Summary
نحن نصف طريقة معدلة تعتمد على أجار مصممة لقياس الآثار المضادة للفطريات للمنتجات المشتقة من النباتات. يمكن تقييم المساهمات المتقلبة وغير المتقلبة في النشاط المضاد للفطريات من خلال هذا البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن قياس الفعالية ضد الفطريات في المراحل التنموية الرئيسية في إعداد تجريبي واحد.
Abstract
ويستند البروتوكول الموصوف على تقنية نقل المكونات التي تسمح بتحديد دقيق لكميات الكائنات الحية الدقيقة ومراحل نموها. وينتشر عدد محدد من الجراثيم على لوحة أجار. يتم احتضان هذه الصفيحة لفترة محددة للسماح للفطريات بالوصول إلى مرحلة النمو المتوقعة ، باستثناء الجراثيم التي لا يلزم حضانتها. يتم سحب المقابس أجار التي تغطيها الجراثيم، الهيجا، أو الميسيليوم المقبل ونقلها على وسائل الإعلام أجار التي تحتوي على مركب مضاد للفطريات لاختبارها إما وضعها على مسافة من الفطريات أو في اتصال. هذه الطريقة قابلة للتطبيق لاختبار كل من المستخلصات السائلة والعينات الصلبة (المساحيق). وهي مناسبة بشكل خاص لتحديد المساهمات النسبية للعوامل المتطايرة وغير المتطايرة في الخلائط النشطة بيولوجيا وتحديد آثارها ، وتحديدا على الجراثيم والهيجا المبكرة والميسيليوم.
هذه الطريقة ذات صلة كبيرة لتوصيف النشاط المضاد للفطريات من منتجات المكافحة الحيوية ، ولا سيما المنتجات المشتقة من النباتات. في الواقع، لمعالجة النبات، يمكن استخدام النتائج لتوجيه اختيار طريقة التطبيق وتحديد عتبات الزناد.
Introduction
يمكن أن تصل الخسائر العالمية من الفواكه والخضروات إلى 50٪ من الإنتاج1 وتنجم في الغالب عن تسوس الأغذية الناجم عن تلف الفطريات في الحقل أو أثناء تخزين ما بعد الحصاد2،3 ، علىالرغممن الاستخدام الواسع لمبيدات الفطريات الاصطناعية منذ منتصف القرن العشرين4. ويجري حاليا إعادة النظر في استخدام هذه المواد لأنها تمثل مخاطر بيئية وصحية خطيرة. كما تظهر العواقب الضارة لاستخدامها في جميع أنحاء النظم الإيكولوجية والأدلة على الآثار الصحية المحتملة قد تراكمت5،6، ويجري تطوير بدائل جديدة لاستراتيجيات وقائية قديمة لعلاج ما قبل وبعد الحصاد7،8،9. ومن هنا يأتي التحدي الذي نواجهه من شقين. ويجب أن تحافظ الاستراتيجيات الجديدة لمبيدات الفطريات، أولا، على مستويات فعالية حماية الأغذية من الأمراض النباتية، وأن تسهم، ثانيا، في الحد بشكل كبير من البصمة البيئية للممارسات الزراعية. ولتحقيق هذا الهدف الطموح، يجري اقتراح استراتيجيات مستوحاة من الدفاعات الطبيعية التي تطورت في النباتات حيث تم تسليط الضوء على أكثر من 1000 نوع من النباتات لخصائصها المضادة للميكروبات8. على سبيل المثال، النباتات التي طورت مبيدات الفطريات الطبيعية لمكافحة phytopathogens هي مورد جديد في استكشاف تطوير منتجات جديدة للتحكم البيولوجي2. الزيوت الأساسية هي الجزيئات الرئيسية من هذا النوع. على سبيل المثال، زيت الأوريجانوم الأساسي يحمي نباتات الطماطم ضد العفن الرمادي في الدفيئات 10 وقد ثبت سوليداغو canadensis L. والزيوت الأساسية كاسيا للحفاظ على الفراولة بعد حصادها من أضرار العفن الرمادي11،12. وتوضح هذه الأمثلة أن المكافحة البيولوجية، ولا سيما المنتجات المشتقة من النباتات، تمثل حلا يجمع بين الفعالية البيولوجية والاستدامة البيئية.
وبالتالي، فإن النباتات مورد مهم للجزيئات ذات الأهمية المحتملة لصناعة حماية المحاصيل. ومع ذلك فقد اقترح سوى عدد قليل من المنتجات النباتية لاستخدامها كمنتجات التحكم البيولوجي على الرغم من أنها معترف بها عموما على أنها آمنة وغير phytotoxic وصديقة للبيئة2. وقد لوحظت بعض الصعوبات في نقل من المختبر إلى الميدان، مثل انخفاض فعالية مرة واحدة تطبق في الجسم الحي2،9. وبالتالي، يصبح من المهم تحسين قدرة الاختبارات المعملية على التنبؤ بشكل أفضل بفعالية المجال. وفي هذا السياق، فإن طرق اختبار مضادات الفطريات للمنتجات المشتقة من النباتات ضرورية لتقييم فعاليتها المضادة للفطريات وتحديد ظروفها المثلى للاستخدام. وعلى وجه التحديد، فإن منتجات المكافحة البيولوجية أقل كفاءة عموما من مبيدات الفطريات الكيميائية، ولذلك فإن من المهم فهم طريقة عملها بشكل أفضل لاقتراح تركيبات مناسبة، وتحديد طريقة التطبيق في المجالات، وتحديد المرحلة التنموية للمسبب الممرض المعرضة للمنتج البيولوجي المرشح.
وتشمل النهج الحالية التي تعالج الأنشطة المضادة للبكتيريا والفطريات أساليب الانتشار مثل نشر قرص أغار، والتخفيف، والتصوير البيولوجي، وقياس التدفق الخلوي13. معظم هذه التقنيات ، وبشكل أكثر تحديدا ، فإن اختبار الحساسية القياسية المضادة للفطريات - نشر قرص أجار ومقايسات التخفيف - مكيفة بشكل جيد لتقييم النشاط المضاد للميكروبات للمركبات القابلة للذوبان على الجراثيم البكتيرية والفطرية في التعليق السائل14. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق ليست مناسبة بشكل عام لاختبار المركبات الصلبة مثل مسحوق النبات المجفف أو لتحديد النشاط المضاد للفطريات أثناء نمو الميسيليوم لأنها تتطلب تخفيف البوغ أو انتشار البوغ على لوحات أجار و / أو تخفيف المركبات المضادة للفطريات13. في طريقة تسمم الطعام ، يتم تلقيح لوحات أجار التي تحتوي على العامل المضاد للفطريات مع قرص قطره 5-7 ملم عينات من ثقافة الفطريات القديمة لمدة 7 أيام دون النظر في الكمية الدقيقة لبدء الميسيليوم. بعد الحضانة ، يتم تحديد النشاط المضاد للفطريات على أنه نسبة مئوية من تثبيط النمو الشعاعي17,18,19. مع هذا النهج يمكننا تقييم النشاط المضاد للفطريات على النمو mycelial. وعلى النقيض من ذلك ، يتم تنفيذ طريقة تخفيف أجار لتحديد النشاط المضاد للفطريات على الجراثيم التي تم تلقيحها مباشرة على سطح لوحة أجار التي تحتوي على المركبات المضادة للفطريات13,20,21. يعطي هذان النهجان نتائج تكميلية على النشاط المضاد للفطريات. ومع ذلك هذه هي اثنين من التقنيات المستقلة المستخدمة بالتوازي التي لا توفر مقارنة دقيقة جنبا إلى جنب من الفعالية النسبية للمركبات المضادة للفطريات على الجراثيم والفطريات17,20,22 كما تختلف كمية المواد الفطرية بدءا في النهجين. وعلاوة على ذلك، فإن النشاط المضاد للفطريات للمنتج المشتق من النبات غالبا ما ينتج عن الجمع بين الجزيئات المضادة للفطريات التي توليفها من قبل النباتات لمواجهة مسببات الأمراض. وتشمل هذه الجزيئات البروتينات والببتيدات23,24، ونواتج الأيض وجود التنوع الكيميائي واسعة والانتماء إلى فئات مختلفة من جزيئات مثل البوليفينول، تيربينس، alcaloïds25, الجلوكوزينولات8، ومركبات أورجانوسلفور26. بعض هذه الجزيئات متقلبة أو تصبح متقلبة أثناء هجوم مسببات الأمراض27. هذه العوامل هي في معظم الأحيان سيئة للذوبان في الماء وارتفاع مركبات الضغط بخار التي يتعين استردادها من خلال تقطير المياه والزيوت الأساسية، وبعضها قد ثبت جيدا أنشطتها المضادة للميكروبات28. تم تطوير اختبارات قابلية للتأثر بوساطة مرحلة البخار لقياس النشاط المضاد للميكروبات للمركبات المتطايرة بعد التبخر والهجرة عبر مرحلة البخار29. وتستند هذه الأساليب على إدخال المركبات المضادة للفطريات على مسافة من الثقافة الميكروبية29,30,31,32,33. في المقايسة agar مرحلة بخار شائعة الاستخدام، يتم إيداع الزيوت الأساسية على قرص ورقي ووضعها في وسط غطاء طبق بيتري على مسافة من تعليق بوغ البكتيرية أو الفطرية، والتي تنتشر على المتوسط أجار. ثم يقاس قطر منطقة تثبيط النمو بنفس الطريقة التي تقاس بها طريقة نشر القرص الأغار20,24. وقد تم تطوير نهج أخرى لتوفير قياس كمي للحساسية المضادة للفطريات في مرحلة البخار من الزيوت الأساسية ، المستمدة من طريقة تخفيف المرق التي تم من خلالها حساب نشاط مضاد للميكروبات بوساطة مثبطة على مرحلة البخار32، أو مشتقة من مقايسات نشر قرص أغار31. هذه الأساليب هي عموما محددة لدراسات النشاط مرحلة بخار وغير مناسبة لمقاايسات تثبيط الاتصال. وهذا يحول دون تحديد المساهمة النسبية للعوامل المتطايرة وغير المتطايرة في النشاط المضاد للفطريات لخليط نشط بيولوجيا معقد.
الطريقة الكمية التي طورناها تهدف إلى قياس التأثير المضاد للفطريات لمسحوق النبات المجفف على الكميات الخاضعة للرقابة من الجراثيم وزرع الميسيليوم المودع على سطح وسيط أجار لإعادة إنتاج النمو الجوي للنباتات النباتية أثناء عدوى النباتات15 وكذلك شبكة mycelial مترابطة16. النهج هو إعداد تجريبي معدل يستند إلى أساليب تخفيف أجار ومسمومة بالغذاء التي تسمح أيضا ، في نفس الإعداد التجريبي ، بالتقيم الكمي جنبا إلى جنب لمساهمة كل من الأيضات المضادة للفطريات المتطايرة وغير المتطايرة. في هذه الدراسة ، تم قياس الطريقة مقابل نشاط ثلاثة مستحضرات مضادة للفطريات تتميز بشكل جيد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد إنوكلا
- قبل التجربة، وضع 5 ميكرولتر من تريتشوديرما spp. SBT10-2018 الجراثيم المخزنة في 4 درجة مئوية على البطاطا dextrose أجار المتوسطة (المساعد الشخصي الرقمي) واحتضان لمدة 4 أيام في 30 درجة مئوية مع التعرض للضوء العادية لتعزيز تشكيل كونيديا42 (الشكل 1، لوحة A).
ملاحظة: تريشوديرما SPP. تم عزل SBT10-2018 عن الخشب ويستخدم كنموذج في هذه الدراسة لنموه السريع وسهولة استعادة البوغ. يتم الحفاظ على هذه السلالة من قبل مختبرنا. - استرداد كونيديا (الشكل 1، لوحة A)
- وضع 3 مل من 0.05٪ توين-20 على الماسيليوم تريتشوديرما.
- استخدام أشعل النار للافراج عن كونيديا من conidiophores; تجنب الضغط على الميسيليوم لمنع الهيجا من التمزق.
- استعادة الحل بسرعة مع micropipette لتجنب أن يتم امتصاصه من قبل المتوسط أجار ونقلها إلى أنبوب 15 مل.
- عد العدد الإجمالي للجراثيم باستخدام مقياس الدم وإعداد محلول يحتوي على 3 × 106 جراثيم / مل.
ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة بعناية لمنع استخراج hyphae. ثم يتم فحص إعداد بوغ تحت المجهر. في نهاية المطاف ، بالنسبة للسلالات التي تقدم الماسيليوم الجوي ورقيق للغاية ، يمكن إضافة خطوة من الترشيح باستخدام مرشح مصفاة 40 ميكرومتر للقضاء على جزء الميسيليوم المتبقي.
2. إعداد لوحات الفطريات (الشكل 1، لوحة ب)
- إيداع 100 ميكرولتر من 3 × 106 الجراثيم / مل مع micropipette على طبق بيتري قطرها 9 سم تحتوي على متوسط المساعد الشخصي الرقمي للحصول على 4800 جراثيم / سم2 المقابلة ل925 جراثيم / 5 مم قطرها أجار المكونات.
- إضافة 10 غرام من 2 مم قطرها الخرز الزجاجي مع ملعقة معقمة وأداء حركات إلى الأمام والخلف موازية وم عمودي على ذراع المشغل لتوزيع بالتساوي الجراثيم على سطح أجار.
- تدوير لوحة من قبل 90 درجة وتكرار الحركات الدورية (كما هو الحال في القسم 2.2)؛ كرر هذه الخطوات حتى يتم تدوير اللوحة تماما.
- استخدم اللوحة على الفور لإعداد التجارب التي تتطلب جراثيم أو احتضان اللوحات عند 30 درجة مئوية لمدة 17 ساعة أو 24 ساعة عند الحاجة إلى الهيجا المبكر أو الميسيليوم على التوالي.
ملاحظة: لمقارنة النشاط المضاد للفطريات الذي يقاس بعد نقل المكونات الميسيليوم ونقل القرص الميسيليوم، استخدم الملاقط العقيمة ووضع أقراص السليلوز المعقمة مقاس 5 ملم بشكل عشوائي على سطح لوحة أغار بعد انتشار البوغ.
3. إعداد المركبات المضادة للفطريات
- إعداد المنتج المشتق من النبات: إعداد مسحوق الثوم
- قشر فصوص الثوم الطازج وقطع القرنفل إلى شرائح 2-3 ملم واسعة باستخدام شفرة مشرط.
- الهواء الجاف شرائح لمدة 2 أيام في 40 درجة مئوية.
- طحن شرائح لمدة 3 × 15 ثانية باستخدام مطحنة سكين للحصول على مسحوق ناعم.
- تخزين مسحوق الثوم في 4 درجة مئوية في أنابيب 50 مل قبل الاستخدام.
ملاحظة: كما الثوم لا autoclaved (لمنع تدهور المركبات المضادة للفطريات الحساسة لدرجة الحرارة) تنظيف طاحونة، مشرط، ومجفف الهواء مع الإيثانول 70٪ قبل الاستخدام.
- إعداد الزيت الأساسي
- إعداد 0.5٪، 1٪، 2.5٪، 5٪ و 20٪ حلول زيت ثيموس فولغاريس الأساسية في 0.5٪ توين-80.
- تخلط جيدا لتشكيل مستحلب قبل إضافته إلى المتوسط المساعد الشخصي الرقمي (انظر القسم 4.2).
- إعداد كاربيندزيم
- وزن كاربيندزيم لإعداد محلول الإيثانول 200 ملغ / لتر (كاربيندزيم غير قابل للذوبان بشكل سيئ في الماء).
- تخزين الحل في درجة حرارة الغرفة قبل إضافته إلى متوسط المساعد الشخصي الرقمي (انظر القسم 4.2).
تنبيه: كاربندازيم يمثل خطرا على الصحة والبيئة. ارتداء قفازات وقناع عند التعامل مع هذا المنتج. تخزينه في مساحة التهوية.
4. اختبار تثبيط الاتصال
- إعداد لوحات أجار تحتوي على مسحوق الثوم
- إعداد وautclave المساعد الشخصي الرقمي المتوسط.
- وزن كمية مسحوق الثوم المطلوب في أنبوب 50 مل باستخدام ملعقة معقمة, للحصول على تركيزات تتراوح عموما من 0.25 ملغم / مل إلى 16 ملغم / مل.
- إضافة 10 مل من المساعد الشخصي الرقمي بعد التحقق من درجة حرارة المتوسطة في داخل المعصم. يجب أن تكون درجة الحرارة منخفضة قدر الإمكان لمنع تدهور الجزيئات الحساسة. من الناحية المثالية، يجب أن تكون درجة الحرارة هذه 45 درجة مئوية.
- تجانس بعناية عن طريق تحويل أنبوب رأسا على عقب لتوزيع بالتساوي مسحوق في المتوسط المساعد الشخصي الرقمي. صب بسرعة 10 مل في طبق بيتري قطرها 5 سم (الشكل 1، لوحة C).
- مع طبق بيتري وضعت في درجة حرارة الغرفة، والانتظار حتى يتماسك أجار.
- إعداد لوحات أجار تحتوي على زيت أساسي أو كاربيندازيم
- إدخال 10 مل من المساعد الشخصي الرقمي في أنبوب 50 مل. تحقق من درجة الحرارة بالنسبة للقسم 4.1.3.
- إضافة 100 ميكرولتر من الحلول المختلفة من زيت ثيموس فولغاريس الأساسية في المساعد الشخصي الرقمي للحصول على حلول 0.005٪، 0.01٪، 0.025٪، 0.05٪ و 0.2٪ حلول (انظر القسم 3.2.1).
- إضافة الحجم المطلوب من كاربينديزيم من محلول 200 ملغم/لتر للحصول على حلول تتراوح بين 0.0625-2 ملغم/لتر (انظر القسم 3.3.1).
- تجانس بعناية عن طريق تحويل أنبوب رأسا على عقب، صب بسرعة 10 مل في طبق بيتري قطرها 5 سم(الشكل 1،لوحة C).
- مع طبق بيتري وضعت في درجة حرارة الغرفة، والانتظار حتى يتماسك أجار.
- اختبار تثبيط الاتصال (الشكل 1)
- مع قطر 5 مم أنبوب الفولاذ المقاوم للصدأ العقيمة، رسم دائرة في وسط أطباق بيتري التي تحتوي على المساعد الشخصي الرقمي أو المساعد الشخصي الرقمي بما في ذلك المركبات المضادة للفطريات. التخلص من اسطوانة أجار باستخدام مسواك معقمة (لوحة C).
- مع قطر 5 مم أنبوب الفولاذ المقاوم للصدأ العقيمة، دوائر مؤامرة عشوائيا في لوحات الفطرية من القسم 2. رسم بين 15-20 دائرة لكل لوحة (لوحة B).
- سحب بعناية أجار اسطوانات تغطيها الجراثيم، hyphae في وقت مبكر، أو الميسيليوم مع مسواك معقمة ووضع المقابس في الفضاء الفارغ من أطباق بيتري التي تحتوي على المساعد الشخصي الرقمي أو المساعد الشخصي الرقمي بما في ذلك المركبات المضادة للفطريات (لوحة C).
- احتضان لوحات تحتوي على الجراثيم لمدة 48 ساعة في 30 درجة مئوية، 31 ساعة للوحات تحتوي على الهيجا في وقت مبكر، و 24 ساعة للوحات مغطاة الميسيليوم (لوحة C).
- قياس قطر النمو الشعاعي وحساب نسبة تثبيط نمو الفطريات على السيطرة باستخدام الصيغة (لوحة D)
٪ تثبيط النمو الفطري = (C - A / C)* 100
حيث C هو قطر النمو الشعاعي في متوسط المساعد الشخصي الرقمي وقطر النمو الشعاعي في المتوسط المساعد الشخصي الرقمي التي تحتوي على المركبات المضادة للفطريات.
ملاحظة: لمقارنة النشاط المضاد للفطريات الذي يقاس بعد نقل المكونات الميسيليوم ونقل القرص الميسيليوم، وذلك باستخدام ملاقط معقمة، نقل قرص قطره 5 ملم تم إيداعه مسبقا على سطح اللوحات الفطرية (ملاحظة القسم 2) في وسط أطباق بيتري التي تحتوي على المساعد الشخصي الرقمي أو المساعد الشخصي الرقمي الذي يحتوي على مركبات مضادة للفطريات والمضي قدما تماما كما لنقل أجار المكونات
5. بخار المرحلة تثبيط المقايسة
- إعداد لوحات أجار تحتوي على مسحوق الثوم
- 1 - المضي قدما كما هو الحال في الفرع 3-1.
- إعداد طبق أجار يحتوي على زيت أساسي أو كاربيندازيم
- 10 - تابع العمل كما هو الحال في الفرع 3-2 و 3-3.
- إعداد لوحات فطرية
- 10 - تابع العمل كما هو الحال في الباب 2.
- بخار المرحلة المضادة للفطريات تثبيط المقايسة (الشكل 1)
- صب 10 مل من المساعد الشخصي الرقمي المتوسط في غطاء من أطباق بيتري قطرها 5 سم تحتوي إما على 10 مل المساعد الشخصي الرقمي المتوسطة أو 10 مل من المساعد الشخصي الرقمي المتوسطة التي تحتوي على مركبات مضادة للفطريات في الجزء السفلي من الأطباق. انتظر حتى يتماسك تماما من أجار في درجة حرارة الغرفة (لوحة C).
- استخدام أنبوب الطرد المركزي 50 مل كأداة معايرة للحصول على دائرة المساعد الشخصي الرقمي في وسط الغطاء; إزالة المساعد الشخصي الرقمي حول الدائرة مع ملعقة معقمة (لوحة C).
- رسم دائرة في وسط المتوسط المساعد الشخصي الرقمي وضعت في الغطاء مع قطر 5 مم أنبوب الفولاذ المقاوم للصدأ العقيمة. تجاهل أغار اسطوانة مع مسواك معقمة (لوحة C).
- شكل المقابس مع قطر 5 ملم أنبوب الفولاذ المقاوم للصدأ العقيمة عشوائيا في لوحات الفطرية كما هو الحال في القسم 4.3.2 (لوحة B).
- باستخدام مسواك معقمة ، قم بنقل المقابس المغطاة بعناية إما بالجراثيم أو الهيجا المبكر أو الميسيليوم من الصفائح الفطرية إلى أغطية لوحات المقايسة (لوحة C).
- حضانة عند 30 درجة مئوية كما هو الحال في القسم 4.3.4 (لوحة C).
- قياس قطر النمو الشعاعي وحساب النسبة المئوية لتثبيط النمو الفطري باستخدام الصيغة في القسم 4.3.5 (لوحة D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتقييم قدرة الطريقة الكمية على التمييز بين طريقة عمل أنواع مختلفة من المركبات المضادة للفطريات ، قارنا فعالية ثلاثة عوامل مضادة للفطريات معروفة. Carbendazim هو مبيد فطري اصطناعي غير متطاير تم استخدامه على نطاق واسع للسيطرة على مجموعة واسعة من الأمراض الفطرية في النباتات39،40. وقد وصفت زيت الغدة الصعترية الأساسية إلى حد كبير لنشاطها المضاد للبكتيريا ومضاد للفطريات ويستخدم كعامل المواد الحافظة للأغذية الطبيعية41. وقد تم اختيار مسحوق الثوم كنموذج من منتج حيوي مشتق من النبات. وقد استخدمت تقليديا كعلاج طبيعي مع الأنشطة المضادة للميكروبات التي تعزى إلى حد كبير إلى وجود مركبات أورجانوسلفور المتطايرة ولكن أيضا إلى وجود الصابونين غير المتطايرة والمركبات الفينولية26، مما يعطي لهذا النموذج تعقيدا ذات الصلة في هذه الدراسة.
تعتمد هذه الطريقة الكمية على نقل مقابس أجار تحتوي على كميات خاضعة للرقابة من الفطريات في مراحل نمو مختلفة من الجراثيم إلى الميسيليوم بينما في الطريقة المسمومة بالغذاء ، يتم نقل الميسيليوم القديم من 5 أيام إلى 7 أيام من أقراص السليلوز13. في المقايسة ، تم استخدام الجراثيم والهيجا المبكر (حضانة 17 ساعة) والميسيليوم (حضانة 24 ساعة) كمواد فطرية. قد لا يكون استخدام نقل القرص ذا صلة حيث تظل كونيديا أو الهيجا المتبقية جزئيا على الأقل على وسيط أجار بعد نقل القرص ، مما يؤدي لاحقا إلى قياس غير دقيق لتثبيط النمو كما هو موضح في الشكل 2. وقد لوحظت أقطار مختلفة من نمو الفطرية الشعاعية بعد نقل مناطق أجار تقع تحت أقراص السليلوز تليها حضانة 24 ساعة(الشكل 2، لوحات A ، B و C) تسليط الضوء على وجود hyphae الفطرية المتبقية على أجار بعد نقل القرص. وقد تم تأكيد القياس الكمي للهيفاي المتبقية من خلال قياس النمو مما يؤدي إلى تقلب قطر يصل إلى 22٪(الشكل 2، لوحة D). تم تقييم التأثير على تثبيط النمو بعد ذلك باستخدام زيت تيسموس فولغاريس الأساسي كمجمع مضاد للفطريات ومقارنتها بالتثبيط الذي تم الحصول عليه بعد نقل المكونات الأجارية(الشكل 2، اللوحة E). كان تثبيط النمو بعد نقل القرص أعلى مما كان عليه بعد نقل المكونات أجار لتركيزات زيت الغدة الصعترية منخفضة، مما أدى إلى الإفراط في تقدير تأثير المثبطة، والتي قد تكون بسبب نقل غير مكتملة من المواد الفطرية ودعم النهج القائم على نقل أجار المكونات.
تريشوديرما spp. SBT10-2018-growth تثبيط الناجمة عن المركبات المضادة للفطريات الثلاثة تم تقييم المقبل باستخدام التلامس وبخار مرحلة تثبيط المقايسات لكل مرحلة فطرية (الشكل 3). انتشرت الجراثيم بعناية على لوحات أجار للحصول على 4800 جراثيم / سم2. تم نقلهم مباشرة إلى لوحات أجار تحتوي على مركبات مضادة للفطريات من خلال استخراج أجار المكونات باستخدام أنبوب الفولاذ المقاوم للصدأ 5 ملم معقمة، مما يسمح للتجربة أن تبدأ من الجراثيم. بالنسبة للمرحلتين التنمويتين الأخريين، تم احتضان لوحات أجار مغطاة بالجراثيم لأول مرة لمدة 17 ساعة أو 24 ساعة عند 30 درجة مئوية قبل نقل المكونات أجار للسماح الإنبات والتنمية المبكرة للهيجا (17 ساعة) وتشكيل الميسيليوم (24 ساعة) (الشكل 3، لوحة A). لقياس مساهمة الجزيئات المتطايرة النشطة في النشاط الكلي المضاد للفطريات ، تم تكييف فحص تثبيط الاتصال وتم وضع الجراثيم ، الهيجا المبكر ، والماسيليوم على مسافة من المركبات المضادة للفطريات التي تصب في متوسط المساعد الشخصي الرقمي بالنسبة لمقايسة تثبيط الاتصال. تم قياس نمو تريتشوديرماشعاعي على مدى 48 ساعة وتم تحديد نسبة التثبيط بالمقارنة مع ظروف التحكم. وقد تم تعريف التركيز المثبط الأدنى (MIC) على أنه أقل تركيز للمركبات المضادة للفطريات التي تمنع النمو المرئي بعد 48 ساعة من الحضانة عند 30 درجة مئوية.
الشكل 3(لوحة B) يظهر حساسية بوغ أعلى لcarendazim مقارنة مع شبكات الهيجا والميوسيليوم في وقت مبكر مع 50٪، 22٪ و 30٪ تثبيط النمو على التوالي في 0.25 ميكروغرام / مل كاربينديزيم عندما Trichoderma والمركبات المضادة للفطريات كانت على اتصال. وفي الوقت المناسب، قدرت قيمة هيئة التصنيع العسكري ب 0.5 ميكروغرام/مل على الإنبات البوغ في حين تم الحصول على زيادة إلى 0.75 ميكروغرام/مل على استطالة الهيجة المبكرة والميسيليوم. وعلى النقيض من ذلك، لم يكن لكاربيندازيم أي تأثير مضاد للفطريات على تريتشوديرما عندما تم وضع الفطريات على مسافة من مبيد الفطريات وفقا لانخفاض تقلب هذه المادة. أظهرت النتائج التي حصلنا عليها باستخدام زيت تيسموس فولغاريس الأساسي (TEO) كمركب مضاد للفطريات(الشكل 3، اللوحة C) حساسية أعلى للبويحة ل TEO مقارنة بالهيجا المبكر والميسيليوم بنسبة 65٪ وحوالي 50٪ تثبيط النمو بنسبة 0.01٪ TEO على التوالي. كانت قيم هيئة التصنيع العسكري التي تم الحصول عليها متشابهة لإنبات البوغ وإطالة الهيجة المبكرة (0.025٪ TEO) وأعلى لنمو الميسيليوم (0.05٪ TEO). كما هو متوقع، قدم زيت ثيموس فولغاريس العطري نشاط مضاد للفطريات متطابقة بغض النظر عن المسافة beTween الفطريات والنفط. تم الحصول على قيم مماثلة لهيئة التصنيع العسكري (0.025٪ TEO) على انبات البوغ وإطالة الهيجة المبكرة لإجراء فحوصات الاتصال ومرحلة البخار ، على الرغم من أنه عند النسبة المئوية الأقل لوحظت حساسية أعلى عندما كانت جراثيم TEO و Trichoderma على اتصال (تثبيط نمو 60٪ في الاتصال مقابل 45٪ تثبيط النمو على مسافة). ومن المدهش أن قيم هيئة التصنيع العسكري التي تم الحصول عليها على الميسيليوم كانت مختلفة في اختبارات تثبيط مرحلة الاتصال والبخار (0.05٪ مقابل 0.1٪) مما يشير إلى أن بعض جزء من الجزيئات المتطايرة ليست نشطة ضد الميسيليوم متطورة. أخيرا، عند استخدام مسحوق الثوم كمركب مضاد للفطريات(الشكل 3، لوحة D) ، لوحظت فعالية أعلى ضد الإنبات البوغ (تثبيط نمو بنسبة 50٪ عند مسحوق الثوم 0.25 ملغم / مل وقيمة MIC من 0.5 ملغم / مل) وإطالة الهيجة المبكرة (0.5 ملغم / مل) 59٪ تثبيط النمو في 0.25 ملغم/ مل وقيمة هيئة التصنيع العسكري من 0.5 ملغم/ مل) من نمو الميسيليوم (29٪ تثبيط النمو في 0.5 ملغم/ مل مسحوق الثوم وقيمة هيئة التصنيع العسكري من 0.75 ملغم / مل). عند مقارنة مقاايسات مرحلة الاتصال والبخار ، أظهرت النتائج انخفاضا كبيرا في النشاط المضاد للفطريات عن بعد بغض النظر عن مرحلة نمو الفطريات. انتقلت قيم هيئة التصنيع العسكري من 0.5 ملغم /مل إلى 1 ملغم/مل لإنبات البوغ، ومن 0.5 ملغم/مل إلى 2 ملغم/مل للاستطالة المبكرة للهيجا، ومن 0.75 ملغم/مل إلى 4 ملغم/مل لنمو الميسيليوم(الشكل 3،لوحة D والشكل 4 للصور التمثيلية). لذلك، تشير هذه النتائج إلى أن مسحوق الثوم يحتوي على خليط من المركبات المتطايرة وغير المتطايرة على حد سواء لها خصائص مضادة للفطريات.
وإجمالا، تبين هذه النتائج أن المساهمة النسبية للعوامل المتطايرة وغير المتطايرة الواردة في المنتجات المشتقة من النباتات يمكن تحديدها في مراحل نمو فطري مختلفة لأن الظروف التجريبية قابلة للمقارنة. ثم يكون هذا النهج مناسبا بشكل خاص للمخاليط المعقدة من المركبات المضادة للفطريات. زيت الغدة الصعترية الأساسي هو مزيج من المركبات المتطايرة ويظهر نشاطا مماثلا عن بعد وفي اتصال لإنبات البوغ وإطالة الهيجة المبكرة ، مما يدعم مقارنة هذه المرحلة من البخار واختناق تثبيط المقايسة وتسليط الضوء على أن الهجرة إلى مرحلة البخار لا تضعف عن طريق التدفق إلى وسيط أجار. وتؤكد النتائج أيضا أن مسحوق الثوم المستخدم كنموذج في هذه الدراسة يحتوي على مكونات نشطة غير متقلبة لها مساهمة كبيرة في النشاط العام المضاد للفطريات والتي تم إهمالها لصالح ثيوسولفينات متقلبة مشتقة من أليوم27،28.
الشكل 1: مخطط Synoptic للبروتوكول الخاص بمراواة ومقاايسات مرحلة البخار يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:عدم الدقة المرتبطة نقل الفطريات من قرص السليلوز. جيم - الدوائر التي لا يمكن أن صورة تمثيلية للنمو الشعاعي للميسيليوم المتبقية بعد نقل المناطق تحت أقراص السليلوز. د- قياس النمو الشعاعي للميسيليوم المتبقي. هاء - ال هاء تأثير زيت تيسموس فولغاريس الأساسي على نمو الميسيليوم المنقول من قرص السليلوز أو المكونات الآجارية (N = 2 ، يعني ± SD) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:مقارنة الأنشطة المضادة للفطريات باستخدام مرحلة البخار ومقايسات تثبيط الاتصال على الجراثيم، الهيجا المبكر، والماسيليوم. أ. صور تمثيلية لجراثيم Trichoderma ، الهيجا المبكر (نمو 17 ساعة) ، والماسيليوم (نمو 24 ساعة). تريتشوديرما النمو تثبيط carbendazim (ب), زيت ثيموس فولغاريس الأساسية (C) ومسحوق الثوم (D). (N = 2، متوسط ± SD) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4:صور تمثيلية للنشاط المضاد للفطريات الثوم على لوحات أجار في الاتصال- (A) أو بخار المرحلة (ب) تثبيط المقايسات يرجىالنقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذاالرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
النهج المعروض هنا يسمح لتقييم الخصائص المضادة للفطريات من المنتجات المشتقة من النباتات المعالجة الحد الأدنى. في هذا البروتوكول ، يتم تحقيق توزيع متجانس للجراثيم على سطح أجار باستخدام حبات زجاجية عيار 2 مم. تتطلب هذه الخطوة مهارات التعامل مع توزيع الخرز بشكل صحيح والحصول على نتائج قابلة للاستنساخ ، مما يسمح في نهاية المطاف بالمقارنة بين الآثار المضادة للفطريات في مراحل مختلفة من نمو الفطريات. وجدنا أن حبات الزجاج 5 ملم أو الدوران المفرط في حين التجانس أثناء الانتشار يمكن أن يسبب قطر النمو المتغير. لذلك، نوصي التدريب على توزيع بوغ الرئيسي قبل التجريب. بالإضافة إلى ذلك ، عندما يجب اختبار مساحيق النبات ، يجب إيلاء الاهتمام للتشتت المتجانس للمنتج في وسط أجار. لمنع المسحوق من الاستقرار في الجزء السفلي من لوحة، يجب أن يكون المنتج مختلطة في المتوسط أجار عندما تصل درجة حرارة المتوسطة الذائبة 45 درجة مئوية (عندما تكون درجة حرارة الغرفة 24 درجة مئوية). يجب تعديل درجة الحرارة هذه وفقا لدرجة حرارة الغرفة المحلية لتجنب الترسيب.
في حين أن الطريقة التي نصفها هنا يمكن أن توفر رؤى قيمة ، يجب النظر في بعض العيوب. تسمح هذه الطريقة بإجراء مقارنات دقيقة جنبا إلى جنب في إعداد تجريبي واحد على حساب قدر كبير من وقت التحضير حيث يمكن أن يكون عدد لوحات أجار التي سيتم إعدادها كبيرا اعتمادا على الأسئلة التي يجب الإجابة عليها. بالإضافة إلى ذلك، هذا المقايسة هي م المقايسة متوسطة الحجم مصممة لأطباق بيتري 5 سم. لذلك ، يمكن أن تكون كمية المواد الفعالة المطلوبة لاختبار جميع الجوانب كبيرة. وهذا يعني أن المواد النادرة قد لا تكون مرشحة مناسبة للاختبار لهذا البروتوكول. يمكن النظر في تقليص المقايسة باستخدام أطباق بيتري الصغيرة وتقليل حجم المقابس. ويمكن اختبار ذلك باستخدام بروتوكول القياس الموصوف هنا مع إيلاء اهتمام خاص لاستخراج المكونات أجار، والتي قد تكون صعبة. ويمكن تخفيض دقة قياسات النمو الشعاعي على هذا النطاق الأصغر.
الطرق الحالية مناسبة لقياس النشاط المضاد للفطريات من المركبات في الحل وأقل قابلية للتطبيق على دراسة مساحيق13. النهج الذي أنشأناه مكيف بشكل جيد لكل من المركبات السائلة والصلبة ، مما يسمح بتقييم الخصائص المضادة للفطريات للمنتجات المشتقة من النباتات المعالجة بالحد الأدنى. وهذا يقلل من الوقت اللازم لاختبار مقتطفات ويقلل من المزالق المتعلقة المواد الفعالة التي تظهر الذوبان الفقراء. كما تحتوي بعض المنتجات المشتقة من النباتات جزيئات نشطة حساسة لارتفاع درجة الحرارة43، وهذا يوفر ميزة الحد من خطر فقدان نشاط هذه المركبات. وقد تم تكييف هذا النهج من طريقة نشر أجار والأغذية المسمومة طريقة15،16،17،18،19 للسماح بالإضافة إلى ذلك المقارنة المباشرة للأنشطة المضادة للفطريات على مراحل النمو الفطرية المختلفة باستخدام إعدادات تجريبية مماثلة. يسمح نقل Agar-plug بالتحكم الدقيق في كميات الكائنات الدقيقة داخل المقايسة. هذه ميزة على نقل القرص ، مما يؤدي إلى الإفراط في تقدير الآثار المضادة للفطريات المرتبطة بنقل غير مكتمل للجراثيم أو الهيجا. وأخيرا، في حين أن المقايسات مرحلة بخار عموما لا تطبق على الاتصال تثبيط المقايسات27،28،29،30،31، الطريقة التي نقترحها يتناول المساهمات النسبية للعوامل المتطايرة وغير المتطايرة الواردة في الخلائط المعقدة مثل مساحيق النباتات أو مقتطفات ويسمح في نهاية المطاف تقييم الأنشطة المضادة للفطريات في مراحل نمو الفطريات المختلفة.
قد يكون النهج الذي نصفه هنا وثيق الصلة بشكل خاص لدعم الحاجة إلى طرق لتقييم الخصائص المضادة للفطريات في المنتجات المشتقة من النباتات للتحكم البيولوجي. الطريقة الكمية التي نقترحها تسمح للمشغلين بتحديد مساهمات كل من المركبات المتطايرة وغير المتطايرة في النشاط المضاد للفطريات لخليط نشط بيولوجيا معقد. وهذا يوفر معلومات قيمة يمكن أن توجه اختيار طرق التطبيق للعلاج وأهمية تنفيذ استخراج السائل. التطبيقات التي يمكن النظر فيها على مسافة من phytopathogen المستهدفة (على سبيل المثال، إدراج المنتج biocontrol في التعبئة والتغليف) أو قد تحتاج إلى اتصال مباشر لتحسين فعالية المنتج biocontrol (التسلط على النباتات أو غمس الفاكهة في حل للمنتج التحكم الحيوي). كما أنه يسمح بالمقارنة بين فعالية مضادة للفطريات في مراحل نمو الفطريات المختلفة من إنبات البوغ إلى مرحلة لاحقة نمو الميسيليوم، مما يؤدي إلى تعريف التوصيات لتحديد عتبات السيطرة المطلوبة لتطبيق منتجات التحكم الحيوي على المحاصيل. والواقع أن تحديد فعالية المواد في مراحل فطرية مختلفة قد يساعد على تصنيف ما إذا كان يمكن استخدام المواد كعلاجات وقائية أو علاجية والتخطيط للجدول الزمني للعلاجات النباتية بمنتجات المكافحة البيولوجية. وهذا أمر ضروري للاستفادة من فعالية المنتجات عند استخدامها في الحقل أو بعد الحصاد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
اي
Acknowledgments
ونحن ممتنون جدا لفرانك ييتس على نصيحته الثمينة. تم دعم هذا العمل من قبل سوب للتكنولوجيا الحيوية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave-vacuclav 24B+ | Melag | ||
| Carbendazim | Sigma | 378674-100G | |
| Distilled water | |||
| Eppendorf tubes | Sarstedt | 72.706 | 1.5 mL |
| Falcons tubes | Sarstedt | 547254 | 50 mL |
| Five millimeters diameter stainless steel tube | retail store | / | |
| Food dehydrator | Sancusto | six trays | |
| Garlic powder | Organic shop | ||
| Glass beads | CLOUP | 65020 |  2 mm |
| Hemocytometer counting cell | Jeulin | 713442 | / |
| Incubator | Memmert | UM400 | 30 °C |
| Knife mill | Bosch | TSM6A013B | |
| Manual cell counter | Labbox | HCNT-001-001 | / |
| Measuring ruler | retail store | ||
| Microbiological safety cabinets | FASTER | FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2 | |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014407 | 100 - 1000 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014411 | 20 - 200 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014412 | 2 - 20 µL |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1194500 | 55 mm |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1473 | 90 mm |
| Pipette Controllers-EASY 60 | Labbox | EASY-P60-001 | / |
| Potato Dextrose Agar | Sigma | 70139-500G | |
| Precision scale-RADWAG | Grosseron | B126698 | AS220.R2-ML 220g/0.1mg |
| Rake | Sarstedt | 86-1569001 | / |
| Reverse microscope AE31E trinocular | Grosseron | M097917 | / |
| Sterile graduated pipette | Sarstedt | 1254001 | 10 mL |
| Thymus essential oil | Drugstore | Essential oil 100% | |
| Tips 1000 µL | Sarstedt | 70.762010 | |
| Tips 20 µL | Sarstedt | 70.760012 | |
| Tips 200 µL | Sarstedt | 70.760002 | |
| Tooth pick | retail store | ||
| Trichoderma spp strain | Strain of LRPIA laboratory | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379-250ML | |
| Tween-80 | Sigma | P1754-1L | |
| Tweezers | Labbox | FORS-001-002 | / |
References
- FAO. Global food losses and food waste - Extent, causes and prevention. FAO. , Rome. (2011).
- da Cruz Cabral, L., Fernández Pinto, V., Patriarca, A. Application of plant compounds to control fungal spoilage and mycotoxin production in foods. International Journal of Food Microbiology. 166 (1), 1-14 (2013).
- Romanazzi, G., Smilanick, J. L., Feliziani, E., Droby, S. Postharvest biology and technology integrated management of postharvest gray mold on fruit crops. Postharvest Biology and Technology. 113, (2016).
- Morton, V., Staub, T.
- Brandhorst, T. T., Klein, B. S. Uncertainty surrounding the mechanism and safety of the post- harvest fungicide Fludioxonil. Food and Chemical Toxicology. 123, 561-565 (2019).
- Bénit, P., et al. Evolutionarily conserved susceptibility of the mitochondrial respiratory chain to SDHI pesticides and its consequence on the impact of SDHIs on human cultured cells. PLoS ONE. 14 (11), 1-20 (2019).
- Usall, J., Torres, R., Teixidó, N. Biological control of postharvest diseases on fruit: a suitable alternative. Current Opinion in Food Science. 11, 51-55 (2016).
- Tripathi, P., Dubey, N. K. Exploitation of natural products as an alternative strategy to control postharvest fungal rotting of fruit and vegetables. Postharvest Biology and Technology. 32 (3), 235-245 (2004).
- Abbey, J. A., et al. Biofungicides as alternative to synthetic fungicide control of grey mould (Botrytis cinerea)-prospects and challenges. Biocontrol Science and Technology. 29 (3), 241-262 (2019).
- Soylu, E. M., Kurt, Ş, Soylu, S. In vitro and in vivo antifungal activities of the essential oils of various plants against tomato grey mould disease agent Botrytis cinerea. International Journal of Food Microbiology. 143 (3), 183-189 (2010).
- Liu, S., Shao, X., Wei, Y., Li, Y., Xu, F., Wang, H. Solidago canadensis L. essential oil vapor effectively inhibits botrytis cinerea growth and preserves postharvest quality of strawberry as a food model system. Frontiers in Microbiology. 7, 0-9 (2016).
- El-Mogy, M. M., Alsanius, B. W. Cassia oil for controlling plant and human pathogens on fresh strawberries. Food Control. 28 (1), 157-162 (2012).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Arikan, S. Current status of antifungal susceptibility testing methods. Medical Mycology. 45 (7), 569-587 (2007).
- Girmay, Z., Gorems, W., Birhanu, G., Zewdie, S. Growth and yield performance of Pleurotus ostreatus (Jacq. Fr.) Kumm (oyster mushroom) on different substrates. AMB Express. 6 (1), 87 (2016).
- Fischer, M. S., Glass, N. L. Communicate and fuse: how filamentous fungi establish and maintain an interconnected mycelial network. Frontiers in Microbiology. 10, 1-20 (2019).
- Mohana, D. C., Raveesha, K. A. Anti-fungal evaluation of some plant extracts against some plant pathogenic field and storage fungi. Journal of Agricultural Technology. 4 (1), 119-137 (2007).
- Balamurugan, S. In vitro activity of aurantifolia plant extracts against phytopathogenic fungi phaseolina. International Letters of Natural Sciences. 13, 70-74 (2014).
- Ameziane, N., et al. Antifungal activity of Moroccan plants against citrus fruit pathogens. Agronomy for sustainable development. 27 (3), 273-277 (2007).
- Rizi, K., Murdan, S., Danquah, C. A., Faull, J., Bhakta, S. Development of a rapid, reliable and quantitative method - "SPOTi" for testing antifungal efficacy. Journal of Microbiological Methods. 117, 36-40 (2015).
- Imhof, A., Balajee, S. A., Marr, K., Marr, K. New methods to assess susceptibilities of Aspergillus isolates to caspofungin. Microbiology. 41 (12), 5683-5688 (2003).
- Goussous, S. J., Abu el-Samen, F. M., Tahhan, R. A. Antifungal activity of several medicinal plants extracts against the early blight pathogen (Alternaria solani). Archives of Phytopathology and Plant Protection. 43 (17), 1745-1757 (2010).
- Ng, T. B. Antifungal proteins and peptides of leguminous and non-leguminous origins. Peptides. 25 (7), 1215-1222 (2004).
- Hu, Z., Zhang, H., Shi, K. Plant peptides in plant defense responses. Plant Signaling and Behavior. 13 (8), (2018).
- Iriti, M., Faoro, F. Chemical diversity and defence metabolism: How plants cope with pathogens and ozone pollution. International Journal of Molecular Sciences. 10 (8), 3371-3399 (2009).
- Lanzotti, V., Bonanomi, G., Scala, F. What makes Allium species effective against pathogenic microbes. Phytochemistry Reviews. 12 (4), 751-772 (2013).
- Kyung, K. H.
- Hyldgaard, M., Mygind, T., Meyer, R. L. Essential oils in food preservation: mode of action, synergies, and interactions with food matrix components. Frontiers in microbiology. 3, 12 (2012).
- Bueno, J. Models of evaluation of antimicrobial activity of essential oils in vapour phase: a promising use in healthcare decontamination. Natural Volatiles & Essential Oils. 2 (2), 16-29 (2015).
- Doi, N. M., Sae-Eaw, A., Suppakul, P., Chompreeda, P. Assessment of synergistic effects on antimicrobial activity in vapour- and liquidphase of cinnamon and oregano essential oils against Staphylococcus aureus. International Food Research Journal. 26 (2), 459-467 (2019).
- Amat, S., Baines, D., Alexander, T. W. A vapour phase assay for evaluating the antimicrobial activities of essential oils against bovine respiratory bacterial pathogens. Letters in Applied Microbiology. 65 (6), 489-495 (2017).
- Feyaerts, A. F., et al. Essential oils and their components are a class of antifungals with potent vapour-phase-mediated anti-Candida activity. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Wang, T. H., Hsia, S. M., Wu, C. H., Ko, S. Y., Chen, M. Y., Shih, Y. H., Shieh, T. M., Chuang, L. C. Evaluation of the antibacterial potential of liquid and vapor phase phenolic essential oil compounds against oral microorganisms. PLoS ONE. 11 (9), 1-17 (2016).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Leadbeater, A. Recent developments and challenges in chemical disease control. Plant Protection Science. 51 (4), 163-169 (2015).
- Jin, C., Zeng, Z., Fu, Z., Jin, Y. Oral imazalil exposure induces gut microbiota dysbiosis and colonic inflammation in mice. Chemosphere. 160, 349-358 (2016).
- Kumar, R., Ghatak, A., Balodi, R., Bhagat, A. P. Decay mechanism of postharvest pathogens and their management using non-chemical and biological approaches. Journal of Postharvest Technology. 6 (1), 1-11 (2018).
- Talibi, I., Boubaker, H., Boudyach, E. H., Ait Ben Aoumar, A. Alternative methods for the control of postharvest citrus diseases. Journal of Applied Microbiology. 117 (1), 1-17 (2014).
- Arya, R., Sharma, R., Malhotra, M., Kumar, V., Sharma, A. K. Biodegradation Aspects of Carbendazim and Sulfosulfuron: Trends, Scope and Relevance. Current Medicinal Chemistry. 22 (9), 1147-1155 (2015).
- European Food Safety Authority. Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance carbendazim. EFSA Journal. 8 (5), 1-76 (2010).
- Sakkas, H., Papadopoulou, C. Antimicrobial activity of basil, oregano, and thyme essential oils. Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (3), 429-438 (2017).
- Steyaert, J. M., Weld, R. J., Mendoza-Mendoza, A., Stewart, A. Reproduction without sex: conidiation in the filamentous fungus Trichoderma. Microbiology. 156, Reading, England. Pt 10 2887-2900 (2010).
- Leontiev, R., Hohaus, N., Jacob, C., Gruhlke, M. C. H., Slusarenko, A. J. A Comparison of the antibacterial and antifungal activities of thiosulfinate analogues of allicin. Scientific Reports. 8 (1), 1-19 (2018).
- Scorzoni, L., et al. The use of standard methodology for determination of antifungal activity of natural products against medical yeasts Candida sp and Cryptococcus sp. Brazilian Journal of Microbiology. 38 (3), 391-397 (2007).
