Vi præsenterer to forskellige farvning protokoller for NKG2D ligand (NKG2DL) afsløring i humane primære akut myeloid leukæmi (AML) prøver. Den første tilgang er baseret på et fusionsprotein, der er i stand til at genkende alle kendte og potentielt endnu ukendte ligands, mens den anden protokol er afhængig af tilsætning af flere anti-NKG2DL-antistoffer.
Inden for samme patient viste fraværet af NKG2D-ligands (NKG2DL) overfladeudtryk at skelne leukæmiske delpopulationer med stamcelleegenskaber (såkaldte leukæmiske stamceller, LSC’er) fra mere differentierede modstykke leukæmiceller, der mangler sygdomsinitieringspotentiale, selvom de bærer lignende leukæmispecifikke genetiske mutationer. NKG2DL er biokemisk meget forskellige MHC klasse I-lignende selvmolekyler. Raske celler i homeostatic betingelser generelt ikke udtrykke NKG2DL på cellens overflade. I stedet fremkaldes ekspressionen af disse ligands ved eksponering for cellulær stress (f.eks. onkogen transformation eller infektiøse stimuli) for at udløse eliminering af beskadigede celler via lysis gennem NKG2D-receptor-udtrykke immunceller som naturlige dræberceller (NK). Interessant nok undertrykkes NKG2DL-overfladeudtryk selektivt i LSC-delpopulationer, så disse celler kan undgå NKG2D-medieret immunovervågning. Her præsenterer vi en side om side-analyse af to forskellige flowcytometrimetoder, der gør det muligt at undersøge NKG2DL-overfladeudtryk på kræftceller, dvs. en metode, der involverer pan-ligand-anerkendelse og en metode, der involverer farvning med flere antistoffer mod enkeltligaler. Disse metoder kan bruges til at adskille levedygtige NKG2DL negative cellulære delpopulationer med formodede kræft stamcelle egenskaber fra NKG2DL positive ikke-LSC.
NK-celler er vigtige effektorer i det medfødte immunsystem, der kan genkende og eliminere ondartede celler eller stressede raske celler (f.eks. ved en virusinfektion) uden forudgående antigenstimulation1. Denne proces er stramt reguleret via et komplekst repertoire af aktiverende receptorer – såsom naturlige cytotoksicitetsreceptorer (NCR’er), NKG2D og CD16 – og hæmmende receptorer, der i vid udstrækning repræsenteres af dræber immunoglobulinlignende receptorer (KIRs)2. Binding af KIR’er til humane leukocytantigen (HLA) klasse I molekyler på somatiske celler sikrer selvgenkendelse og formidler NK celletolerance. På den anden side udløser fraværet af selvgenkendelse og øget binding af aktiverende receptorer til deres ligands på målcellerne frigivelsen af cytotoksiske granulater, der fører til NK cellemedieret cytotoksicitet1. Endelig kan NK-celler udøve antistofafhængig cellulær cytotoksicitet (ADCC) ved at binde den aktiverende receptor CD16 til mål, der udtrykker Fc-delen af Ig (FcR)2. Bortset fra direkte cytotoksicitet kan NK-celler også udløse cytokinfrigivelse, der forbinder det medfødte med det adaptive immunsystem3.
NKG2D er en vigtig aktiverende receptor udtrykt på NK, NKT, γδ T og naive CD8+ T-celler4, der gør det muligt for sådanne cytotoksiske immunceller at genkende og lyse NKG2D ligand (NKG2DL), der udtrykker målceller. Raske celler udtrykker normalt ikke NKG2DL. I stedet er NKG2DL-udtryk upreguleret på ondartede eller virusinficerede celler for at gøre disse modtagelige for immunfrigang5.
Den menneskelige NKG2DL-familie består af otte kendte molekyler, blandt hvilke de to MHC I kæderelaterede molekyler A og B (MICA og MICB6) og cytomegalovirus UL16-bindende proteiner 1-6 (ULBP1-67). Udtrykket af NKG2DL er reguleret på transskriptionelle, post-transskriptionelle samt post-translationelle niveauer8. Som sådan, mens NKG2DL udtryk er almindeligt ikke påvises på overfladen af raske celler, NKG2DL mRNA9 og intracellulære protein udtryk blev rapporteret i sundt væv. Den funktionelle relevans af et sådant udtryk og de mekanismer , der ligger til grund for sådanne diskrete udtryksmønstre , mangler stadig at blive defineret10.
Den mekanistiske regulering af NKG2DL-ekspressionen i kræftcellerne er et fascinerende undersøgelsesområde. Veje, der vides at være involveret i enten cellulær stress,f.eks. Men selv om overfladeudtryk af NKG2DL er blevet effektivt induceret, kan dette udtryk gå tabt igen gennem proteolytisk medieret afgivelse, en mekanisme forbundet med immunflugt og dårlig klinisk prognose i nogle kræftformer13.
Fraværet af celleoverfladeNKG2DL kan også spille vigtige roller hos patienter med AML. Her fremkalder behandling med intensiv kemoterapi ofte remission, men tilbagefald opstår ofte fra leukæmiske stamceller (LSC), som selektivt overlever kemoterapier og undgår immunrespons. Som vi for nylig viste, undslipper LSC’er for eksempel NK-celle lysis ved at undertrykke NKG2DL-overfladeudtryk14.
Omvendt kan fraværet af NKG2DL-overfladeudtryk bruges som en metode til at identificere og isolere formodede stamceller fra bulk-modstykke leukemic delpopulationer. Her præsenterer vi to flow cytometriske tilgange, der kan bruges til at detektere NKG2DL overfladeudtryk og derved identificere NKG2DL negative stamceller i leukæmi og måske også i andre kræftformer: En metode til pan-ligand overfladegenkendelse og en metode, der involverer farvning med enkelt eller samlet antistoffer, der genkender individuelle kendte NKG2DL-proteiner.
Her præsenterer vi to flow cytometriske metoder, der kan detektere NKG2DL overfladeudtryk på menneskets primære AML-celler. Vi viser, at begge detektionsmetoder kan bruges sammen med andre antistofpletter (f.eks. detektering af CD34-udtryk). Lignende pletter kan også udføres på andre primære celletyper og cellelinjer.
Vi har for nylig vist, at fraværet af NKG2DL på overfladen af AML patient blaster kan berige LSC14. I AML besidder NKG2DL negative, men ikke NKG2…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Swiss National Science Foundation (179239), Foundation for Fight Against Cancer (Zuerich), Wilhelm Sander Foundation til CL (2019.042.1) og Novartis Foundation for medicinsk-biologisk forskning til C.L. Desuden har dette projekt modtaget støtte fra EU’s Horizon 2020-forsknings- og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftalen nr. 765104. Vi takker Flow Cytometry-faciliteten i Basel for støtte.
7-amminoactinomycin D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Viability dye |
96 well plate U bottom | Sarstedt | 833925500 | 96 Well plate for our Flow cytometer |
APC Mouse Anti-Human cd34 | BD | 555824 | Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614 |
Bovine Serum Albumin | PanReac AppliChem | A1391,0050 | Component of the staining buffer |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Roth | 8043.1 | Component of the staining buffer |
Fetal Calf Serum (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | Component of the supplemented RPMI medium |
FlowJo 10.2 | BD | / | Software enabling data analysis for flow cytometry experiment |
Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853 |
Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R&D | 1299-NK-050 | Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID: |
Human ULBP-1 Antibody | R&D | AF1380 | Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765 |
Human ULBP-2/5/6 Antibody | R&D | AF1298 | Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725 |
Human ULBP-3 Antibody | R&D | AF1517 | Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835 |
MICA Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-35346 | Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656 |
MICB Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-66698 | Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413 |
One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions | Miltenyibiotec | 130-093-385 | Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein |
Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-500ML | Component of the staining buffer |
Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217 |
Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um | Spherotech Inc. | RCP-30-20A | Beads used for flow cytometry device maintainance |
RPMI medium | Sigma Aldrich | R8758-500ML | Cell culture medium |
RayBright Universal Compensation Beads | Raybiotech | 137-00013-100 | Beads used to create the compensation matrix |
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) – 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection |