Summary
Nous décrivons une méthode modifiée à base d’agar conçue pour quantifier les effets antifongiques des produits dérivés des plantes. Les contributions volatiles et non volatiles à l’activité antifongique peuvent être évaluées par ce protocole. En outre, l’efficacité contre les champignons peut être mesurée à des stades clés de développement dans une seule configuration expérimentale.
Abstract
Le protocole décrit est basé sur une technique de plug-transfer qui permet une détermination précise des quantités de micro-organismes et de leurs stades de développement. Un certain nombre de spores sont réparties sur une plaque d’agar. Cette plaque d’agar est incubée pendant une période définie pour permettre aux champignons d’atteindre le stade de développement prévu, à l’exception des spores où l’incubation n’est pas nécessaire. Les bouchons d’agar couverts de spores, d’hyphes ou de mycélium sont ensuite retirés et transférés sur des supports d’agar contenant le composé antifongique à tester soit à une distance des champignons, soit en contact. Cette méthode est applicable pour tester à la fois les extraits liquides et les échantillons solides (poudres). Il est particulièrement bien adapté pour quantifier les contributions relatives des agents volatils et non volatils dans les mélanges bioactifs et pour déterminer leurs effets, spécifiquement sur les spores, les hyphes précoces et le mycélium.
La méthode est très pertinente pour la caractérisation de l’activité antifongique des produits de lutte biologique, notamment les produits dérivés des plantes. En effet, pour le traitement des plantes, les résultats peuvent être utilisés pour guider le choix du mode d’application et pour établir les seuils de déclenchement.
Introduction
Les pertes mondiales de fruits et légumes peuvent atteindre jusqu’à 50 % de la production1 et résulter principalement de la décomposition des aliments causée par la détérioration des champignons sur le terrain ou pendant le stockage post-récolte2,3, malgré l’emploi important de fongicides synthétiques depuis le milieu du XXe siècle4. L’utilisation de ces substances est réexaminée puisqu’elle représente de graves risques pour l’environnement et la santé. Comme les conséquences néfastes de leur utilisation se manifestent dans tous les écosystèmes et que des preuves d’impacts potentiels sur la santése sont accumulées 5,6, de nouvelles alternatives aux anciennes stratégies prophylactiques sont en cours d’élaboration pour les traitements pré et post-récolte7,8,9. Par conséquent, le défi auquel nous sommes confrontés est double. Les nouvelles stratégies fongicides doivent, premièrement, maintenir les niveaux d’efficacité de la protection alimentaire contre les phytopathogènes et, en même temps, contribuer, deuxièmement, à réduire considérablement l’empreinte environnementale des pratiques agricoles. Pour atteindre cet objectif ambitieux, des stratégies inspirées par les défenses naturelles évoluées dans les plantes sont proposées car plus de 1000 espèces végétales ont été mises en évidence pour leurs propriétés antimicrobiennes8. Par exemple, les plantes qui ont développé des fongicides naturels pour lutter contre les phytopathogènes sont une ressource nouvelle dans l’exploration du développement de nouveaux produits de lutte biologique2. Les huiles essentielles sont des molécules phares de ce type. Par exemple, l’huile essentielle d’Origanum protège les plants de tomates contre la moisissure grise dans les serres 10 et solidago canadensis L. et cassia huiles essentielles ont été montrés pour préserver les fraises post-récolte de dommages moulegris 11,12. Ces exemples illustrent que le biocontrôle et notamment les produits dérivés des plantes représentent une solution qui combine efficacité biologique et durabilité environnementale.
Ainsi, les plantes sont une ressource importante de molécules d’intérêt potentiel pour l’industrie de la protection des cultures. Toutefois, seule une poignée de produits végétaux ont été proposés pour être utilisés comme produits de lutte biologique, même s’ils sont généralement reconnus comme sûrs, non phytotoxiques et respectueux del’environnement 2. Certaines difficultés dans la transposition du laboratoire au champ ont été observées, comme la diminution de l’efficacité une fois appliquée in vivo2,9. Ainsi, il devient important d’améliorer la capacité des tests de laboratoire à mieux prédire l’efficacité sur le terrain. Dans ce contexte, des méthodes d’essai antifongiques pour les produits dérivés des plantes sont nécessaires à la fois pour évaluer leur efficacité antifongique et pour définir leurs conditions optimales d’utilisation. Plus précisément, les produits de lutte biologique sont généralement moins efficaces que les fongicides chimiques, de sorte qu’une meilleure compréhension de leur mode d’action est importante pour proposer des formulations appropriées, pour identifier le mode d’application dans les champs et pour définir quel stade de développement de l’agent pathogène est vulnérable au bioproduit candidat.
Les approches actuelles portant sur les activités antibactériennes et antifongiques comprennent des méthodes de diffusion telles que la diffusion du disque d’agar, la dilution, la bioautographie et la cytométrie des flux.13. La plupart de ces techniques, et plus particulièrement, les tests de susceptibilité antifongique standard - analyse de diffusion et de dilution du disque d’agar - sont bien adaptés pour évaluer l’activité antimicrobienne des composés solubles sur les spores bactériennes et fongiques dans les suspensions liquides.14. Toutefois, ces méthodes ne conviennent généralement pas aux essais de composés solides tels que la poudre de plantes séchées ou à quantifier l’activité antifongique pendant la croissance du mycélium, car elles nécessitent une dilution des spores ou une propagation des spores sur les plaques d’agar et/ou une dilution des composés antifongiques.13. Dans la méthode empoisonnée par la nourriture, les plaques d’agar contenant l’agent antifongique sont inoculées avec un disque de 5-7 mm de diamètre échantillonné à partir d’une culture de champignons de 7 jours sans tenir compte de la quantité précise de mycélium de départ. Après incubation, l’activité antifongique est déterminée comme un pourcentage d’inhibition de la croissance radiale17,18,19. Avec cette approche, nous pouvons évaluer l’activité antifongique sur la croissance mycéliale. En revanche, la méthode de dilution de l’agar est effectuée pour déterminer l’activité antifongique sur les spores directement inoculées à la surface de la plaque d’agar contenant les composés antifongiques13,20,21. Ces deux approches donnent des résultats complémentaires sur l’activité antifongique. Toutefois, il s’agit de deux techniques indépendantes utilisées en parallèle qui ne permettent pas de comparer côte à côte avec précision l’efficacité relative des composés antifongiques sur les spores et le mycélium.17,20,22 comme la quantité de matériel fongique de départ diffère dans les deux approches. En outre, l’activité antifongique d’un produit dérivé des plantes résulte souvent de la combinaison de molécules antifongiques synthétisées par les plantes pour faire face à des agents pathogènes. Ces molécules englobent les protéines, les peptides23,24, et les métabolites ayant une grande diversité chimique et appartenant à différentes classes de molécules telles que les polyphénols, terpènes, alcaloïdes25, glucosinolates8, et les composés organosulfurés26. Certaines de ces molécules sont volatiles ou deviennent volatiles lors d’une attaque d’agents pathogènes27. Ces agents sont le plus souvent des composés solubles dans l’eau et à haute pression de vapeur qui doivent être récupérés par distillation de l’eau sous forme d’huiles essentielles, dont certaines activités antimicrobiennes ont été bien établies.28. Des essais de susceptibilité 2métras par phase de vapeur ont été mis au point pour mesurer l’activité antimicrobienne des composés volatils après l’évaporation et la migration par la phase de vapeur29. Ces méthodes sont basées sur l’introduction de composés antifongiques à distance de la culture microbienne29,30,31,32,33. Dans l’analyse couramment utilisée de l’agar en phase de vapeur, les huiles essentielles sont déposées sur un disque de papier et placées au centre de la couverture de la boîte de Pétri à distance de la suspension bactérienne ou fongique des spores, qui se propage sur le milieu de l’agar. Le diamètre de la zone d’inhibition de croissance est ensuite mesuré de la même manière que pour la méthode de diffusion du disque d’agar20,24. D’autres approches ont été développées pour fournir une mesure quantitative de la susceptibilité antifongique de phase de vapeur des huiles essentielles, dérivée de la méthode de dilution du bouillon à partir de laquelle une activité antimicrobienne ment mentée en phase de vapeur inhibitrice a été calculée32, ou dérivé d’analyses de diffusion de disque d’agar31. Ces méthodes sont généralement spécifiques aux études d’activité en phase de vapeur et ne conviennent pas aux essais d’inhibition de contact. Cela empêche la détermination de la contribution relative d’agents volatils et non volatils à l’activité antifongique d’un mélange bioactif complexe.
La méthode quantitative que nous avons développée vise à mesurer l’effet antifongique de la poudre de plantes séchées sur des quantités contrôlées de spores et de mycélium cultivé déposé à la surface d’un milieu d’agar pour reproduire la croissance aérienne des phytopathogènes lors de l’infectiondes plantes 15 ainsi qu’un réseau mycélial interconnecté16. L’approche est une configuration expérimentale modifiée basée sur la dilution de l’agar et les méthodes empoisonnées par les aliments qui permet également, dans la même configuration expérimentale, la quantification côte à côte de la contribution des métabolites antifongiques volatils et non volatils. Dans cette étude, la méthode a été comparée à l’activité de trois préparations antifongiques bien caractérisées.
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Protocol
1. Préparation d’Inocula
- Avant l’expérience, 5 μL de Trichoderma spp. Spores de SBT10-2018 stockées à 4 °C sur le milieu de l’agar dextrose de pomme de terre (PDA) et incuber pendant 4 jours à 30 °C avec exposition régulière à la lumière pour favoriser la formation de conidies42 (figure 1, panneau A).
NOTE: Trichoderma spp. Le SBT10-2018 a été isolé du bois et est utilisé comme modèle dans cette étude pour sa croissance rapide et sa facilité de récupération des spores. Cette souche est conservée par notre laboratoire. - Récupérer conidia (Figure 1, panneau A)
- 3 mL de 0,05% de Tween-20 sur le mycélium trichoderma.
- Utilisez un râteau pour libérer les conidies des conidiophores; éviter de presser sur le mycélium pour éviter que les hyphes ne soient arrachés.
- Récupérez rapidement la solution avec une micropipette pour éviter qu’elle ne soit absorbée par le milieu de l’agar et transfert dans un tube de 15 mL.
- Comptez le nombre total de spores à l’aide d’un hémocytomètre et préparez une solution contenant 3 x10 6 spores/mL.
REMARQUE : Cette étape doit être effectuée avec soin pour éviter l’extraction des hyphes. La préparation des spores est ensuite vérifiée au microscope. Finalement, pour les souches présentant du mycélium hautement aérien et moelleux, une étape de filtration utilisant un filtre de passoire de 40 μM peut être ajoutée pour éliminer le fragment résiduel de mycélium.
2. Préparation des plaques fongiques( Figure 1, panneau B)
- Déposer 100 μL de 3 x 106 spores/mL avec une micropipette sur une boîte de Pétri de 9 cm de diamètre contenant du milieu PDA pour obtenir 4 800 spores/cm2 correspondant à une prise de 925 spores/5 mm de diamètre-agar.
- Ajouter 10 g de perles de verre de 2 mm de diamètre à l’aide d’une spatule stérile et effectuer des mouvements vers l’avant et vers l’arrière parallèles et perpendiculaires au bras de l’opérateur pour répartir uniformément les spores à la surface de l’agar.
- Faire pivoter la plaque de 90° et répéter les mouvements rotatifs (comme dans la section 2.2); répéter ces étapes jusqu’à ce que la plaque ait été complètement tournée.
- Utilisez immédiatement la plaque pour mettre en place des expériences nécessitant des spores ou incuber les plaques à 30 °C pendant 17 h ou 24 h lorsque l’hyphae précoce ou le mycélium, respectivement, sont nécessaires.
REMARQUE : Pour comparer l’activité antifongique mesurée après le transfert de bouchon de mycélium et le transfert de disque de mycélium, utilisez des pinces stériles et placez les disques stériles de cellulose de 5 mm au hasard sur la surface de la plaque d’agar après la propagation des spores.
3. Préparation des composés antifongiques
- Préparation de produits dérivés des plantes : préparation à l’ail en poudre
- Peler les gousses d’ail frais et couper les clous de girofle en tranches de 2 à 3 mm de large à l’aide d’une lame de scalpel.
- Sécher à l’air les tranches pendant 2 jours à 40 °C.
- Moudre les tranches pendant 3 x 15 secondes à l’aide d’un moulin à couteaux pour obtenir une poudre fine.
- Conserver la poudre d’ail à 4 °C dans des tubes de 50 mL avant utilisation.
REMARQUE : Comme l’ail n’est pas autoclavé (pour empêcher la dégradation des composés antifongiques sensibles à la température), nettoyez le broyeur, le scalpel et le séchoir à air avec 70 % d’éthanol avant utilisation.
- Préparation d’huile essentielle
- Préparez 0,5%, 1%, 2,5%, 5% et 20% thymus vulgaris solutions d’huile essentielle en 0,5% Tween-80.
- Bien mélanger pour former une émulsion avant de l’ajouter dans le milieu PDA (voir la section 4.2).
- Préparation carbendazim
- Pesez le carbendazim pour préparer une solution d’éthanol de 200 mg/L (le carbendazim est mal soluble dans l’eau).
- Conservez la solution à température ambiante avant de l’ajouter au milieu PDA (voir la section 4.2).
MISE EN GARDE : Carbendazim présente un danger pour la santé et l’environnement. Portez des gants et un masque lors de la manipulation de ce produit. Rangez-le dans un espace ventilé.
4. Test d’inhibition de contact
- Préparation d’assiettes d’agar contenant de la poudre d’ail
- Préparer et autoclave PDA moyen.
- Peser la quantité désirée de poudre d’ail dans un tube de 50 mL à l’aide d’une spatule stérile, pour obtenir des concentrations généralement allant de 0,25 mg/mL à 16 mg/mL.
- Ajouter 10 mL de PDA après avoir vérifié la température du milieu à l’intérieur du poignet. La température doit être aussi basse que possible pour empêcher la dégradation des molécules sensibles. Idéalement, cette température devrait être de 45 °C.
- Homogénéisez soigneusement en retournant le tube à l’envers pour répartir uniformément la poudre dans le milieu PDA. Verser rapidement 10 mL dans une boîte de Pétri de 5 cm de diamètre(figure 1,panneau C).
- Avec la boîte de Pétri placée à température ambiante, attendez que l’agar se solidifie.
- Préparation de plaques d’agar contenant de l’huile essentielle ou du carbendazim
- Introduire 10 mL de PDA dans un tube de 50 mL. Vérifiez la température comme pour la section 4.1.3.
- Ajouter 100 μL des différentes solutions d’huile essentielle thymus vulgaris en PDA pour obtenir 0,005%, 0,01%, 0,025%, 0,05% et 0,2% de solutions (voir section 3.2.1).
- Ajoutez le volume requis de carbendazim de la solution 200 mg/L pour obtenir des solutions allant de 0,0625-2 mg/L (voir la section 3.3.1).
- Homogénéisez soigneusement en retournant le tube à l’envers, versez rapidement 10 mL dans une boîte de Pétri de 5 cm dediamètre (figure 1,panneau C).
- Avec la boîte de Pétri placée à température ambiante, attendez que l’agar se solidifie.
- Test d’inhibition de contact (Figure 1)
- Avec un tube stérile en acier inoxydable de 5 mm de diamètre, tracez un cercle au centre des boîtes de Petri contenant soit PDA ou PDA, y compris les composés antifongiques. Disposer du cylindre d’agar à l’aide d’un cure-dent stérile (panneau C).
- Avec un tube stérile en acier inoxydable de 5 mm de diamètre, l’intrigue tourne au hasard dans les plaques fongiques de la section 2. Parcelle entre 15-20 cercles par plaque (panneau B).
- Retirez soigneusement les cylindres d’agar recouverts de spores, d’hyphes précoces ou de mycélium avec un cure-dent stérile et placez les bouchons dans l’espace vide des plats de Petri contenant soit pda ou PDA, y compris les composés antifongiques (panneau C).
- Incuber les plaques contenant des spores pendant 48 h à 30 °C, 31 h pour les plaques contenant des hyphes précoces et 24 h pour les plaques recouvertes de mycélium (panneau C).
- Mesurer le diamètre de la croissance radiale et calculer le pourcentage d’inhibition de la croissance fongique sur le contrôle à l’aide de la formule (panneau D)
% d’inhibition de la croissance fongique = (C - A/C)* 100
où C est le diamètre de la croissance radiale dans le milieu PDA et A le diamètre de la croissance radiale dans le milieu PDA contenant les composés antifongiques.
REMARQUE : Pour comparer l’activité antifongique mesurée après le transfert de bouchon de mycélium et le transfert de disque de mycélium, à l’aide de pinces stériles, transférez un disque de 5 mm de diamètre précédemment déposé à la surface des plaques fongiques (note de section 2) au centre des boîtes de Pétri contenant des composés antifongiques et procédez exactement comme pour le transfert de bouchon d’agar
5. Essai d’inhibition de phase de vapeur
- Préparation d’assiettes d’agar contenant de la poudre d’ail
- Procéder comme à l’article 3.1.
- Préparation d’une plaque d’agar contenant de l’huile essentielle ou du carbendazim
- Procéder comme aux sections 3.2 et 3.3.
- Préparation de plaques fongiques
- Procéder comme à la section 2.
- Test d’inhibition antifongique de phase de vapeur (Figure 1)
- Verser 10 mL de milieu PDA dans le couvercle des boîtes De Petri de 5 cm de diamètre contenant 10 mL de PDA moyen ou 10 mL de milieu PDA contenant des composés antifongiques dans le fond de la vaisselle. Attendez la solidification complète de l’agar à température ambiante (panneau C).
- Utilisez un tube centrifuge de 50 mL comme outil d’étalonnage pour obtenir un cercle de PDA au centre du couvercle; retirer le PDA autour du cercle à l’aide d’une spatule stérile (panneau C).
- Tracez un cercle au centre du milieu PDA placé dans le couvercle avec un tube stérile en acier inoxydable de 5 mm de diamètre. Jeter le cylindre d’agar à l’aide d’un cure-dent stérile (panneau C).
- Formez des bouchons avec un tube stérile en acier inoxydable de 5 mm de diamètre au hasard dans les plaques fongiques comme dans la section 4.3.2 (panneau B).
- À l’aide d’un cure-dent stérile, transférez soigneusement les bouchons recouverts de spores, d’hyphes précoces ou de mycélium provenant de plaques fongiques dans les couvercles des plaques d’analyse (panneau C).
- Incuber à 30 °C comme à la section 4.3.4 (panneau C).
- Mesurer le diamètre de la croissance radiale et calculer le pourcentage d’inhibition de la croissance fongique à l’aide de la formule dans la section 4.3.5 (panneau D).
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Representative Results
Pour évaluer la capacité de la méthode quantitative à discriminer le mode d’action de différents types de composés antifongiques, nous avons comparé l’efficacité de trois agents antifongiques bien connus. Carbendazim est un fongicide synthétique non volatil qui a été largement utilisé pour contrôler un large éventail de maladies fongiques chez les plantes39,40. Thymus vulgaris huile essentielle a été largement décrit pour son activité antibactérienne et antifongique et est utilisé comme agent de conservation des aliments naturels41. La poudre d’ail a été choisie comme modèle d’un bioproduit dérivé des plantes. Il a été traditionnellement utilisé comme remède naturel avec des activités antimicrobiennes qui ont été largement attribuées à la présence de composés organosulfuraux volatils, mais aussi à la présence de saponines non volatiles et de composés phénoliques26, donnant à ce modèle une complexité pertinente dans cette étude.
Cette méthode quantitative repose sur le transfert de bouchons d’agar contenant des quantités contrôlées de champignons à différents stades de développement, des spores au mycélium, tandis que dans la méthode empoisonnée par les aliments, le mycélium de 5 jours à 7 jours est transféré des disques de cellulose13. Dans l’analyse, les spores, les hyphes précoces (incubation de 17 h) et le mycélium (incubation de 24 h) ont été utilisés comme matériau fongique de départ. L’utilisation du transfert de disque pourrait ne pas être pertinente car les conidies ou les hyphes résiduels demeurent au moins partiellement sur le milieu de l’agar après le transfert du disque, ce qui entraîne par la suite une mesure inexacte de l’inhibition de la croissance, comme l’illustre la figure 2. Différents diamètres de croissance fongique-radiale ont été observés après le transfert de zones d’agar situées sous des disques de cellulose suivies d’une incubation de 24 h(figure 2,panneaux A, B et C) soulignant la présence d’hyphes fongiques résiduels sur l’agar après transfert de disque. La quantification des hyphes résiduels a été confirmée par la mesure de la croissance conduisant à une variabilité de diamètre allant jusqu’à 22 %(figure 2, panneau D). L’effet sur l’inhibition de croissance a ensuite été évalué à l’aide de l’huile essentielle thymus vulgaris comme composé antifongique et comparé à l’inhibition obtenue après le transfert de bouchon d’agar(figure 2, panneau E). L’inhibition de croissance après transfert de disque était plus élevée qu’après transfert d’agar-plug pour de faibles concentrations d’huile de Thymus, menant à une surestimation de l’effet inhibiteur, qui pourrait être due au transfert incomplet du matériel fongique et soutenir l’approche basée sur le transfert d’agar-plug.
Trichoderma spp. L’inhibition de croissance du TAS10-2018 déclenchée par les trois composés antifongiques a ensuite été évaluée à l’aide des essais d’inhibition de phase de contact et de vapeur pour chaque stade fongique (figure 3). Les spores ont été soigneusement répandues sur les plaques d’agar pour obtenir 4 800 spores/cm2. Ils ont été directement transférés dans des plaques d’agar contenant des composés antifongiques par extraction de bouchons d’agar à l’aide d’un tube stérile en acier inoxydable de 5 mm, permettant à l’expérience de partir des spores. Pour les deux autres stades de développement, les plaques d’agar recouvertes de spores ont d’abord été incubées pendant 17 h ou 24 h à 30 °C avant de transférer la fiche d’agar pour permettre la germination et le développement précoce de l’hyphe (17 h) et de la formation de mycélium (24 h) (figure 3, panneau A). Pour quantifier la contribution des molécules volatiles actives à l’activité antifongique globale, l’essai d’inhibition de contact a été adapté et des spores, des hyphes tôt, et le mycélium ont été placés à une distance des composés antifongiques versés dans le milieu de PDA comme pour l’essai de contact-inhibition. La croissance trichoderma-radialea été mesurée sur 48 heures et le pourcentage d’inhibition a été déterminé par rapport aux conditions de contrôle. La concentration minimale inhibitrice (MIC) a été définie comme la plus faible concentration de composés antifongiques empêchant la croissance visible après 48 h d’incubation à 30 °C.
La figure 3(panneau B) montre une sensibilité plus élevée des spores au carbendazim par rapport aux réseaux précoces d’hyphe et de mycélium avec 50 %, 22 % et 30 % d’inhibition de croissance respectivement à 0,25 μg/mL de carbendazim lorsque Trichoderma et les composés antifongiques étaient en contact. Parallèlement, une valeur mic de 0,5 μg/mL a été estimée sur la germination des spores alors qu’une augmentation à 0,75 μg/mL a été obtenue lors de l’allongement précoce des hyphes et du mycélium. En revanche, le carbendazim n’a eu aucun effet antifongique sur Trichoderma quand le champignon a été placé à distance du fongicide conformément à la faible volatilité de cette substance. Les résultats que nous avons obtenus en utilisant l’huile essentielle thymus vulgaris (TEO) comme composé antifongique (Figure 3, panneau C) ont montré une sensibilité plus élevée spore à TEO par rapport à l’hyphae précoce et le mycélium avec 65% et environ 50% d’inhibition de croissance à 0,01% TEO respectivement. Les valeurs mic obtenues étaient similaires pour la germination des spores et l’allongement précoce des hyphes (0,025 % TEO) et plus élevées pour la croissance du mycélium (0,05 % TEO). Comme prévu, thymus vulgaris huile essentielle présentait une activité antifongique identique indépendamment de la distance beTween le champignon et l’huile. Des valeurs mic similaires (0,025 % TEO) ont été obtenues sur la germination des spores et l’allongement précoce des hyphes pour les essais de contact et de phase de vapeur, bien qu’au pourcentage inférieur une sensibilité plus élevée ait été observée lorsque les spores teo et trichoderma étaient en contact (inhibition de croissance de 60 % au contact contre inhibition de croissance de 45 % à distance). Étonnamment, les valeurs mic obtenues sur le mycélium étaient différentes dans les essais d’inhibition de phase de contact et de vapeur (0,05% contre 0,1%) suggérant qu’une partie des molécules volatiles n’est pas active contre un mycélium bien développé. Enfin, lors de l’utilisation de la poudre d’ail comme composé antifongique (figure 3, panneau D), une efficacité plus élevée a été observée contre la germination des spores (inhibition de croissance de 50 % à 0,25 mg/mL de poudre d’ail et valeur MIC de 0,5 mg/mL) et l’allongement précoce de l’hyphe (1 Inhibition de croissance de 59 % à 0,25 mg/mL et valeur MIC de 0,5 mg/mL) que pour la croissance du mycélium (inhibition de croissance de 29 % à 0,5 mg/mL de poudre d’ail et valeur MIC de 0,75 mg/mL). Lorsque les essais de phase de contact et de vapeur ont été comparés, les résultats ont montré une diminution significative de l’activité antifongique à distance indépendamment du stade de développement du champignon. Les valeurs mic sont passée de 0,5 mg/mL à 1 mg/mL pour la germination des spores, de 0,5 mg/mL à 2 mg/mL pour l’allongement précoce de l’hyphae, et de 0,75 mg/mL à 4 mg/mL pour la croissance du mycélium(figure 3,panneau D et figure 4 pour les images représentatives). Ainsi, ces résultats suggèrent que la poudre d’ail contient un mélange de composés volatils et non volatils ayant des propriétés antifongiques.
Dans l’ensemble, ces résultats montrent que la contribution relative des agents volatils et non volatils contenus dans les produits dérivés des plantes peut être déterminée à différents stades de croissance fongique, car les conditions expérimentales sont comparables. Cette approche est alors particulièrement bien adaptée pour les mélanges complexes de composés antifongiques. Thymus vulgaris huile essentielle est un mélange de composés volatils et montre une activité similaire à distance et en contact pour la germination des spores et l’allongement précoce de l’hyphae, soutenant la comparaison de cette phase de vapeur et de contact-inhibition analyse et soulignant que la migration dans la phase de vapeur n’est pas altérée par la coulée dans le milieu de l’agar. Les résultats soulignent également que la poudre d’ail utilisée comme modèle dans cette étude contient des composants actifs non volatils qui ont une contribution significative dans l’activité antifongique globale et qui ont été négligés au profit de thiosulfinates volatils dérivés de l’allium27,28.
Figure 1: Schéma synoptique du protocole pour les analyses de contact et de phase de vapeur Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Inexactitude associée autransfert fongique du disque de cellulose. A. Schéma représentant le transfert de disque sur des plaques d’agar couvertes de spores et transfert de disque à la surface sur des plaques d’agar contenant des composés antifongiques B. Schéma représentant le transfert d’agar des zones sous les disques de cellulose suivie de l’incubation et de la mesure de la croissance résiduelle. C. C. Image représentative de la croissance radiale du transfert résiduel de mycéliumafter des secteurs sous des disques de cellulose. D. D. Mesure radiale de croissance du mycélium résiduel. E. E. Effet de thymus vulgaris huile essentielle sur la croissance du mycélium transféré à partir du disque de cellulose ou agar-plug (N =2, moyenne ± SD) S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Comparaison des activités antifongiques à l’aide de la phase de vapeur et des essais d’inhibition de contact sur les spores, les hyphes précoces et le mycélium. R. Photos représentatives des spores de Trichoderma, des hyphes précoces (croissance de 17 h) et du mycélium (croissance de 24 h). Inhibition de croissance de Trichoderma par carbendazim (B), huile essentielle de Thymus vulgaris (C) et poudre d’ail (D). (N=2, moyenne ± SD) S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Photos représentatives de l’activité antifongique de l’ail sur les plaques d’agar dans les analyses d’inhibition de phase de contact (A) ou de vapeur (B)Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cechiffre.
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Discussion
L’approche présentée ici permet d’évaluer les propriétés antifongiques des produits dérivés de plantes peu transformés. Dans ce protocole, la distribution homogène des spores à la surface de l’agar est obtenue à l’aide de perles de verre de 2 mm. Cette étape nécessite des compétences de manipulation pour distribuer correctement les perles et d’obtenir des résultats reproductibles, permettant finalement la comparaison des effets antifongiques à différents stades de la croissance fongique. Nous avons constaté que les perles de verre de 5 mm ou la rotation excessive tout en homogénéisant pendant la diffusion peuvent causer le diamètre variable de croissance. Par conséquent, nous recommandons une formation pour maîtriser la distribution des spores avant l’expérimentation. En outre, lorsque des poudres végétales doivent être testées, il faut prêter attention à la dispersion homogène du produit dans le milieu de l’agar. Pour éviter que la poudre ne s’installe au fond de la plaque, le produit doit être mélangé en milieu d’agar lorsque la température du milieu fondu atteint 45 °C (lorsque la température ambiante est de 24 °C). Cette température doit être ajustée en fonction de la température ambiante locale pour éviter la sédimentation.
Bien que la méthode que nous décrivons ici peut fournir des informations précieuses, quelques inconvénients doivent être pris en considération. Cette méthode permet des comparaisons précises et côte à côte dans une seule configuration expérimentale au détriment d’une quantité importante de temps de préparation car le nombre de plaques d’agar à préparer peut être considérable en fonction des questions auxquelles il faut répondre. En outre, cet essai est un essai à moyenne échelle conçu pour les plats petri de 5 cm. Par conséquent, la quantité de substances actives nécessaires pour tester tous les aspects peut être importante. Cela signifie que les substances rares peuvent ne pas convenir aux candidats à ce protocole. Une réduction de l’analyse peut être envisagée en utilisant de plus petites boîtes de Pétri et en réduisant la taille des bouchons. Cela pourrait être testé en utilisant le protocole d’analyse comparative décrit ici avec une attention particulière à l’extraction de bouchon d’agar, ce qui pourrait être difficile. La précision des mesures de croissance radiale pourrait être réduite à cette plus petite échelle.
Les méthodes actuelles sont appropriées pour mesurer l’activité antifongique des composés en solution et moins applicables à l’étude des poudres13. L’approche que nous avons établie est bien adaptée pour les composés liquides et solides, ce qui permet d’évaluer les propriétés antifongiques des produits dérivés des plantes peu transformés. Cela réduit le temps nécessaire pour tester les extraits et réduit les pièges liés aux substances actives affichant une faible solubilité. Comme certains produits dérivés des plantes contiennent des molécules actives sensibles àla température élevée 43,cela offre l’avantage de limiter le risque de perte d’activité de ces composés. Cette approche a été adaptée de la méthode de diffusion de l’agar et de la méthodeempoisonnée par les aliments 15,16,17,18,19 pourpermettre en outre la comparaison directe des activités antifongiques sur différents stades de croissance fongique en utilisant des paramètres expérimentaux similaires. Le transfert de bouchon d’agar permet un contrôle précis des quantités de micro-organismes dans l’analyse. Il s’agit d’un avantage par rapport au transfert de disque, ce qui conduit à une surestimation des effets antifongiques associés à un transfert incomplet de spores ou d’hyphes. Enfin, alors que les essais en phase vapeur ne sont généralement pas appliqués aux analyses d’inhibition de contact27,28,29,30,31, la méthode que nous proposons traite des contributions relatives des agents volatils et non volatils contenus dans des mélanges complexes tels que les poudres végétales ou des extraits et permet finalement l’évaluation des activités antifongiques à différents stades de croissance fongique.
L’approche que nous décrivons ici pourrait être particulièrement pertinente pour appuyer la nécessité de méthodes qui évaluent les propriétés antifongiques dans les produits dérivés des plantes pour la lutte biologique. La méthode quantitative que nous proposons permet aux opérateurs de déterminer les contributions respectives de composés volatils et non volatils à l’activité antifongique d’un mélange bioactif complexe. Cela fournit des informations précieuses qui peuvent guider le choix des modes d’application pour le traitement et la pertinence de l’extraction liquide. Applications qui pourraient être considérées à distance du phytopathogène ciblé (par exemple, l’inclusion du produit de lutte biologique dans un emballage) ou qui pourraient avoir besoin d’un contact direct pour optimiser l’efficacité du produit de lutte biologique (nébulisation sur les plantes ou trempage des fruits dans une solution de produit de lutte biologique). Il permet également de comparer l’efficacité antifongique à différents stades de croissance fongique, de la germination des spores à la croissance ultérieure du mycélium, ce qui conduit à la définition de recommandations pour établir les seuils de contrôle nécessaires à l’application de produits de lutte biologique aux cultures. En effet, la définition de l’efficacité des substances à différents stades fongiques peut aider à catégoriser si les substances peuvent être utilisées comme traitements préventifs ou curatifs et à planifier le calendrier des traitements végétaux avec des produits de lutte biologique. Ceci est essentiel pour tirer parti de l’efficacité des produits lorsqu’ils sont utilisés sur le terrain ou après la récolte.
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Disclosures
aucun
Acknowledgments
Nous sommes très reconnaissants à Frank Yates pour ses précieux conseils. Ce travail a été soutenu par Sup’Biotech.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave-vacuclav 24B+ | Melag | ||
| Carbendazim | Sigma | 378674-100G | |
| Distilled water | |||
| Eppendorf tubes | Sarstedt | 72.706 | 1.5 mL |
| Falcons tubes | Sarstedt | 547254 | 50 mL |
| Five millimeters diameter stainless steel tube | retail store | / | |
| Food dehydrator | Sancusto | six trays | |
| Garlic powder | Organic shop | ||
| Glass beads | CLOUP | 65020 |  2 mm |
| Hemocytometer counting cell | Jeulin | 713442 | / |
| Incubator | Memmert | UM400 | 30 °C |
| Knife mill | Bosch | TSM6A013B | |
| Manual cell counter | Labbox | HCNT-001-001 | / |
| Measuring ruler | retail store | ||
| Microbiological safety cabinets | FASTER | FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2 | |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014407 | 100 - 1000 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014411 | 20 - 200 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014412 | 2 - 20 µL |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1194500 | 55 mm |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1473 | 90 mm |
| Pipette Controllers-EASY 60 | Labbox | EASY-P60-001 | / |
| Potato Dextrose Agar | Sigma | 70139-500G | |
| Precision scale-RADWAG | Grosseron | B126698 | AS220.R2-ML 220g/0.1mg |
| Rake | Sarstedt | 86-1569001 | / |
| Reverse microscope AE31E trinocular | Grosseron | M097917 | / |
| Sterile graduated pipette | Sarstedt | 1254001 | 10 mL |
| Thymus essential oil | Drugstore | Essential oil 100% | |
| Tips 1000 µL | Sarstedt | 70.762010 | |
| Tips 20 µL | Sarstedt | 70.760012 | |
| Tips 200 µL | Sarstedt | 70.760002 | |
| Tooth pick | retail store | ||
| Trichoderma spp strain | Strain of LRPIA laboratory | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379-250ML | |
| Tween-80 | Sigma | P1754-1L | |
| Tweezers | Labbox | FORS-001-002 | / |
References
- FAO. Global food losses and food waste - Extent, causes and prevention. FAO. , Rome. (2011).
- da Cruz Cabral, L., Fernández Pinto, V., Patriarca, A. Application of plant compounds to control fungal spoilage and mycotoxin production in foods. International Journal of Food Microbiology. 166 (1), 1-14 (2013).
- Romanazzi, G., Smilanick, J. L., Feliziani, E., Droby, S. Postharvest biology and technology integrated management of postharvest gray mold on fruit crops. Postharvest Biology and Technology. 113, (2016).
- Morton, V., Staub, T.
- Brandhorst, T. T., Klein, B. S. Uncertainty surrounding the mechanism and safety of the post- harvest fungicide Fludioxonil. Food and Chemical Toxicology. 123, 561-565 (2019).
- Bénit, P., et al. Evolutionarily conserved susceptibility of the mitochondrial respiratory chain to SDHI pesticides and its consequence on the impact of SDHIs on human cultured cells. PLoS ONE. 14 (11), 1-20 (2019).
- Usall, J., Torres, R., Teixidó, N. Biological control of postharvest diseases on fruit: a suitable alternative. Current Opinion in Food Science. 11, 51-55 (2016).
- Tripathi, P., Dubey, N. K. Exploitation of natural products as an alternative strategy to control postharvest fungal rotting of fruit and vegetables. Postharvest Biology and Technology. 32 (3), 235-245 (2004).
- Abbey, J. A., et al. Biofungicides as alternative to synthetic fungicide control of grey mould (Botrytis cinerea)-prospects and challenges. Biocontrol Science and Technology. 29 (3), 241-262 (2019).
- Soylu, E. M., Kurt, Ş, Soylu, S. In vitro and in vivo antifungal activities of the essential oils of various plants against tomato grey mould disease agent Botrytis cinerea. International Journal of Food Microbiology. 143 (3), 183-189 (2010).
- Liu, S., Shao, X., Wei, Y., Li, Y., Xu, F., Wang, H. Solidago canadensis L. essential oil vapor effectively inhibits botrytis cinerea growth and preserves postharvest quality of strawberry as a food model system. Frontiers in Microbiology. 7, 0-9 (2016).
- El-Mogy, M. M., Alsanius, B. W. Cassia oil for controlling plant and human pathogens on fresh strawberries. Food Control. 28 (1), 157-162 (2012).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Arikan, S. Current status of antifungal susceptibility testing methods. Medical Mycology. 45 (7), 569-587 (2007).
- Girmay, Z., Gorems, W., Birhanu, G., Zewdie, S. Growth and yield performance of Pleurotus ostreatus (Jacq. Fr.) Kumm (oyster mushroom) on different substrates. AMB Express. 6 (1), 87 (2016).
- Fischer, M. S., Glass, N. L. Communicate and fuse: how filamentous fungi establish and maintain an interconnected mycelial network. Frontiers in Microbiology. 10, 1-20 (2019).
- Mohana, D. C., Raveesha, K. A. Anti-fungal evaluation of some plant extracts against some plant pathogenic field and storage fungi. Journal of Agricultural Technology. 4 (1), 119-137 (2007).
- Balamurugan, S. In vitro activity of aurantifolia plant extracts against phytopathogenic fungi phaseolina. International Letters of Natural Sciences. 13, 70-74 (2014).
- Ameziane, N., et al. Antifungal activity of Moroccan plants against citrus fruit pathogens. Agronomy for sustainable development. 27 (3), 273-277 (2007).
- Rizi, K., Murdan, S., Danquah, C. A., Faull, J., Bhakta, S. Development of a rapid, reliable and quantitative method - "SPOTi" for testing antifungal efficacy. Journal of Microbiological Methods. 117, 36-40 (2015).
- Imhof, A., Balajee, S. A., Marr, K., Marr, K. New methods to assess susceptibilities of Aspergillus isolates to caspofungin. Microbiology. 41 (12), 5683-5688 (2003).
- Goussous, S. J., Abu el-Samen, F. M., Tahhan, R. A. Antifungal activity of several medicinal plants extracts against the early blight pathogen (Alternaria solani). Archives of Phytopathology and Plant Protection. 43 (17), 1745-1757 (2010).
- Ng, T. B. Antifungal proteins and peptides of leguminous and non-leguminous origins. Peptides. 25 (7), 1215-1222 (2004).
- Hu, Z., Zhang, H., Shi, K. Plant peptides in plant defense responses. Plant Signaling and Behavior. 13 (8), (2018).
- Iriti, M., Faoro, F. Chemical diversity and defence metabolism: How plants cope with pathogens and ozone pollution. International Journal of Molecular Sciences. 10 (8), 3371-3399 (2009).
- Lanzotti, V., Bonanomi, G., Scala, F. What makes Allium species effective against pathogenic microbes. Phytochemistry Reviews. 12 (4), 751-772 (2013).
- Kyung, K. H.
- Hyldgaard, M., Mygind, T., Meyer, R. L. Essential oils in food preservation: mode of action, synergies, and interactions with food matrix components. Frontiers in microbiology. 3, 12 (2012).
- Bueno, J. Models of evaluation of antimicrobial activity of essential oils in vapour phase: a promising use in healthcare decontamination. Natural Volatiles & Essential Oils. 2 (2), 16-29 (2015).
- Doi, N. M., Sae-Eaw, A., Suppakul, P., Chompreeda, P. Assessment of synergistic effects on antimicrobial activity in vapour- and liquidphase of cinnamon and oregano essential oils against Staphylococcus aureus. International Food Research Journal. 26 (2), 459-467 (2019).
- Amat, S., Baines, D., Alexander, T. W. A vapour phase assay for evaluating the antimicrobial activities of essential oils against bovine respiratory bacterial pathogens. Letters in Applied Microbiology. 65 (6), 489-495 (2017).
- Feyaerts, A. F., et al. Essential oils and their components are a class of antifungals with potent vapour-phase-mediated anti-Candida activity. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Wang, T. H., Hsia, S. M., Wu, C. H., Ko, S. Y., Chen, M. Y., Shih, Y. H., Shieh, T. M., Chuang, L. C. Evaluation of the antibacterial potential of liquid and vapor phase phenolic essential oil compounds against oral microorganisms. PLoS ONE. 11 (9), 1-17 (2016).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Leadbeater, A. Recent developments and challenges in chemical disease control. Plant Protection Science. 51 (4), 163-169 (2015).
- Jin, C., Zeng, Z., Fu, Z., Jin, Y. Oral imazalil exposure induces gut microbiota dysbiosis and colonic inflammation in mice. Chemosphere. 160, 349-358 (2016).
- Kumar, R., Ghatak, A., Balodi, R., Bhagat, A. P. Decay mechanism of postharvest pathogens and their management using non-chemical and biological approaches. Journal of Postharvest Technology. 6 (1), 1-11 (2018).
- Talibi, I., Boubaker, H., Boudyach, E. H., Ait Ben Aoumar, A. Alternative methods for the control of postharvest citrus diseases. Journal of Applied Microbiology. 117 (1), 1-17 (2014).
- Arya, R., Sharma, R., Malhotra, M., Kumar, V., Sharma, A. K. Biodegradation Aspects of Carbendazim and Sulfosulfuron: Trends, Scope and Relevance. Current Medicinal Chemistry. 22 (9), 1147-1155 (2015).
- European Food Safety Authority. Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance carbendazim. EFSA Journal. 8 (5), 1-76 (2010).
- Sakkas, H., Papadopoulou, C. Antimicrobial activity of basil, oregano, and thyme essential oils. Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (3), 429-438 (2017).
- Steyaert, J. M., Weld, R. J., Mendoza-Mendoza, A., Stewart, A. Reproduction without sex: conidiation in the filamentous fungus Trichoderma. Microbiology. 156, Reading, England. Pt 10 2887-2900 (2010).
- Leontiev, R., Hohaus, N., Jacob, C., Gruhlke, M. C. H., Slusarenko, A. J. A Comparison of the antibacterial and antifungal activities of thiosulfinate analogues of allicin. Scientific Reports. 8 (1), 1-19 (2018).
- Scorzoni, L., et al. The use of standard methodology for determination of antifungal activity of natural products against medical yeasts Candida sp and Cryptococcus sp. Brazilian Journal of Microbiology. 38 (3), 391-397 (2007).
