Summary
Vi beskriver en modificeret agarbaseret metode designet til at kvantificere de svampedræbende virkninger af plantebaserede produkter. Både volatile og ikke-volatile bidrag til svampeaktiviteten kan vurderes ved hjælp af denne protokol. Derudover kan effekten mod svampe måles på centrale udviklingsstadier i et enkelt eksperimentelt setup.
Abstract
Den beskrevne protokol er baseret på en plug-transfer-teknik, der giver mulighed for nøjagtig bestemmelse af mikroorganismemængder og deres udviklingsstadier. Et bestemt antal sporer spredes på en agarplade. Denne agarplade inkuberes i en bestemt periode, så svampene kan nå det forventede udviklingsstadium, undtagen sporer, hvor inkubation ikke er påkrævet. Agar stik dækket af sporer, hyphae, eller mycelium er næste trukket tilbage og overføres til agar medier, der indeholder svampedræbende forbindelse, der skal testes enten placeret i en afstand fra svampe eller i kontakt. Denne metode anvendes til test af både flydende ekstrakter og faste prøver (pulvere). Det er især velegnet til at kvantificere de relative bidrag fra flygtige og ikke-flygtige stoffer i bioaktive blandinger og til bestemmelse af deres virkninger, specielt på sporer, tidlig hyphae og mycelium.
Metoden er yderst relevant for karakteriseringen af biokontrolprodukters svampedræbende aktivitet, navnlig planteafledte produkter. Til plantebehandling kan resultaterne faktisk bruges til at vejlede valget af anvendelsesmåde og til at fastsætte udløsertærsklerne.
Introduction
Globale tab af frugt og grøntsager kan nå op til 50% af produktionen1 og skyldes hovedsagelig mad henfald forårsaget af svampe fordærv i marken eller under post-høst opbevaring2,3, på trods af den omfattende beskæftigelse af syntetiske fungicider siden midten af det tyvende århundrede4. Anvendelsen af disse stoffer tages op til fornyet overvejelse, da det udgør alvorlige miljø- og sundhedsrisici. Da de skadelige konsekvenser af deres anvendelse viser sig i hele økosystemerne , og der er indsamlet dokumentation for potentielle sundhedsmæssige virkninger5,6, udvikles der nye alternativer til gamle profylaktiske strategier til behandling før og efterhøsten 7,8,9. Derfor er den udfordring, vi står over for, dobbelt. Nye svampedræbende strategier skal for det første opretholde niveauet for fødevaresikkerhed mod fytopatogener og samtidig bidrage til en drastisk reduktion af landbrugspraksissens miljømæssige fodaftryk. For at opfylde dette ambitiøse mål foreslås strategier inspireret af det naturlige forsvar udviklet i planter, da mere end 1000 plantearter er blevet fremhævet for deres antimikrobielle egenskaber8. For eksempel er planter, der har udviklet naturlige fungicider til bekæmpelse af fytopathogens, en ny ressource i at udforske udviklingen af nye biokontrolprodukter2. Æteriske olier er flagskib molekyler af denne type. For eksempel beskytter Origanum æterisk olie tomatplanter mod grå skimmelsvamp i drivhuse 10 og Solidago canadensis L. og cassia æteriske olier har vist sig at bevare post-høstede jordbær fra grå skimmel skader11,12. Disse eksempler illustrerer, at biokontrol og især plantebaserede produkter udgør en løsning, der kombinerer biologisk effektivitet og miljømæssig bæredygtighed.
Således er planter en vigtig ressource af molekyler af potentiel interesse for afgrødebeskyttelsesindustrien. Der er imidlertid kun foreslået en håndfuld planteprodukter, der skal anvendes som biokontrolprodukter, selv om de generelt anerkendes som sikre, ikke-fytotoksiske og miljøvenlige2. Der er konstateret visse vanskeligheder i forbindelse med gennemførelsen fra laboratoriet til marken , f.eks. Således bliver det vigtigt at forbedre muligheden for lab tests til bedre at forudsige felteffektivitet. I denne forbindelse er svampedræbende testmetoder for planteafledte produkter nødvendige både for at evaluere deres svampedræbende virkning og for at definere deres optimale anvendelsesbetingelser. Specifikt er biokontrolprodukter generelt mindre effektive end kemiske fungicider, så en bedre forståelse af deres virkningsmåde er vigtig for at foreslå passende formuleringer, identificere anvendelsesmåden på områder og definere, hvilken udviklingsstadium af patogenet der er sårbar over for kandidatbioproduktet.
De nuværende metoder til antibakterielle og svampedræbende aktiviteter omfatter diffusionsmetoder såsom diffusion af agardisketter, fortynding, bioautografi og flowcytometri13. De fleste af disse teknikker, og mere specifikt, standard antifungal modtagelighed test - agar-disk diffusion og fortynding assays - er velegnede til vurdering af antimikrobiel aktivitet opløselige forbindelser på bakterielle og svampesporer i flydende suspensioner14. Disse metoder er dog generelt ikke egnede til at teste faste forbindelser såsom tørret plantepulver eller til at kvantificere svampedræbende aktivitet under myceliumvækst, da de kræver sporefortynding eller sporespredning på agarplader og / eller fortynding af svampedræbende forbindelser13. I den fødevaregiftede metode podes agarplader, der indeholder svampedræbende middel, med en 5-7 mm diameter disk udtaget fra en 7-dages gammel svampekultur uden at overveje den nøjagtige mængde start mycelium. Efter inkubation bestemmes svampedræbende aktivitet som en procentdel af radialvæksthæmning17,18,19. Med denne tilgang kan vi evaluere svampedræbende aktivitet på mycelial vækst. Derimod udføres agarfortyndingsmetoden for at bestemme svampedræbende aktivitet på sporer, der er direkte podet på overfladen af agarpladen, der indeholder svampedræbende forbindelser13,20,21. Disse to tilgange giver komplementære resultater med antifungal aktivitet. Men disse er to uafhængige teknikker, der anvendes parallelt, som ikke giver nøjagtig side-by-side sammenligning af den relative effekt af svampedræbende forbindelser på sporer og mycelium17,20,22 da mængden af startvalsemateriale varierer i de to tilgange. Desuden skyldes den svampedræbende aktivitet af et planteafledt produkt ofte kombinationen af svampedræbende molekyler syntetiseret af planter til ansigt patogener. Disse molekyler omfatter proteiner, peptider23,24, og metabolitter med bred kemisk diversitet og tilhører forskellige klasser af molekyler såsom polyfenoler, terpener, alcaloïds25, glucosinolater8, og organosulfurforbindelser26. Nogle af disse molekyler er flygtige eller bliver flygtige under patogenangreb27. Disse midler er oftest dårligt vandopløselige og højdamptryksforbindelser, der skal genvindes gennem vanddestillation som æteriske olier, hvoraf nogle antimikrobielle aktiviteter er veletablerede.28. Dampfase medieret modtagelighed assays er blevet udviklet til at måle antimikrobiel aktivitet af flygtige forbindelser efter fordampning og migration via damp fase29. Disse metoder er baseret på indførelsen af svampedræbende forbindelser i en afstand fra den mikrobielle kultur29,30,31,32,33. I den almindeligt anvendte dampfase agaranalyse deponeres æteriske olier på en papirdisk og placeres i midten af dækslet af petriskålen i afstand fra bakteriel eller svampesporeaffjedring, som spredes på agar medium. Diameteren af væksthæmmende zone måles derefter på samme måde som for agar-disk diffusionsmetoden20,24. Der er udviklet andre metoder til kvantitativ måling af æteriske oliers antifungale modtagelighed i dampfasen, der stammer fra bouillonfortyndingsmetoden, hvorfra der blev beregnet en hæmmende dampfasemedieret antimikrobiel aktivitet.32, eller fremstillet af diffusionsanalyser af agar-disk31. Disse metoder er generelt specifikke for dampfaseaktivitetsundersøgelser og ikke egnede til kontakthæmmende assays. Dette udelukker bestemmelse af det relative bidrag fra flygtige og ikke-flygtige stoffer til svampedræbende aktivitet i en kompleks bioaktiv blanding.
Den kvantitative metode, vi har udviklet, har til formål at måle den svampedræbende virkning af tørret plantepulver på kontrollerede mængder sporer og dyrket mycelium deponeret på overfladen af et agarmedium for at reproducere luftvæksten af fytopathogens under infektion af planter15 samt et sammenkoblet mycelialt netværk16. Tilgangen er en modificeret eksperimentel opsætning baseret på agarfortynding og fødevaregifte metoder, der også i samme eksperimentelle opsætning muliggør side om side kvantificering af bidraget fra både flygtige og ikke-flygtige svampedræbende metabolitter. I denne undersøgelse er metoden blevet benchmarket mod aktiviteten af tre velkaraktererede svampedræbende præparater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Podning af inocula
- Før forsøget lå 5 μL Trichoderma spp. SBT10-2018 sporer oplagret ved 4 °C på kartoffeldextrose agar medium (PDA) og inkuberes i 4 dage ved 30 °C med regelmæssig lyseksponering for at fremme conidiadannelse42 (Figur 1, panel A).
BEMÆRK: Trichoderma spp. SBT10-2018 er blevet isoleret fra træ og bruges som model i denne undersøgelse for sin hurtige vækst og lette sporegenvinding. Denne stamme er bevaret af vores laboratorium. - Gendan conidia (Figur 1, panel A)
- Læg 3 mL på 0,05% Tween-20 på Trichoderma mycelium.
- Brug en rake til at frigøre conidia fra conidiophores; undgå at trykke ned på myceliet for at forhindre, at hyphae rives væk.
- Opløsningen genvindes hurtigt med en mikropipette for at undgå, at den absorberes af agarmediet og overføres til et 15 ml rør.
- Det samlede antal sporer, der bruger et hæmocytometer, og forbered en opløsning, der indeholder 3 x 106 sporer/mL.
BEMÆRK: Dette trin skal udføres omhyggeligt for at forhindre, at hyphae udvindes. Sporeforberedelse kontrolleres derefter under mikroskop. Til sidst, for stammer præsenterer meget luft-og fluffy mycelium, et trin af filtrering ved hjælp af 40 μM si filter kan tilsættes for at fjerne resterende mycelium fragment.
2. Forberedelse af svampeplader(figur 1,panel B)
- Der aflejres 100 μL på 3 x 106 sporer/mL med mikropipette på petriskål med en diameter på 9 cm med PDA-medium for at opnå 4.800 sporer/cm2 svarende til 925 sporer/5 mm diameter-agar-stik.
- Der tilsættes 10 g glasperler med en diameter på 2 mm med en steril spatel, og bevægelserne frem og tilbage udføres parallelt og vinkelret på operatørens arm for at fordele sporerne jævnt på agarens overflade.
- Pladen roteres med 90°, og de roterende bevægelser gentages (som i punkt 2.2). gentag disse trin, indtil pladen er drejet helt.
- Brug pladen straks til at opstille forsøg, der kræver sporer eller inkuberer pladerne ved henholdsvis 30 °C i 17 timer eller 24 timer, når der er behov for tidlig hyphae eller mycelium.
BEMÆRK: For at sammenligne svampedræbende aktivitet målt efter mycelium plug-transfer og mycelium disk-overførsel, skal du bruge steril pincet og sted sterile 5 mm cellulose diske tilfældigt på overfladen af agar plade efter spore spredning.
3. Forberedelse af svampedræbende forbindelser
- Vegetabilsk produktforberedelse: tilberedning af hvidløgspulver
- Skræl fed af frisk hvidløg og skær fed i 2-3 mm brede skiver ved hjælp af en skalpelblad.
- Skiverne lufttørres i 2 dage ved 40 °C.
- Slib skiverne i 3 x 15 sekunder ved hjælp af en knivmølle for at opnå et fint pulver.
- Hvidløgspulveret opbevares ved 4 °C i 50 mL rør inden brug.
BEMÆRK: Da hvidløg ikke er autoklaveret (for at forhindre nedbrydning af temperaturfølsomme svampemidler), rengøres kværnen, skalpellen og lufttørreren med 70% ethanol før brug.
- Præparat af æterisk olie
- Forbered 0,5%, 1%, 2,5%, 5% og 20% Thymus vulgaris æteriske olieopløsninger i 0,5% Tween-80.
- Bland godt for at danne en emulsion, før du tilføjer den i PDA-mediet (se afsnit 4.2).
- Carbendazim præparat
- Veje carbendazim at forberede en 200 mg / L ethanol løsning (carbendazim er dårligt opløseligt i vand).
- Opløsningen opbevares ved stuetemperatur, før den tilsættes til PDA-mediet (se punkt 4.2).
ADVARSEL: Carbendazim udgør en sundheds- og miljørisiko. Brug handsker og maske, når du håndterer dette produkt. Opbevar den i et ventileret rum.
4. Kontakt-hæmning analyse
- Fremstilling af agarplader indeholdende hvidløgspulver
- Forbered og autoklave PDA medium.
- Den ønskede mængde hvidløgspulver vejes i et 50 mL rør ved hjælp af en steril spatel for at opnå koncentrationer, der generelt spænder fra 0,25 mg/mL til 16 mg/mL.
- Tilsæt 10 mL PDA efter at have kontrolleret mediets temperatur på indersiden af håndleddet. Temperaturen skal være så lav som muligt for at forhindre nedbrydning af følsomme molekyler. Ideelt set bør denne temperatur være 45 °C.
- Homogeniser forsigtigt ved at vende røret på hovedet for jævnt at fordele pulveret i PDA-mediet. Hæld hurtigt 10 mL i en petriskål med en diameter på 5 cm(figur 1,panel C).
- Med Petri parabol placeret ved stuetemperatur, vente, indtil agar størkner.
- Fremstilling af agarplader indeholdende flygtige vegetabilske olier eller carbendazim
- Der indføres 10 mL PDA i et 50 mL rør. Temperaturen kontrolleres i punkt 4.1.3.
- Der tilsættes 100 μL af thymus vulgaris æterisk olie i PDA for at opnå 0,005%, 0,01%, 0,025%, 0,05% og 0,2% opløsninger (se afsnit 3.2.1).
- Den krævede mængde carbendazim tilsættes fra 200 mg/l-opløsningen for at opnå opløsninger fra 0,0625-2 mg/l (se afsnit 3.3.1).
- Homogeniser forsigtigt ved at dreje røret på hovedet, hæld hurtigt 10 mL i en 5 cm diameter Petri skål(Figur 1, panel C).
- Med Petri parabol placeret ved stuetemperatur, vente, indtil agar størkner.
- Kontakthæmmende analyse (Figur 1)
- Med et sterilt rør i rustfrit stål med en diameter på 5 mm skal du plotte en cirkel i midten af petriskåle, der indeholder enten PDA eller PDA, herunder svampedræbende forbindelser. Agarcylinderen skal bortskaffes med en steril tandstikker (panel C).
- Med et sterilt rør i rustfrit stål med en diameter på 5 mm cirkler du tilfældigt ind i svampepladerne fra afsnit 2. Plot mellem 15-20 cirkler pr plade (panel B).
- Træk forsigtigt agarcylindrene dækket af sporer, tidlig hyphae eller mycelium med en steril tandstikker tilbage, og placer stikkene i det tomme rum af petriskåle, der indeholder enten PDA eller PDA, herunder svampedræbende forbindelser (panel C).
- Pladerne med sporer indeholder 48 timer ved 30 °C, 31 timer for pladerne med tidlig hyphae og 24 timer for plader dækket af mycelium (panel C).
- Mål diameteren af radial vækst og beregn procentdelen af svampevæksthæmning over kontrol ved hjælp af formlen (panel D)
% hæmning af svampevækst = (C - A/C)* 100
hvor C er diameteren af radial vækst i PDA-medium og A diameteren af radial vækst i PDA medium, der indeholder svampedræbende forbindelser.
BEMÆRK: For at sammenligne svampedræbende aktivitet målt efter mycelium plug-transfer og mycelium disk-overførsel, ved hjælp af steril pincet, overføre en 5 mm diameter disk tidligere deponeret på overfladen af svampeplader (punkt 2 note) i midten af Petri retter, der indeholder enten PDA eller PDA indeholder svampedræbende forbindelser og fortsætte præcis som for agar-plug overførsel
5. Dampfase hæmning analyse
- Fremstilling af agarplader indeholdende hvidløgspulver
- Fortsæt som i punkt 3.1.
- Fremstilling af agarplader indeholdende flygtige vegetabilske olier eller carbendazim
- Fortsæt som i punkt 3.2 og 3.3.
- Fremstilling af svampeplader
- Fortsæt som i afsnit 2.
- Dampfase antifungal hæmningsanalyse (Figur 1)
- Der hældes 10 mL PDA-medium i låget på petriskålene med en diameter på 5 cm, der indeholder enten 10 mL PDA-medium eller 10 mL PDA-medium indeholdende svampedræbende forbindelser i bunden af opvasken. Vent til fuldstændig størkning af agaren ved stuetemperatur (panel C).
- Brug et 50 mL centrifugalrør som kalibreringsværktøj til at opnå en cirkel af PDA i midten af låget; fjerne PDA rundt om cirklen med en steril spatel (panel C).
- Plot en cirkel i midten af PDA medium placeret i låget med en 5 mm diameter steril rustfrit stål rør. Kassér agarcylinderen med en steril tandstikker (panel C).
- Form stik med en 5 mm diameter sterilt rustfrit stål rør tilfældigt ind i svampeplader som i punkt 4.3.2 (panel B).
- Ved hjælp af en steril tandstikker, forsigtigt overføre stik dækket enten med sporer, tidlig hyphae, eller mycelium fra svampeplader i låg af assay plader (panel C).
- Inkuber ved 30 °C som i punkt 4.3.4 (panel C).
- Diameteren af radialvækst måles, og procentdelen af svampevæksthæmmere beregnes ved hjælp af formlen i afsnit 4.3.5 (panel D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at evaluere den kvantitative metodes evne til at diskriminere virkningsmåden for forskellige typer svampemidler, sammenlignede vi effekten af tre velkendte svampemidler. Carbendazim er et ikke-flygtigt syntetisk fungicid , som i vid udstrækning er blevet anvendt til at kontrollere en bred vifte af svampesygdomme i planter39,40. Thymus vulgaris æterisk olie er i vid udstrækning blevet beskrevet for sin antibakterielle og svampedræbende aktivitet og bruges som naturligt konserveringsmiddel til levnedsmidler41. Hvidløgspulver er valgt som model af et plantebaseret bioprodukt. Det har traditionelt været brugt som et naturligt middel med antimikrobielle aktiviteter, som i vid udstrækning er blevet tilskrevet tilstedeværelsen af flygtige organosulfurforbindelser, men også til tilstedeværelsen af ikke-flygtige saponiner og phenolforbindelser26, hvilket giver denne model en kompleksitet, der er relevant i denne undersøgelse.
Denne kvantitative metode er baseret på overførsel af agarpropper, der indeholder kontrollerede mængder svamp på forskellige udviklingsstadier fra sporer til mycelium, mens 5-dages til 7-dages gammelt mycelium overføres fra celluloseskiv13. I analysen blev sporer, tidlig hyphae (17 h inkubation) og mycelium (24 timers inkubation) brugt som startsvampmateriale. Brugen af diskoverførsel er muligvis ikke relevant, da conidia eller resthyphae forbliver i det mindste delvist på agarmediet efter diskoverførsel, hvilket efterfølgende fører til unøjagtig måling af væksthæmning som vist i figur 2. Forskellige diametre af svampe-radial vækst er blevet observeret efter overførsel af agar områder placeret under cellulose diske efterfulgt af 24 h inkubation (Figur 2, paneler A, B og C) fremhæver tilstedeværelsen af resterende svampehyphae på agar efter disk overførsel. Kvantificeringen af resthyfat er blevet bekræftet ved måling af vækst, der fører til en variabilitet med en diameter på op til 22 %(figur 2, panel D). Effekten på væksthæmning blev derefter evalueret ved hjælp af Thymus vulgaris æterisk olie som svampedræbende forbindelse og sammenlignet med hæmning opnået efter agar-plug overførsel (Figur 2, panel E). Væksthæmning efter diskoverførsel var højere end efter agar-plug-overførsel for lave Thymus-oliekoncentrationer, hvilket førte til en overvurdering af den hæmmende virkning, hvilket kan skyldes ufuldstændig overførsel af svampemateriale og understøtter tilgangen baseret på agar-plug-overførsel.
Trichoderma spp. SBT10-2018-væksthæmning udløst af de tre svampedræbende forbindelser blev næste gang evalueret ved hjælp af kontakt- og dampfasehæmmende assays for hvert svampestadie (Figur 3). Sporer blev omhyggeligt spredt på agarplader for at opnå 4.800 sporer / cm2. De blev direkte overført til agarplader, der indeholdt svampedræbende forbindelser gennem agar-plug ekstraktion ved hjælp af et 5 mm sterilt rustfrit stålrør, så eksperimentet kunne starte fra sporerne. I de to andre udviklingsstadier blev agarplader dækket med sporer først inkuberet i 17 timer eller 24 timer ved 30 °C, før agarproppen blev overført for at muliggøre spiring og tidlig udvikling af hyphae (17 timer) og myceliumdannelse (24 timer) (Figur 3, panel A). For at kvantificere aktive flygtige molekylers bidrag til den samlede svampedræbende aktivitet er kontakthæmmende assay blevet tilpasset, og sporer, tidlig hyphae og mycelium blev placeret i en afstand fra de svampedræbende forbindelser, der hældes i PDA-medium som for kontakthæmmende assay. Trichoderma-radialvækstblev målt over 48 timer, og procentdelen af hæmning er blevet bestemt i forhold til kontrolbetingelserne. Den minimale hæmmende koncentration (MIC) er blevet defineret som den laveste koncentration af svampedræbende forbindelser, der forhindrer synlig vækst efter 48 timers inkubation ved 30 °C.
Figur 3(panel B) viser højere sporefølsomhed over for carbendazim sammenlignet med tidlige hyphae- og myceliumnetværk med henholdsvis 50%, 22% og 30% væksthæmning ved henholdsvis 0,25 μg/mL carbendazim, når Trichoderma og svampedræbende forbindelser var i kontakt. Samtidig er der ved tidlig hyphae-forlængelse og mycelium opnået en MIC-værdi på 0,5 μg/mL ved sporspiring, mens der er opnået en stigning til 0,75 μg/mL ved tidlig hyphae-forlængelse og mycelium. Derimod havde carbendazim ingen svampedræbende virkning på Trichoderma, da svampen blev placeret i afstand fra fungiciden i overensstemmelse med den lave volatilitet af dette stof. De resultater, vi opnåede ved hjælp af Thymus vulgaris æterisk olie (TEO) som svampedræbende forbindelse(Figur 3,panel C) har vist en højere spore følsomhed over for TEO i forhold til tidlig hyphae og mycelium med 65% og ca 50% vækst hæmning på 0,01% TEO hhv. De opnåede MIC-værdier var de samme for sporespiring og tidlig hyphae-forlængelse (0,025% TEO) og højere for myceliumvækst (0,05% TEO). Som forventet præsenterede Thymus vulgaris æterisk olie identisk svampedræbende aktivitet uanset afstanden mellem svampen og olien. Lignende MIC-værdier (0,025% TEO) blev opnået ved sporespiring og tidlig hyphae-forlængelse for kontakt- og dampfaseanalyser, men i den lavere procentdel er der observeret en højere følsomhed, når TEO og Trichoderma sporer var i kontakt (60% væksthæmning i kontakt versus 45% væksthæmning ved afstand). Overraskende nok var MIC-værdierne opnået på myceliet forskellige i kontakt- og dampfasehæmmende assays (0,05% mod 0,1%) tyder på, at en del af de flygtige molekyler ikke er aktiv mod et veludviklet mycelium. Endelig er der ved anvendelse af hvidløgspulver som svampedræbende stof (figur 3, panel D) blev der observeret en højere effekt mod sporespiring (50% væksthæmmende ved 0,25 mg/mL hvidløgspulver og MIC-værdi på 0,5 mg/mL) og tidlig hyphae-forlængelse (0,5 mg/mL) og tidlig hyphae-forlængelse (0,5 mg/mL) 59% væksthæmning ved 0,25 mg/mL og MIC-værdi på 0,5 mg/mL) end for myceliumvækst (29% væksthæmning ved 0,5 mg/mL hvidløgspulver og MIC-værdi på 0,75 mg/mL). Ved sammenlignet med kontakt- og dampfaseanalyser har resultaterne vist et betydeligt fald i svampedræbende aktivitet på afstand uanset svampens udviklingsstadium. MIC-værdierne bevægede sig fra 0,5 mg/mL til 1 mg/mL for sporespiring, fra 0,5 mg/mL til 2 mg/mL for tidlig hyphae-forlængelse og fra 0,75 mg/mL til 4 mg/mL for myceliumvækst (Figur 3, panel D og figur 4 for repræsentative billeder). Så disse resultater tyder på, at hvidløgspulver indeholder en blanding af både flygtige og ikke-flygtige forbindelser med svampedræbende egenskaber.
Alt i alt viser disse resultater, at det relative bidrag fra flygtige og ikke-flygtige stoffer i plantebaserede produkter kan bestemmes i forskellige svampevækststadier, da forsøgsbetingelserne er sammenlignelige. Denne tilgang er så særlig velegnet til komplekse blandinger af svampedræbende forbindelser. Thymus vulgaris æterisk olie er en blanding af flygtige forbindelser og viser en lignende aktivitet på afstand og i kontakt for spore spiring og tidlig hyphae forlængelse, støtte sammenligningen af denne damp-fase og kontakt-hæmning assay og fremhæve, at migration i damp-fase ikke er svækket ved at hælde i agar medium. Resultaterne understreger også, at hvidløgspulver, der anvendes som model i denne undersøgelse, indeholder ikke-flygtige aktive komponenter, som har et betydeligt bidrag til den samlede svampedræbende aktivitet , og som er blevet forsømt til fordel for flygtige thiosulfinater afledt af allium27,28.
Figur 1: Synoptisk skema i protokollen for kontakt- og dampfaseanalyser Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Unøjagtighed i forbindelse med svampeoverførsel fra cellulosedisk. A. Ordning, der repræsenterer diskoverførsel til agarplader dækket af sporer og diskoverførsel til overfladen på agarplader indeholdende svampedræbende forbindelser B. Ordning, der repræsenterer agaroverførsel af områder under celluloseskinder efterfulgt af inkubation og restvækstmåling. C. Repræsentativt billede af radial vækst af resterende mycelium efter overførsel af områder under cellulose diske. D. Det er mig. Radial vækstmåling af rest mycelium. E. Effekt af Thymus vulgaris æterisk olie på væksten af mycelium overført fra cellulose disk eller agar-plug (N = 2, betyder ± SD) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Sammenligning af svampedræbende aktiviteter ved hjælp af dampfasen og kontakthæmmende assays på sporer, tidlig hyphae og mycelium. A. Det er ikke så lidt. Repræsentative billeder af Trichoderma sporer, tidlig hyphae (17 timers vækst) og mycelium (24 timers vækst). Trichoderma vækst hæmning af carbendazim (B), Thymus vulgaris æterisk olie (C) og hvidløgspulver (D). (N=2, middelværdi ± SD) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative billeder af hvidløgsantifungal aktivitet på agarplader i kontakt- (A) eller dampfase (B) hæmningsanalyser Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den fremgangsmåde, der præsenteres her, giver mulighed for evaluering af svampedræbende egenskaber ved minimalt forarbejdede plantebaserede produkter. I denne protokol opnås homogen fordeling af sporer på agaroverfladen ved hjælp af 2 mm glasperler. Dette trin kræver håndtering færdigheder til korrekt at distribuere perler og for at opnå reproducerbare resultater, i sidste ende gør det muligt at sammenligne svampedræbende virkninger på forskellige stadier af svampevækst. Vi fandt ud af, at 5 mm glasperler eller overdreven rotation under homogenisering under spredning kan forårsage variabel vækstdiameter. Derfor anbefaler vi træning til master spore distribution forud for eksperimenter. Når plantepulver skal testes, skal der desuden lægges vægt på homogen spredning af produktet i agarmediet. For at undgå, at pulveret sætter sig i bunden af pladen, skal produktet blandes i agarmedium, når det smeltede mediums temperatur når 45 °C (når rumtemperaturen er 24 °C). Denne temperatur skal justeres i henhold til den lokale rumtemperatur for at undgå sedimentering.
Mens den metode, vi beskriver her, kan give værdifuld indsigt, skal et par ulemper overvejes. Denne metode giver mulighed for nøjagtige sammenligninger og sammenligninger side om side i en enkelt eksperimentel opsætning på bekostning af en betydelig mængde forberedelsestid, da antallet af agarplader, der skal udarbejdes, kan være stort afhængigt af de spørgsmål, der skal besvares. Derudover er denne analyse en mellemstor analyse designet til 5 cm petriskåle. Derfor kan mængden af aktive stoffer, der kræves for at teste alle aspekter, være betydelig. Det betyder, at sjældne stoffer muligvis ikke er egnede testkandidater til denne protokol. En nedskalering af analysen kan overvejes ved hjælp af mindre petriskåle og reducere størrelsen af stikkene. Dette kan testes ved hjælp af benchmarkingprotokollen, der er beskrevet her, med særlig vægt på agar-plug-ekstraktionen, hvilket kan være vanskeligt. Nøjagtigheden af radialvækstmålinger kan reduceres i mindre målestok.
De nuværende metoder er egnede til måling af svampedræbende aktivitet af forbindelser i opløsning og mindre anvendelige til undersøgelse af pulvere13. Den tilgang, vi har etableret, er velegnet til både flydende og faste forbindelser, hvilket gør det muligt at evaluere svampedræbende egenskaber ved minimalt forarbejdede plantebaserede produkter. Dette reducerer den tid, det tager at teste ekstrakter og reducerer faldgruber relateret til aktive stoffer, der udviser dårlig opløselighed. Da nogle plantebaserede produkter indeholder aktive molekyler, der er følsomme over for høj temperatur43, giver dette fordelen ved at begrænse risikoen for tab af aktivitet af sådanne forbindelser. Denne tilgang er blevet tilpasset fra agar-diffusionsmetoden og fødevaregiftsmetoden15,16,17,18,19 for desuden at muliggøre direkte sammenligning af svampedræbende aktiviteter på forskellige svampevækststadier ved hjælp af lignende eksperimentelle indstillinger. Agar-plug overførsel giver mulighed for nøjagtig kontrol af mængden af mikroorganismer inden for analysen. Dette er en fordel i forhold til diskoverførsel, hvilket fører til overvurdering af svampedræbende virkninger forbundet med ufuldstændig overførsel af sporer eller hyphae. Endelig, mens dampfaseanalyser generelt ikke anvendes på kontakthæmmende assays27,28,29,30,31, adresserer den metode, vi foreslår, de relative bidrag fra flygtige og ikke-flygtige stoffer indeholdt i komplekse blandinger som plantepulver eller ekstrakter og tillader i sidste ende evaluering af svampedræbende aktiviteter i forskellige svampevækststadier.
Den tilgang, vi beskriver her, kan være særlig relevant for at understøtte behovet for metoder, der vurderer svampedræbende egenskaber i plantebaserede produkter til biokontrol. Den kvantitative metode, vi foreslår, gør det muligt for operatørerne at bestemme de respektive bidrag fra flygtige og ikke-flygtige forbindelser til svampedræbende aktivitet i en kompleks bioaktiv blanding. Dette giver værdifulde oplysninger, der kan guide valget af anvendelsesmåder for behandlingen og relevansen af at udføre væskeudvinding. Anvendelser, der kan overvejes i en afstand fra den målrettede fytopat (f.eks. inkludering af biokontrolproduktet i en emballage) eller kan have brug for direkte kontakt for at optimere biokontrolproduktets effektivitet (forstøvning på planter eller dypning af frugt i en opløsning af biokontrolproduktet). Det giver også mulighed for sammenligning af svampedræbende effekt i forskellige svampevækststadier fra sporespiring til senere myceliumvækst, hvilket fører til definitionen af anbefalinger til fastsættelse af kontroltærskler, der kræves for at anvende biokontrolprodukter på afgrøder. En definition af stoffernes virkning på forskellige svampestadier kan faktisk bidrage til at kategorisere, om stoffer kan anvendes som forebyggende eller helbredende behandlinger, og til at planlægge tidsplanen for plantebehandlinger med biokontrolprodukter. Dette er afgørende for at udnytte produkternes effektivitet, når de anvendes i marken eller efter høsten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ingen
Acknowledgments
Vi er Frank Yates meget taknemmelige for hans dyrebare råd. Dette arbejde blev støttet af Sup'Biotech.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave-vacuclav 24B+ | Melag | ||
| Carbendazim | Sigma | 378674-100G | |
| Distilled water | |||
| Eppendorf tubes | Sarstedt | 72.706 | 1.5 mL |
| Falcons tubes | Sarstedt | 547254 | 50 mL |
| Five millimeters diameter stainless steel tube | retail store | / | |
| Food dehydrator | Sancusto | six trays | |
| Garlic powder | Organic shop | ||
| Glass beads | CLOUP | 65020 |  2 mm |
| Hemocytometer counting cell | Jeulin | 713442 | / |
| Incubator | Memmert | UM400 | 30 °C |
| Knife mill | Bosch | TSM6A013B | |
| Manual cell counter | Labbox | HCNT-001-001 | / |
| Measuring ruler | retail store | ||
| Microbiological safety cabinets | FASTER | FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2 | |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014407 | 100 - 1000 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014411 | 20 - 200 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014412 | 2 - 20 µL |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1194500 | 55 mm |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1473 | 90 mm |
| Pipette Controllers-EASY 60 | Labbox | EASY-P60-001 | / |
| Potato Dextrose Agar | Sigma | 70139-500G | |
| Precision scale-RADWAG | Grosseron | B126698 | AS220.R2-ML 220g/0.1mg |
| Rake | Sarstedt | 86-1569001 | / |
| Reverse microscope AE31E trinocular | Grosseron | M097917 | / |
| Sterile graduated pipette | Sarstedt | 1254001 | 10 mL |
| Thymus essential oil | Drugstore | Essential oil 100% | |
| Tips 1000 µL | Sarstedt | 70.762010 | |
| Tips 20 µL | Sarstedt | 70.760012 | |
| Tips 200 µL | Sarstedt | 70.760002 | |
| Tooth pick | retail store | ||
| Trichoderma spp strain | Strain of LRPIA laboratory | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379-250ML | |
| Tween-80 | Sigma | P1754-1L | |
| Tweezers | Labbox | FORS-001-002 | / |
References
- FAO. Global food losses and food waste - Extent, causes and prevention. FAO. , Rome. (2011).
- da Cruz Cabral, L., Fernández Pinto, V., Patriarca, A. Application of plant compounds to control fungal spoilage and mycotoxin production in foods. International Journal of Food Microbiology. 166 (1), 1-14 (2013).
- Romanazzi, G., Smilanick, J. L., Feliziani, E., Droby, S. Postharvest biology and technology integrated management of postharvest gray mold on fruit crops. Postharvest Biology and Technology. 113, (2016).
- Morton, V., Staub, T.
- Brandhorst, T. T., Klein, B. S. Uncertainty surrounding the mechanism and safety of the post- harvest fungicide Fludioxonil. Food and Chemical Toxicology. 123, 561-565 (2019).
- Bénit, P., et al. Evolutionarily conserved susceptibility of the mitochondrial respiratory chain to SDHI pesticides and its consequence on the impact of SDHIs on human cultured cells. PLoS ONE. 14 (11), 1-20 (2019).
- Usall, J., Torres, R., Teixidó, N. Biological control of postharvest diseases on fruit: a suitable alternative. Current Opinion in Food Science. 11, 51-55 (2016).
- Tripathi, P., Dubey, N. K. Exploitation of natural products as an alternative strategy to control postharvest fungal rotting of fruit and vegetables. Postharvest Biology and Technology. 32 (3), 235-245 (2004).
- Abbey, J. A., et al. Biofungicides as alternative to synthetic fungicide control of grey mould (Botrytis cinerea)-prospects and challenges. Biocontrol Science and Technology. 29 (3), 241-262 (2019).
- Soylu, E. M., Kurt, Ş, Soylu, S. In vitro and in vivo antifungal activities of the essential oils of various plants against tomato grey mould disease agent Botrytis cinerea. International Journal of Food Microbiology. 143 (3), 183-189 (2010).
- Liu, S., Shao, X., Wei, Y., Li, Y., Xu, F., Wang, H. Solidago canadensis L. essential oil vapor effectively inhibits botrytis cinerea growth and preserves postharvest quality of strawberry as a food model system. Frontiers in Microbiology. 7, 0-9 (2016).
- El-Mogy, M. M., Alsanius, B. W. Cassia oil for controlling plant and human pathogens on fresh strawberries. Food Control. 28 (1), 157-162 (2012).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Arikan, S. Current status of antifungal susceptibility testing methods. Medical Mycology. 45 (7), 569-587 (2007).
- Girmay, Z., Gorems, W., Birhanu, G., Zewdie, S. Growth and yield performance of Pleurotus ostreatus (Jacq. Fr.) Kumm (oyster mushroom) on different substrates. AMB Express. 6 (1), 87 (2016).
- Fischer, M. S., Glass, N. L. Communicate and fuse: how filamentous fungi establish and maintain an interconnected mycelial network. Frontiers in Microbiology. 10, 1-20 (2019).
- Mohana, D. C., Raveesha, K. A. Anti-fungal evaluation of some plant extracts against some plant pathogenic field and storage fungi. Journal of Agricultural Technology. 4 (1), 119-137 (2007).
- Balamurugan, S. In vitro activity of aurantifolia plant extracts against phytopathogenic fungi phaseolina. International Letters of Natural Sciences. 13, 70-74 (2014).
- Ameziane, N., et al. Antifungal activity of Moroccan plants against citrus fruit pathogens. Agronomy for sustainable development. 27 (3), 273-277 (2007).
- Rizi, K., Murdan, S., Danquah, C. A., Faull, J., Bhakta, S. Development of a rapid, reliable and quantitative method - "SPOTi" for testing antifungal efficacy. Journal of Microbiological Methods. 117, 36-40 (2015).
- Imhof, A., Balajee, S. A., Marr, K., Marr, K. New methods to assess susceptibilities of Aspergillus isolates to caspofungin. Microbiology. 41 (12), 5683-5688 (2003).
- Goussous, S. J., Abu el-Samen, F. M., Tahhan, R. A. Antifungal activity of several medicinal plants extracts against the early blight pathogen (Alternaria solani). Archives of Phytopathology and Plant Protection. 43 (17), 1745-1757 (2010).
- Ng, T. B. Antifungal proteins and peptides of leguminous and non-leguminous origins. Peptides. 25 (7), 1215-1222 (2004).
- Hu, Z., Zhang, H., Shi, K. Plant peptides in plant defense responses. Plant Signaling and Behavior. 13 (8), (2018).
- Iriti, M., Faoro, F. Chemical diversity and defence metabolism: How plants cope with pathogens and ozone pollution. International Journal of Molecular Sciences. 10 (8), 3371-3399 (2009).
- Lanzotti, V., Bonanomi, G., Scala, F. What makes Allium species effective against pathogenic microbes. Phytochemistry Reviews. 12 (4), 751-772 (2013).
- Kyung, K. H.
- Hyldgaard, M., Mygind, T., Meyer, R. L. Essential oils in food preservation: mode of action, synergies, and interactions with food matrix components. Frontiers in microbiology. 3, 12 (2012).
- Bueno, J. Models of evaluation of antimicrobial activity of essential oils in vapour phase: a promising use in healthcare decontamination. Natural Volatiles & Essential Oils. 2 (2), 16-29 (2015).
- Doi, N. M., Sae-Eaw, A., Suppakul, P., Chompreeda, P. Assessment of synergistic effects on antimicrobial activity in vapour- and liquidphase of cinnamon and oregano essential oils against Staphylococcus aureus. International Food Research Journal. 26 (2), 459-467 (2019).
- Amat, S., Baines, D., Alexander, T. W. A vapour phase assay for evaluating the antimicrobial activities of essential oils against bovine respiratory bacterial pathogens. Letters in Applied Microbiology. 65 (6), 489-495 (2017).
- Feyaerts, A. F., et al. Essential oils and their components are a class of antifungals with potent vapour-phase-mediated anti-Candida activity. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Wang, T. H., Hsia, S. M., Wu, C. H., Ko, S. Y., Chen, M. Y., Shih, Y. H., Shieh, T. M., Chuang, L. C. Evaluation of the antibacterial potential of liquid and vapor phase phenolic essential oil compounds against oral microorganisms. PLoS ONE. 11 (9), 1-17 (2016).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Leadbeater, A. Recent developments and challenges in chemical disease control. Plant Protection Science. 51 (4), 163-169 (2015).
- Jin, C., Zeng, Z., Fu, Z., Jin, Y. Oral imazalil exposure induces gut microbiota dysbiosis and colonic inflammation in mice. Chemosphere. 160, 349-358 (2016).
- Kumar, R., Ghatak, A., Balodi, R., Bhagat, A. P. Decay mechanism of postharvest pathogens and their management using non-chemical and biological approaches. Journal of Postharvest Technology. 6 (1), 1-11 (2018).
- Talibi, I., Boubaker, H., Boudyach, E. H., Ait Ben Aoumar, A. Alternative methods for the control of postharvest citrus diseases. Journal of Applied Microbiology. 117 (1), 1-17 (2014).
- Arya, R., Sharma, R., Malhotra, M., Kumar, V., Sharma, A. K. Biodegradation Aspects of Carbendazim and Sulfosulfuron: Trends, Scope and Relevance. Current Medicinal Chemistry. 22 (9), 1147-1155 (2015).
- European Food Safety Authority. Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance carbendazim. EFSA Journal. 8 (5), 1-76 (2010).
- Sakkas, H., Papadopoulou, C. Antimicrobial activity of basil, oregano, and thyme essential oils. Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (3), 429-438 (2017).
- Steyaert, J. M., Weld, R. J., Mendoza-Mendoza, A., Stewart, A. Reproduction without sex: conidiation in the filamentous fungus Trichoderma. Microbiology. 156, Reading, England. Pt 10 2887-2900 (2010).
- Leontiev, R., Hohaus, N., Jacob, C., Gruhlke, M. C. H., Slusarenko, A. J. A Comparison of the antibacterial and antifungal activities of thiosulfinate analogues of allicin. Scientific Reports. 8 (1), 1-19 (2018).
- Scorzoni, L., et al. The use of standard methodology for determination of antifungal activity of natural products against medical yeasts Candida sp and Cryptococcus sp. Brazilian Journal of Microbiology. 38 (3), 391-397 (2007).
