Summary
אנו מתארים שיטה מבוססת אגר שונה שנועדה לכמת את ההשפעות האנטי פטרייתיות של מוצרים שמקורם בצמחים. ניתן להעריך הן תרומות תנודתיות והן תרומות לא תנודתיות לפעילות האנטי-פטרייתית באמצעות פרוטוקול זה. בנוסף, ניתן למדוד את היעילות נגד פטריות בשלבים התפתחותיים מרכזיים במערך ניסיוני יחיד.
Abstract
הפרוטוקול המתואר מבוסס על טכניקת העברת פלאג המאפשרת קביעה מדויקת של כמויות מיקרואורגניזם ושלבי ההתפתחות שלהם. מספר מסוים של נבגים מפוזרים על צלחת אגר. צלחת אגר זו דגירה לתקופה מוגדרת כדי לאפשר לפטריות להגיע לשלב ההתפתחותי הצפוי, למעט נבגים שבהם אין צורך בדגירה. תקעי אגר המכוסים בנבגים, היפאי או מיסליום נסוגים ומועברים לאחר מכן למדיית אגר המכילה את התרכובת נגד פטריות להיבדק או ממוקמת במרחק מהפטריות או במגע. שיטה זו ישימה כדי לבדוק הן תמציות נוזלי ודגימות מוצקות (אבקות). היא מתאימה במיוחד לכימות התרומות היחסיות של סוכנים נדיפים ולא נדיפים בתערובות ביו-אקטיביות ולקביעת השפעותיהם, במיוחד על נבגים, היפה מוקדמת ומיסליום.
השיטה רלוונטית מאוד לאפיון הפעילות האנטי פטרייתית של מוצרי ביו-בקרה, בעיקר מוצרים שמקורם בצמחים. ואכן, לטיפול בצמחים, ניתן להשתמש בתוצאות כדי להנחות את הבחירה של מצב היישום ולהקים את סף ההדק.
Introduction
הפסדים גלובליים של פירות וירקות יכולים להגיע עד 50% מהייצור1 ונבעים בעיקר מריקבון מזון שנגרם על ידי קלקול פטריות בשדה או במהלך אחסון שלאחר הקציר2,3, למרות התעסוקה הנרחבת של קוטלי פטריות סינתטיים מאז אמצע המאה העשרים4. השימוש בחומרים אלה נשקל מחדש שכן הוא מייצג מפגעים סביבתיים ובריאותיים חמורים. כמו ההשלכות המזיקות של השימוש בהם מופיעים ברחבי מערכות אקולוגיות ועדויות של השפעות בריאותיות פוטנציאליות צברה5,6, חלופות הרומן אסטרטגיות מניעתיות ישנות מפותחים עבור טיפולים לפני ואחרי הקציר7,8,9. לפיכך האתגר העומד בפנינו הוא כפול. אסטרטגיות פטרייתיות חדשניות חייבות, ראשית, לשמור על רמות היעילות של הגנה על מזון מפני פיטופטוגנים ובוי-זמנית, שנית, לתרום לצמצום דרמטי של טביעת הרגל הסביבתית של שיטות חקלאיות. כדי להגשים מטרה שאפתנית זו, אסטרטגיות בהשראת ההגנות הטבעיות שהתפתחו בצמחים מוצעות כמו יותר מ 1000 מיני צמחים הודגשו עבור תכונות מיקרוביאלית שלהם8. לדוגמה, צמחים אשר פיתחו קוטלי פטריות טבעיים להילחם phytopathogens הם משאב חדשני לחקור את הפיתוח של מוצרים חדשים biocontrol2. שמנים אתריים הם מולקולות דגל מסוג זה. לדוגמה, שמן אתרי Origanum מגן על צמחי עגבניות מפני עובש אפור בחממות 10 ו Solidago canadensis L. ושמנים אתריים קאסיה הוכחו לשמר תותים שלאחר שנקטפו מנזק עובש אפור11,12. דוגמאות אלה ממחישות כי ביו-בקרה ובמיוחד מוצרים שמקורם בצמחים מייצגים פתרון המשלב יעילות ביולוגית וקיימות סביבתית.
לכן, צמחים הם משאב חשוב של מולקולות בעלות עניין פוטנציאלי לתעשיית הגנת היבול. עם זאת רק קומץ של מוצרים צמחיים הוצעו לשמש מוצרים biocontrol למרות שהם מוכרים בדרך כלל בטוח, לא פיטוטוקסי וידידותי לסביבה2. כמה קשיים טרנספוזיציה מהמעבדה לשדה נצפו, כגון יעילות פוחתת פעם להחיל vivo2,9. לכן, חשוב לשפר את היכולת של בדיקות מעבדה כדי לחזות טוב יותר את יעילות השדה. בהקשר זה, שיטות בדיקה נגד פטריות עבור מוצרים שמקורם בצמחים נחוצים הן כדי להעריך את היעילות שלהם נגד פטריות והן כדי להגדיר את התנאים האופטימליים שלהם לשימוש. באופן ספציפי, מוצרי ביו-בקרה הם בדרך כלל פחות יעילים מאשר קוטלי פטריות כימיים, ולכן הבנה טובה יותר של אופן הפעולה שלהם חשובה להצעת ניסוחים מתאימים, לזהות את אופן היישום בשדות, ולהגדיר איזה שלב התפתחותי של הפתוגן פגיע לייצור הביולוגי המועמד.
הגישות הנוכחיות המטפלות בפעילויות אנטיבקטריאליות ונוגדות פטריות כוללות שיטות דיפוזיה כגון דיפוזיה של אגר-דיסק, דילול, ביואוטוגרפיה וציטומטריית זרימה13. רוב הטכניקות הללו, וליתר דיוק, בדיקות הרגישות האנטי-פטרייתיות הסטנדרטיות - דיפוזיה של אגר-דיסק ובדיקות דילול - מותאמות היטב להערכת הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של תרכובות מסיסות על נבגים חיידקיים ופטריות בהשעיות נוזליות14. עם זאת, שיטות אלה אינן מתאימות בדרך כלל לבדיקת תרכובות מוצקות כגון אבקת צמחים מיובשים או לכמת פעילות אנטי פטרייתית במהלך צמיחת mycelium כפי שהם דורשים דילול נבג או נבג מתפשט על צלחות אגר ו / או דילול של תרכובות נגד פטריות13. בשיטה מורעלת מזון, צלחות אגר המכילות את הסוכן נגד פטריות מחוסנים עם דיסק בקוטר 5-7 מ"מ שנדגם מתרבות פטריות בת 7 ימים מבלי לקחת בחשבון את הכמות המדויקת של מיסליום מתחיל. לאחר הדגירה, הפעילות נגד פטריות נקבעת כאחוז של עיכוב צמיחה רדיאלית17,18,19. עם גישה זו אנו יכולים להעריך את הפעילות נגד פטריות על צמיחה mycelial. לעומת זאת, שיטת דילול אגר מבוצעת כדי לקבוע את הפעילות נגד פטריות על נבגים מחוסנים ישירות על פני השטח של צלחת אגר המכילה את תרכובות נגד פטריות13,20,21. שתי גישות אלה לתת תוצאות משלימות על פעילות נגד פטריות. עם זאת אלה שתי טכניקות עצמאיות המשמשות במקביל שאינן מספקות השוואה מדויקת זה לצד זה של היעילות היחסית של תרכובות אנטי פטרייתיות על נבגים ומיסליום17,20,22 כמו כמות החומר הפטרייתית ההתחלתית שונה בשתי הגישות. יתר על כן, הפעילות נגד פטריות של מוצר שמקורו בצמחים נובעת לעתים קרובות משילוב של מולקולות אנטי פטרייתיות מסונתז על ידי צמחים להתמודד עם פתוגנים. מולקולות אלה מקיפות חלבונים, פפטידים23,24ומטבוליטים בעלי מגוון כימי רחב ושייכים לסוגים שונים של מולקולות כגון פוליפנולים, טרפנים, אלקלוואידים25גלוקוסינולטים,8ותרכובות אורגנוסולפור,26. חלק ממולקולות אלה הן נדיפות או הופכות נדיפות במהלך התקפת פתוגן27. סוכנים אלה הם לרוב מסיסים במים גרועים ותרכובות בלחץ אדים גבוה שיש לשחזר באמצעות זיקוק מים כמו שמנים אתריים, שחלק מהפעילויות האנטי מיקרוביאליות שלהם הוקמו היטב28. מבחני רגישות מתווכים בשלב האדים פותחו כדי למדוד את הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של תרכובות נדיפות לאחר אידוי והגירה דרך שלב האדים29. שיטות אלה מבוססות על כניסתה של תרכובות נגד פטריות במרחק מהתרבות המיקרוביאלית29,30,31,32,33. ב Assay אגר שלב אדים נפוץ, שמנים אתריים מופקדים על דיסק נייר ממוקם במרכז הכיסוי של צלחת פטרי במרחק מן ההשעיה נבג חיידקי או פטרייתי, אשר מתפשט על מדיום אגר. קוטר אזור עיכוב הגדילה נמדד באותו אופן כמו בשיטת הדיפוזיה של אגר-דיסק20,24. גישות אחרות פותחו כדי לספק מדידה כמותית של הרגישות נגד פטריות שלב האדים של שמנים אתריים, נגזר משיטת דילול המרק שממנה חושבה פעילות מיקרוביאלית מתווכת שלב אדים מעכבת32או נגזר ממאיורי דיפוזיה של דיסק אגר,31. שיטות אלה הן בדרך כלל ספציפיות מחקרי פעילות שלב האדים ולא מתאים למגע עיכוב מבחנים. זה מונע את קביעת התרומה היחסית של סוכנים תנודתיים ולא תנודתיים לפעילות אנטי פטרייתית של תערובת ביו-אקטיבית מורכבת.
השיטה הכמותית שפיתחנו שואפת למדוד את ההשפעה האנטי פטרייתית של אבקת צמחים מיובשים על כמויות מבוקרות של נבגים ומיסליום גדל שהופקד על פני השטח של מדיום אגר כדי לשחזר את הצמיחה האווירית של פיטופטוגנים במהלך זיהום שלצמחים 15, כמו גם רשת mycelial מחובר16. הגישה היא התקנה ניסיונית שונה המבוססת על דילול אגר ושיטות מורעלות מזון המאפשרות גם, באותה התקנה ניסיונית, כימות זה לצד זה של תרומתם של מטבוליטים אנטי נדיפים ולא נדיפים. במחקר זה, השיטה כבר benchmarked נגד הפעילות של שלוש תכשירים אנטי פטרייתיים מאופיינים היטב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת אינקולה
- לפני הניסוי, שכב 5 μL של טריכודרמה spp. נבגי SBT10-2018 המאוחסנים ב-4 °C (60 °F) על מדיום אגר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDA) ודגדוג במשך 4 ימים ב 30 מעלות צלזיוס עם חשיפה רגילה לאור כדי לקדם היווצרות conidia42 (איור 1, פאנל A).
הערה: טריכודרמה spp. SBT10-2018 מבודד מעץ ומשמש כמודל במחקר זה לצמיחה מהירה וקלות של התאוששות נבגים. זן זה נשמר על ידי המעבדה שלנו. - שחזור קונידיה(איור 1, פאנל A)
- שכב 3 מ"ל של 0.05% Tween-20 על מיסליום Trichoderma.
- השתמש מגרפה כדי לשחרר conidia מ conidiophores; להימנע מלחיצה על mycelium כדי למנוע hyphae מלהיות נקרע משם.
- לשחזר את הפתרון במהירות עם micropipette כדי למנוע את זה נספג על ידי מדיום אגר ולהעביר לתוך צינור 15 מ"ל.
- לספור את המספר הכולל של נבגים באמצעות hemocytometer ולהכין פתרון המכיל 3 x 106 נבגים / מ"ל.
הערה: שלב זה חייב להתבצע בקפידה כדי למנוע חילוץ של hyphae. הכנת הנבג נבדקת לאחר מכן תחת מיקרוסקופ. בסופו של דבר, עבור זנים המציגים mycelium אווירי מאוד רך, צעד של סינון באמצעות מסנן מסננת μM 40 ניתן להוסיף כדי לחסל שבר mycelium שיורית.
2. הכנת צלחות פטרייתיות(איור 1, פאנל ב')
- הפקדה 100 μL של 3 x 106 נבגים / מ"ל עם micropipette על צלחת פטרי בקוטר 9 ס"מ המכילה מדיום מחשב כף יד כדי להשיג 4,800 נבגים / ס"מ2 המתאים 925 נבגים / 5 מ"מ קוטר אגר תקע.
- מוסיפים 10 גרם של חרוזי זכוכית בקוטר 2 מ"מ עם מרית סטרילית ומבצעים תנועות קדימה ואחורה במקביל ובניצב לזרוע המפעיל כדי להפיץ באופן שווה את הנבגים על פני השטח של האגר.
- סובב את הצלחת ב- 90° וחזור על התנועות המסתובבות (כמו בסעיף 2.2); חזור על שלבים אלה עד שהצלחת תסתובב לחלוטין.
- השתמש בצלחת מיד כדי להגדיר ניסויים הדורשים נבגים או דגירה הצלחות ב 30 מעלות צלזיוס עבור 17 שעות או 24 שעות כאשר hyphae מוקדם או mycelium, בהתאמה, יש צורך.
הערה: כדי להשוות פעילות אנטי פטרייתית שנמדדה לאחר העברת תקע mycelium והעברת דיסק mycelium, להשתמש פינצטה סטרילית ומניחים דיסקים תאית סטרילית 5 מ"מ באופן אקראי על פני השטח של צלחת אגר לאחר התפשטות נבג.
3. הכנת תרכובות נגד פטריות
- הכנת מוצר ממקור צמחי: הכנת אבקת שום
- מקלפים את שיני השום הטרי וחותכים את הציפורן לפרוסות ברוחב 2-3 מ"מ באמצעות להב אזמל.
- מייבשים את הפרוסות ליומיים ב-40 מעלות צלזיוס.
- טוחנים את הפרוסות במשך 3 x 15 שניות באמצעות טחנת סכין כדי להשיג אבקה דקה.
- לאחסן את אבקת השום ב 4 מעלות צלזיוס ב 50 צינורות מ"ל לפני השימוש.
הערה: כמו שום אינו autoclaved (כדי למנוע השפלה של תרכובות אנטי פטרייתיות רגישות לטמפרטורה) לנקות את המטחנה, אזמל, ואת מייבש האוויר עם 70% אתנול לפני השימוש.
- הכנת שמן אתרי
- הכן 0.5%, 1%, 2.5%, 5% ו 20% תימוס וולגריס פתרונות שמן אתרי ב 0.5% Tween-80.
- מערבבים היטב ליצירת אמולסיה לפני הוספתה למדיום מחשב כף יד (ראה סעיף 4.2).
- הכנת כרבנדזים
- לשקול carbendazim להכין פתרון אתנול 200 מ"ג / ליטר (carbendazim הוא מסיס במים).
- אחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר לפני הוספתו למדיית מחשב כף יד (ראה סעיף 4.2).
התראה: קרבנדזים מהווה סכנה בריאותית וסביבתית. יש ללבוש כפפות ומסכה בעת הטיפול במוצר זה. אחסן אותו בחלל מאוורר.
4. מבחני עיכוב מגע
- הכנת צלחות אגר המכילות אבקת שום
- הכן ו autoclave מחשב כף יד בינוני.
- לשקול את כמות אבקת השום הרצויה לתוך צינור 50 מ"ל באמצעות מרית סטרילית, כדי לקבל ריכוזים הנעים בדרך כלל בין 0.25 מ"ג / מ"ל ל 16 מ"ג / מ"ל.
- הוסף 10 מ"ל של מחשב כף יד לאחר שבדק את הטמפרטורה של המדיום בחלק הפנימי של פרק כף היד. הטמפרטורה חייבת להיות נמוכה ככל האפשר כדי למנוע השפלה של מולקולות רגישות. באופן אידיאלי, טמפרטורה זו צריכה להיות 45 °C (69 °F).
- הומוגנית בזהירות על ידי הפיכת הצינור במהופך כדי להפיץ את האבקה באופן שווה למדיום מחשב כף היד. יוצקים במהירות 10 מ"ל לצלחת פטרי בקוטר 5 ס"מ(איור 1,פאנל C).
- עם צלחת פטרי להציב בטמפרטורת החדר, לחכות עד אגר מתגבש.
- הכנת צלחות אגר המכילות שמן אתרי או קרבנדזים
- הכנס 10 מ"ל של מחשב כף יד לתוך צינור 50 מ"ל. בדוק את הטמפרטורה באשר לסעיף 4.1.3.
- הוסף 100 μL של הפתרונות השונים של שמן אתרי Thymus vulgaris ב PDA כדי להשיג 0.005%, 0.01%, 0.025%, 0.05% ו 0.2% פתרונות (ראה סעיף 3.2.1).
- הוסף את הנפח הנדרש של carbendazim מן הפתרון 200 מ"ג / ליטר כדי להשיג פתרונות החל 0.0625-2 מ"ג / ליטר (ראה סעיף 3.3.1).
- להומוגניזציה בזהירות על ידי הפיכת הצינור במהופך, יוצקים במהירות 10 מ"ל לצלחת פטרי בקוטר 5 ס"מ(איור 1,פאנל C).
- עם צלחת פטרי להציב בטמפרטורת החדר, לחכות עד אגר מתגבש.
- מבחני עיכוב מגע (איור 1)
- עם צינור נירוסטה סטרילי בקוטר 5 מ"מ, התווה עיגול במרכז צלחות פטרי המכילות מחשב כף יד או מחשב כף יד כולל תרכובות נגד פטריות. להיפטר גליל אגר באמצעות קיסם סטרילי (פאנל C).
- עם צינור נירוסטה סטרילי בקוטר 5 מ"מ, עיגולי עלילה באופן אקראי לתוך הצלחות הפטריות מחלק 2. עלילה בין 15-20 עיגולים לצלחת (לוח B).
- בזהירות למשוך את אגר צילינדרים מכוסה נבגים, hyphae מוקדם, או mycelium עם קיסם סטרילי ומניחים את התקעים לחלל הריק של צלחות פטרי המכילות מחשב כף יד או מחשב כף יד כולל תרכובות נגד פטריות (פאנל C).
- דגירה הצלחות המכילות נבגים עבור 48 שעות ב 30 מעלות צלזיוס, 31 שעות עבור הצלחות המכילות hyphae מוקדם, 24 שעות עבור הצלחות מכוסה mycelium (פאנל C).
- למדוד את קוטר הצמיחה הרדיאלית ולחשב את אחוז עיכוב הצמיחה הפטרייתית על השליטה באמצעות הנוסחה (פאנל D)
% עיכוב גדילה פטרייתית = (C - מיזוג אוויר)* 100
כאשר C הוא קוטר הצמיחה הרדיאלית במדיום מחשב כף יד וקוטר גידול רדיאלי במדיום מחשב כף יד המכיל את תרכובות נגד פטריות.
הערה: כדי להשוות פעילות אנטי פטרייתית נמדדה לאחר העברת תקע mycelium והעברת דיסק mycelium, באמצעות פינצטה סטרילית, להעביר דיסק אחד בקוטר 5 מ"מ שהופקדו בעבר על פני השטח של הצלחות הפטריות (סעיף 2 הערה) במרכז מנות פטרי המכילות מחשב כף יד או מחשב כף יד המכיל תרכובות אנטי פטרייתיות ולהמשיך בדיוק כמו להעברת תקע אגר
5. מבחני עיכוב פאזה אדים
- הכנת צלחות אגר המכילות אבקת שום
- המשך כמו בסעיף 3.1.
- הכנת צלחת אגר המכילה שמן אתרי או קרבנדזים
- המשך כמו בסעיף 3.2 ו- 3.3.
- הכנת צלחות פטרייתיות
- המשך כמו בסעיף 2.
- בדיקת עיכוב נגד פטריות בשלב אדים (איור 1)
- יוצקים 10 מ"ל של מחשב כף יד בינוני לתוך המכסה של 5 ס"מ קוטר פטרי מנות המכילות גם 10 מ"ל מחשב כף יד בינוני או 10 מ"ל של מחשב כף יד בינוני המכיל תרכובות נגד פטריות לתחתית הכלים. המתן עד להתמצקות מלאה של האגר בטמפרטורת החדר (לוח C).
- השתמש צינור צנטריפוגלי 50 מ"ל ככלי כיול כדי לקבל מעגל של מחשב כף יד במרכז המכסה; להסיר את מחשב כף יד סביב העיגול עם מרית סטרילית (לוח C).
- התווה עיגול במרכז מדיום מחשב כף יד הממוקם במכסה עם צינור נירוסטה סטרילי בקוטר 5 מ"מ. השלך את צילינדר האגר עם קיסם סטרילי (לוח C).
- טופס תקעים עם צינור נירוסטה סטרילי בקוטר 5 מ"מ באופן אקראי לתוך לוחות פטרייתי כמו בסעיף 4.3.2 (פאנל B).
- באמצעות קיסם סטרילי, להעביר בזהירות את התקעים מכוסה או עם נבגים, hyphae מוקדם, או mycelium מצלחות פטרייתי לתוך העפעפיים של צלחות assay (פאנל C).
- דגירה ב 30 °C (60 °F) כמו בסעיף 4.3.4 (פאנל C).
- למדוד את קוטר הצמיחה הרדיאלית ולחשב את אחוז עיכוב הצמיחה הפטרייתית באמצעות הנוסחה בסעיף 4.3.5 (פאנל D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להעריך את היכולת של השיטה הכמותית להפלות את אופן הפעולה של סוגים שונים של תרכובות נגד פטריות, השווינו את היעילות של שלושה סוכנים ידועים נגד פטריות. Carbendazim הוא קוטל פטריות סינתטי לא נדיף אשר נעשה שימוש נרחב כדי לשלוט במגוון רחב של מחלות פטרייתיות בצמחים39,40. תימוס וולגריס שמן אתרי תוארה במידה רבה עבור פעילות אנטיבקטריאלית שלה נגד פטריות ומשמש חומר משמר מזון טבעי41. אבקת שום נבחרה כמודל של ביו-פרוצרקט ממקור צמחי. זה שימש באופן מסורתי כתרופה טבעית עם פעילויות מיקרוביאלית אשר יוחסו במידה רבה לנוכחות של תרכובות organosulfur נדיף, אלא גם לנוכחות של סאפונינים לא נדיפים ותרכובות פנוליות26, נותן מודל זה מורכבות רלוונטית במחקר זה.
שיטה כמותית זו מסתמכת על העברת תקעי אגר המכילים כמויות מבוקרות של פטרייה בשלבים התפתחותיים שונים מנבגים למיסליום ואילו בשיטת המזון המורעל, מיסליום בן 5 ימים עד 7 ימים מועבר מדיסקים תאיים13. במהלך ההסתערות, נבגים, היפה מוקדמת (דגירה של 17 שעות) ומיסליום (דגירה של 24 שעות) שימשו כחומר פטרייתי מתחיל. ייתכן שהשימוש בהעברת דיסקים אינו רלוונטי מכיוון שקונידיה או שאריות היפה נשארות לפחות בחלקן במדיום האגר לאחר העברת הדיסק, מה שמוביל לאחר מכן למדידה לא מדויקת של עיכוב הצמיחה כפי שמודגם באיור 2. קטרים שונים של צמיחה פטרייתית-רדיאלית נצפו לאחר העברת אזורי אגר הממוקמים מתחת לדיסקים תאיים ואחריו דגירה של 24 שעות (איור 2, לוחות A, B ו- C) המדגישה את נוכחותם של שאריות היפה פטרייתית על אגר לאחר העברת הדיסק. הכימות של שאריות ההייפה אושר על ידי מדידת הצמיחה המובילה לשונות בקוטר של עד 22%(איור 2, פאנל D). ההשפעה על עיכוב הצמיחה הוערכה לאחר מכן באמצעות שמן אתרי Thymus vulgaris כתרכובת אנטי פטרייתית ובהשוואה לעיכוב המתקבל לאחר העברת תקע אגר (איור 2, פאנל E). עיכוב הצמיחה לאחר העברת הדיסק היה גבוה יותר מאשר לאחר העברת תקע אגר עבור ריכוזי שמן תימוס נמוכים, מה שהוביל להערכת יתר של האפקט המעכב, אשר עשוי להיות בשל העברה חלקית של חומר פטרייתי ולתמוך בגישה המבוססת על העברת תקע אגר.
טריכודרמה ס.ו. עיכוב הצמיחה SBT10-2018 מופעלות על ידי שלוש תרכובות נגד פטריות הוערך הבא באמצעות מגע- ו vapor-שלב עיכוב assays עבור כל שלב פטרייתי (איור 3). נבגים היו מפוזרים בקפידה על לוחות אגר כדי להשיג 4,800 נבגים / ס"מ2. הם הועברו ישירות ללוחות אגר המכילים תרכובות נגד פטריות באמצעות מיצוי תקע אגר באמצעות צינור נירוסטה סטרילי 5 מ"מ, המאפשר לניסוי להתחיל מהנבגים. עבור שני השלבים ההתפתחותיים האחרים, צלחות אגר המכוסות בנבגים דגירו תחילה במשך 17 שעות או 24 שעות ב-30 מעלות צלזיוס לפני שהעבירו את תקע האגר כדי לאפשר נביטה ופיתוח מוקדם של היפאי (17 שעות) ויצירת מיסליום (24 שעות)(איור 3, פאנל A). כדי לכמת את תרומתן של מולקולות נדיפות פעילות לפעילות הכוללת נגד פטריות, בדיקת עיכוב המגע הותאמה ונבגים, היפה מוקדמת, ו mycelium הונחו במרחק מן תרכובות נגד פטריות שפכו לתוך מדיום מחשב כף יד כמו עבור מגע עיכוב assay. טריכודרמה- צמיחה רדיאלית נמדדה במשך 48 שעות ואחוז העיכוב נקבע בהשוואה לתנאי הבקרה. הריכוז המינימלי-מעכבות (MIC) הוגדר כריכוז הנמוך ביותר של תרכובות נגד פטריות המונעות צמיחה נראית לעין לאחר 48 שעות של דגירה ב 30 מעלות צלזיוס.
איור 3(פאנל B) מראה רגישות גבוהה יותר לנבגים בהשוואה לרשתות היפאי ומיסליום מוקדמות עם 50%, עיכוב צמיחה של 22% ו-30% בהתאמה ב-0.25 מיקרוגרם/מ"ל קרבנדאזים כאשר טריכודרמה ותרכובות אנטי פטרייתיות היו במגע. במקביל, ערך MIC של 0.5 מיקרוגרם / מ"ל הוערך על נביטת נבג ואילו עלייה ל 0.75 מיקרוגרם / מ"ל הושגה על התארכות hyphae מוקדם ו mycelium. לעומת זאת, קרבנדאזים לא השפיעו על טריכודרמה כאשר הפטרייה הונחה במרחק מקוטל הפטריות בהתאם לתנודתיות הנמוכה של חומר זה. התוצאות שהשגנו באמצעות שמן אתרי Thymus vulgaris (TEO) כתרכובת אנטי פטרייתית(איור 3,פאנל C) הראו רגישות גבוהה יותר לנבגים ל-TEO בהשוואה להיפאי מוקדם ומיסליום עם 65% ועיכוב צמיחה של כ-50% ב-0.01% TEO בהתאמה. ערכי ה-MIC שהתקבלו היו דומים לנביטת נבגים והתארכות hyphae מוקדמת (0.025% TEO) ומעלה לצמיחת מיסליום (0.05% TEO). כצפוי, שמן אתרי Thymus vulgaris הציג פעילות אנטי פטרייתית זהה ללא קשר למרחק beTween הפטרייה והשמן. ערכי MIC דומים (0.025% TEO) התקבלו על נביטת נבגים והתארכות hyphae מוקדמת למגע ומבחני פאזה אדים, אם כי באחוז התחתון נצפתה רגישות גבוהה יותר כאשר נבגי TEO ו- Trichoderma היו במגע (עיכוב צמיחה של 60% במגע לעומת עיכוב צמיחה של 45% במרחק). באופן מפתיע, ערכי ה-MIC שהושגו על המיצ'ליום היו שונים בהסתעפויות העכבות של שלב המגע והאדים (0.05% לעומת 0.1%) מה שמרמז שחלק מהמולקולות הנדיפות אינן פעילות נגד מיסליום מפותח. לבסוף, בעת שימוש באבקת שום כתרכובת אנטי פטרייתית(איור 3, פאנל D), נצפתה יעילות גבוהה יותר נגד נביטת נבגים (עיכוב צמיחה של 50% באבקת שום 0.25 מ"ג/מ"ל וערך MIC של 0.5 מ"ג/מ"ל) והארכת היפה מוקדמת (עיכוב צמיחה של 59% ב-0.25 מ"ג/מ"ל וערך MIC של 0.5 מ"ג/מ"ל) מאשר לצמיחת מיסליום (עיכוב של 29% ב-0.5 מ"ג/מ"ל אבקת שום וערך MIC של 0.75 מ"ג/מ"ל). כאשר הושוו מבחני מגע ואדים, התוצאות הראו ירידה משמעותית בפעילות האנטי פטרייתית במרחק ללא קשר לשלב ההתפתחותי של הפטרייה. ערכי ה-MIC עברו מ-0.5 מ"ג/מ"ל ל-1 מ"ג/מ"ל לנביטת נבגים, מ-0.5 מ"ג/מ"ל ל-2 מ"ג/מ"ל להארכת היפה מוקדמת, ומ-0.75 מ"ג/מ"ל ל-4 מ"ג/מ"ל לצמיחת מיסליום(איור 3, פאנל D ואיור 4 לתמונות מייצגות). אז, תוצאות אלה מראות כי אבקת שום מכיל תערובת של תרכובות נדיפות ולא נדיפות שיש תכונות אנטי פטרייתיות.
בסך הכל, תוצאות אלה מראות כי התרומה היחסית של סוכנים תנודתיים ולא תנודתיים הכלולים במוצרים שמקורם בצמחים עשויה להיקבע בשלבי צמיחה פטרייתיים שונים שכן התנאים הניסיוניים דומים. גישה זו מתאימה במיוחד לתערובות מורכבות של תרכובות נגד פטריות. שמן אתרי Thymus vulgaris הוא תערובת של תרכובות נדיפות ומראה פעילות דומה מרחוק ובמגע לנביטת נבגים והתארכות hyphae מוקדמת, תמיכה בהשוואה של זה שלב אדים ומגע עיכוב הבדיקה ומדגיש כי הגירה לתוך שלב האדים אינו נפגע על ידי שפיכה לתוך מדיום אגר. התוצאות גם להדגיש כי אבקת שום המשמש כמודל במחקר זה מכיל רכיבים פעילים שאינם נדיפים אשר יש תרומה משמעותית בפעילות הכוללת נגד פטריות אשר הוזנחו לטובת thiosulfinates נדיף נגזר allium27,28.
איור 1: הערכה הסינופטית של הפרוטוקול עבור מבחני מגע ואידוי שלב אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אי דיוקים הקשורים להעברה פטרייתית מדיסק תאית. A. ערכה המייצגת העברת דיסק על לוחות אגר המכוסים בנבגים והעברת דיסק על פני השטח על לוחות אגר המכילים תרכובות אנטי פטרייתיות B. ערכה המייצגת העברה אגר של אזורים תחת דיסקים תאית ואחריו דגירה ומדידת צמיחה שיורית. ג. ג. תמונה מייצגת של צמיחה רדיאלית של העברת mycelium לאחר העברת שיורית של אזורים תחת דיסקים תאית. ד. מדידת גדילה רדיאלית של שאריות מיסליום. אי, אי. ההשפעה של שמן אתרי Thymus vulgaris על הצמיחה של mycelium מועבר מדיסק תאית או תקע אגר (N = 2, כלומר ± SD) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: השוואה בין פעילויות אנטי פטרייתיות באמצעות מבחני עיכוב שלב האדים והמגע על נבגים, היפה מוקדמת ומיסליום. א. תמונות מייצגות של נבגי טריכודרמה, היפה מוקדמת (צמיחה של 17 שעות) ומיסליום (צמיחה של 24 שעות). עיכוב צמיחת טריכודרמה על ידי carbendazim (B), שמן אתרי תימוס וולגריס (C) ואבקת שום (D). (N = 2, ממוצע ± SD) לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונות מייצגות של פעילות אנטי פטרייתית שום על צלחות אגר במגע- (A) או אדים שלב (B) מבחני עיכובאנא לחץ כאן כדי להציגגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הגישה המוצגת כאן מאפשרת הערכה של תכונות אנטי פטרייתיות של מוצרים צמחיים מעובדים מינימלית. בפרוטוקול זה, התפלגות הומוגנית של נבגים על פני השטח אגר מושגת באמצעות חרוזי זכוכית 2 מ"מ. שלב זה דורש טיפול במיומנויות כדי להפיץ כראוי את החרוזים כדי להשיג תוצאות לשחזור, בסופו של דבר המאפשר השוואה של השפעות אנטי פטרייתיות בשלבים שונים של צמיחה פטרייתית. מצאנו כי חרוזי זכוכית 5 מ"מ או סיבוב מוגזם תוך הומוגניזציה במהלך התפשטות יכול לגרום קוטר צמיחה משתנה. לכן, אנו ממליצים להתאמן כדי לשלוט בהפצת נבגים לפני הניסויים. בנוסף, כאשר אבקות צמחים חייבות להיבדק, יש לתת תשומת לב לפיזור הומוגני של המוצר למדיום אגר. כדי למנוע מהאבקה להתיישב בתחתית הצלחת, יש לערבב את המוצר למדיום אגר כאשר הטמפרטורה של המדיום המומס מגיעה ל -45 מעלות צלזיוס (כאשר טמפרטורת החדר היא 24 מעלות צלזיוס). טמפרטורה זו צריכה להיות מותאמת על פי טמפרטורת החדר המקומית, כדי למנוע משקעים.
בעוד השיטה שאנו מתארים כאן יכולה לספק תובנות חשובות, יש לקחת בחשבון כמה חסרונות. שיטה זו מאפשרת השוואות מדויקות זה לצד זה במערך ניסיוני אחד על חשבון כמות משמעותית של זמן הכנה כמו מספר צלחות אגר להיות מוכן יכול להיות גדול בהתאם לשאלות שיש לענות עליהן. בנוסף, מבחנים אלה הם מבחנים בקנה מידה בינוני המיועדים למנות פטרי 5 ס"מ. לכן, כמות החומרים הפעילים הנדרשים לבדיקת כל ההיבטים יכולה להיות משמעותית. משמעות הדבר היא כי חומרים נדירים לא יכול להיות מתאים מועמדים לבדיקה עבור פרוטוקול זה. ניתן לשקול צמצום של ההסתעפות באמצעות מנות פטרי קטנות יותר ולהקטין את גודל התקעים. זה יכול להיבדק באמצעות פרוטוקול benchmarking המתואר כאן עם תשומת לב מיוחדת לחילוץ תקע אגר, אשר עשוי להיות קשה. הדיוק של מדידות צמיחה רדיאלית עשוי להיות מופחת בקנה מידה קטן יותר.
השיטות הנוכחיות מתאימות למדידת הפעילות האנטי פטרייתית של תרכובות בתמיסה ופחות ישימות ללימוד אבקות13. הגישה שקבענו מותאמת היטב הן לתרכובות נוזליות והן לתרכובות מוצקות, המאפשרת הערכה של תכונות אנטי פטרייתיות של מוצרים צמחיים מעובדים מינימלית. זה מקטין את הזמן הנדרש כדי לבדוק תמציות ומפחית מלכודות הקשורות חומרים פעילים המציגים מסיסות ירודה. כמו כמה מוצרים צמחיים מכילים מולקולות פעילות רגיש לטמפרטורה גבוהה43, זה מציע את היתרון של הגבלת הסיכון לאובדן פעילות של תרכובות כאלה. גישה זו הותאמה משיטת דיפוזיה אגר ושיטה מורעלת מזון15,16,17,18,19 כדי לאפשר השוואה ישירה של פעילויות אנטי פטרייתיות בשלבי צמיחה פטרייתיים שונים באמצעות הגדרות ניסיוניות דומות. העברת תקע אגר מאפשרת שליטה מדויקת בכמויות המיקרואורגניזמים בתוך ההסעה. זהו יתרון על פני העברת דיסק, מה שמוביל להערכת יתר של השפעות אנטי פטרייתיות הקשורות להעברה לא שלמה של נבגים או hyphae. לבסוף, בעוד מבחני שלב האדים אינם מיושמים בדרך כלל על מבחני עיכוב מגע27,28,29,30,31, השיטה שאנו מציעים מטפלת בתרומות היחסיות של סוכנים נדיפים ולא נדיפים הכלולים בתערובות מורכבות כגון אבקות צמחים או תמציות ובסופו של דבר מאפשרת הערכה של פעילויות אנטי פטרייתיות בשלבי צמיחה פטרייתיים שונים.
הגישה שאנו מתארים כאן עשויה להיות רלוונטית במיוחד כדי לתמוך בצורך בשיטות להערכת תכונות אנטי פטרייתיות במוצרים שמקורם בצמחים עבור בקרון ביולוגי. השיטה הכמותית שאנו מציעים מאפשרת למפעילים לקבוע את התרומות המתאימות של תרכובות נדיפות ולא נדיפות לפעילות האנטי פטרייתית של תערובת ביו-אקטיבית מורכבת. זה מספק מידע בעל ערך שיכול להנחות את הבחירה של מצבי היישום לטיפול ואת הרלוונטיות של ביצוע מיצוי נוזלי. יישומים שעשויים להיחשב במרחק מן phytopathogen ממוקד (למשל, הכללת המוצר biocontrol לתוך אריזה) או עשוי להזדקק למגע ישיר כדי לייעל את היעילות של המוצר biocontrol (nebulization על צמחים או טבילת פירות לתוך פתרון של מוצר biocontrol). זה גם מאפשר את ההשוואה של יעילות פטרייתית בשלבים שונים של צמיחה פטרייתית מנבגים לצמיחה mycelium בשלב מאוחר יותר, מה שמוביל להגדרת המלצות להקמת ספי בקרה הנדרשים כדי להחיל מוצרים biocontrol על יבולים. ואכן, הגדרת היעילות של החומרים בשלבים פטרייתיים שונים עשויה לעזור לסווג אם חומרים יכולים לשמש כטיפולים מונעים או מרפאים ולתכנן את לוח הזמנים לטיפולים צמחיים במוצרי ביו-קונטרול. זה חיוני כדי למנף את היעילות של המוצרים בעת שימוש בשדה או לאחר הקציר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ללא
Acknowledgments
אנו אסירי תודה לפרנק ייטס על עצתו היקרה. עבודה זו נתמכה על ידי Sup'Biotech.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave-vacuclav 24B+ | Melag | ||
| Carbendazim | Sigma | 378674-100G | |
| Distilled water | |||
| Eppendorf tubes | Sarstedt | 72.706 | 1.5 mL |
| Falcons tubes | Sarstedt | 547254 | 50 mL |
| Five millimeters diameter stainless steel tube | retail store | / | |
| Food dehydrator | Sancusto | six trays | |
| Garlic powder | Organic shop | ||
| Glass beads | CLOUP | 65020 |  2 mm |
| Hemocytometer counting cell | Jeulin | 713442 | / |
| Incubator | Memmert | UM400 | 30 °C |
| Knife mill | Bosch | TSM6A013B | |
| Manual cell counter | Labbox | HCNT-001-001 | / |
| Measuring ruler | retail store | ||
| Microbiological safety cabinets | FASTER | FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2 | |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014407 | 100 - 1000 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014411 | 20 - 200 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014412 | 2 - 20 µL |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1194500 | 55 mm |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1473 | 90 mm |
| Pipette Controllers-EASY 60 | Labbox | EASY-P60-001 | / |
| Potato Dextrose Agar | Sigma | 70139-500G | |
| Precision scale-RADWAG | Grosseron | B126698 | AS220.R2-ML 220g/0.1mg |
| Rake | Sarstedt | 86-1569001 | / |
| Reverse microscope AE31E trinocular | Grosseron | M097917 | / |
| Sterile graduated pipette | Sarstedt | 1254001 | 10 mL |
| Thymus essential oil | Drugstore | Essential oil 100% | |
| Tips 1000 µL | Sarstedt | 70.762010 | |
| Tips 20 µL | Sarstedt | 70.760012 | |
| Tips 200 µL | Sarstedt | 70.760002 | |
| Tooth pick | retail store | ||
| Trichoderma spp strain | Strain of LRPIA laboratory | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379-250ML | |
| Tween-80 | Sigma | P1754-1L | |
| Tweezers | Labbox | FORS-001-002 | / |
References
- FAO. Global food losses and food waste - Extent, causes and prevention. FAO. , Rome. (2011).
- da Cruz Cabral, L., Fernández Pinto, V., Patriarca, A. Application of plant compounds to control fungal spoilage and mycotoxin production in foods. International Journal of Food Microbiology. 166 (1), 1-14 (2013).
- Romanazzi, G., Smilanick, J. L., Feliziani, E., Droby, S. Postharvest biology and technology integrated management of postharvest gray mold on fruit crops. Postharvest Biology and Technology. 113, (2016).
- Morton, V., Staub, T.
- Brandhorst, T. T., Klein, B. S. Uncertainty surrounding the mechanism and safety of the post- harvest fungicide Fludioxonil. Food and Chemical Toxicology. 123, 561-565 (2019).
- Bénit, P., et al. Evolutionarily conserved susceptibility of the mitochondrial respiratory chain to SDHI pesticides and its consequence on the impact of SDHIs on human cultured cells. PLoS ONE. 14 (11), 1-20 (2019).
- Usall, J., Torres, R., Teixidó, N. Biological control of postharvest diseases on fruit: a suitable alternative. Current Opinion in Food Science. 11, 51-55 (2016).
- Tripathi, P., Dubey, N. K. Exploitation of natural products as an alternative strategy to control postharvest fungal rotting of fruit and vegetables. Postharvest Biology and Technology. 32 (3), 235-245 (2004).
- Abbey, J. A., et al. Biofungicides as alternative to synthetic fungicide control of grey mould (Botrytis cinerea)-prospects and challenges. Biocontrol Science and Technology. 29 (3), 241-262 (2019).
- Soylu, E. M., Kurt, Ş, Soylu, S. In vitro and in vivo antifungal activities of the essential oils of various plants against tomato grey mould disease agent Botrytis cinerea. International Journal of Food Microbiology. 143 (3), 183-189 (2010).
- Liu, S., Shao, X., Wei, Y., Li, Y., Xu, F., Wang, H. Solidago canadensis L. essential oil vapor effectively inhibits botrytis cinerea growth and preserves postharvest quality of strawberry as a food model system. Frontiers in Microbiology. 7, 0-9 (2016).
- El-Mogy, M. M., Alsanius, B. W. Cassia oil for controlling plant and human pathogens on fresh strawberries. Food Control. 28 (1), 157-162 (2012).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Arikan, S. Current status of antifungal susceptibility testing methods. Medical Mycology. 45 (7), 569-587 (2007).
- Girmay, Z., Gorems, W., Birhanu, G., Zewdie, S. Growth and yield performance of Pleurotus ostreatus (Jacq. Fr.) Kumm (oyster mushroom) on different substrates. AMB Express. 6 (1), 87 (2016).
- Fischer, M. S., Glass, N. L. Communicate and fuse: how filamentous fungi establish and maintain an interconnected mycelial network. Frontiers in Microbiology. 10, 1-20 (2019).
- Mohana, D. C., Raveesha, K. A. Anti-fungal evaluation of some plant extracts against some plant pathogenic field and storage fungi. Journal of Agricultural Technology. 4 (1), 119-137 (2007).
- Balamurugan, S. In vitro activity of aurantifolia plant extracts against phytopathogenic fungi phaseolina. International Letters of Natural Sciences. 13, 70-74 (2014).
- Ameziane, N., et al. Antifungal activity of Moroccan plants against citrus fruit pathogens. Agronomy for sustainable development. 27 (3), 273-277 (2007).
- Rizi, K., Murdan, S., Danquah, C. A., Faull, J., Bhakta, S. Development of a rapid, reliable and quantitative method - "SPOTi" for testing antifungal efficacy. Journal of Microbiological Methods. 117, 36-40 (2015).
- Imhof, A., Balajee, S. A., Marr, K., Marr, K. New methods to assess susceptibilities of Aspergillus isolates to caspofungin. Microbiology. 41 (12), 5683-5688 (2003).
- Goussous, S. J., Abu el-Samen, F. M., Tahhan, R. A. Antifungal activity of several medicinal plants extracts against the early blight pathogen (Alternaria solani). Archives of Phytopathology and Plant Protection. 43 (17), 1745-1757 (2010).
- Ng, T. B. Antifungal proteins and peptides of leguminous and non-leguminous origins. Peptides. 25 (7), 1215-1222 (2004).
- Hu, Z., Zhang, H., Shi, K. Plant peptides in plant defense responses. Plant Signaling and Behavior. 13 (8), (2018).
- Iriti, M., Faoro, F. Chemical diversity and defence metabolism: How plants cope with pathogens and ozone pollution. International Journal of Molecular Sciences. 10 (8), 3371-3399 (2009).
- Lanzotti, V., Bonanomi, G., Scala, F. What makes Allium species effective against pathogenic microbes. Phytochemistry Reviews. 12 (4), 751-772 (2013).
- Kyung, K. H.
- Hyldgaard, M., Mygind, T., Meyer, R. L. Essential oils in food preservation: mode of action, synergies, and interactions with food matrix components. Frontiers in microbiology. 3, 12 (2012).
- Bueno, J. Models of evaluation of antimicrobial activity of essential oils in vapour phase: a promising use in healthcare decontamination. Natural Volatiles & Essential Oils. 2 (2), 16-29 (2015).
- Doi, N. M., Sae-Eaw, A., Suppakul, P., Chompreeda, P. Assessment of synergistic effects on antimicrobial activity in vapour- and liquidphase of cinnamon and oregano essential oils against Staphylococcus aureus. International Food Research Journal. 26 (2), 459-467 (2019).
- Amat, S., Baines, D., Alexander, T. W. A vapour phase assay for evaluating the antimicrobial activities of essential oils against bovine respiratory bacterial pathogens. Letters in Applied Microbiology. 65 (6), 489-495 (2017).
- Feyaerts, A. F., et al. Essential oils and their components are a class of antifungals with potent vapour-phase-mediated anti-Candida activity. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Wang, T. H., Hsia, S. M., Wu, C. H., Ko, S. Y., Chen, M. Y., Shih, Y. H., Shieh, T. M., Chuang, L. C. Evaluation of the antibacterial potential of liquid and vapor phase phenolic essential oil compounds against oral microorganisms. PLoS ONE. 11 (9), 1-17 (2016).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Leadbeater, A. Recent developments and challenges in chemical disease control. Plant Protection Science. 51 (4), 163-169 (2015).
- Jin, C., Zeng, Z., Fu, Z., Jin, Y. Oral imazalil exposure induces gut microbiota dysbiosis and colonic inflammation in mice. Chemosphere. 160, 349-358 (2016).
- Kumar, R., Ghatak, A., Balodi, R., Bhagat, A. P. Decay mechanism of postharvest pathogens and their management using non-chemical and biological approaches. Journal of Postharvest Technology. 6 (1), 1-11 (2018).
- Talibi, I., Boubaker, H., Boudyach, E. H., Ait Ben Aoumar, A. Alternative methods for the control of postharvest citrus diseases. Journal of Applied Microbiology. 117 (1), 1-17 (2014).
- Arya, R., Sharma, R., Malhotra, M., Kumar, V., Sharma, A. K. Biodegradation Aspects of Carbendazim and Sulfosulfuron: Trends, Scope and Relevance. Current Medicinal Chemistry. 22 (9), 1147-1155 (2015).
- European Food Safety Authority. Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance carbendazim. EFSA Journal. 8 (5), 1-76 (2010).
- Sakkas, H., Papadopoulou, C. Antimicrobial activity of basil, oregano, and thyme essential oils. Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (3), 429-438 (2017).
- Steyaert, J. M., Weld, R. J., Mendoza-Mendoza, A., Stewart, A. Reproduction without sex: conidiation in the filamentous fungus Trichoderma. Microbiology. 156, Reading, England. Pt 10 2887-2900 (2010).
- Leontiev, R., Hohaus, N., Jacob, C., Gruhlke, M. C. H., Slusarenko, A. J. A Comparison of the antibacterial and antifungal activities of thiosulfinate analogues of allicin. Scientific Reports. 8 (1), 1-19 (2018).
- Scorzoni, L., et al. The use of standard methodology for determination of antifungal activity of natural products against medical yeasts Candida sp and Cryptococcus sp. Brazilian Journal of Microbiology. 38 (3), 391-397 (2007).
