20 | ThermoFisher Scientific | 11972278 | Bacterial cultures |
| SpeedVac Savant vacuum device | ThermoFisher Scientific | DNA120 | RNA extraction and purification |
| Stratalinker UV Crosslinker 1800 | Stratagene | 400672 | Northern blot assays |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher Scientific | EL0014 | Plasmid construction |
| TBE (Tris-Borate-EDTA) | Euromedex | ET020-C | Northern blot assays |
| ThermalCycler T100 | BioRad | 1861096 | Plasmid construction |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416-100ML | Northern blot assays |
| X-ray film processor | hu.q | HQ-350XT | Northern blot assays |
| X-ray films Super RX-N | FujiFilm | 4741019318 | Northern blot assays |
References
- Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action. Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).
- Hör, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G. Trans-Acting Small RNAs and Their Effects on Gene Expression in Escherichia coli and Salmonella enterica. EcoSal Plus. 9 (1), (2020).
- Desgranges, E., Marzi, S., Moreau, K., Romby, P., Caldelari, I.
- Adams, P. P., Storz, G. Prevalence of small base-pairing RNAs derived from diverse genomic loci. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (7), 194524 (2020).
- Pain, A., et al. An assessment of bacterial small RNA target prediction programs. RNA Biology. 12 (5), 509-513 (2015).
- Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S., Lalaouna, D. Navigation through the twists and turns of RNA sequencing technologies: Application to bacterial regulatory RNAs. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. , 194506 (2020).
- Wright, P. R., et al. CopraRNA and IntaRNA: predicting small RNA targets, networks and interaction domains. Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 119-123 (2014).
- Smirnov, A., Schneider, C., Hor, J., Vogel, J. Discovery of new RNA classes and global RNA-binding proteins. Current Opinion in Microbiology. 39, 152-160 (2017).
- Saliba, A. E., Santos, S., Vogel, J. New RNA-seq approaches for the study of bacterial pathogens. Current Opinion in Microbiology. 35, 78-87 (2017).
- Melamed, S., Adams, P. P., Zhang, A., Zhang, H., Storz, G. RNA-RNA Interactomes of ProQ and Hfq Reveal Overlapping and Competing Roles. Molecular Cell. 77 (2), 411-425 (2020).
- Melamed, S., et al. Global Mapping of Small RNA-Target Interactions in Bacteria. Molecular Cell. 63 (5), 884-897 (2016).
- Iosub, I. A., et al. Hfq CLASH uncovers sRNA-target interaction networks linked to nutrient availability adaptation. Elife. 9, (2020).
- Waters, S. A., et al. Small RNA interactome of pathogenic E. revealed through crosslinking of RNase E. The EMBO Journal. 36 (3), 374-387 (2017).
- Dos Santos, R. F., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. New molecular interactions broaden the functions of the RNA chaperone Hfq. Current Genetics. , (2019).
- Kavita, K., de Mets, F., Gottesman, S. New aspects of RNA-based regulation by Hfq and its partner sRNAs. Current Opinion in Microbiology. 42, 53-61 (2018).
- Bohn, C., Rigoulay, C., Bouloc, P. No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus. BMC Microbiology. 7, 10 (2007).
- Jousselin, A., Metzinger, L., Felden, B. On the facultative requirement of the bacterial RNA chaperone, Hfq. Trends in Microbiology. 17 (9), 399-405 (2009).
- Olejniczak, M., Storz, G. ProQ/FinO-domain proteins: another ubiquitous family of RNA matchmakers. Molecular Microbiology. 104 (6), 905-915 (2017).
- Lalaouna, D., Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S. Chapter Sixteen - MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach in the Human Pathogen Staphylococcus aureus. Methods in Enzymology. 612, 393-411 (2018).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. Identification of unknown RNA partners using MAPS. Methods. 117, 28-34 (2017).
- Lalaouna, D., et al. A 3' external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise. Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).
- Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli. Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).
- Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome. Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).
- Silva, I. J., et al. SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).
- Lalaouna, D., Masse, E. Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology. Genomics Data. 5, 136-138 (2015).
- Tomasini, A., et al. The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms. Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).
- Bronesky, D., et al. A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus. The EMBO Journal. 38 (6), (2019).
- Lalaouna, D., et al. RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation. Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).
- Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).
- Garibyan, L., Avashia, N.
- Revie, D., Smith, D. W., Yee, T. W. Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions. Nucleic Acids Research. 16 (21), 10301-10321 (1988).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 1 Unit 1.8 (2001).
- Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
- Grosser, M. R., Richardson, A. R. Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis. Methods in Molecular Biology. 1373, 51-57 (2016).
- Krumlauf, R.
- Koontz, L.
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Reseaerch. 44, 3-10 (2016).
- Jagodnik, J., Brosse, A., Le Lam, T. N., Chiaruttini, C., Guillier, M. Mechanistic study of base-pairing small regulatory RNAs in bacteria. Methods. 117, 67-76 (2017).
- Mann, M., Wright, P. R., Backofen, R. IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions. Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).
- Georg, J., et al. The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs. Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).
