MS2-affinitetsrening i kombination med RNA-sekvensering i grampositiva bakterier
Summary
MAPS-tekniken har utvecklats för att granska målbilden för ett specifikt regulatoriskt RNA in vivo. SRNA av intresse är märkt med en MS2 aptamer som möjliggör samrening av sina RNA-partners och deras identifiering genom RNA-sekvensering. Detta modifierade protokoll är särskilt lämpat för grampositiva bakterier.
Abstract
Även om små regulatoriska RNAs (sRNAs) är utbredda bland livets bakteriella domän, är funktionerna hos många av dem fortfarande dåligt karakteriserade, särskilt på grund av svårigheten att identifiera deras mRNA-mål. Här beskrev vi ett modifierat protokoll av MS2-Affinity Rening i kombination med RNA Sekvensering (MAPS) teknik, syftar till att avslöja alla RNA-partners av en specifik sRNA in vivo. I stort sett är MS2 aptamer smält till 5′ änden av sRNA av intresse. Denna konstruktion uttrycks sedan in vivo, vilket gör det möjligt för MS2-sRNA att interagera med sina cellulära partners. Efter bakterieskörden lyss cellerna mekaniskt. Råextraktet laddas i en amylosbaserad kromatografikolonn som tidigare belagts med MS2-proteinet som smälts till maltosbindningsproteinet. Detta möjliggör specifik fångst av MS2-sRNA och interagerande RNAs. Efter eluering identifieras co-purified RNAs av hög genomströmning RNA sekvensering och efterföljande bioinformatic analys. Följande protokoll har implementerats i den Gram-positiva humanpatogenen Staphylococcus aureus och kan i princip överföras till alla Grampositiva bakterier. Sammanfattningsvis utgör MAPS-tekniken en effektiv metod för att djupt utforska det regulatoriska nätverket av ett visst sRNA och erbjuda en ögonblicksbild av hela sin målometer. Det är dock viktigt att komma ihåg att de förmodade mål som identifierats av MAPS fortfarande måste valideras genom kompletterande experimentella metoder.
Introduction
Hundratals, kanske till och med tusentals små regulatoriska RNAs (sRNAs) har identifierats i de flesta bakteriella genom, men funktionerna hos de allra flesta av dem förblir okarakteriserade. Sammantaget är sRNAs korta icke-kodande molekyler, spelar stora roller i bakteriefysiologi och anpassning till fluktuerande miljöer1,2,3. Faktum är att dessa makromolekyler är i centrum för många invecklade regleringsnätverk, vilket påverkar metaboliska vägar, stressresponser men också virulens och antibiotikaresistens. Logiskt utlöses deras syntes av specifika miljöstimulanser (t.ex. näringssvält, oxidativa eller membranspänningar). De flesta sRNAs reglerar flera mål mRNAs på post-transkriptionsnivå genom kort och icke-sammanhängande bas parning. De förhindrar vanligtvis översättningsinitiering genom att konkurrera med ribosomer för översättningsinitieringsregioner4. Bildandet av sRNA: mRNA duplexer resulterar också ofta i aktiv nedbrytning av mål mRNA genom rekrytering av specifika RNases.
Karakteriseringen av en sRNA-målome (dvs. hela uppsättningen av dess mål-RNAs) gör det möjligt att identifiera de metaboliska vägar där den ingriper och den potentiella signalen den svarar på. Följaktligen kan funktionerna hos ett specifikt sRNA i allmänhet härledas från dess targetome. För detta ändamål har flera i silico-förutsägelseverktyg utvecklats som IntaRNA och CopraRNA5,6,7. De förlitar sig särskilt på sekvenskomplementaritet, parning av energi och tillgänglighet på den potentiella interaktionsplatsen för att bestämma förmodade sRNA-partners. Förutsägelsealgoritmer integrerar dock inte alla faktorer som påverkar basparning in vivo, såsom inblandning av RNA-förkläde8 som gynnar suboptimala interaktioner eller samuttryck av båda partnerna. På grund av deras inneboende begränsningar är den falska positiva frekvensen av förutsägelseverktyg fortfarande hög. De flesta experimentella storskaliga metoder är baserade på samrening av sRNA: mRNA-par som interagerar med ett märkt RNA-bindande protein (RBP)6,9. Till exempel identifierade RNA-interaktionen genom ligation och sekvensering (RIL-seq) -metoden RNA-duplex som samrenade med RNA-förkläden som Hfq och ProQ i Escherichia coli10,11. En liknande teknik som kallas UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) tillämpades på RNase E- och Hfq-associerade sRNAs i E. coli12,13. Trots de välbeskrivna rollerna av Hfq och ProQ i sRNA-medierad reglering i flera bakterier8,14,15, sRNA-baserad reglering verkar vara RNA förkläde-oberoende i flera organismer som S. aureus16,17,18. Även om reningen av RNA-duplex i samband med RNases är möjlig som visas av Waters och medarbetare13, är detta fortfarande svårt eftersom RNases utlöser deras snabba nedbrytning. Därför utgör MS2-Affinity Rening i kombination med RNA Sekvensering (MAPS)strategi 19,20 ett fast alternativ i sådana organismer.
Till skillnad från ovan nämnda metoder använder MAPS ett specifikt sRNA som bete för att fånga alla interagerande RNAs och förlitar sig därför inte på inblandning av en RBP. Hela processen visas i figur 1. I korthet är sRNA märkt på 5′ med MS2 RNA aptamer som är specifikt erkänd av MS2 coat protein. Detta protein smälts med maltosbindande protein (MBP) för att immobiliseras på ett amylosharts. Därför behålls MS2-sRNA och dess RNA-partners på affinitetskromatografikolonnen. Efter eluering med maltos identifieras samrenade RNAs med hjälp av RNA-sekvensering med hög genomströmning följt av bioinformatisk analys (figur 2). MAPS-tekniken ritar i slutändan en interagerande karta över alla potentiella interaktioner som förekommer in vivo.
MAPS-tekniken implementerades ursprungligen i den icke-patogena Gramnegativa bakterien E. coli21. Anmärkningsvärt nog hjälpte MAPS till att identifiera ett tRNA-härlett fragment som specifikt interagerade med både RyhB och RybB sRNAs och förhindrade sRNA-transkriptionsljud för att reglera mRNA-mål under icke-inducerande förhållanden. Därefter har MAPS framgångsrikt tillämpats på andra E. coli sRNAs som DsrA22,RprA23,CyaR23 och GcvB24 (tabell 1). Förutom att bekräfta tidigare kända mål förlängde MAPS målbilden för dessa välkända sRNAs. Nyligen har MAPS utförts i Salmonella Typhimurium och avslöjat att SraL sRNA binder till rho mRNA, kodning för en transkription uppsägning faktor25. Genom denna parning skyddar SraL rho mRNA från den för tidiga transkriptionsavslutningen som utlöses av Rho själv. Intressant nog är denna teknik inte begränsad till sRNAs och kan tillämpas på alla typer av cellulära RNAs som exemplifieras med användning av ett tRNA-härlett fragment26 och en 5′-oöversatt region av mRNA22 (Tabell 1).
MAPS-metoden har också anpassats till den patogena Grampositiva bakterien S. aureus19. Specifikt har lysisprotokollet modifierats för att effektivt bryta celler på grund av en tjockare cellvägg än gramnegativa bakterier och för att upprätthålla RNA-integriteten. Detta anpassade protokoll har redan avslöjat interactomen av RsaA27,RsaI28 och RsaC29. Detta tillvägagångssätt gav insikter om den avgörande rollen av dessa sRNAs i reglerande mekanismer för cellytans egenskaper, glukos upptag och oxidativa stress svar.
Protokollet som utvecklades och implementerades i E. coli 2015 har nyligen beskrivits i detalj30. Här tillhandahåller vi det modifierade MAPS-protokollet, som är särskilt lämpligt för att studera sRNA-regleringsnätverk i Grampositiva (tjockare cellvägg) bakterier oavsett om de är icke-patogena eller patogena (säkerhetsåtgärder).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett modifierat protokoll för grampositiva bakterier
Det ursprungliga protokollet för MAPS utvecklades för att studera sRNA interactome i modellorganismen E. coli20,30. Här beskriver vi ett modifierat protokoll som är lämpligt för karakterisering av sRNA-beroende regleringsnätverk i den opportunistiska mänskliga patogenen S. aureus och är säkert överförbar till andra Gram-positiva bakterier, patogena eller inte.</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av “Agence Nationale de la Recherche” (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH och ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, till PR). Det har också publicerats inom ramen för labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 och ANR-17-EURE- 0023 (till PR), som finansiering från staten som förvaltas av ANR som en del av investeringarna för det framtida programmet. DL stöddes av EU:s forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 inom ramen för Marie Skłodowska-Curie Grant Agreement nr 753137-SaRNAReg. Arbetet i E. Massé Lab har fått stöd av driftsbidrag från Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) och National institutes of Health NIH Team Grant R01 GM092830-06A1.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Starstedt | 72.691 | |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | RNA quantity and quality |
| 250 mL culture flask | Dominique Dutscher | 2515074 | Bacterial cultures |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | 352051 | Culture centrifugation |
| Absolute ethanol | VWR Chemicals | 20821.321 | RNA extraction and purification |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | Bacterial pelleting | |
| Ampicilin (amp) | Sigma-Aldrich | A9518-5G | Growth medium |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | MS2-affinity purification |
| Anti-dioxigenin AP Fab fragment | Sigma Aldrich | 11093274910 | Northern blot assays |
| Autoradiography cassette | ThermoFisher Scientific | 50-212-726 | Northern blot assays |
| BamHI | ThermoFisher Scientific | ER0051 | Plasmid construction |
| BHI (Brain Heart Infusion) Broth | Sigma-Aldrich | 53286 | Growth medium |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | Northern blot assays |
| CDP-Star | Sigma Aldrich | 11759051001 | Northern blot assays (substrate) |
| Centrifuge 5415 R | Eppendorf | RNA extraction and purification | |
| Chloroform | Dominique Dutscher | 508320-CER | RNA extraction and purification |
| DIG-RNA labelling mix | Sigma-Aldrich | 11277073910 | Northern blot assays |
| DNase I | Roche | 4716728001 | DNase treatment |
| Erythromycin (ery) | Sigma-Aldrich | Fluka 45673 | Growth medium |
| FastPrep device | MP Biomedicals | 116004500 | Mechanical lysis |
| Guanidium Thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277-250G | Northern blot assays |
| Hybridization Hoven Hybrigene | Techne | FHB4DD | Northern blot assays |
| Hybridization tubes | Techne | FHB16 | Northern blot assays |
| Isoamyl alcohol | Fisher Scientific | A/6960/08 | RNA extraction and purification |
| LB (Lysogeny Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | Growth medium |
| Lysing Matrix B Bulk | MP Biomedicals | 6540-428 | Mechanical lysis |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | Plasmid construction |
| Milli-Q water device | Millipore | Z00QSV0WW | Ultrapure water |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | RNA/DNA quantity and quality | |
| Nitrocellulose membrane | Dominique Dutsher | 10600002 | Northern blot assays |
| Phembact Neutre | PHEM Technologies | BAC03-5-11205 | Cleaning and decontamination |
| Phenol | Carl Roth | 38.2 | RNA extraction and purification |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | Plasmid construction |
| pMBP-MS2 | Addgene | 65104 | MS2-MBP production |
| Poly-Prep chromatography column | BioRad | 7311550 | MS2-affinity purification |
| PstI | ThermoFisher Scientific | ER0615 | Plasmid construction |
| Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | RNA quantity |
| RNAPro Solution | MP Biomedicals | 6055050 | Mechanical lysis |
| ScriptSeq Complete Kit | Illumina | BB1224 | Preparation of cDNA librairies |
| Spectrophotometer Genesys 20 | ThermoFisher Scientific | 11972278 | Bacterial cultures |
| SpeedVac Savant vacuum device | ThermoFisher Scientific | DNA120 | RNA extraction and purification |
| Stratalinker UV Crosslinker 1800 | Stratagene | 400672 | Northern blot assays |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher Scientific | EL0014 | Plasmid construction |
| TBE (Tris-Borate-EDTA) | Euromedex | ET020-C | Northern blot assays |
| ThermalCycler T100 | BioRad | 1861096 | Plasmid construction |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416-100ML | Northern blot assays |
| X-ray film processor | hu.q | HQ-350XT | Northern blot assays |
| X-ray films Super RX-N | FujiFilm | 4741019318 | Northern blot assays |
References
- Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action. Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).
- Hör, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G. Trans-Acting Small RNAs and Their Effects on Gene Expression in Escherichia coli and Salmonella enterica. EcoSal Plus. 9 (1), (2020).
- Desgranges, E., Marzi, S., Moreau, K., Romby, P., Caldelari, I. Noncoding RNA. Microbiology Spectrum. 7 (2), (2019).
- Adams, P. P., Storz, G. Prevalence of small base-pairing RNAs derived from diverse genomic loci. Biochimica et Biophysica Acta – Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (7), 194524 (2020).
- Pain, A., et al. An assessment of bacterial small RNA target prediction programs. RNA Biology. 12 (5), 509-513 (2015).
- Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S., Lalaouna, D. Navigation through the twists and turns of RNA sequencing technologies: Application to bacterial regulatory RNAs. Biochimica et Biophysica Acta – Gene Regulatory Mechanisms. , 194506 (2020).
- Wright, P. R., et al. CopraRNA and IntaRNA: predicting small RNA targets, networks and interaction domains. Nucleic Acids Research. 42, 119-123 (2014).
- Smirnov, A., Schneider, C., Hor, J., Vogel, J. Discovery of new RNA classes and global RNA-binding proteins. Current Opinion in Microbiology. 39, 152-160 (2017).
- Saliba, A. E., Santos, S., Vogel, J. New RNA-seq approaches for the study of bacterial pathogens. Current Opinion in Microbiology. 35, 78-87 (2017).
- Melamed, S., Adams, P. P., Zhang, A., Zhang, H., Storz, G. RNA-RNA Interactomes of ProQ and Hfq Reveal Overlapping and Competing Roles. Molecular Cell. 77 (2), 411-425 (2020).
- Melamed, S., et al. Global Mapping of Small RNA-Target Interactions in Bacteria. Molecular Cell. 63 (5), 884-897 (2016).
- Iosub, I. A., et al. Hfq CLASH uncovers sRNA-target interaction networks linked to nutrient availability adaptation. Elife. 9, (2020).
- Waters, S. A., et al. Small RNA interactome of pathogenic E. revealed through crosslinking of RNase E. The EMBO Journal. 36 (3), 374-387 (2017).
- Dos Santos, R. F., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. New molecular interactions broaden the functions of the RNA chaperone Hfq. Current Genetics. , (2019).
- Kavita, K., de Mets, F., Gottesman, S. New aspects of RNA-based regulation by Hfq and its partner sRNAs. Current Opinion in Microbiology. 42, 53-61 (2018).
- Bohn, C., Rigoulay, C., Bouloc, P. No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus. BMC Microbiology. 7, 10 (2007).
- Jousselin, A., Metzinger, L., Felden, B. On the facultative requirement of the bacterial RNA chaperone, Hfq. Trends in Microbiology. 17 (9), 399-405 (2009).
- Olejniczak, M., Storz, G. ProQ/FinO-domain proteins: another ubiquitous family of RNA matchmakers. Molecular Microbiology. 104 (6), 905-915 (2017).
- Lalaouna, D., Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S. Chapter Sixteen – MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach in the Human Pathogen Staphylococcus aureus. Methods in Enzymology. 612, 393-411 (2018).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. Identification of unknown RNA partners using MAPS. Methods. 117, 28-34 (2017).
- Lalaouna, D., et al. A 3′ external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise. Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).
- Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli. Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).
- Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome. Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).
- Silva, I. J., et al. SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).
- Lalaouna, D., Masse, E. Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology. Genomics Data. 5, 136-138 (2015).
- Tomasini, A., et al. The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms. Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).
- Bronesky, D., et al. A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus. The EMBO Journal. 38 (6), (2019).
- Lalaouna, D., et al. RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation. Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).
- Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).
- Garibyan, L., Avashia, N. Polymerase chain reaction. Journal of Investigative Dermatology. 133 (3), 1-4 (2013).
- Revie, D., Smith, D. W., Yee, T. W. Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions. Nucleic Acids Research. 16 (21), 10301-10321 (1988).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).
- Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
- Grosser, M. R., Richardson, A. R. Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis. Methods in Molecular Biology. 1373, 51-57 (2016).
- Krumlauf, R. Northern blot analysis. Methods in Molecular Biology. 58, 113-128 (1996).
- Koontz, L. Agarose gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 529, 35-45 (2013).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Reseaerch. 44, 3-10 (2016).
- Jagodnik, J., Brosse, A., Le Lam, T. N., Chiaruttini, C., Guillier, M. Mechanistic study of base-pairing small regulatory RNAs in bacteria. Methods. 117, 67-76 (2017).
- Mann, M., Wright, P. R., Backofen, R. IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions. Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).
- Georg, J., et al. The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs. Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).
