Summary
식물 유래 제품의 항진균 효과를 정량화하도록 설계된 수정된 한천 기반 방법을 설명합니다. 항진균 활성에 대한 휘발성 및 비휘발성 기여는 모두 이 프로토콜을 통해 평가될 수 있다. 또한, 곰팡이에 대한 효능은 단일 실험 설정에서 주요 발달 단계에서 측정될 수 있다.
Abstract
설명된 프로토콜은 미생물 수량 및 발달 단계를 정확하게 판단할 수 있는 플러그 전달 기술을 기반으로 합니다. 지정된 수의 포자가 한천 판에 퍼져 있습니다. 이 한천판은 배양이 필요하지 않은 포자를 제외한 곰팡이가 예상되는 발달 단계에 도달할 수 있도록 정의된 기간 동안 배양됩니다. 포자, 최면 또는 균사체로 덮인 한천 플러그는 다음 철회하고 항진균 화합물을 함유한 천매체로 이송되어 곰팡이로부터 멀리 또는 접촉하여 테스트할 수 있습니다. 이 방법은 액체 추출물과 고체 샘플(분말)을 모두 테스트하는 데 적용됩니다. 특히 포자, 조기 최면 및 균사체에 대한 휘발성 및 비휘발성 제제의 상대적 기여를 정량화하고 그 효과를 결정하는 데 특히 적합합니다.
이 방법은 바이오 제어 제품, 특히 식물 유래 제품의 항진균 활성의 특성화와 매우 관련이 있습니다. 실제로, 식물 처리를 위해, 결과는 응용 프로그램의 모드의 선택을 안내하고 트리거 임계 값을 설정하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
과일과 채소의 글로벌 손실은 생산1의 50 %까지 도달 할 수 있으며 주로 20세기중반 부터 합성 살균제의 광범위한 고용에도 불구하고, 필드 또는 수확 후 저장2,3동안 곰팡이 부패로 인한 식품 부패로 인해 발생할 수 있습니다. 이 물질의 사용은 심각한 환경 및 건강 위험을 나타내기 때문에 재검토되고있다. 이들의 유해한 결과가 생태계 전반에 걸쳐 나타나고 잠재적 건강 영향의증거가 축적됨에 따라5,6,수확 후 치료 전 및 후 예방 전략에 대한 새로운 대안이 개발되고 있다7,8,9. 따라서 우리가 직면하는 도전은 두 배입니다. 새로운 살균 전략은 첫째, 식물 병원균에 대한 식품 보호의 효능 수준을 유지하고 두 번째로 농업 관행의 환경 발자국을 획기적으로 줄이는 데 기여해야합니다. 이 야심찬 목표를 달성하기 위해 식물에서 진화한 자연 방어에서 영감을 얻은 전략은 1000종 이상의 식물종이 항균성질8을강조함에 따라 제안되고 있다. 예를 들어, 식물병원균과 싸우기 위해 천연 살균제를 개발한 식물은 새로운 생물통제 제품2의개발을 탐구하는 새로운 자원이다. 에센셜 오일은 이 유형의 주력 분자입니다. 예를 들어, 오리가눔 에센셜 오일은 온실 10의 회색 곰팡이로부터 토마토 식물을 보호하고, Solidago canadensis L. 및 cassia 에센셜 오일은 수확 후 딸기를 회색 곰팡이 손상11,12로부터보존하는 것으로 나타났다. 이러한 예는 생물 통제와 특히 식물 유래 제품이 생물학적 효능과 환경 지속 가능성을 결합한 솔루션을 나타낸다는 것을 보여줍니다.
따라서, 식물은 작물 보호 산업에 대 한 잠재적인 관심의 분자의 중요 한 자원. 그러나 소수의 식물 제품만이 일반적으로 안전, 비식물독성 및 친환경2로인식되더라도 생물 통제 제품으로 사용할 것을 제안되었습니다. 실험실에서 현장으로의 전치에 대한 몇 가지 어려움이 관찰되었으며, 예컨대 생체 내적용2,9에적용된 효능감소 등이 관찰되었다. 따라서, 더 나은 필드 효능을 예측하는 실험실 테스트의 능력을 개선하는 것이 중요해진다. 이러한 맥락에서 식물 유래 제품에 대한 항진균 검사 방법은 항진균 효능을 평가하고 사용하기 위한 최적의 조건을 정의하는 데 모두 필요합니다. 구체적으로, 바이오컨트롤 제품은 일반적으로 화학 살균제보다 효율이 낮기 때문에, 그들의 행동 모드를 더 잘 이해하는 것이 적합한 제형을 제안하고, 분야에서 적용 모드를 식별하고, 병원균의 발달 단계가 후보 바이오제품에 취약한지를 정의하는 것이 중요하다.
항균 및 항진균 활동을 해결하는 현재 접근법은 한천 디스크 확산, 희석, 생물학적 소학 및 유동 세포측정과 같은 확산 방법을 포함합니다.13. 이러한 기술의 대부분, 그리고 더 구체적으로, 표준 항진균 감수성 테스트 - agar 디스크 확산 및 희석 작용 - 액체 현탁액에서 세균성 및 곰팡이 포자에 용해 화합물의 항균 활성을 평가하기위한 잘 적응된다14. 그러나, 이러한 방법은 일반적으로 건조 된 식물 분말 과 같은 고체 화합물을 테스트하거나 천판에 포자 희석 또는 포자 확산 및 /또는 항진균 화합물의 희석을 필요로하기 때문에 균사 체 성장 중 항진균 활성을 정량화하는 데 적합하지 않습니다.13. 식품 독방법에서 항진균제를 함유한 한천판은 정확한 양의 시동을 고려하지 않고 7일 된 곰팡이 배양에서 샘플링된 5-7mm 직경 디스크로 접종된다. 인큐베이션 후 항진균 활성은 방사형 성장 억제의 백분율로 결정됩니다.17,18,19. 이 접근으로 우리는 근생 성장에 항진균 활동을 평가할 수 있습니다. 대조적으로, agar 희석 방법은 항진균 화합물을 함유하는 천판의 표면에 직접 접종된 포자에 대한 항진균 활성을 결정하기 위해 수행됩니다.13,20,21. 이 두 가지 방법은 항진균 활성에 대한 보완적인 결과를 제공합니다. 그러나 이들은 포자와 균사체에 항진균 화합물의 상대적 효능의 정확한 나란히 비교를 제공하지 않는 병렬로 사용되는 두 개의 독립적 인 기술입니다17,20,22 곰팡이 재료의 시작량이 두 가지 접근 방식에서 다릅니다. 더욱이, 식물 유래 제품의 항진균 활성은 종종 식물에 의해 합성된 항진균 분자의 조합으로부터 병원균을 마주하게 된다. 이 분자는 단백질, 펩티드를 포함합니다23,24, 및 대사 산물은 광범위한 화학적 다양성을 가지며 폴리페놀, 테르펜, 알칼로이드와 같은 다양한 분자 클래스에 속하는 대사산물25, 글루코시올레이트8및 유기황 화합물26. 이들 분자 중 일부는 불안정하거나 병원균 공격 중 휘발성이 됩니다.27. 이 에이전트는 가장 자주 가난한 수용성 및 에센셜 오일로 물 증류를 통해 복구 해야 하는 높은 증기 압력 화합물, 그 중 일부는 잘 설립 되었습니다.28. 증기상 매개 감수성 감수성 작용은 증기상을 통한 증발 및 이동에 따른 휘발성 화합물의 항균 활성을 측정하기 위해 개발되었습니다.29. 이러한 방법은 미생물 배양으로부터 멀리 떨어진 항진균 화합물의 도입에 기초한다.29,30,31,32,33. 일반적으로 사용되는 증기상 한고 분석에서 에센셜 오일은 종이 디스크에 증착되어 포이 배지에 퍼지는 세균또는 곰팡이 포자 현탁액과 멀리 떨어진 페트리 접시의 표지 중앙에 배치됩니다. 성장 억제 영역의 직경은 다음 한천 디스크 확산 방법에 대한 것과 같은 방식으로 측정됩니다.20,24. 다른 접근법은 억제 증기상 매개 항균 활성을 계산한 국물 희석 법에서 유래된 에센셜 오일의 증기상 항진균 감수성의 정량적 측정을 제공하기 위해 개발되었습니다.32또는 한천 디스크 확산 소집에서 파생31. 이러한 방법은 일반적으로 증기상 활성 연구에 특이적이며 접촉 억제 작용에 적합하지 않습니다. 이는 복잡한 생리활성 혼합물의 항진균 활성에 휘발성 및 비휘발성 제제의 상대적 기여의 결정을 배제한다.
우리가 개발한 정량적 방법은 식물15의 감염 시 식물병원균의 공중 성장을 재현하기 위해 천 배지의 표면에 증착된 포자와 재배 된 균사체의 제어량에 대한 건조 식물 분말의 항진균 효과를 측정하는 것을 목표로하고 있으며, 상호 연결된 균사네트워크(16). 접근방식은 동일한 실험 설정에서 휘발성 및 비 휘발성 항진균 대사 산물의 기여도를 나란히 정량화할 수 있는 agar 희석 및 식품 중독 방법에 기초한 변형된 실험 용 설정이다. 이 연구에서는, 이 방법은 잘 특징인 3개의 항진균 제제의 활동에 대하여 벤치마킹되었습니다.
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Protocol
1화 이노쿨라 준비
- 실험 에 앞서 트리코데르마 스프의 5 μL을 놓습니다. SBT10-2018 포자는 감자 덱스트로스 천 배지(PDA)에 4°C에 저장되고 코니아형성을 촉진하기 위해 정기적인 광 노출로 30°C에서 4일 동안 배양한다(도1,패널 A).
참고 : 트리코데르마 sPP. SBT10-2018은 나무에서 분리되어 있으며, 빠르게 성장하고 포자 회복의 용이성을 위해 이 연구의 모델로 사용됩니다. 이 균주는 우리의 실험실에 의해 보존됩니다. - 코니디아 복구(그림 1,패널 A)
- 트리코데르마 균셀륨에 0.05% Tween-20의 3mL를 놓습니다.
- 갈퀴를 사용하여 conidiophores에서 코니디아를 방출; 최해가 찢어지는 것을 방지하기 위해 균사체를 누르지 마십시오.
- 마이크로피펫으로 용액을 빠르게 회수하여 한천 배지에 흡수되는 것을 피하고 15mL 튜브로 이송합니다.
- 혈류계를 사용하여 총 포자 수를 계산하고 3 x 106 포자 /mL을 포함하는 솔루션을 준비하십시오.
참고: 이 단계는 최해가 추출되는 것을 방지하기 위해 신중하게 수행해야합니다. 포자 제제는 현미경으로 검사됩니다. 결국, 높은 공중 및 푹신한 균사체를 제시하는 균주의 경우, 40 μM 스트레이너 필터를 사용하여 여과 단계를 추가하여 잔류 균사체 조각을 제거할 수 있습니다.
2. 곰팡이 플레이트 준비(그림 1,패널 B)
- PDA 배지를 함유한 9cm 직경 페트리 접시에 마이크로파이프로 3 x 106 포자/mL의 100 μL을 4,800 개의 포자 / 5mm 직경 - agar 플러그에 해당하는 4,800 포자 / cm2를 얻습니다.
- 멸균 주걱으로 직경 2mm 유리 구슬 10g을 추가하고 작업자의 팔에 평행하고 수직으로 앞뒤로 이동하여 천표면에 포자를 고르게 분배합니다.
- 플레이트를 90° 회전시키고 회전 움직임을 반복합니다(섹션 2.2에서와 같이); 플레이트가 완전히 회전할 때까지 이러한 단계를 반복합니다.
- 플레이트를 즉시 사용하여 포자를 필요로 하는 실험을 설정하거나 17시간 또는 24시간 동안 30°C에서 플레이트를 배양하여 조기 최해 또는 균사체가 각각 필요할 때.
참고: 균사칼 플러그 이송 및 균사체 디스크 전달 후 측정된 항진균 활성을 비교하려면 멸균 핀셋을 사용하고 멸균 5mm 셀룰로오스 디스크를 포자 확산 후 천자 판 표면에 무작위로 배치합니다.
3. 항진균 화합물 제제
- 식물 유래 제품 준비: 마늘 분말 제제
- 신선한 마늘의 정향을 껍질을 벗기고 메스 블레이드를 사용하여 2-3mm 너비의 슬라이스로 정향을 자른다.
- 40 °C에서 2 일 동안 슬라이스를 공기 건조시십시오.
- 미세 한 분말을 얻기 위해 칼 공장을 사용하여 3 x 15 초 동안 슬라이스를 갈아.
- 사용 전에 마늘 분말을 50mL 튜브에 4°C로 저장합니다.
참고: 마늘이 오토클레이브되지 않기 때문에(온도에 민감한 항진균 화합물의 분해를 방지하기 위해) 사용 전에 70%의 에탄올로 분쇄기, 메스 및 공기 건조기를 청소합니다.
- 에센셜 오일 준비
- 0.5%, 1%, 2.5%, 5%, 20% 티무스 불가리스 에센셜 오일 솔루션 0.5% Tween-80을 준비하십시오.
- PDA 매체에 추가하기 전에 에멀젼을 형성하기 위해 잘 섞어 보세요(섹션 4.2 참조).
- 카르벤다짐 준비
- 200 mg / L 에탄올 용액을 준비하기 위해 carbendazim 의 무게 (carbendazim은 물에 제대로 용해되지 않습니다).
- PDFA 매체에 추가하기 전에 실온에서 솔루션을 저장합니다(섹션 4.2 참조).
주의: 카르벤다짐은 건강과 환경적 위험을 제시합니다. 이 제품을 취급할 때 장갑과 마스크를 착용하십시오. 통풍이 잘 되는 공간에 보관하십시오.
4. 접촉 억제 분석
- 마늘 가루를 함유한 한천 접시 준비
- PDA 매체를 준비하고 자동 복제합니다.
- 원하는 마늘 분말량을 멸균 주걱을 사용하여 50mL 튜브에 계량하여 일반적으로 0.25 mg/mL에서 16 mg/mL에 이르는 농도를 얻습니다.
- 손목 안쪽에 있는 매체의 온도를 확인한 후에 PDA의 10mL를 추가합니다. 온도는 민감한 분자의 저하를 방지하기 위해 가능한 한 낮아야합니다. 이상적으로, 이 온도는 45 °C이어야한다.
- 튜브를 거꾸로 뒤집어 서 분말을 PDA 배지로 고르게 분배하여 조심스럽게 균질화합니다. 직경 5cm페트리접시(그림 1,패널 C)에 10mL를 빠르게 붓습니다.
- 페트리 접시를 실온에 놓고, 한천이 고화될 때까지 기다립니다.
- 에센셜 오일 또는 카르벤다짐을 함유한 한천 판 준비
- 50mL 튜브에 PDA 10mL을 소개합니다. 섹션 4.1.3의 온도를 확인합니다.
- PDA에 Thymus vulgaris 에센셜 오일의 다른 용액의 100 μL을 추가하여 0.005%, 0.01%, 0.025%, 0.2% 용액을 얻습니다(섹션 3.2.1 참조).
- 0.0625-2 mg/L에 이르는 솔루션을 얻기 위해 200 mg/L 솔루션에서 카벤다짐의 필요한 볼륨을 추가합니다(섹션 3.3.1 참조).
- 튜브를 거꾸로 뒤집어 조심스럽게 균질화하고, 10mL를 직경 5cm의 페트리접시(그림 1,패널 C)로 빠르게 붓습니다.
- 페트리 접시를 실온에 놓고, 한천이 고화될 때까지 기다립니다.
- 접촉 억제 분석(도 1)
- 직경 5mm의 멸균 스테인리스 스틸 튜브를 사용하면 항진균 화합물을 포함한 PDA 또는 PDA가 포함된 페트리 접시 중앙에 원을 플롯합니다. 멸균 이쑤시개(패널 C)를 사용하여 한천 실린더를 폐기하십시오.
- 직경 5mm의 멸균 스테인리스 스틸 튜브를 사용하면 2부에서 곰팡이 판에 무작위로 동그라미를 넣습니다. 플레이트당 15-20 원(패널 B)을 플롯합니다.
- 포자, 조기 최해, 또는 멸균 이쑤시개를 함유한 진셀륨으로 덮인 천실린더를 조심스럽게 철회하고 항진균 화합물(panel C)을 포함한 PDA 또는 PDA를 포함하는 페트리 접시의 빈 공간에 플러그를 넣습니다.
- 30°C에서 48시간, 31h의 초기 최해를 포함하는 플레이트에 대해, 24h의 균사체(panel C)로 덮인 플레이트에 대해 포자를 함유한 플레이트를 배양한다.
- 방사형 성장의 직경을 측정하고 포뮬러 (패널 D)를 사용하여 제어를 통해 곰팡이 성장 억제의 백분율을 계산합니다.
% 곰팡이 성장 억제 = (C - A / C)* 100
여기서 C는 PDA 배지및 항진균 화합물을 함유하는 PDA 배지에서 방사형 성장의 직경이다.
참고: 균사형 플러그 이송 및 균사체 디스크 전달 후 측정된 항진균 활성을 비교하기 위해 멸균 핀셋을 사용하여 이전에 진균판 의 표면에 증착된 5mm 직경 디스크(섹션 2 노트)를 PDA 또는 PDA가 함유한 페트리 접시의 중앙에 옮기고 항진균 화합물을 함유한 PDA와 정확히 진행
5. 증기 상 억제 분석
- 마늘 가루를 함유한 한천 접시 준비
- 섹션 3.1에서와 같이 진행합니다.
- 에센셜 오일 또는 카르벤다짐을 함유한 한천판 준비
- 3.2 항 및 3.3 섹션에서와 같이 진행합니다.
- 곰팡이 접시의 준비
- 섹션 2에서와 같이 진행합니다.
- 증기상 항진균 억제 분석(도 1)
- PDA 배지 10mL을 5cm 직경의 페트리 접시뚜껑에 붓고 10mL PDA 배지 또는 10mL의 PDA 배지를 함유하여 항진균 화합물을 접시 의 바닥에 넣습니다. 실온(패널 C)에서 한천을 완전히 응고할 때까지 기다립니다.
- 50mL 원심관을 교정 도구로 사용하여 뚜껑 중앙에 PDA 원을 얻는 다; 멸균 주걱 (패널 C)으로 원 주위의 PDA를 제거합니다.
- 5mm 직경의 멸균 스테인레스 스틸 튜브로 뚜껑에 배치된 PDA 매체의 중앙에 원을 플롯합니다. 멸균 이쑤시개(패널 C)로 한천 실린더를 폐기하십시오.
- 섹션 4.3.2 (패널 B)와 같이 곰팡이 판에 무작위로 5mm 직경의 멸균 스테인레스 스틸 튜브가있는 플러그를 형성합니다.
- 멸균 이쑤시개를 사용하여 포자, 조기 최해 또는 진균 판에서 균사체로 덮인 플러그를 분석 판(패널 C)의 뚜껑으로 조심스럽게 옮춥니다.
- 섹션 4.3.4 (패널 C)에서와 같이 30 °C에서 배양하십시오.
- 방사형 성장의 직경을 측정하고 섹션 4.3.5 (패널 D)에서 수식을 사용하여 곰팡이 성장 억제의 백분율을 계산합니다.
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Representative Results
항진균 화합물의 다른 유형의 작용 모드를 구별하는 정량적 방법의 능력을 평가하기 위해, 우리는 잘 알려진 3개의 항진균제의 효능을 비교했습니다. Carbendazim은식물 39,40에서곰팡이 질병의 넓은 범위를 제어하기 위해 널리 사용되어 온 비 휘발성 합성 살균제입니다. Thymus vulgaris 에센셜 오일은 주로 항균 및 항진균 활성에 대해 설명되어 있으며 천연 식품 방부제 제(41)로사용됩니다. 마늘 분말은 식물 유래 바이오 제품의 모델로 선택되었습니다. 그것은 전통적으로 크게 휘발성 유기 황 화합물의 존재뿐만 아니라 비 휘발성 사포닌과 페놀 화합물의 존재에 기인한 항균 활동을 가진 자연 요법으로 사용되었습니다26,이 모델에 이 연구에서 관련 있는 복잡성을 주는.
이러한 정량적 방법은 포자에서 균사체로의 다양한 발달 단계에서 대조되는 곰팡이를 포함하는 천 플러그의 전달에 의존하지만, 식품 중독 방법에서는 5일에서 7일 된 균셀륨이 셀룰로오스디스크(13)에서전달된다. 분석에서, 포자, 초기 최면 (17 h 인큐베이션) 및 균사체 (24 h 인큐베이션)는 곰팡이 물질을 시동하는 것으로 사용되었다. 디스크 전송의 사용은 디스크 전송 후 한천 매체에 적어도 부분적으로 남아 있는 코니디아 또는 잔류 최해와 관련이 없을 수 있으며, 이어서 도 2에도시된 바와 같이 성장 억제의 부정확한 측정으로 이어진다. 곰팡이 방사형 성장의 다른 직경은 셀룰로오스 디스크 아래에위치한 한천 영역을 전송한 후 관찰되었으며 24 h 인큐베이션(그림 2,패널 A, B 및 C)은 디스크 전송 후 한고에 잔류 곰팡이 최해의 존재를 강조합니다. 잔류 최해의 정량화는 최대 22%의 직경 가변성(도2,패널 D)까지 이어지는 성장의 측정에 의해 확인되었습니다. 성장 억제에 미치는 영향은 다음으로 흉부 저속한 에센셜 오일을 항진균 화합물로 평가하고, 한천 플러그 전달 후 얻은 억제에 비해(도2,패널 E). 디스크 이송 후 성장 억제는 낮은 Thymus 오일 농도에 대한 천 플러그 전송 후보다 높았으며, 이는 곰팡이 물질의 불완전한 전송으로 인한 억제 효과의 과대 평가로 이어졌으며 agar-plug 전송에 기초한 접근 방식을 지원합니다.
트리코데르마 는 spp. 3개의 항진균 화합물에 의해 유발된 SBT10-2018-성장 억제는 각 곰팡이 단계에 대한 접촉 및 증기상 억제분석제(도 3)를이용하여 다음으로 평가되었다. 포자는 4,800 포자/cm2를얻기 위해 한천 판에 조심스럽게 퍼졌다. 그들은 5mm 멸균 스테인레스 스틸 튜브를 사용하여 천플러그 추출을 통해 항진균 화합물을 함유한 천판으로 직접 전달되어 포자에서 실험을 시작할 수 있게 하였다. 다른 두 가지 발달 단계의 경우, 포자로 덮인 한천판은 30°C에서 17시간 또는 24시간 동안 먼저 배양한 후 찬로 플러그를 옮겨 하이피(17h)와 균사체 형성(24h)의 발아 및 조기 개발을 허용하였다(도3,패널 A). 전체 항진균 활성에 활성 휘발성 분자의 기여를 정량화하기 위해, 접촉 억제 분석이 적응되고 포자, 초기 최해, 및 균셀륨은 접촉 억제 분석에 관해서는 PDA 배지에 부어진 항진균 화합물으로부터 먼 거리에 배치되었다. 트리코데르마-방사형성장은 48시간 이상 측정되었고 억제의 비율은 대조조건에 비해 결정되었다. 최소 억제 농도(MIC)는 30°C에서 48h의 배양 후 가시적인 성장을 방지하는 항진균 화합물의 가장 낮은 농도로 정의되었다.
도 3(패널B)는 트리코데르마 및 항진균 화합물이 접촉했을 때 0.25 μg/mL 카벤다짐에서 각각 50%, 22% 및 30% 성장 억제를 가진 초기 최해 및 균사체 네트워크에 비해 카벤다짐에 대한 높은 포자 민감성을 나타낸다. 수반되 게도, 0.5 μg/mL의 MIC 값은 포자 발아에 추정된 반면 0.75 μg/mL로 증가초기 최해 연신및 균사체에서 얻어졌다. 대조적으로, 카벤다짐은 이 물질의 낮은 변동성에 따라 곰팡이가 살균제로부터 멀리 배치되었을 때 트리코데르마에 항진균 효과가 없었다. 티무스 불가리스 에센셜 오일(TEO)을 항진균화합물(도 3,패널 C)으로 사용하여 얻은 결과는 조기 최해 및 균셀륨에 비해 TEO에 대해 각각 0.01% 및 약 50%의 성장 억제를 보였다. 얻어진 MIC 값은 포자 발아 및 조기 최면 신장(0.025% TEO)과 균사체 성장(0.05% TEO)과 유사하였다. 예상대로, Thymus vulgaris 에센셜 오일은 곰팡이와 오일의 거리 와 관계없이 동일한 항진균 활성을 제시했습니다. 유사한 MIC 값(0.025% TEO)은 접촉 및 증기상 아약에 대한 포자 발화 및 조기 최면 연신에 얻어졌지만, 낮은 비율로는 TEO 및 트리코데르마 포자가 접촉했을 때 더 높은 감도가 관찰되었지만(접촉시 60% 성장 억제대 45% 성장 억제). 놀랍게도, 균사체상에서 얻은 MIC 값은 접촉및 증기상 억제 소약에서 달랐다(0.05% 대 0.1%) 휘발성 분자의 일부가 잘 발달 된 균사체에 대해 활성화되지 않는다는 것을 시사합니다. 마지막으로, 마늘 분말을 항진균화합물(도 3,패널 D)으로 사용할 때, 포자 발아에 대하여 더 높은 효능이 관찰되었다(0.25 mg/mL 마늘 분말 및 MIC 값0.5 mg/mL) 및 조기 최면 신장 (59% 성장 억제0.25 mg/mL 및 MIC 값 0.5 mg/mL) 보다는 균사 체 성장 (29% 0.5 mg/mL 마늘 분말 및 MIC 값 0.75 mg/mL)에 대 한 보다. 접촉 및 증기상 소과를 비교했을 때, 결과는 곰팡이의 발달 단계에 관계없이 거리에서 항진균 활성의 현저한 감소를 보였다. MIC 값은 포자 발아를 위한 0.5 mg/mL에서 1 mg/mL로, 초기 최면 연신을 위한 0.5 mg/mL에서 2 mg/mL로, 그리고 0.75 mg/mL에서 4 mg/mL로 이동하여 균사체 성장을 위한 4 mg/mL로 이동하였다(그림3,패널 D 및 대표 사진용 그림 4). 따라서 이러한 결과는 마늘 분말이 항진균 성질을 갖는 휘발성 화합물과 비휘발성 화합물의 혼합물을 함유하고 있음을 시사합니다.
이러한 결과는 식물 유래 제품에 포함된 휘발성 및 비휘발성 제제의 상대적 기여가 실험 조건이 비슷하기 때문에 상이한 곰팡이 성장 단계에서 결정될 수 있음을 보여준다. 이 방법은 항진균 화합물의 복잡한 혼합물에 특히 적합합니다. 흉부 불가리스 에센셜 오일은 휘발성 화합물의 혼합물이며 포자 발아 및 초기 최면 신장에 대한 접촉에서 유사한 활성을 나타내며, 이 증기상 및 접촉 억제 분석의 비교를 지원하고 증기상으로의 이동이 천공 배지로 부어 서 손상되지 않는다는 것을 강조한다. 결과는 또한 이 연구에서 모델로 사용되는 마늘 분말이 전체 항진균 활성에 상당한 기여를 하고 알륨27,28에서유래한 휘발성 티오술피네이트에 찬성하여 소홀히 한 비휘발성 활성 성분을 포함하고 있음을 강조한다.
그림 1: 접촉 및 증기 단계 분석에 대한 프로토콜의 Synoptic 방식은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 셀룰로오스 디스크에서 곰팡이 전달과 관련된 부정확성. A. 항진균 화합물을 함유한 천지판의 표면에 포자와 디스크 이송이 적용되는 한고판으로 디스크 전송을 나타내는 계획 B. 셀룰로오스 디스크 아래 영역의 한고 이동을 나타내는 방식이 인큐베이션 및 잔류 성장 측정을 한다. C. 셀룰로오스 디스크 아래 영역의 잔류 균사 후 전송의 방사형 성장의 대표적인 그림. D. 잔류 균셀륨의 방사형 성장 측정. E. 셀룰로오스 디스크 또는 한천 플러그(N=2, 평균 ± SD)에서 전송된 균사체의 성장에 대한 흉부 저속한 에센셜 오일의 효과는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 포자, 조기 최해 및 균사체에 대한 증기상 및 접촉 억제 효소를 이용한 항진균 활동의 비교. A. 트리코데르마 포자, 조기 최해(17시간 성장), 균사체(24시간 성장)의 대표적인 사진. 카르벤다짐(B), 티무스 불가리스 에센셜 오일(C) 및마늘분말(D)에의한 트리코데르마 의 성장 억제. (N=2, 평균 ± SD) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 접촉식 에서 한천 판에 마늘 항진균 활성의 대표적인 사진- (A) 또는 증기상 (B) 억제 작용이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시 된 접근 방식은 최소 가공 식물 유래 제품의 항진균 특성의 평가를 허용합니다. 이 프로토콜에서는 2mm 유리 구슬을 사용하여 천 표면에 포자의 균일한 분포가 달성된다. 이 단계는 제대로 구슬을 배포하고 재현 가능한 결과를 얻기 위해 처리 기술을 필요로, 궁극적으로 곰팡이 성장의 다른 단계에서 항진균 효과의 비교를 허용. 우리는 확산 하는 동안 균질화 하는 동안 5 mm 유리 구슬 또는 과도 한 회전 변수 성장 직경을 일으킬 수 있습니다 발견. 따라서 실험 전에 포자 분포를 마스터하는 교육을 권장합니다. 또한 식물 분말을 테스트해야 하는 경우 제품의 균일한 분산을 한천 매체로 분산시켜야 합니다. 분말이 플레이트 의 바닥에 침전되는 것을 방지하기 위해 용융 된 매체의 온도가 45 °C에 도달하면 제품을 한천 매체로 혼합해야합니다 (실온이 24 °C인 경우). 이 온도는 침전을 피하기 위해 지역 실온에 따라 조정되어야 합니다.
여기서 설명하는 방법은 귀중한 통찰력을 제공할 수 있지만 몇 가지 단점을 고려해야 합니다. 이 방법을 사용하면 준비해야 하는 질문에 따라 상당한 양의 준비 시간을 희생하여 단일 실험 설정에서 정확하고 나란히 비교할 수 있습니다. 또한, 이 분석은 5cm 페트리 요리를 위해 설계된 중간 규모의 분석입니다. 따라서 모든 측면을 테스트하는 데 필요한 활성 물질의 양은 상당할 수 있습니다. 즉, 희귀 물질은 이 프로토콜에 적합한 테스트 후보가 아닐 수 있습니다. 작은 페트리 접시를 사용하고 플러그 크기를 줄이는 분석법의 축소를 고려할 수 있습니다. 이것은 어려울 수 있는 한천 플러그 추출에 특별한 주의를 기울여 여기에 설명된 벤치마킹 프로토콜을 사용하여 테스트할 수 있습니다. 방사형 성장 측정의 정확도는 그 작은 규모로 감소될 수 있습니다.
현재 방법은 용액에 있는 화합물의 항진균 활성을 측정하고분말(13)을연구하는 데 덜 적용된다. 우리가 확립 한 접근 방식은 액체 및 고체 화합물 모두에 잘 적응되어 최소 가공 된 식물 유래 제품의 항진균 특성을 평가 할 수 있습니다. 이렇게 하면 추출물을 테스트하는 데 필요한 시간을 줄이고 용해도가 떨어지는 활성 물질과 관련된 함정을 줄입니다. 일부 식물 유래 제품에는 고온43에민감한 활성 분자가 포함되어 있으므로 이러한 화합물의 활성 손실 위험을 제한하는 이점을 제공합니다. 이러한 접근법은 유사한 실험 설정을 사용하여 상이한 곰팡이 성장 단계에서 항진균 활동의 직접적인 비교를 추가로 허용하기 위해 한천 확산 방법 및 식품 중독방법(15,16,17,18, 19)에서 적용되었다. Agar 플러그 전송을 통해 분석 결과 내에서 미생물의 양을 정확하게 제어할 수 있습니다. 이는 포자 또는 최면의 불완전한 전송과 관련된 항진균 효과의 과대 평가로 이어지는 디스크 전송에 비해 이점입니다. 마지막으로, 증기상 소법은 일반적으로 접촉 억제작용제(27,28,29,30,31)에적용되지 않는 반면, 식물 분말 이나 추출물과 같은 복잡한 혼합물에 함유된 휘발성 및 비휘발성 제의 상대적 기여를 해결하고 궁극적으로 상이한 진균 성장 단계에서 항진균 활동의 평가를 허용한다.
우리가 여기에서 설명하는 접근 은 생물 통제를 위한 식물 유래 제품에 있는 항진균 특성을 평가하는 방법에 대한 필요를 지원하기 위하여 특히 관련있을 수 있습니다. 우리가 제안하는 정량적 방법은 운영자가 복잡한 생리 활성 혼합물의 항진균 활성에 휘발성 및 비 휘발성 화합물의 각각의 기여를 결정할 수 있게 합니다. 이것은 처리를 위한 응용 프로그램의 선택권 및 액체 추출의 수행의 관련성을 안내할 수 있는 귀중한 정보를 제공합니다. 표적 식물병원균(예: 바이오 컨트롤 제품을 포장에 포함)으로부터 멀리서 고려될 수 있거나 생물제어 제품의 효능을 최적화하기 위해 직접 접촉해야 할 수도 있습니다(식물에 분기화 또는 과일을 생물통제 제품의 용액으로 찍어 넣는경우). 또한 포자 발아에서 부터 추후 단계균 성장까지 다양한 곰팡이 성장 단계에서 항진균 효능을 비교할 수 있으며, 이는 작물에 바이오 컨트롤 제품을 적용하는 데 필요한 제어 임계값을 확립하기 위한 권장 사항의 정의로 이어집니다. 실제로, 다른 곰팡이 단계에서 물질의 효능을 정의하는 것은 물질이 예방 또는 치료 치료로 사용될 수 있는지 여부를 분류하고 생물 통제 제품으로 식물 치료 일정을 계획하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이것은 필드 또는 포스트 수확에 사용될 때 제품의 효능을 활용하는 데 필수적입니다.
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Disclosures
없음
Acknowledgments
프랭크 예이츠의 소중한 조언에 감사드립니다. 이 작품은 Sup'Biotech에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave-vacuclav 24B+ | Melag | ||
| Carbendazim | Sigma | 378674-100G | |
| Distilled water | |||
| Eppendorf tubes | Sarstedt | 72.706 | 1.5 mL |
| Falcons tubes | Sarstedt | 547254 | 50 mL |
| Five millimeters diameter stainless steel tube | retail store | / | |
| Food dehydrator | Sancusto | six trays | |
| Garlic powder | Organic shop | ||
| Glass beads | CLOUP | 65020 |  2 mm |
| Hemocytometer counting cell | Jeulin | 713442 | / |
| Incubator | Memmert | UM400 | 30 °C |
| Knife mill | Bosch | TSM6A013B | |
| Manual cell counter | Labbox | HCNT-001-001 | / |
| Measuring ruler | retail store | ||
| Microbiological safety cabinets | FASTER | FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2 | |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014407 | 100 - 1000 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014411 | 20 - 200 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014412 | 2 - 20 µL |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1194500 | 55 mm |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1473 | 90 mm |
| Pipette Controllers-EASY 60 | Labbox | EASY-P60-001 | / |
| Potato Dextrose Agar | Sigma | 70139-500G | |
| Precision scale-RADWAG | Grosseron | B126698 | AS220.R2-ML 220g/0.1mg |
| Rake | Sarstedt | 86-1569001 | / |
| Reverse microscope AE31E trinocular | Grosseron | M097917 | / |
| Sterile graduated pipette | Sarstedt | 1254001 | 10 mL |
| Thymus essential oil | Drugstore | Essential oil 100% | |
| Tips 1000 µL | Sarstedt | 70.762010 | |
| Tips 20 µL | Sarstedt | 70.760012 | |
| Tips 200 µL | Sarstedt | 70.760002 | |
| Tooth pick | retail store | ||
| Trichoderma spp strain | Strain of LRPIA laboratory | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379-250ML | |
| Tween-80 | Sigma | P1754-1L | |
| Tweezers | Labbox | FORS-001-002 | / |
References
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