Summary
Vi beskriver en modifierad agarbaserad metod utformad för att kvantifiera de svampdödande effekterna av växtbaserade produkter. Både flyktiga och icke-flyktiga bidrag till den svampdödande verksamheten kan bedömas genom detta protokoll. Dessutom kan effekt mot svampar mätas i viktiga utvecklingsstadier i en enda experimentell installation.
Abstract
Det beskrivna protokollet bygger på en plug-transfer-teknik som möjliggör noggrann bestämning av mikroorganismkvantiteter och deras utvecklingsstadier. Ett angivet antal sporer sprids på en agarplatta. Denna agarplatta inkuberas under en definierad period för att svamparna ska kunna nå det förväntade utvecklingsstadiet, med undantag för sporer där inkubation inte krävs. Agarpluggar täckta av sporer, hyphae eller mycelium dras sedan tillbaka och överförs till agarmedier som innehåller den svampdödande förening som ska testas antingen placerad på avstånd från svamparna eller i kontakt. Denna metod är tillämplig för att testa både flytande extrakt och fasta prover (pulver). Det är särskilt väl lämpat för kvantifiering av de relativa bidragen från flyktiga och icke-flyktiga medel i bioaktiva blandningar och för att bestämma deras effekter, särskilt på sporer, tidig hyphae och mycelium.
Metoden är mycket relevant för karakteriseringen av biokontrollprodukters svampdödande aktivitet, särskilt växtbaserade produkter. När det gäller växtrening kan resultaten användas för att vägleda valet av användningssätt och för att fastställa tröskelvärdena för utlösande ämnen.
Introduction
Globala förluster av frukt och grönsaker kan nå upp till 50% av produktionen1 och resultera främst från matförfall orsakad av svampförstöring i fält eller under lagringefter skörden 2,3, trots den omfattande sysselsättningen av syntetiska fungicider sedan mitten av 1900-talet4. Användningen av dessa ämnen omprövas eftersom den utgör allvarliga miljö- och hälsorisker. Eftersom de skadliga konsekvenserna av deras användning dyker upp i hela ekosystemen och bevis på potentiella hälsoeffekter har ackumulerats5,6, utvecklas nya alternativ till gamla profylaktiska strategier för behandlingar före och efterskörden 7,8,9. Därför är utmaningen vi står inför dubbel. Nya fungicidstrategier måste för det första bibehålla effektiviteten hos livsmedelsskyddet mot fytopatogener och samtidigt, för det andra, bidra till att dramatiskt minska jordbruksmetoders miljöavtryck. För att uppfylla detta ambitiösa mål föreslås strategier inspirerade av det naturliga försvaret som utvecklats i växter eftersom mer än 1000 växtarter har lyfts fram för sina antimikrobiella egenskaper8. Till exempel är växter som har utvecklat naturliga fungicider för att bekämpa fytopatogener en ny resurs för att utforska utvecklingen av nya biokontrollprodukter2. Eteriska oljor är flaggskeppsmolekyler av denna typ. Till exempel skyddar Origanum eterisk olja tomatplantor mot gråmögel i växthus 10 och Solidago canadensis L. och fatias eteriska oljor har visat sig bevara efterskördade jordgubbar från grå mögelskador11,12. Dessa exempel visar att biokontroll och särskilt växtbaserade produkter utgör en lösning som kombinerar biologisk effektivitet och miljömässig hållbarhet.
Växter är således en viktig resurs för molekyler av potentiellt intresse för växtskyddsindustrin. Endast en handfull vegetabiliska produkter har dock föreslagits användas som biokontrollprodukter trots att de allmänt erkänns som säkra, icke-fytotoxiska och miljövänliga2. Vissa svårigheter i införlivandet från labbet till fältet har observerats, såsom effekt minska när tillämpas in vivo2,9. Således blir det viktigt att förbättra laboratorietesternas förmåga att bättre förutsäga fälteffektiviteten. I detta sammanhang är svampdödande testmetoder för växtbaserade produkter nödvändiga både för att utvärdera deras svampdödande effekt och för att definiera deras optimala användningsvillkor. Specifikt är biokontrollprodukter i allmänhet mindre effektiva än kemiska fungicider, så en bättre förståelse av deras verkningssätt är viktigt för att föreslå lämpliga formuleringar, för att identifiera användningssättet inom fält och för att definiera vilket utvecklingsstadium av patogenen som är sårbart för den sökande bioprodukten.
Nuvarande metoder för antibakteriella och svampdödande aktiviteter inkluderar diffusionsmetoder som agar-diskdiffusion, utspädning, bioautografi och flödescytometri13. De flesta av dessa tekniker, och mer specifikt standardtestning av antifungal känslighet - agar-disk diffusion och utspädningsanalyser - är väl anpassade för att utvärdera den antimikrobiella aktiviteten hos lösliga föreningar på bakteriella och svampsporer i flytande suspensioner14. Dessa metoder är dock i allmänhet inte lämpliga för att testa fasta föreningar såsom torkat växtpulver eller för att kvantifiera svampdödande aktivitet under myceliumtillväxt eftersom de kräver sporutspädning eller sporspridning på agarplattor och/eller utspädning av svampdödande föreningar.13. I den livsmedelsförgiftade metoden vaccineras agarplattor som innehåller det svampdödande medlet med en 5-7 mm diameter skiva som provtas från en 7-dagars gammal svampkultur utan att ta hänsyn till den exakta mängden start av mycelium. Efter inkubation bestäms den svampdödande aktiviteten som en procent av radiell tillväxthämning17,18,19. Med detta tillvägagångssätt kan vi utvärdera den svampdödande aktiviteten på mycelial tillväxt. Däremot utförs agar-utspädningsmetoden för att bestämma den svampdödande aktiviteten på sporer som direkt inokuleras på ytan av agarplattan som innehåller svampdödande föreningar13,20,21. Dessa två metoder ger kompletterande resultat när det gäller svampdödande verksamhet. Dessa är dock två oberoende tekniker som används parallellt och som inte ger korrekt jämförelse sida vid sida av den relativa effekten av svampdödande föreningar på sporer och mycelium17,20,22 eftersom mängden startsvampmaterial skiljer sig åt i de två metoderna. Dessutom är den svampdödande aktiviteten hos en växtbaserad produkt ofta resultatet av kombinationen av svampdödande molekyler syntetiserade av växter för att möta patogener. Dessa molekyler omfattar proteiner, peptider23,24, och metaboliter med bred kemisk mångfald och som tillhör olika klasser av molekyler såsom polyfenoler, terpener, alcaloïds25, glukosinolater8, och organosulfurföreningar26. Vissa av dessa molekyler är flyktiga eller blir flyktiga under patogenattack27. Dessa medel är oftast dåligt vattenlösliga och högtrycksföreningar som måste återvinnas genom vattendestillation som eteriska oljor, av vilka några av vars antimikrobiella verksamhet har varit väl etablerad28. Ångfasmedierade känslighetsanalyser har utvecklats för att mäta den antimikrobiella aktiviteten hos flyktiga föreningar efter avdunstning och migration via ångfasen29. Dessa metoder är baserade på införandet av svampdödande föreningar på avstånd från den mikrobiella kulturen29,30,31,32,33. I den vanliga ångfasen agaranalys deponeras eteriska oljor på en pappersskiva och placeras i mitten av petriskålens lock på avstånd från bakteriell eller svampsporsuspension, som sprids på agarmedium. Diametern på tillväxthämningszonen mäts sedan på samma sätt som för agar-diskdiffusionsmetoden20,24. Andra metoder har utvecklats för att ge kvantitativ mätning av ångfasens antifunktionella känslighet för eteriska oljor, härledda från den buljongutspädningsmetod från vilken en hämmande ångfasmedierad antimikrobiell aktivitet beräknades32, eller härrör från agar-disk diffusionsanalyser31. Dessa metoder är i allmänhet specifika för aktivitetsstudier i ångfas och är inte lämpliga för kontakthämningsanalyser. Detta utesluter bestämning av det relativa bidraget från flyktiga och icke-flyktiga agenser till den svampdödande aktiviteten hos en komplex bioaktiv blandning.
Den kvantitativa metoden vi har utvecklat syftar till att mäta den svampdödande effekten av torkat växtpulver på kontrollerade mängder sporer och odlat mycelium deponerat på ytan av ett agarmedium för att reproducera flygtillväxten av fytopatogener under infektion avväxter 15 samt ett sammankopplat mycelialnät16. Tillvägagångssättet är en modifierad experimentell inställning baserad på agar-utspädning och livsmedelsförgiftade metoder som också möjliggör, i samma experimentella installation, sida vid sida kvantifiering av bidraget från både flyktiga och icke-flyktiga antifungala metaboliter. I denna studie har metoden benchmarkats mot aktiviteten hos tre väl karakteriserade svampdödande preparat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Inokula beredning
- Före experimentet, lägg 5 μL Trichoderma spp. SBT10-2018 sporer lagrade vid 4 °C på potatisdextrosa agar medium (PDA) och inkubera i 4 dagar vid 30 °C med regelbunden ljusexponering för att främja konidiabildning42 (figur 1, panel A).
OBS: Trichoderma spp. SBT10-2018 har isolerats från trä och används som modell i denna studie för sin snabba tillväxt och enkla sporåtervinning. Denna stam bevaras av vårt laboratorium. - Recover conidia (Bild 1, panel A)
- Lägg 3 ml 0,05% interpolering-20 på Trichoderma mycelium.
- Använd en kratta för att frigöra conidia från conidiophores; undvik att trycka ner myceliet för att förhindra att hyphae slits bort.
- Återställ lösningen snabbt med en mikropipett för att undvika att den absorberas av agarmediet och överförs till ett 15 ml-rör.
- Räkna det totala antalet sporer med hjälp av en hemocytometer och förbered en lösning som innehåller 3 x 106 sporer/ml.
OBS: Detta steg måste utföras noggrant för att förhindra att hyphae extraheras. Sporpreparat kontrolleras sedan under mikroskop. Så småningom, för stammar som presenterar mycket antenn och fluffigt mycelium, kan ett steg av filtrering med 40 μM silfilter tillsättas för att eliminera återstående myceliumfragment.
2. Förberedelse av svampplattor(figur 1,panel B)
- Deponering 100 μL 3 x 106 sporer/ml med en mikropipett på en petriskål med 9 cm diameter som innehåller PDA-medium för att erhålla 4 800 sporer/cm2 motsvarande 925 sporer/5 mm diameter-agarplugg.
- Tillsätt 10 g glaspärlor med diametern 2 mm med en steril spatel och utför parallella och bakåtriktade rörelser framåt och bakåt parallellt och vinkelrätt mot operatörens arm för att jämnt fördela sporerna på agarens yta.
- Vrid plattan med 90° och upprepa de roterande rörelserna (som i avsnitt 2.2). upprepa dessa steg tills plattan har roterats helt.
- Använd plattan omedelbart för att sätta upp experiment som kräver sporer eller inkubera plattorna vid 30 °C i 17 timmar respektive 24 timmar när tidig hyphae respektive mycelium behövs.
OBS: För att jämföra svampdödande aktivitet mätt efter myceliumpluggöverföring och myceliumskivaöverföring, använd sterila pincett och placera sterila 5 mm cellulosaskivor slumpmässigt på agarplattans yta efter sporspridning.
3. Beredning av svampdödande föreningar
- Beredning av växtbaserade produkter: beredning av vitlökspulver
- Skala kryddnejlika av färsk vitlök och skär kryddnejlika i 2-3 mm breda skivor med hjälp av ett skalpellblad.
- Lufttorka skivorna i 2 dagar vid 40 °C.
- Slipa skivorna i 3 x 15 sekunder med en knivkvarn för att få ett fint pulver.
- Förvara vitlökspulvret vid 4 °C i 50 ml-rör före användning.
OBS: Eftersom vitlök inte är autoklaverat (för att förhindra nedbrytning av temperaturkänsliga svampdödande föreningar) rengör kvarnen, skalpellen och lufttorken med 70% etanol före användning.
- Beredning av eterisk olja
- Förbered 0,5%, 1%, 2,5%, 5% och 20% Thymus vulgaris eteriska oljelösningar i 0,5% Tween-80.
- Blanda väl för att bilda en emulsion innan du lägger till den i PDA-mediet (se avsnitt 4. 2).
- Karbaendazim beredning
- Väg karbindazim för att förbereda en 200 mg/L etanollösning (karbindazim är dåligt lösligt i vatten).
- Förvara lösningen i rumstemperatur innan du lägger till den i handd-mediet (se avsnitt 4.2).
VARNING: Karbindazim utgör en hälso- och miljörisk. Använd handskar och mask när du hanterar denna produkt. Förvara den i ventilerat utrymme.
4. Test av kontakthämning
- Beredning av agarplattor som innehåller vitlökspulver
- Förbered och autoklavera PDA-medium.
- Väg önskad vitlökspulvermängd i ett 50 ml-rör med en steril spatel för att erhålla koncentrationer som i allmänhet sträcker sig från 0,25 mg/ml till 16 mg/ml.
- Tillsätt 10 ml handdator efter att ha kontrollerat temperaturen på mediet på insidan av handleden. Temperaturen måste vara så låg som möjligt för att förhindra nedbrytning av känsliga molekyler. Helst bör denna temperatur vara 45 °C.
- Homogenisera försiktigt genom att vända röret upp och ner för att jämnt fördela pulvret i handdatorns medium. Häll snabbt 10 ml i en petriskål med 5 cm diameter (Bild 1, panel C).
- Med Petri-skålen placerad i rumstemperatur, vänta tills agaren stelnat.
- Beredning av agarplattor som innehåller eterisk olja eller karbindazim
- Sätt in 10 ml handdator i ett 50 ml-rör. Kontrollera temperaturen enligt avsnitt 4.1.3.
- Tillsätt 100 μL av de olika lösningarna för Thymus vulgaris eteriska olja i handdator för att erhålla 0,005%, 0,01%, 0,025%, 0,05% och 0,2% lösningar (se avsnitt 3. 2.1).
- Tillsätt den erforderliga volymen karbaendazim från 200 mg/L-lösningen för att få lösningar från 0,0625-2 mg/L (se avsnitt 3.3.1).
- Homogenisera försiktigt genom att vända röret upp och ner, häll snabbt 10 ml i en petriskål med 5 cm diameter(bild 1,panel C).
- Med Petri-skålen placerad i rumstemperatur, vänta tills agaren stelnat.
- Test av kontakthämning(figur 1)
- Med ett sterilt rör i diameter 5 mm, rita en cirkel i mitten av Petri-rätter som innehåller antingen PDA eller handdator inklusive svampdödande föreningar. Kassera agarcylindern med en steril tandpetare (panel C).
- Med ett sterilt rör i diameter 5 mm cirklar plot cirklar slumpmässigt in i svampplattorna från avsnitt 2. Rita mellan 15-20 cirklar per platta (panel B).
- Dra försiktigt tillbaka agarcylindrarna täckta av sporer, tidig hyphae eller mycelium med en steril tandpetare och placera pluggarna i det tomma utrymmet för petriskålar som innehåller antingen PDA eller PDA inklusive svampdödande föreningar (panel C).
- Inkubera plattorna som innehåller sporer i 48 timmar vid 30 °C, 31 timmar för plattorna som innehåller tidig hyphae och 24 timmar för de plattor som är täckta med mycelium (panel C).
- Mät diametern på radiell tillväxt och beräkna procenten av svamptillväxthämning över kontroll med hjälp av formeln (panel D)
% svamptillväxthämning = (C - A/C)* 100
där C är diametern på den radiella tillväxten i PDA-medium och A diametern på den radiella tillväxten i PDA-medium som innehåller de svampdödande föreningarna.
OBS: För att jämföra svampdödande aktivitet som uppmätts efter myceliumpluggöverföring och myceliumdisköverföring, med sterila pincett, överför en disk med 5 mm diameter som tidigare deponerats på ytan av svampplattorna (avsnitt 2-lapp) i mitten av Petri-diskar som innehåller antingen handdator eller handdator som innehåller svampdödande föreningar och fortsätt exakt som för agar-pluggöverföring
5. Test av ångfashämning
- Beredning av agarplattor som innehåller vitlökspulver
- Fortsätt som i avsnitt 3.1.
- Beredning av agarplatta som innehåller eterisk olja eller karbindazim
- Fortsätt som i avsnitt 3.2 och 3.3.
- Förberedelse av svampplattor
- Fortsätt som i avsnitt 2.
- Antifungalhämningsanalys för ångfas(figur 1)
- Häll 10 ml PDA-medium i locket på petriskålarna med diametern 5 cm som innehåller antingen 10 ml PDA-medium eller 10 ml PDA-medium som innehåller svampdödande föreningar i botten av disken. Vänta tills agarn stelnat helt i rumstemperatur (panel C).
- Använd ett 50 ml centrifugalrör som kalibreringsverktyg för att få en cirkel med handdator i mitten av locket; ta bort handdatorn runt cirkeln med en steril spatel (panel C).
- Rita en cirkel i mitten av handdatorns medium placerad i locket med ett sterilt rör av rostfritt stål med diametern 5 mm. Kassera agarcylindern med en steril tandpetare (panel C).
- Forma pluggar med ett sterilt rör av 5 mm diameter slumpmässigt i svampplattorna enligt avsnitt 4.3.2 (panel B).
- Använd en steril tandpetare och överför försiktigt pluggarna täckta antingen med sporer, tidig hyphae eller mycelium från svampplattor till locken på analysplattor (panel C).
- Inkubera vid 30 °C enligt avsnitt 4.3.4 (panel C).
- Mät diametern på radiell tillväxt och beräkna procenten av svamptillväxthämningen med hjälp av formeln i avsnitt 4.3.5 (panel D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att utvärdera den kvantitativa metodens förmåga att diskriminera verkningssättet hos olika typer av svampdödande föreningar jämförde vi effekten av tre välkända svampdödande medel. Kardendazim är en icke-flyktig syntetisk fungicid som har använts i stor utsträckning för att kontrollera ett brett spektrum av svampsjukdomar iväxter 39,40. Thymus vulgaris eteriska olja har till stor del beskrivits för sin antibakteriella och svampdödande aktivitet och används som naturligt livsmedelsskyddsmedel41. Vitlökspulver har valts som modell av en växtbaserad bioprodukt. Det har traditionellt använts som ett naturligt botemedel med antimikrobiella aktiviteter som till stor del har tillskrivits förekomsten av flyktiga organosulfurföreningar men också till närvaron av icke-flyktiga saponiner och fenolföreningar26, vilket ger denna modell en komplexitet som är relevant i denna studie.
Denna kvantitativa metod förlitar sig på överföring av agarpluggar som innehåller kontrollerade mängder svamp i olika utvecklingsstadier från sporer till mycelium medan 5-dagars till 7-dagars gammalt mycelium överförs från cellulosaskivor13i den livsmedelsförgiftade metoden. I analysen användes sporer, tidig hyphae (17 h inkubation) och mycelium (24 h inkubation) som startsvampmaterial. Användningen av disköverföring kanske inte är relevant eftersom konidia eller resthyphae åtminstone delvis förblir på agarmediet efter disköverföring, vilket senare leder till felaktig mätning av tillväxthämning enligt figur 2. Olika diametrar av svampradiell tillväxt har observerats efter överföring av agarområden som ligger under cellulosaskivor följt av 24 h inkubation(figur 2, panelernaA, B och C) som belyser förekomsten av kvarvarande svamphyphae på agar efter disköverföring. Kvantifieringen av resthyphae har bekräftats genom mätning av tillväxt som leder till upp till 22% diametervariation(figur 2,panel D). Effekten på tillväxthämning utvärderades därefter med Thymus vulgaris eteriska olja som svampdödande förening och jämfördes med den hämning som erhållits efter överföring av agar-plugg(figur 2,panel E). Tillväxthämningen efter disköverföring var högre än efter överföring av agar-plugg för låga Thymus-oljekoncentrationer, vilket ledde till en överskattning av den hämmande effekten, vilket kan bero på ofullständig överföring av svampmaterial och stödja tillvägagångssättet baserat på agar-plug-överföring.
Trichoderma spp. SBT10-2018-tillväxthämning utlöst av de tre svampdödande föreningarna utvärderades därefter med hjälp av kontakt- och ångfashämningsanalyser för varje svampsteg (figur 3). Sporer spreds noggrant på agarplattor för att få 4 800 sporer / cm2. De överfördes direkt till agarplattor som innehåller svampdödande föreningar genom agar-pluggextraktion med hjälp av ett 5 mm sterilt rostfritt stålrör, vilket gör att experimentet kan börja från sporerna. För de två andra utvecklingsstadierna inkuberades agarplattor täckta med sporer för det första i 17 timmar eller 24 timmar vid 30 °C innan agarpluggen överförs för att möjliggöra spiring och tidig utveckling av hyphae (17 h) och myceliumbildning (24 timmar) (figur 3, panel A). För att kvantifiera bidraget från aktiva flyktiga molekyler till den totala svampdödande aktiviteten har kontakthämningsanalysen anpassats och sporer, tidig hyphae och mycelium placerats på avstånd från de svampdödande föreningarna som hällts i PDA-medium som för kontakthämningsanalysen. Trichoderma-radielltillväxt mättes över 48 timmar och andelen hämning har fastställts i jämförelse med kontrollförhållanden. Den minsta hämmande koncentrationen (MIC) har definierats som den lägsta koncentrationen av svampdödande föreningar som förhindrar synlig tillväxt efter 48 h inkubation vid 30 °C.
Figur 3(panel B) visar högre sporkänslighet mot karbendazim jämfört med tidiga hyphae- och myceliumnätverk med 50%, 22% respektive 30% tillväxthämning vid 0, 25 μg/mL karbendazim när Trichoderma och svampdödande föreningar var i kontakt. Samtidigt har ett MIC-värde på 0,5 μg/ml uppskattats på sporspirering medan en ökning till 0,75 μg/ml har erhållits vid tidig hyphae förlängning och mycelium. Carbendazim hade däremot ingen svampdödande effekt på Trichoderma när svampen placerades på avstånd från fungiciden i enlighet med den låga volatiliteten hos detta ämne. De resultat vi erhållit med Thymus vulgaris eterisk olja (TEO) som svampdödande förening(figur 3,panel C) har visat en högre sporkänslighet för TEO i jämförelse med tidig hyphae och mycelium med 65% respektive cirka 50% tillväxthämning vid 0, 01% TEO. De erhållna MIC-värdena var likartade för sporspiration och tidig hyphae förlängning (0,025% TEO) och högre för mycelium tillväxt (0,05% TEO). Som förväntat presenterade Thymus vulgaris eterisk olja identisk svampdödande aktivitet oavsett avståndet mellan svampen och oljan. Liknande MIC-värden (0, 025% TEO) erhölls på sporspirering och tidig hyphae förlängning för kontakt och vapor-phase analyser, men vid den lägre procentsatsen har en högre känslighet observerats när TEO och Trichoderma sporer var i kontakt (60% tillväxthämning vid kontakt jämfört med 45% tillväxthämning på avstånd). Överraskande nog var MIC-värdena som erhållits på myceliet olika i kontakt- och ångfashämningsanalyserna (0, 05% jämfört med 0, 1%) tyder på att en del av de flyktiga molekylerna inte är aktiva mot ett välutvecklat mycelium. Slutligen, Vid användning av vitlökspulver som svampdödande förening(figur 3,panel D) observerades en högre effekt mot sporgrodd (50% tillväxthämning vid 0, 25 mg/ml vitlökspulver och MIC-värde på 0, 5 mg/mL) och tidig hyphae förlängning (59% tillväxthämning vid 0, 25 mg/ml och MIC-värde på 0,5 mg/ml) än för myceliumtillväxt (29% tillväxthämning vid 0, 5 mg/ml vitlökspulver och MIC-värde på 0, 75 mg/ml). När kontakt- och ångfasanalyser jämfördes har resultaten visat en signifikant minskning av svampdödande aktivitet på avstånd oavsett svampens utvecklingsstadium. MIC-värdena flyttades från 0, 5 mg/ml till 1 mg/ml för sporspiration, från 0,5 mg/ml till 2 mg/ml för tidig hyphaeförlängning och från 0,75 mg/ml till 4 mg/ml för myceliumtillväxt(figur 3,panel D och figur 4 för representativa bilder). Så dessa resultat tyder på att vitlökspulver innehåller en blandning av både flyktiga och icke-flyktiga föreningar med svampdödande egenskaper.
Sammantaget visar dessa resultat att det relativa bidraget från flyktiga och icke-flyktiga ämnen i växtbaserade produkter kan fastställas i olika svamptillväxtstadier eftersom försöksbetingarna är jämförbara. Detta tillvägagångssätt är då särskilt väl lämpat för komplexa blandningar av svampdödande föreningar. Thymus vulgaris eteriska olja är en blandning av flyktiga föreningar och visar en liknande aktivitet på avstånd och i kontakt för sporspiral och tidig hyphae förlängning, vilket stöder jämförelsen av denna ångfas och kontakthämningsanalys och belyser att migrationen till ångfasen inte försämras genom att hälla i agarmediet. Resultaten understryker också att vitlökspulver som används som modell i denna studie innehåller icke-flyktiga aktiva komponenter som har ett betydande bidrag i den totala svampdödande aktiviteten och som har försummats till förmån för flyktiga tiosulfinat som härrör från allium27,28.
Bild 1:Synoptiskt schema för protokollet för kontakt- och ångfasanalyser Klicka här för att se en större version av den här siffran.
Figur 2:Felaktigheter i samband medöverföring av svamp från cellulosaskiva. A. System som representerar skivöverföring på agarplattor täckta av sporer och skivöverföring på ytan på agarplattor som innehåller svampdödande föreningar B. System som representerar agaröverföring av områden under cellulosaskivor följt av inkubation och resttillväxtmätning. C. Representativ bild av radiell tillväxt av resterande mycelium efter överföring av områden under cellulosa skivor. D. Jag är inte så bra på Radiell tillväxtmätning av restmycelium. E. Effekten av Thymus vulgaris eterisk olja på tillväxten av mycelium överförs från cellulosa disk eller agar-plug (N=2, mean ± SD) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Jämförelse av svampdödande aktiviteter med hjälp av ångfasen och kontakthämningsanalyser på sporer, tidig hyphae och mycelium. A. Representativa bilder av Trichoderma sporer, tidig hyphae (17 h tillväxt) och mycelium (24 h tillväxt). Trichoderma tillväxthämning av karbindazim (B), Thymus vulgaris eteriskolja (C) och vitlök pulver (D). (N=2, medelvärde ± SD) Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 4: Representativa bilder av vitlöksantifungalaktivitet på agarplattor i kontakt- (A) eller ångfas (B) hämningsanalyser Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det tillvägagångssätt som presenteras här möjliggör utvärdering av svampdödande egenskaper hos minimalt bearbetade växtbaserade produkter. I detta protokoll uppnås homogen fördelning av sporer på agarytan med hjälp av 2 mm glaspärlor. Detta steg kräver hanteringsförmåga för att korrekt fördela pärlorna och få reproducerbara resultat, vilket i slutändan gör det möjligt att jämföra svampdödande effekter i olika stadier av svamptillväxt. Vi fann att 5 mm glaspärlor eller överdriven rotation under homogenisering under spridning kan orsaka variabel tillväxtdiameter. Därför rekommenderar vi utbildning för att behärska spordistribution före experiment. När växtpulver måste testas skall dessutom homogen spridning av produkten i agarmediet uppmärksammas. För att förhindra att pulvret lägger sig längst ner på plattan måste produkten blandas i agarmedium när temperaturen på det smälta mediet når 45 °C (när rumstemperaturen är 24 °C). Denna temperatur måste justeras enligt den lokala rumstemperaturen för att undvika sedimentering.
Även om metoden vi beskriver här kan ge värdefulla insikter, måste några nackdelar övervägas. Denna metod möjliggör exakta och sida vid sida jämförelser i en enda experimentell inställning på bekostnad av en betydande mängd förberedelsetid eftersom antalet agarplattor som ska förberedas kan vara betydande beroende på de frågor som måste besvaras. Dessutom är denna analys en medelstor analys utformad för 5 cm Petri-rätter. Därför kan mängden aktiva substanser som krävs för att testa alla aspekter vara betydande. Det innebär att sällsynta ämnen kanske inte är lämpliga testkandidater för detta protokoll. En nedskalning av analysen kan övervägas med mindre petriskålar och minska storleken på pluggarna. Detta kan testas med hjälp av benchmarkingprotokollet som beskrivs här med särskild uppmärksamhet på agar-plug-extraktionen, vilket kan vara svårt. Noggrannheten i radiella tillväxtmätningar kan minskas i den mindre skalan.
Nuvarande metoder är lämpliga för att mäta svampdödande aktivitet hos föreningar i lösning och mindre tillämpliga för att studera pulver13. Det tillvägagångssätt vi har etablerat är väl anpassat för både flytande och fasta föreningar, vilket möjliggör utvärdering av de svampdödande egenskaperna hos minimalt bearbetade växtbaserade produkter. Detta minskar den tid som krävs för att testa extrakt och minskar fallgropar relaterade till aktiva substanser som uppvisar dålig löslighet. Eftersom vissa växtbaserade produkter innehåller aktiva molekyler som är känsliga förhög temperatur 43, erbjuder detta fördelen att begränsa risken för förlust av aktivitet av sådana föreningar. Detta tillvägagångssätt har anpassats från agar-diffusionsmetoden och livsmedelsförgiftad metod15,16,17,18,19 för att dessutom tillåta direkt jämförelse av svampdödande aktiviteter på olika svamptillväxtstadier med liknande experimentella inställningar. Agar-pluggöverföring möjliggör noggrann kontroll av mängden mikroorganismer inom analysen. Detta är en fördel jämfört med disköverföring, vilket leder till överskattning av svampdödande effekter i samband med ofullständig överföring av sporer eller hyphae. Slutligen, medan ångfasanalyser i allmänhet inte tillämpas på kontakthämningsanalyser27,28,29,30, 31, behandlar den metod vi föreslår de relativa bidragen från flyktiga och icke-flyktiga medel som ingår i komplexa blandningar som växtpulver ellerextraktoch möjliggör i slutändan utvärdering av svampdödande aktiviteter i olika svamptillväxtstadier.
Det tillvägagångssätt vi beskriver här kan vara särskilt relevant för att stödja behovet av metoder som utvärderar svampdödande egenskaper i växtbaserade produkter för biokontroll. Den kvantitativa metoden som vi föreslår gör det möjligt för operatörer att bestämma respektive bidrag från flyktiga och icke-flyktiga föreningar till den svampdödande aktiviteten hos en komplex bioaktiv blandning. Detta ger värdefull information som kan vägleda valet av användningssätt för behandlingen och relevansen av att utföra vätskeutvinning. Tillämpningar som kan övervägas på avstånd från den riktade fytopatogenen (t.ex. införande av biokontrollprodukten i en förpackning) eller som kan behöva direktkontakt för att optimera biokontrollproduktens effektivitet (nebulisering på växter eller doppning av frukt i en lösning av biokontrollprodukten). Det gör det också möjligt att jämföra svampdödande effekt i olika svamptillväxtstadier från sporspiration till senare myceliumtillväxt, vilket leder till definitionen av rekommendationer för att fastställa kontrolltrösklar som krävs för att applicera biokontrollprodukter på grödor. Att definiera effekten av ämnena i olika svampstadier kan faktiskt bidra till att kategorisera om ämnen kan användas som förebyggande eller botande behandlingar och att planera schemat för växtbehandlingar med biokontrollprodukter. Detta är viktigt för att utnyttja produkternas effektivitet när de används i fält eller efter skörden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ingen
Acknowledgments
Vi är mycket tacksamma mot Frank Yates för hans värdefulla råd. Detta arbete stöddes av Sup'Biotech.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave-vacuclav 24B+ | Melag | ||
| Carbendazim | Sigma | 378674-100G | |
| Distilled water | |||
| Eppendorf tubes | Sarstedt | 72.706 | 1.5 mL |
| Falcons tubes | Sarstedt | 547254 | 50 mL |
| Five millimeters diameter stainless steel tube | retail store | / | |
| Food dehydrator | Sancusto | six trays | |
| Garlic powder | Organic shop | ||
| Glass beads | CLOUP | 65020 |  2 mm |
| Hemocytometer counting cell | Jeulin | 713442 | / |
| Incubator | Memmert | UM400 | 30 °C |
| Knife mill | Bosch | TSM6A013B | |
| Manual cell counter | Labbox | HCNT-001-001 | / |
| Measuring ruler | retail store | ||
| Microbiological safety cabinets | FASTER | FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2 | |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014407 | 100 - 1000 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014411 | 20 - 200 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014412 | 2 - 20 µL |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1194500 | 55 mm |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1473 | 90 mm |
| Pipette Controllers-EASY 60 | Labbox | EASY-P60-001 | / |
| Potato Dextrose Agar | Sigma | 70139-500G | |
| Precision scale-RADWAG | Grosseron | B126698 | AS220.R2-ML 220g/0.1mg |
| Rake | Sarstedt | 86-1569001 | / |
| Reverse microscope AE31E trinocular | Grosseron | M097917 | / |
| Sterile graduated pipette | Sarstedt | 1254001 | 10 mL |
| Thymus essential oil | Drugstore | Essential oil 100% | |
| Tips 1000 µL | Sarstedt | 70.762010 | |
| Tips 20 µL | Sarstedt | 70.760012 | |
| Tips 200 µL | Sarstedt | 70.760002 | |
| Tooth pick | retail store | ||
| Trichoderma spp strain | Strain of LRPIA laboratory | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379-250ML | |
| Tween-80 | Sigma | P1754-1L | |
| Tweezers | Labbox | FORS-001-002 | / |
References
- FAO. Global food losses and food waste - Extent, causes and prevention. FAO. , Rome. (2011).
- da Cruz Cabral, L., Fernández Pinto, V., Patriarca, A. Application of plant compounds to control fungal spoilage and mycotoxin production in foods. International Journal of Food Microbiology. 166 (1), 1-14 (2013).
- Romanazzi, G., Smilanick, J. L., Feliziani, E., Droby, S. Postharvest biology and technology integrated management of postharvest gray mold on fruit crops. Postharvest Biology and Technology. 113, (2016).
- Morton, V., Staub, T.
- Brandhorst, T. T., Klein, B. S. Uncertainty surrounding the mechanism and safety of the post- harvest fungicide Fludioxonil. Food and Chemical Toxicology. 123, 561-565 (2019).
- Bénit, P., et al. Evolutionarily conserved susceptibility of the mitochondrial respiratory chain to SDHI pesticides and its consequence on the impact of SDHIs on human cultured cells. PLoS ONE. 14 (11), 1-20 (2019).
- Usall, J., Torres, R., Teixidó, N. Biological control of postharvest diseases on fruit: a suitable alternative. Current Opinion in Food Science. 11, 51-55 (2016).
- Tripathi, P., Dubey, N. K. Exploitation of natural products as an alternative strategy to control postharvest fungal rotting of fruit and vegetables. Postharvest Biology and Technology. 32 (3), 235-245 (2004).
- Abbey, J. A., et al. Biofungicides as alternative to synthetic fungicide control of grey mould (Botrytis cinerea)-prospects and challenges. Biocontrol Science and Technology. 29 (3), 241-262 (2019).
- Soylu, E. M., Kurt, Ş, Soylu, S. In vitro and in vivo antifungal activities of the essential oils of various plants against tomato grey mould disease agent Botrytis cinerea. International Journal of Food Microbiology. 143 (3), 183-189 (2010).
- Liu, S., Shao, X., Wei, Y., Li, Y., Xu, F., Wang, H. Solidago canadensis L. essential oil vapor effectively inhibits botrytis cinerea growth and preserves postharvest quality of strawberry as a food model system. Frontiers in Microbiology. 7, 0-9 (2016).
- El-Mogy, M. M., Alsanius, B. W. Cassia oil for controlling plant and human pathogens on fresh strawberries. Food Control. 28 (1), 157-162 (2012).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Arikan, S. Current status of antifungal susceptibility testing methods. Medical Mycology. 45 (7), 569-587 (2007).
- Girmay, Z., Gorems, W., Birhanu, G., Zewdie, S. Growth and yield performance of Pleurotus ostreatus (Jacq. Fr.) Kumm (oyster mushroom) on different substrates. AMB Express. 6 (1), 87 (2016).
- Fischer, M. S., Glass, N. L. Communicate and fuse: how filamentous fungi establish and maintain an interconnected mycelial network. Frontiers in Microbiology. 10, 1-20 (2019).
- Mohana, D. C., Raveesha, K. A. Anti-fungal evaluation of some plant extracts against some plant pathogenic field and storage fungi. Journal of Agricultural Technology. 4 (1), 119-137 (2007).
- Balamurugan, S. In vitro activity of aurantifolia plant extracts against phytopathogenic fungi phaseolina. International Letters of Natural Sciences. 13, 70-74 (2014).
- Ameziane, N., et al. Antifungal activity of Moroccan plants against citrus fruit pathogens. Agronomy for sustainable development. 27 (3), 273-277 (2007).
- Rizi, K., Murdan, S., Danquah, C. A., Faull, J., Bhakta, S. Development of a rapid, reliable and quantitative method - "SPOTi" for testing antifungal efficacy. Journal of Microbiological Methods. 117, 36-40 (2015).
- Imhof, A., Balajee, S. A., Marr, K., Marr, K. New methods to assess susceptibilities of Aspergillus isolates to caspofungin. Microbiology. 41 (12), 5683-5688 (2003).
- Goussous, S. J., Abu el-Samen, F. M., Tahhan, R. A. Antifungal activity of several medicinal plants extracts against the early blight pathogen (Alternaria solani). Archives of Phytopathology and Plant Protection. 43 (17), 1745-1757 (2010).
- Ng, T. B. Antifungal proteins and peptides of leguminous and non-leguminous origins. Peptides. 25 (7), 1215-1222 (2004).
- Hu, Z., Zhang, H., Shi, K. Plant peptides in plant defense responses. Plant Signaling and Behavior. 13 (8), (2018).
- Iriti, M., Faoro, F. Chemical diversity and defence metabolism: How plants cope with pathogens and ozone pollution. International Journal of Molecular Sciences. 10 (8), 3371-3399 (2009).
- Lanzotti, V., Bonanomi, G., Scala, F. What makes Allium species effective against pathogenic microbes. Phytochemistry Reviews. 12 (4), 751-772 (2013).
- Kyung, K. H.
- Hyldgaard, M., Mygind, T., Meyer, R. L. Essential oils in food preservation: mode of action, synergies, and interactions with food matrix components. Frontiers in microbiology. 3, 12 (2012).
- Bueno, J. Models of evaluation of antimicrobial activity of essential oils in vapour phase: a promising use in healthcare decontamination. Natural Volatiles & Essential Oils. 2 (2), 16-29 (2015).
- Doi, N. M., Sae-Eaw, A., Suppakul, P., Chompreeda, P. Assessment of synergistic effects on antimicrobial activity in vapour- and liquidphase of cinnamon and oregano essential oils against Staphylococcus aureus. International Food Research Journal. 26 (2), 459-467 (2019).
- Amat, S., Baines, D., Alexander, T. W. A vapour phase assay for evaluating the antimicrobial activities of essential oils against bovine respiratory bacterial pathogens. Letters in Applied Microbiology. 65 (6), 489-495 (2017).
- Feyaerts, A. F., et al. Essential oils and their components are a class of antifungals with potent vapour-phase-mediated anti-Candida activity. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Wang, T. H., Hsia, S. M., Wu, C. H., Ko, S. Y., Chen, M. Y., Shih, Y. H., Shieh, T. M., Chuang, L. C. Evaluation of the antibacterial potential of liquid and vapor phase phenolic essential oil compounds against oral microorganisms. PLoS ONE. 11 (9), 1-17 (2016).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Leadbeater, A. Recent developments and challenges in chemical disease control. Plant Protection Science. 51 (4), 163-169 (2015).
- Jin, C., Zeng, Z., Fu, Z., Jin, Y. Oral imazalil exposure induces gut microbiota dysbiosis and colonic inflammation in mice. Chemosphere. 160, 349-358 (2016).
- Kumar, R., Ghatak, A., Balodi, R., Bhagat, A. P. Decay mechanism of postharvest pathogens and their management using non-chemical and biological approaches. Journal of Postharvest Technology. 6 (1), 1-11 (2018).
- Talibi, I., Boubaker, H., Boudyach, E. H., Ait Ben Aoumar, A. Alternative methods for the control of postharvest citrus diseases. Journal of Applied Microbiology. 117 (1), 1-17 (2014).
- Arya, R., Sharma, R., Malhotra, M., Kumar, V., Sharma, A. K. Biodegradation Aspects of Carbendazim and Sulfosulfuron: Trends, Scope and Relevance. Current Medicinal Chemistry. 22 (9), 1147-1155 (2015).
- European Food Safety Authority. Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance carbendazim. EFSA Journal. 8 (5), 1-76 (2010).
- Sakkas, H., Papadopoulou, C. Antimicrobial activity of basil, oregano, and thyme essential oils. Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (3), 429-438 (2017).
- Steyaert, J. M., Weld, R. J., Mendoza-Mendoza, A., Stewart, A. Reproduction without sex: conidiation in the filamentous fungus Trichoderma. Microbiology. 156, Reading, England. Pt 10 2887-2900 (2010).
- Leontiev, R., Hohaus, N., Jacob, C., Gruhlke, M. C. H., Slusarenko, A. J. A Comparison of the antibacterial and antifungal activities of thiosulfinate analogues of allicin. Scientific Reports. 8 (1), 1-19 (2018).
- Scorzoni, L., et al. The use of standard methodology for determination of antifungal activity of natural products against medical yeasts Candida sp and Cryptococcus sp. Brazilian Journal of Microbiology. 38 (3), 391-397 (2007).
