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जैव नियंत्रण उत्पादों की अस्थिर और गैर-अस्थिर एंटीफंगल गतिविधि को मापना

Published: December 5, 2020 doi: 10.3791/61798
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Food Engineering Laboratory, Sup’Biotech

Summary

हम पौधे से व्युत्पन्न उत्पादों के एंटीफंगल प्रभावों की मात्रा निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन की गई एक संशोधित आगर-आधारित विधि का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल के माध्यम से एंटीफंगल गतिविधि में अस्थिर और गैर-अस्थिर योगदान दोनों का आकलन किया जा सकता है। इसके अलावा, कवक के खिलाफ प्रभावकारिता एक ही प्रयोगात्मक सेटअप में प्रमुख विकासात्मक चरणों में मापा जा सकता है।

Abstract

वर्णित प्रोटोकॉल एक प्लग-ट्रांसफर तकनीक पर आधारित है जो सूक्ष्मजीव मात्रा और उनके विकास के चरणों के सटीक निर्धारण की अनुमति देता है। एक आगार प्लेट पर एक निर्दिष्ट संख्या में बीजाणु फैले होते हैं। इस आगर प्लेट को एक निर्धारित अवधि के लिए इनक्यूबेटेड किया जाता है ताकि कवक को अपेक्षित विकासात्मक चरण तक पहुंचने की अनुमति दी जा सके, सिवाय बीजाणुओं को छोड़कर जहां इनक्यूबेशन की आवश्यकता नहीं है। बीजाणुओं, हाइफे, या माइसेलियम द्वारा कवर किए गए एगर प्लग को अगले वापस ले लिया जाता है और एंटीफंगल यौगिक वाले एगर मीडिया पर स्थानांतरित किया जाता है जिसका परीक्षण या तो कवक से दूरी पर या संपर्क में रखा जाता है। यह विधि तरल अर्क और ठोस नमूनों (पाउडर) दोनों का परीक्षण करने के लिए लागू होती है। यह विशेष रूप से जैव सक्रिय मिश्रण में अस्थिर और गैर-अस्थिर एजेंटों के सापेक्ष योगदान को निर्धारित करने और उनके प्रभावों का निर्धारण करने के लिए, विशेष रूप से बीजाणुओं, प्रारंभिक हाइफा और माइसेलियम पर अच्छी तरह से अनुकूल है।

यह विधि जैव नियंत्रण उत्पादों, विशेष रूप से पौधे से व्युत्पन्न उत्पादों की एंटीफंगल गतिविधि के लक्षण वर्णन के लिए अत्यधिक प्रासंगिक है। दरअसल, संयंत्र के उपचार के लिए, परिणाम आवेदन के मोड की पसंद का मार्गदर्शन करने के लिए और ट्रिगर थ्रेसहोल्ड स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

फलों और सब्जियों का वैश्विक नुकसान उत्पादन के 50% तक पहुंच सकताहै1 और परिणामस्वरूप अधिकांशतर क्षेत्र में कवक खराब होने के कारण या फसल के बाद भंडारण2,3 के दौरान खाद्यक्षयहो सकता है, बीसवीं शताब्दी के मध्य से सिंथेटिक कवकनाशकों के व्यापक रोजगार के बावजूद । इन पदार्थों के उपयोग पर पुनर्विचार किया जा रहा है क्योंकि यह गंभीर पर्यावरणीय और स्वास्थ्य खतरों का प्रतिनिधित्व करता है । चूंकि उनके उपयोग के हानिकारक परिणाम पूरे पारिस्थितिकी तंत्र में दिखाई दे रहे हैं और संभावित स्वास्थ्य प्रभावोंके साक्ष्य5, 6जमा हो गए हैं, पुरानी रोगनिरोधी रणनीतियों के लिए उपन्यास विकल्प पूर्व और फसल के बाद के उपचार7,8,9के लिए विकसित किए जा रहे हैं। इसलिए हमारे सामने जो चुनौती है, वह दो गुना है । उपन्यास कवकनाशक रणनीतियों को सबसे पहले फाइटोपैथोजन के खिलाफ खाद्य संरक्षण की प्रभावकारिता के स्तर को बनाए रखना चाहिए और दूसरे, कृषि प्रथाओं के पर्यावरणीय पदचिह्न को नाटकीय रूप से कम करने में योगदान देना चाहिए । इस महत्वाकांक्षी लक्ष्य को पूरा करने के लिए, पौधों में विकसित प्राकृतिक सुरक्षा से प्रेरित रणनीतियों का प्रस्ताव किया जा रहा है क्योंकि 1000 से अधिक पौधों की प्रजातियों को उनके रोगाणुरोधी गुणों के लिए रेखांकित किया गया है8। उदाहरण के लिए, जिन पौधों ने फाइटोपैथोजन से लड़ने के लिए प्राकृतिक कवकनाशक विकसित किए हैं, वे नए जैव नियंत्रण उत्पादों के विकास की खोज में एक उपन्यास संसाधन हैं2। आवश्यक तेल इस प्रकार के प्रमुख अणु हैं। उदाहरण के लिए, ओरिगनम आवश्यक तेल ग्रीनहाउस 10 और सॉलिडागो कैनाडेन्सिस एल में ग्रे मोल्ड के खिलाफ टमाटर के पौधों की रक्षा करता है और कैसिया आवश्यक तेलों को ग्रे मोल्ड क्षति11,12से कटा हुआ स्ट्रॉबेरी को संरक्षित करने के लिए दिखाया गया है। ये उदाहरण स्पष्ट करते हैं कि बायोकंट्रोल और विशेष रूप से पौधे से व्युत्पन्न उत्पाद एक समाधान का प्रतिनिधित्व करते हैं जो जैविक प्रभावकारिता और पर्यावरणीय स्थिरता को जोड़ती है।

इस प्रकार, पौधे फसल संरक्षण उद्योग के लिए संभावित हित के अणुओं का एक महत्वपूर्ण संसाधन हैं । हालांकि केवल एक मुट्ठी भर पौधे उत्पादों को बायोकंट्रोल उत्पादों के रूप में उपयोग करने का प्रस्ताव किया गया है, भले ही उन्हें आम तौर पर सुरक्षित, गैर-फाइटॉक्सिक और पर्यावरण के अनुकूल 2 के रूप में पहचानाजाताहै। प्रयोगशाला से क्षेत्र में पक्षांतरण में कुछ कठिनाइयां देखी गई हैं, जैसे वीवो2,9में लागू होने के बाद प्रभावकारिता कम हो रही है। इस प्रकार, यह बेहतर क्षेत्र प्रभावकारिता की भविष्यवाणी करने के लिए प्रयोगशाला परीक्षणों की क्षमता में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण हो जाता है । इस संदर्भ में, पौधों से व्युत्पन्न उत्पादों के लिए एंटीफंगल परीक्षण विधियां उनकी एंटीफंगल प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने और उपयोग के लिए उनकी इष्टतम स्थितियों को परिभाषित करने के लिए आवश्यक हैं। विशेष रूप से, बायोकंट्रोल उत्पाद आम तौर पर रासायनिक कवकनाशकों की तुलना में कम कुशल होते हैं, इसलिए उपयुक्त योगों का प्रस्ताव करने, क्षेत्रों में आवेदन के तरीके की पहचान करने और यह परिभाषित करने के लिए कि रोगजनक का विकासात्मक चरण उम्मीदवार बायोप्रोडक्ट के लिए असुरक्षित है, उनकी कार्रवाई के तरीके की बेहतर समझ महत्वपूर्ण है।

जीवाणुरोधी और एंटीफंगल गतिविधियों को संबोधित करने वाले वर्तमान दृष्टिकोणों में अगर-डिस्क प्रसार, कमजोर पड़ने, बायोऑटोग्राफी और प्रवाह साइटोमेट्री जैसे प्रसार विधियां शामिल हैं13. इन तकनीकों में से अधिकांश, और अधिक विशेष रूप से, मानक एंटीफंगल संवेदनशीलता परीक्षण - अगर-डिस्क प्रसार और कमजोर पड़ने परख - तरल निलंबन में बैक्टीरियल और फंगल बीजाणुओं पर घुलनशील यौगिकों की एंटीमाइक्रोबियल गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित हैं14. हालांकि, ये विधियां आम तौर पर सूखे पौधे के पाउडर जैसे ठोस यौगिकों का परीक्षण करने या माइसेलियम विकास के दौरान एंटीफंगल गतिविधि की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयुक्त नहीं होती हैं क्योंकि उन्हें आगर प्लेटों पर फैलने वाले बीजाणु कमजोर पड़ने या बीजाणु की आवश्यकता होती है और/या एंटीफंगल यौगिकों का कमजोर होना13. भोजन-जहर विधि में, एंटीफंगल एजेंट युक्त आगर प्लेटों को माइसेलियम शुरू करने की सटीक मात्रा पर विचार किए बिना 7 दिन पुरानी कवक संस्कृति से नमूना 5-7 मिमी व्यास डिस्क के साथ टीका लगाया जाता है। इनक्यूबेशन के बाद, एंटीफंगल गतिविधि रेडियल-ग्रोथ अवरोध के प्रतिशत के रूप में निर्धारित की जाती है17,18,19. इस दृष्टिकोण के साथ हम माइसेमल विकास पर एंटीफंगल गतिविधि का मूल्यांकन कर सकते हैं। इसके विपरीत, आगर-कमजोर पड़ने की विधि एंटीफंगल यौगिकों वाले आगर प्लेट की सतह पर सीधे टीका लगाने वाले बीजाणुओं पर एंटीफंगल गतिविधि निर्धारित करने के लिए की जाती है।13,20,21. ये दोनों दृष्टिकोण एंटीफंगल गतिविधि पर पूरक परिणाम देते हैं। हालांकि ये दो स्वतंत्र तकनीकें हैं जिनका उपयोग समानांतर में किया जाता है जो बीजाणुओं और माइसेलियम पर एंटीफंगल यौगिकों की सापेक्ष प्रभावकारिता की सटीक साथ-साथ तुलना प्रदान नहीं करते हैं17,20,22 चूंकि कवक सामग्री शुरू करने की मात्रा दो दृष्टिकोणों में भिन्न होती है। इसके अलावा, पौधे से प्राप्त उत्पाद की एंटीफंगल गतिविधि अक्सर रोगजनकों का सामना करने के लिए पौधों द्वारा संश्लेषित एंटीफंगल अणुओं के संयोजन से होती है। इन अणुओं में प्रोटीन, पेप्टाइड्स शामिल हैं23,24, और चयापचय में व्यापक रासायनिक विविधता होती है और पॉलीफेनॉल, टर्पेन, अल्कालोड्स जैसे अणुओं के विभिन्न वर्गों से संबंधित होते हैं।25, ग्लूकोसिनोलेट्स8, और ऑर्गेनोसल्फ़ यौगिक26. इनमें से कुछ अणु अस्थिर होते हैं या रोगजनक हमले के दौरान अस्थिर हो जाते हैं27. इन एजेंटों सबसे अधिक बार खराब पानी घुलनशील और उच्च वाष्प दबाव यौगिकों कि आवश्यक तेलों के रूप में पानी आसवन के माध्यम से बरामद किया जाना है, जिनकी रोगाणुरोधी गतिविधियों में से कुछ अच्छी तरह से स्थापित किया गया है28. वाष्प चरण मध्यस्थता संवेदनशीलता परख वाष्प चरण के माध्यम से वाष्पीकरण और प्रवास के बाद अस्थिर यौगिकों की रोगाणुरोधी गतिविधि को मापने के लिए विकसित किया गया है29. ये विधियां माइक्रोबियल संस्कृति से दूरी पर एंटीफंगल यौगिकों की शुरूआत पर आधारित हैं29,30,31,32,33. आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले वाष्प-चरण आगर परख में, आवश्यक तेलों को पेपर डिस्क पर जमा किया जाता है और बैक्टीरियल या फंगल बीजाणु निलंबन से दूरी पर पेट्री डिश के कवर के केंद्र में रखा जाता है, जो आगर माध्यम पर फैला हुआ है। विकास निषेध के क्षेत्र का व्यास तब उसी तरह मापा जाता है जैसे कि अगर-डिस्क प्रसार विधि के लिए20,24. अन्य दृष्टिकोणों को आवश्यक तेलों की वाष्प-चरण एंटीफंगल संवेदनशीलता का मात्रात्मक माप प्रदान करने के लिए विकसित किया गया है, जो शोरबा-कमजोर पड़ने की विधि से प्राप्त होता है जिसमें से एक निरोधात्मक वाष्प-चरण मध्यस्थता एंटीमाइक्रोबियल गतिविधि की गणना की गई थी32, या आगर-डिस्क प्रसार परख से व्युत्पन्न31. ये विधियां आम तौर पर वाष्प-चरण गतिविधि अध्ययनों के लिए विशिष्ट होती हैं और संपर्क-अवरोध परख के लिए उपयुक्त नहीं होती हैं। यह एक जटिल बायोएक्टिव मिश्रण की एंटीफंगल गतिविधि के लिए अस्थिर और गैर-अस्थिर एजेंटों के सापेक्ष योगदान के निर्धारण को रोकता है।

हमारे द्वारा विकसित की गई मात्रात्मक विधि का उद्देश्य बीजाणुओं की नियंत्रित मात्राओं पर सूखे पौधे के पाउडर के एंटीफंगल प्रभाव को मापना और एक आगर माध्यम की सतह पर जमा माइसेलियम कोपौधों के संक्रमण के दौरान फाइटोपैथोजन के हवाई विकास को पुन: उत्पन्न करने के साथ-साथ एक परस्पर माइसेलियल नेटवर्क16को पुन: मिलाना है । दृष्टिकोण एक संशोधित प्रयोगात्मक सेटअप है जो आगर-कमजोर पड़ने और खाद्य-जहर विधियों के आधार पर है जो एक ही प्रयोगात्मक सेटअप में, अस्थिर और गैर-अस्थिर एंटीफंगल मेटाबोलाइट्स दोनों के योगदान का साथ-साथ मात्राकरण की अनुमति देता है। इस अध्ययन में, विधि को तीन अच्छी तरह से विशेषता वाले एंटीफंगल तैयारी की गतिविधि के खिलाफ बेंचमार्क किया गया है।

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Protocol

1. इनोकुला तैयारी

  1. प्रयोग से पहले, ट्राइकोडर्मा स्प्प के 5 माइक्रोन बिछाएं। SBT10-2018 बीजाणुओं आलू डेक्सट्रोस आगार माध्यम (पीडीए) पर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और 4 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर नियमित रूप से प्रकाश जोखिम के साथ कोनिडियागठन 42 (चित्रा 1,पैनल ए) को बढ़ावा देने के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: ट्राइकोडर्मा स्प्प। SBT10-2018 लकड़ी से अलग किया गया है और इस अध्ययन में अपने तेजी से विकास और बीजाणु वसूली की आसानी के लिए मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है । यह तनाव हमारी प्रयोगशाला द्वारा संरक्षित है।
  2. रिकवर कोनिडिया(चित्रा 1,पैनल ए)
    1. ट्राइकोडर्मा माइसेलियम पर 0.05% ट्वीन-20 का 3 एमएल रखना।
    2. कोनियोफोरस से कोनिडिया छोड़ने के लिए एक रेक का उपयोग करें; हाइफा को फटे होने से रोकने के लिए माइसेलियम पर नीचे दबाने से बचें।
    3. समाधान को तेजी से माइक्रोपिपेट के साथ ठीक करें ताकि इसे आगर माध्यम द्वारा अवशोषित किया जा सके और 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित किया जा सके।
    4. हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके बीजाणुओं की कुल संख्या की गणना करें और 3 x 106 बीजाणुओं/एमएल युक्त समाधान तैयार करें।
      नोट: इस कदम को सावधानी से किया जाना चाहिए ताकि हाइफा को निकाले जाने से रोका जा सके। इसके बाद माइक्रोस्कोप के नीचे बीजाणु तैयार करने की जांच की जाती है। अंततः, अत्यधिक हवाई और शराबी माइसेलियम पेश उपभेदों के लिए, अवशिष्ट माइसीलियम टुकड़े को खत्म करने के लिए 40 माइक्रोन छलनी फिल्टर का उपयोग कर छानने का एक कदम जोड़ा जा सकता है।

2. फंगल प्लेट्स तैयारी(चित्रा 1,पैनल बी)

  1. 9 सेमी व्यास पेट्री डिश पर माइक्रोपिपेट के साथ 3 x 106 बीजाणु/एमएल के 100 माइक्रोल जमा करें, जिसमें पीडीए माध्यम से 4,800 बीजाणु/सेमी2 प्राप्त करने के लिए 925 बीजाणु/5 मिमी व्यास-आगर प्लग के अनुरूप है।
  2. बाँझ स्पैटुला के साथ 2 मिमी व्यास ग्लास मोतियों में से 10 ग्राम जोड़ें और अग्र की सतह पर बीजाणुओं को समान रूप से वितरित करने के लिए ऑपरेटर के हाथ में समानांतर और लंबवत आगे और पिछड़े आंदोलनों को अंजाम दें।
  3. प्लेट को 90 डिग्री से घुमाएं और घूर्णन आंदोलनों को दोहराएं (जैसा कि धारा 2.2 में); इन चरणों को तब तक दोहराएं जब तक कि प्लेट को पूरी तरह से घुमाया न जाए।
  4. प्लेट का उपयोग तुरंत स्थापित करने के लिए बीजाणुओं की आवश्यकता वाले प्रयोगों को स्थापित करने या प्लेटों को 17 घंटे या 24 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने के लिए करें, जब क्रमशः जल्दी हाइफा या माइसेलियम की आवश्यकता होती है।
    नोट: माइसेलियम प्लग-ट्रांसफर और माइसेलियम डिस्क-ट्रांसफर के बाद मापा जाने वाली एंटीफंगल गतिविधि की तुलना करने के लिए, बाँझ चिमटी का उपयोग करें और बीजाणु फैलने के बाद आगर प्लेट की सतह पर बेतरतीब ढंग से बाँझ 5 मिमी सेल्यूलोज डिस्क रखें।

3. एंटीफंगल यौगिकों की तैयारी

  1. पौधे से व्युत्पन्न उत्पाद तैयार करना: लहसुन-पाउडर तैयार करना
    1. ताजा लहसुन की लौंग छील और एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर 2-3 मिमी चौड़ा स्लाइस में लौंग काट।
    2. हवा- स्लाइस को 40 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों तक सुखा लें।
    3. एक ठीक पाउडर प्राप्त करने के लिए चाकू मिल का उपयोग करके 3 x 15 सेकंड के लिए स्लाइस पीसें।
    4. लहसुन पाउडर को इस्तेमाल से पहले 50 एमएल ट्यूब में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर कर लें।
      नोट: चूंकि लहसुन ऑटोक्लेव नहीं है (तापमान के प्रति संवेदनशील एंटीफंगल यौगिकों के क्षरण को रोकने के लिए) उपयोग से पहले 70% इथेनॉल के साथ ग्राइंडर, स्केलपेल और एयर ड्रायर को साफ करें।
  2. आवश्यक तेल तैयार करना
    1. 0.5% ट्वीन-80 में 0.5%, 1%, 2.5%, 5% और 20% थाइमस वल्गैरिस आवश्यक तेल समाधान तैयार करें।
    2. पीडीए माध्यम में जोड़ने से पहले एक पायस बनाने के लिए अच्छी तरह से मिलाएं (धारा 4.2 देखें)।
  3. कार्बेंडअजीम तैयारी
    1. 200 मिलीग्राम/एल इथेनॉल समाधान तैयार करने के लिए कार्बेंडाजिम का वजन करें (कार्बेंडाजिम पानी में खराब घुलनशील है)।
    2. इसे पीडीए माध्यम में जोड़ने से पहले कमरे के तापमान पर समाधान स्टोर करें (धारा 4.2 देखें)।
      सावधानी: Carbendazim एक स्वास्थ्य और पर्यावरण के लिए खतरा प्रस्तुत करता है । इस उत्पाद को संभालते समय दस्ताने और मुखौटा पहनें। इसे हवादार जगह में स्टोर करें।

4. संपर्क-अवरोध परख

  1. लहसुन पाउडर युक्त आगर प्लेटों की तैयारी
    1. पीडीए माध्यम तैयार करें और ऑटोक्लेव करें।
    2. एक बाँझ स्पैटुला का उपयोग कर एक ५० एमएल ट्यूब में वांछित लहसुन पाउडर मात्रा का वजन, आम तौर पर ०.२५ मिलीग्राम/एमएल से 16 मिलीग्राम/एमएल को लेकर सांद्रता प्राप्त करने के लिए ।
    3. कलाई के अंदर पर माध्यम के तापमान की जांच करने के बाद पीडीए के 10 मिलीएल जोड़ें। संवेदनशील अणुओं के क्षरण को रोकने के लिए तापमान यथासंभव कम होना चाहिए । आदर्श रूप में, यह तापमान 45 डिग्री सेल्सियस होना चाहिए।
    4. पीडीए माध्यम में पाउडर को समान रूप से वितरित करने के लिए ट्यूब को उल्टा करके सावधानी से समरूपता दें। जल्दी से 5 सेमी व्यास पेट्री डिश(चित्रा 1,पैनल सी) में 10 एमएल डालें।
    5. पेट्री डिश के साथ कमरे के तापमान पर रखा, जब तक आगर जमना रुको ।
  2. आवश्यक तेल या कार्बेंडअजीम युक्त आगर प्लेटों की तैयारी
    1. पीडीए के 10 एमएल को 50 एमएल ट्यूब में पेश करें। सेक्शन 4.1.3 के लिए तापमान की जांच करें।
    2. 0.005%, 0.01%, 0.025%, 0.05% और 0.2% समाधान (धारा 3.2.1 देखें) प्राप्त करने के लिए पीडीए में थाइमस वल्गैरिस आवश्यक तेल के विभिन्न समाधानों के 100 माइक्रोन जोड़ें।
    3. 0.0625-2 मिलीग्राम/एल से लेकर समाधान प्राप्त करने के लिए 200 मिलीग्राम/एल समाधान से कार्बेंडेन्डाज़िम की आवश्यक मात्रा जोड़ें (धारा 3.3.1 देखें)।
    4. ट्यूब को उल्टा करके ध्यान से समरूप बनाएं, जल्दी से 5 सेमी व्यास पेट्री डिश(चित्रा 1,पैनल सी) में 10 एमएल डालें।
    5. पेट्री डिश के साथ कमरे के तापमान पर रखा, जब तक आगर जमना रुको ।
  3. संपर्क अवरोध परख(चित्र 1)
    1. 5 मिमी व्यास बाँझ स्टेनलेस-स्टील ट्यूब के साथ, एंटीफंगल यौगिकों सहित पीडीए या पीडीए युक्त पेट्री व्यंजनों के केंद्र में एक सर्कल प्लॉट करें। बाँझ टूथपिक (पैनल सी) का उपयोग करके आगर सिलेंडर का निपटान करें।
    2. एक 5 मिमी व्यास बाँझ स्टेनलेस स्टील ट्यूब के साथ, साजिश धारा 2 से कवक प्लेटों में बेतरतीब ढंग से हलकों । प्रति प्लेट 15-20 हलकों (पैनल बी) के बीच प्लॉट।
    3. सावधानी से एक बाँझ टूथपिक के साथ बीजाणुओं, जल्दी हाइफे, या माइसेलियम द्वारा कवर किए गए अगर-सिलेंडरों को वापस लें और प्लग को पेट्री व्यंजनों की खाली जगह में रखें जिसमें पीडीए या पीडीए शामिल हैं जिसमें एंटीफंगल यौगिक (पैनल सी) शामिल हैं।
    4. 30 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए बीजाणुओं वाली प्लेटों को इनक्यूबेट करें, 31 घंटे प्लेटों के लिए जिसमें शुरुआती हाइफा और, 24 घंटे माइसेलियम (पैनल सी) से ढकी प्लेटों के लिए हैं।
    5. रेडियल विकास के व्यास को मापें और सूत्र (पैनल डी) का उपयोग करके नियंत्रण पर कवक-विकास अवरोध के प्रतिशत की गणना करें
      % कवक विकास अवरोध = (C - A/C) * 100
      जहां सी पीडीए माध्यम में रेडियल विकास का व्यास है और पीडीए माध्यम में रेडियल विकास का व्यास है जिसमें एंटीफंगल यौगिक होते हैं ।
      नोट: माइसेलियम प्लग-ट्रांसफर और माइसेलियम डिस्क-ट्रांसफर के बाद मापा जाने वाली एंटीफंगल गतिविधि की तुलना करने के लिए, बाँझ चिमटी का उपयोग करके, पेट्री व्यंजनों के केंद्र में पहले जमा किए गए एक 5 मिमी व्यास डिस्क को स्थानांतरित करें, जिसमें पीडीए या पीडीए युक्त एंटीफंगल यौगिक होते हैं और बिल्कुल एगर-प्लग हस्तांतरण के लिए आगे बढ़ें

5. वाष्प-चरण अवरोध परख

  1. लहसुन पाउडर युक्त आगर प्लेटों की तैयारी
    1. धारा 3.1 की तरह आगे बढ़ें।
  2. आवश्यक तेल या कार्बेंडअजीम युक्त आगर प्लेट की तैयारी
    1. धारा 3.2 और 3.3 की तरह आगे बढ़ें।
  3. फंगल प्लेटों की तैयारी
    1. धारा 2 की तरह आगे बढ़ें।
  4. वाष्प-चरण एंटीफंगल अवरोध परख(चित्र 1)
    1. पीडीए माध्यम के 10 एमएल को 5 सेमी व्यास पेट्री व्यंजनों के ढक्कन में डालें जिसमें या तो 10 एमएल पीडीए माध्यम या पीडीए माध्यम के 10 एमएल हैं जिसमें एंटीफंगल यौगिक होते हैं। कमरे के तापमान (पैनल सी) पर आगर के पूर्ण ठोसकरण तक प्रतीक्षा करें।
    2. ढक्कन के केंद्र में पीडीए का एक चक्र प्राप्त करने के लिए एक अंशांकन उपकरण के रूप में 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब का उपयोग करें; एक बाँझ स्पैटुला (पैनल सी) के साथ सर्कल के चारों ओर पीडीए निकालें।
    3. पीडीए माध्यम के केंद्र में एक सर्कल प्लॉट एक 5 मिमी व्यास बाँझ स्टेनलेस स्टील ट्यूब के साथ ढक्कन में रखा । बाँझ टूथपिक (पैनल सी) के साथ अगर-सिलेंडर को त्यागें।
    4. सेक्शन 4.3.2 (पैनल बी) की तरह फंगल प्लेटों में बेतरतीब ढंग से 5 मिमी व्यास बाँझ स्टेनलेस-स्टील ट्यूब के साथ प्लग बनाएं।
    5. बाँझ टूथपिक का उपयोग करके, प्लग को सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें जो या तो बीजाणुओं, प्रारंभिक हाइफा, या फंगल प्लेटों से माइसेलियम के साथ परख प्लेटों (पैनल सी) के ढक्कन में शामिल हैं।
    6. धारा 4.3.4 (पैनल सी) की तरह 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    7. रेडियल विकास के व्यास को मापें और धारा 4.3.5 (पैनल डी) में सूत्र का उपयोग करके फंगल विकास अवरोध के प्रतिशत की गणना करें।

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Representative Results

विभिन्न प्रकार के एंटीफंगल यौगिकों की कार्रवाई के तरीके को भेदभाव करने के लिए मात्रात्मक विधि की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, हमने तीन प्रसिद्ध एंटीफंगल एजेंटों की प्रभावकारिता की तुलना की। कार्बेंडाजिम एक गैर-अस्थिर सिंथेटिक कवकनाशक है जिसका व्यापक रूप से पौधों में व्यापक रूप से कवक रोगों को नियंत्रित करने के लिए उपयोग किया गया है39,40. थाइमस वल्गैरिस आवश्यक तेल को काफी हद तक इसके जीवाणुरोधी और एंटीफंगल गतिविधि के लिए वर्णित किया गया है और इसका उपयोग प्राकृतिक खाद्य परिरक्षक एजेंट41के रूप में किया जाता है। लहसुन पाउडर को पौधे से व्युत्पन्न बायोप्रोडक्ट के मॉडल के रूप में चुना गया है। इसका पारंपरिक रूप से रोगाणुरोधी गतिविधियों के साथ एक प्राकृतिक उपचार के रूप में उपयोग किया जाता है, जिसे काफी हद तक अस्थिर ऑर्गेनोसल्फर यौगिकों की उपस्थिति के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है, लेकिन गैर-अस्थिर सैपोनिन और फेनोलिक यौगिकों26की उपस्थिति के लिए भी, इस मॉडल को इस अध्ययन में प्रासंगिक जटिलता देते हुए।

यह मात्रात्मक विधि बीजाणुओं से माइसेलियम तक विभिन्न विकासात्मक चरणों में कवक की नियंत्रित मात्रा वाले एगर प्लग के हस्तांतरण पर निर्भर करती है जबकि भोजन-जहर विधि में, 5 दिन से 7 दिन पुराने माइसेलियम को सेल्यूलोज डिस्क13से स्थानांतरित किया जाता है। परख में, बीजाणु, प्रारंभिक हाइफा (17 एच इनक्यूबेशन) और माइसेलियम (24 एच इनक्यूबेशन) का उपयोग फंगल सामग्री शुरू करने के रूप में किया जाता था। डिस्क हस्तांतरण का उपयोग प्रासंगिक नहीं हो सकता है क्योंकि कोनिडिया या अवशिष्ट हाइफा कम से कम डिस्क हस्तांतरण के बाद आगर माध्यम पर आंशिक रूप से रहते हैं,बाद में चित्र 2 में सचित्र विकास अवरोध का गलत माप होता है। सेल्यूलोज डिस्क के तहत स्थित आगर क्षेत्रों के हस्तांतरण के बाद फंगल-रेडियल विकास के विभिन्न व्यास देखे गए हैं जिसके बाद 24 घंटे इनक्यूबेशन(चित्रा 2,पैनल ए, बी और सी) डिस्क हस्तांतरण के बाद आगर पर अवशिष्ट फंगल हाइफा की उपस्थिति को रेखांकित करते हैं। अवशिष्ट हाइफाई के परिमाणीकरण की पुष्टि विकास के मापन द्वारा की गई है जिससे 22% व्यास परिवर्तनशीलता(चित्र 2,पैनल डी) तक हो जाती है। विकास अवरोध पर प्रभाव अगले थाइमस वल्गैरिस आवश्यक तेल का उपयोग करके एंटीफंगल यौगिक के रूप में मूल्यांकन किया गया था और आगर-प्लग हस्तांतरण(चित्रा 2,पैनल ई) के बाद प्राप्त अवरोध की तुलना में। डिस्क हस्तांतरण के बाद विकास अवरोध कम थाइमस तेल सांद्रता के लिए अगर-प्लग हस्तांतरण के बाद अधिक था, जिससे निरोधात्मक प्रभाव का अधिक अनुमान लगाया जा सकता है, जो फंगल सामग्री के अधूरे हस्तांतरण के कारण हो सकता है और एगर-प्लग हस्तांतरण के आधार पर दृष्टिकोण का समर्थन करता है।

ट्राइकोडर्मा स्पीप। SBT10-2018-तीन एंटीफंगल यौगिकों द्वारा ट्रिगर विकास अवरोध अगले संपर्क का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था-और वाष्प चरण अवरोध प्रत्येक कवक चरण(चित्र 3)के लिए परख । 4,800 बीजाणुओं/सेमी 2 प्राप्त करने के लिए आगर प्लेटों पर बीजाणु सावधानीपूर्वक फैलेहुएथे। उन्हें सीधे 5 मिमी बाँझ स्टेनलेस-स्टील ट्यूब का उपयोग करके एगर-प्लग निष्कर्षण के माध्यम से एंटीफंगल यौगिकों वाली आगर प्लेटों में स्थानांतरित कर दिया गया था, जिससे प्रयोग बीजाणुओं से शुरू हो सकता था। दो अन्य विकासात्मक चरणों के लिए, बीजाणुओं से ढके आगर प्लेटों को सबसे पहले 17 घंटे या 24 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड किया गया था ताकि आगर प्लग को स्थानांतरित किया जा सके ताकि हाइफा (17 एच) और माइसेलियम गठन (24 एच)(चित्रा 3,पैनल ए) के अंकुरण और प्रारंभिक विकास की अनुमति दी जा सके। समग्र एंटीफंगल गतिविधि के लिए सक्रिय अस्थिर अणुओं के योगदान की मात्रा निर्धारित करने के लिए, संपर्क अवरोध परख को अनुकूलित किया गया है और बीजाणु, प्रारंभिक हाइफे, और माइसेलियम को संपर्क-अवरोध परख के लिए पीडीए माध्यम में डाले गए एंटीफंगल यौगिकों से दूरी पर रखा गया था। ट्राइकोडर्मा-रेडियलविकास को 48 घंटे से अधिक मापा गया था और अवरोध का प्रतिशत नियंत्रण स्थितियों की तुलना में निर्धारित किया गया है। न्यूनतम-निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) को 30 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद दिखाई देने वाले विकास को रोकने वाले एंटीफंगल यौगिकों की सबसे कम एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया है।

चित्रा 3(पैनल बी) 50%, 22% और 30% वृद्धि अवरोध के साथ प्रारंभिक हाइफे और माइसेलियम नेटवर्क की तुलना में कार्बेंडेजिम के लिए उच्च बीजाणु संवेदनशीलता को दर्शाता है, जब ट्राइकोडर्मा और एंटीफंगल यौगिक संपर्क में थे। इसके साथ-साथ, बीजाणु अंकुरण पर 05 माइक्रोग्राम/एमएल के एमआईसी मूल्य का अनुमान लगाया गया है जबकि प्रारंभिक हाइफाई विस्तार और माइसेलियम पर 075 माइक्रोन/एमएल की वृद्धि प्राप्त की गई है। इसके विपरीत, जब कवक को इस पदार्थ की कम अस्थिरता के अनुसार कवक से दूरी पर रखा गया था तो ट्राइकोडर्मा पर कार्बेंडेमा का कोई एंटीफंगल प्रभाव नहीं पड़ा। एंटीफंगल कंपाउंड(चित्रा 3,पैनल सी) के रूप में थिमस वल्गैरिस आवश्यक तेल (टीईओ) का उपयोग करके हमने प्राप्त किए गए परिणामों में क्रमशः 0.01% टीईओ पर 65% और लगभग 50% वृद्धि निषेध के साथ शुरुआती हाइफे और माइसेलियम की तुलना में टीईओ के लिए उच्च बीजाणु संवेदनशीलता दिखाई है। प्राप्त एमआईसी मान बीजाणु अंकुरण और प्रारंभिक हाइफाई विस्तार (0.025% TEO) और माइसेलियम वृद्धि (0.05% TEO) के लिए उच्च के समान थे। जैसा कि उम्मीद थी, थाइमस वल्गैरिस आवश्यक तेल ने कवक और तेल की दूरी पर ध्यान दिए बिना समान एंटीफंगल गतिविधि प्रस्तुत की। इसी तरह के एमआईसी मान (0.025% TEO) संपर्क और वाष्प चरण परख के लिए बीजाणु अंकुरण और प्रारंभिक हाइफाई विस्तार पर प्राप्त किए गए थे, हालांकि कम प्रतिशत पर एक उच्च संवेदनशीलता देखी गई है जब TEO और Trichoderma बीजाणु संपर्क में थे (दूरी पर 45% अवरोध विकास बनाम संपर्क में 60% वृद्धि अवरोध)। आश्चर्य की बात है, माइक मूल्यों mycelium पर प्राप्त संपर्क में अलग थे-और वाष्प चरण अवरोध परख (०.०५% बनाम ०.१%) यह सुझाव देना कि अस्थिर अणुओं का कुछ हिस्सा एक अच्छी तरह से विकसित माइसेलियम के खिलाफ सक्रिय नहीं है। अंत में, एंटीफंगल यौगिक(चित्रा 3,पैनल डी) के रूप में लहसुन पाउडर का उपयोग करते समय, बीजाणु अंकुरण (0.25 मिलीग्राम/एमएल लहसुन पाउडर पर 50% वृद्धि अवरोध और 0.5 मिलीग्राम/एमएल) पर 50% वृद्धि अवरोध और प्रारंभिक हाइफाई विस्तार (प्रारंभिक हाइफाई विस्तार) के खिलाफ एक उच्च प्रभावकारिता देखी गई। माइसेलियम वृद्धि (0.5 मिलीग्राम/एमएल लहसुन पाउडर और 0.75 मिलीग्राम/एमएल के एमआईसी मूल्य) की तुलना में 0.25 मिलीग्राम/एमएल और एमआईसी मूल्य 0.5 मिलीग्राम/एमएल पर 59% वृद्धि अवरोध) । जब संपर्क और वाष्प चरण की तुलना की गई, तो परिणामों ने कवक के विकास के चरण पर ध्यान दिए बिना दूरी पर एंटीफंगल गतिविधि में काफी कमी दिखाई है । एमआईसी मान बीजाणु अंकुरण के लिए 0.5 मिलीग्राम/एमएल/एमएल, प्रारंभिक हाइहै विस्तार के लिए 0.5 मिलीग्राम/एमएल से 2 मिलीग्राम/एमएल तक और मिसेलियम वृद्धि के लिए 0.75 मिलीग्राम/एमएल/एमएल तक(चित्रा 3,पैनल डी और प्रतिनिधि चित्रों के लिए चित्रा 4) तक चले गए। इसलिए, इन परिणामों से पता चलता है कि लहसुन पाउडर में अस्थिर और गैर-अस्थिर यौगिकों दोनों का मिश्रण होता है जिसमें एंटीफंगल गुण होते हैं।

कुल मिलाकर, इन परिणामों से पता चलता है कि संयंत्र-व्युत्पन्न उत्पादों में निहित अस्थिर और गैर-अस्थिर एजेंटों के सापेक्ष योगदान को विभिन्न कवक-विकास चरणों में निर्धारित किया जा सकता है क्योंकि प्रायोगिक स्थितियां तुलनीय हैं । यह दृष्टिकोण तब विशेष रूप से एंटीफंगल यौगिकों के जटिल मिश्रण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। थाइमस वल्गैरिस आवश्यक तेल अस्थिर यौगिकों का मिश्रण है और दूरी पर और बीजाणु अंकुरण और प्रारंभिक हाइफाई विस्तार के लिए संपर्क में एक समान गतिविधि दिखाता है, इस वाष्प-चरण और संपर्क-अवरोध परख की तुलना का समर्थन करता है और इस बात पर प्रकाश डालता है कि वाष्प-चरण में प्रवास आगर माध्यम में डालने से बिगड़ा नहीं है। परिणाम यह भी रेखांकित करते हैं कि इस अध्ययन में मॉडल के रूप में उपयोग किए जाने वाले लहसुन पाउडर में गैर-अस्थिर सक्रिय घटक होते हैं जिनका समग्र एंटीफंगल गतिविधि में महत्वपूर्ण योगदान होता है और जिन्हें एलियम27, 28से प्राप्त अस्थिर थिओसुलिफाइनेट के पक्ष में उपेक्षित किया गया है ।

Figure 1
चित्रा 1:संपर्क और वाष्प चरण परख के लिए प्रोटोकॉल की सारांश योजना कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:सेल्यूलोज डिस्क से कवक हस्तांतरण से जुड़ी अशुद्धि। A. योजना बीजाणुओं द्वारा कवर किए गए आगर-प्लेटों पर डिस्क हस्तांतरण का प्रतिनिधित्व करती है और आगर-प्लेटों पर सतह पर डिस्क हस्तांतरण करती है जिसमें एंटीफंगल यौगिक बी योजना होती है जो सेल्यूलोज डिस्क के तहत क्षेत्रों के आगार हस्तांतरण का प्रतिनिधित्व करती है जिसके बाद इनक्यूबेशन और अवशिष्ट विकास माप होता है । सी. सेल्यूलोज डिस्क के तहत क्षेत्रों के हस्तांतरण के बाद अवशिष्ट माइसीलियम के रेडियल विकास की प्रतिनिधि तस्वीर। डी. अवशिष्ट माइसीलियम का रेडियल विकास माप। ई. थाइमस वल्गैरिस का प्रभाव सेल्यूलोज डिस्क या एगर-प्लग (एन = 2, मतलब ± एसडी) से स्थानांतरित माइसेलियम के विकास पर आवश्यक तेल कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3:वाष्प-चरण का उपयोग करके एंटीफंगल गतिविधियों की तुलना और संपर्क अवरोध बीजाणुओं, प्रारंभिक हाइफे और माइसेलियम पर परखता है। A. ट्राइकोडर्मा बीजाणुओं, प्रारंभिक हाइफा (17 एच विकास), और माइसेलियम (24 घंटे की वृद्धि) के प्रतिनिधि चित्र। कारबेंडअजीम(बी), थाइमस वल्गैरिस आवश्यक तेल(सी)और लहसुन पाउडर(डी)द्वारा ट्राइकोडर्मा विकास अवरोध। (N=2, मतलब ± एसडी) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:संपर्क में आगर प्लेटों पर लहसुन एंटीफंगल गतिविधि के प्रतिनिधि चित्र-(ए) या वाष्प चरण (बी) अवरोध परख कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण न्यूनतम प्रसंस्कृत संयंत्र-व्युत्पन्न उत्पादों के एंटीफंगल गुणों के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल में, आगर की सतह पर बीजाणुओं का समरूप वितरण 2 मिमी ग्लास मोतियों का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। इस कदम के लिए मोतियों को ठीक से वितरित करने और प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए कौशल को संभालने की आवश्यकता होती है, अंततः फंगल विकास के विभिन्न चरणों में एंटीफंगल प्रभावों की तुलना की अनुमति देता है। हमने पाया कि 5 मिमी कांच के मोती या अत्यधिक रोटेशन जबकि फैलने के दौरान समरूप परिवर्तन चर विकास व्यास पैदा कर सकता है । इसलिए, हम प्रयोग से पहले बीजाणु वितरण में महारत हासिल करने के लिए प्रशिक्षण की सलाह दें। इसके अलावा, जब पौधे के पाउडर का परीक्षण किया जाना चाहिए, तो उत्पाद के समरूप फैलाव को आगर माध्यम में ध्यान दिया जाना चाहिए। पाउडर को प्लेट के नीचे बसने से रोकने के लिए, उत्पाद को आगर माध्यम में मिलाना पड़ता है जब पिघले हुए माध्यम का तापमान 45 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाता है (जब कमरे का तापमान 24 डिग्री सेल्सियस होता है)। तलछट से बचने के लिए इस तापमान को स्थानीय कमरे के तापमान के अनुसार समायोजित करना होगा।

जबकि विधि हम यहां वर्णन मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, कुछ कमियों पर विचार किया जाना चाहिए । यह विधि तैयारी के समय की एक महत्वपूर्ण राशि की कीमत पर एक ही प्रयोगात्मक सेटअप में सटीक और साथ-साथ तुलना के लिए अनुमति देती है क्योंकि तैयार किए जाने वाले आगर प्लेटों की संख्या उन प्रश्नों के आधार पर खासी हो सकती है जिनका उत्तर दिया जाना है। इसके अलावा, यह परख एक मध्यम पैमाने पर परख 5 सेमी पेट्री व्यंजन के लिए बनाया गया है। इसलिए, सभी पहलुओं का परीक्षण करने के लिए आवश्यक सक्रिय पदार्थों की मात्रा पर्याप्त हो सकती है। इसका मतलब है कि दुर्लभ पदार्थ इस प्रोटोकॉल के लिए उपयुक्त परीक्षण उम्मीदवार नहीं हो सकते हैं। परख के एक पैमाने के नीचे छोटे पेट्री व्यंजन का उपयोग कर और प्लग के आकार को कम करने पर विचार किया जा सकता है । यह आगर प्लग निष्कर्षण, जो मुश्किल हो सकता है पर विशेष ध्यान के साथ यहां वर्णित बेंचमार्किंग प्रोटोकॉल का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है । रेडियल-ग्रोथ मापन की सटीकता उस छोटे पैमाने पर कम हो सकती है ।

वर्तमान तरीके समाधान में यौगिकों की एंटीफंगल गतिविधि को मापने के लिए उपयुक्त हैं और पाउडर का अध्ययन करने के लिए कम लागू होते हैं13. हमारे द्वारा स्थापित दृष्टिकोण तरल और ठोस यौगिकों दोनों के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित है, जो न्यूनतम प्रसंस्कृत संयंत्र-व्युत्पन्न उत्पादों के एंटीफंगल गुणों के मूल्यांकन की अनुमति देता है। यह अर्क का परीक्षण करने के लिए आवश्यक समय को कम करता है और खराब घुलनशीलता प्रदर्शित करने वाले सक्रिय पदार्थों से संबंधित नुकसान को कम करता है। चूंकि कुछ पौधों से प्राप्त उत्पादों में उच्च तापमान43के प्रति संवेदनशील सक्रिय अणु होते हैं, यह ऐसे यौगिकों की गतिविधि के नुकसान के जोखिम को सीमित करने का लाभ प्रदान करता है। इस दृष्टिकोण को अगर-प्रसार विधि औरखाद्य-जहर विधि15, 16, 17,18,19से अनुकूलित किया गया है ताकि समान प्रयोगात्मक सेटिंग्स का उपयोग करके विभिन्न कवक विकास चरणों पर एंटीफंगल गतिविधियों की सीधी तुलना की अनुमति दी जा सके। एगर-प्लग ट्रांसफर परख के भीतर सूक्ष्मजीवों की मात्रा के सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है। यह डिस्क हस्तांतरण पर एक लाभ है, जो बीजाणुओं या हाइफे के अधूरे हस्तांतरण से जुड़े एंटीफंगल प्रभावों का अधिक अनुमान जाता है। अंत में, जबकि वाष्प चरण परख आम तौर पर संपर्क निषेध पर लागू नहीं होतेहैं27,28, 29,30,31,जिस विधि का हम प्रस्ताव करते हैं वह जटिल मिश्रण जैसे संयंत्र पाउडर या अर्क में निहित अस्थिर और गैर-अस्थिर एजेंटों के सापेक्ष योगदान को संबोधित करती है और अंततः विभिन्न कवक-विकास चरणों में एंटीफंगल गतिविधियों के मूल्यांकन की अनुमति देती है।

हम यहां जिस दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं, वह विशेष रूप से उन तरीकों की आवश्यकता का समर्थन करने के लिए प्रासंगिक हो सकता है जो बायोकंट्रोल के लिए पौधों से व्युत्पन्न उत्पादों में एंटीफंगल गुणों का मूल्यांकन करते हैं। मात्रात्मक विधि हम प्रस्ताव ऑपरेटरों एक जटिल जैव सक्रिय मिश्रण की एंटीफंगल गतिविधि के लिए अस्थिर और गैर अस्थिर यौगिकों के संबंधित योगदान निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है । यह मूल्यवान जानकारी प्रदान करता है जो उपचार के लिए आवेदन के तरीकों और तरल निष्कर्षण करने की प्रासंगिकता के विकल्प का मार्गदर्शन कर सकता है। ऐसे अनुप्रयोग जिन पर लक्षित फाइटोपैथोजन (उदाहरण के लिए, बायोकंट्रोल उत्पाद को पैकेजिंग में शामिल करना) से दूरी पर विचार किया जा सकता है या बायोकंट्रोल उत्पाद की प्रभावकारिता को अनुकूलित करने के लिए सीधे संपर्क की आवश्यकता हो सकती है (पौधों पर नेबुलाइजेशन या फल को बायोकंट्रोल उत्पाद के समाधान में डुबोना)। यह बीजाणु अंकुरण से लेकर बाद के चरण माइसेलियम विकास तक विभिन्न कवक-विकास चरणों में एंटीफंगल प्रभावकारिता की तुलना की भी अनुमति देता है, जिससे फसलों पर जैव नियंत्रण उत्पादों को लागू करने के लिए आवश्यक नियंत्रण थ्रेसहोल्ड स्थापित करने के लिए सिफारिशों की परिभाषा होती है । दरअसल, विभिन्न कवक चरणों में पदार्थों की प्रभावकारिता को परिभाषित करने से यह वर्गीकृत करने में मदद मिल सकती है कि क्या पदार्थों का उपयोग निवारक या उपचारात्मक उपचार के रूप में किया जा सकता है और बायोकंट्रोल उत्पादों के साथ पौधे के उपचार के लिए अनुसूची की योजना बनाना है। यह क्षेत्र या फसल के बाद में उपयोग किए जाने पर उत्पादों की प्रभावकारिता का लाभ उठाने के लिए आवश्यक है।

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Disclosures

कोई नहीं

Acknowledgments

हम उनकी बहुमूल्य सलाह के लिए फ्रैंक येट्स के बहुत आभारी हैं । इस काम को सुप बायोटेक ने समर्थन दिया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclave-vacuclav 24B+ Melag
Carbendazim Sigma  378674-100G
Distilled water
Eppendorf tubes Sarstedt 72.706 1.5 mL
Falcons tubes Sarstedt 547254 50 mL
Five millimeters diameter stainless steel tube retail store /
Food dehydrator Sancusto six trays
Garlic powder Organic shop
Glass beads CLOUP 65020 Equation 1 2 mm
Hemocytometer counting cell Jeulin 713442 /
Incubator Memmert  UM400 30 °C
Knife mill Bosch TSM6A013B
Manual cell counter Labbox HCNT-001-001 /
Measuring ruler retail store
Microbiological safety cabinets FASTER FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2
Micropipette Mettler-Toledo 17014407 100 - 1000 µL
Micropipette Mettler-Toledo 17014411 20 - 200 µL
Micropipette Mettler-Toledo 17014412 2 - 20 µL
Petri dish Sarstedt 82-1194500 Equation 1 55 mm
Petri dish Sarstedt 82-1473  Equation 1 90 mm
Pipette Controllers-EASY 60 Labbox EASY-P60-001 /
Potato Dextrose Agar Sigma  70139-500G
Precision scale-RADWAG Grosseron B126698 AS220.R2-ML 220g/0.1mg 
Rake Sarstedt 86-1569001 /
Reverse microscope AE31E trinocular Grosseron M097917 /
Sterile graduated pipette Sarstedt 1254001 10 mL
Thymus essential oil Drugstore Essential oil 100%
Tips 1000 µL  Sarstedt 70.762010
Tips 20 µL  Sarstedt 70.760012
Tips 200 µL Sarstedt 70.760002
Tooth pick retail store
Trichoderma spp strain Strain of LRPIA laboratory
Tween-20  Sigma  P1379-250ML
Tween-80 Sigma  P1754-1L
Tweezers Labbox FORS-001-002 /

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पर्यावरण विज्ञान अंक 166 बायोकंट्रोल फंगल फाइटोपैथोजन फंगल विकास संपर्क और वाष्प चरण परख
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Gligorijevic, V., Benel, C., Gonzalez, P., Saint-Pol, A. Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products. J. Vis. Exp. (166), e61798, doi:10.3791/61798 (2020).

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