Summary

To Flow cytometriske tilgange af NKG2D Ligand Surface Detection at skelne stamceller fra Bulk Subpopulations i akut myeloid leukæmi

Published: February 21, 2021
doi:

Summary

Vi præsenterer to forskellige farvning protokoller for NKG2D ligand (NKG2DL) afsløring i humane primære akut myeloid leukæmi (AML) prøver. Den første tilgang er baseret på et fusionsprotein, der er i stand til at genkende alle kendte og potentielt endnu ukendte ligands, mens den anden protokol er afhængig af tilsætning af flere anti-NKG2DL-antistoffer.

Abstract

Inden for samme patient viste fraværet af NKG2D-ligands (NKG2DL) overfladeudtryk at skelne leukæmiske delpopulationer med stamcelleegenskaber (såkaldte leukæmiske stamceller, LSC’er) fra mere differentierede modstykke leukæmiceller, der mangler sygdomsinitieringspotentiale, selvom de bærer lignende leukæmispecifikke genetiske mutationer. NKG2DL er biokemisk meget forskellige MHC klasse I-lignende selvmolekyler. Raske celler i homeostatic betingelser generelt ikke udtrykke NKG2DL på cellens overflade. I stedet fremkaldes ekspressionen af disse ligands ved eksponering for cellulær stress (f.eks. onkogen transformation eller infektiøse stimuli) for at udløse eliminering af beskadigede celler via lysis gennem NKG2D-receptor-udtrykke immunceller som naturlige dræberceller (NK). Interessant nok undertrykkes NKG2DL-overfladeudtryk selektivt i LSC-delpopulationer, så disse celler kan undgå NKG2D-medieret immunovervågning. Her præsenterer vi en side om side-analyse af to forskellige flowcytometrimetoder, der gør det muligt at undersøge NKG2DL-overfladeudtryk på kræftceller, dvs. en metode, der involverer pan-ligand-anerkendelse og en metode, der involverer farvning med flere antistoffer mod enkeltligaler. Disse metoder kan bruges til at adskille levedygtige NKG2DL negative cellulære delpopulationer med formodede kræft stamcelle egenskaber fra NKG2DL positive ikke-LSC.

Introduction

NK-celler er vigtige effektorer i det medfødte immunsystem, der kan genkende og eliminere ondartede celler eller stressede raske celler (f.eks. ved en virusinfektion) uden forudgående antigenstimulation1. Denne proces er stramt reguleret via et komplekst repertoire af aktiverende receptorer – såsom naturlige cytotoksicitetsreceptorer (NCR’er), NKG2D og CD16 – og hæmmende receptorer, der i vid udstrækning repræsenteres af dræber immunoglobulinlignende receptorer (KIRs)2. Binding af KIR’er til humane leukocytantigen (HLA) klasse I molekyler på somatiske celler sikrer selvgenkendelse og formidler NK celletolerance. På den anden side udløser fraværet af selvgenkendelse og øget binding af aktiverende receptorer til deres ligands på målcellerne frigivelsen af cytotoksiske granulater, der fører til NK cellemedieret cytotoksicitet1. Endelig kan NK-celler udøve antistofafhængig cellulær cytotoksicitet (ADCC) ved at binde den aktiverende receptor CD16 til mål, der udtrykker Fc-delen af Ig (FcR)2. Bortset fra direkte cytotoksicitet kan NK-celler også udløse cytokinfrigivelse, der forbinder det medfødte med det adaptive immunsystem3.

NKG2D er en vigtig aktiverende receptor udtrykt på NK, NKT, γδ T og naive CD8+ T-celler4, der gør det muligt for sådanne cytotoksiske immunceller at genkende og lyse NKG2D ligand (NKG2DL), der udtrykker målceller. Raske celler udtrykker normalt ikke NKG2DL. I stedet er NKG2DL-udtryk upreguleret på ondartede eller virusinficerede celler for at gøre disse modtagelige for immunfrigang5.

Den menneskelige NKG2DL-familie består af otte kendte molekyler, blandt hvilke de to MHC I kæderelaterede molekyler A og B (MICA og MICB6) og cytomegalovirus UL16-bindende proteiner 1-6 (ULBP1-67). Udtrykket af NKG2DL er reguleret på transskriptionelle, post-transskriptionelle samt post-translationelle niveauer8. Som sådan, mens NKG2DL udtryk er almindeligt ikke påvises på overfladen af raske celler, NKG2DL mRNA9 og intracellulære protein udtryk blev rapporteret i sundt væv. Den funktionelle relevans af et sådant udtryk og de mekanismer , der ligger til grund for sådanne diskrete udtryksmønstre , mangler stadig at blive defineret10.

Den mekanistiske regulering af NKG2DL-ekspressionen i kræftcellerne er et fascinerende undersøgelsesområde. Veje, der vides at være involveret i enten cellulær stress,f.eks. Men selv om overfladeudtryk af NKG2DL er blevet effektivt induceret, kan dette udtryk gå tabt igen gennem proteolytisk medieret afgivelse, en mekanisme forbundet med immunflugt og dårlig klinisk prognose i nogle kræftformer13.

Fraværet af celleoverfladeNKG2DL kan også spille vigtige roller hos patienter med AML. Her fremkalder behandling med intensiv kemoterapi ofte remission, men tilbagefald opstår ofte fra leukæmiske stamceller (LSC), som selektivt overlever kemoterapier og undgår immunrespons. Som vi for nylig viste, undslipper LSC’er for eksempel NK-celle lysis ved at undertrykke NKG2DL-overfladeudtryk14.

Omvendt kan fraværet af NKG2DL-overfladeudtryk bruges som en metode til at identificere og isolere formodede stamceller fra bulk-modstykke leukemic delpopulationer. Her præsenterer vi to flow cytometriske tilgange, der kan bruges til at detektere NKG2DL overfladeudtryk og derved identificere NKG2DL negative stamceller i leukæmi og måske også i andre kræftformer: En metode til pan-ligand overfladegenkendelse og en metode, der involverer farvning med enkelt eller samlet antistoffer, der genkender individuelle kendte NKG2DL-proteiner.

Protocol

Patientprøver blev indsamlet efter godkendelse fra Ethics Review Board på universitetshospitalerne i Basel og Tuebingen. 1. Biotinylering af NKG2D-fusionsproteinet BEMÆRK: Dette trin udføres med et biotinyleringssæt (se Materialetabel) i henhold til producentens instruktion. Dette trin i protokollen skal udføres mindst 24 timer før farvningen. Det biotinylerede NKG2D-fusionsprotein skal opbevares ved -20 °C. Tø både biotin, samt …

Representative Results

Begge de protokoller, der præsenteres her, gør det muligt at berige AML LSC ved at flowcytometriske analyser ved hjælp af CD34, en kendt markør for LSC17, i kombination med NKG2DL overfladeudtryk ved enten at udnytte pan-ligand anerkendelse eller farvning med puljede antistoffer mod individuelle ligands. I figur 1viser vi, at de analyserede AML-prøver er positive for CD34 og NKG2DL, men der findes også negative delpopulationer, hvilket fremgår af tilstedeværel…

Discussion

Her præsenterer vi to flow cytometriske metoder, der kan detektere NKG2DL overfladeudtryk på menneskets primære AML-celler. Vi viser, at begge detektionsmetoder kan bruges sammen med andre antistofpletter (f.eks. detektering af CD34-udtryk). Lignende pletter kan også udføres på andre primære celletyper og cellelinjer.

Vi har for nylig vist, at fraværet af NKG2DL på overfladen af AML patient blaster kan berige LSC14. I AML besidder NKG2DL negative, men ikke NKG2…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Swiss National Science Foundation (179239), Foundation for Fight Against Cancer (Zuerich), Wilhelm Sander Foundation til CL (2019.042.1) og Novartis Foundation for medicinsk-biologisk forskning til C.L. Desuden har dette projekt modtaget støtte fra EU’s Horizon 2020-forsknings- og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftalen nr. 765104. Vi takker Flow Cytometry-faciliteten i Basel for støtte.

Materials

7-amminoactinomycin D (7-AAD) Invitrogen A1310 Viability dye
96 well plate U bottom Sarstedt 833925500 96 Well plate for our Flow cytometer
APC Mouse Anti-Human cd34 BD 555824 Antibody detecting CD34
RRID: AB_398614
Bovine Serum Albumin PanReac AppliChem A1391,0050 Component of the staining buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid Roth 8043.1 Component of the staining buffer
Fetal Calf Serum (FCS) BioConcept 2-01F10-I Component of the supplemented RPMI medium
FlowJo 10.2 BD / Software enabling data analysis for flow cytometry experiment
Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Thermo Scientific A21222 Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB
RRID: AB_1037853
Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF R&D 1299-NK-050 Fusion Protein detecting all NKG2DLs
RRID:
Human ULBP-1 Antibody R&D AF1380 Antibody detecting ULBP1
RRID: AB_354765
Human ULBP-2/5/6 Antibody R&D AF1298 Antibody detecting ULBP2/5/6
RRID: AB_354725
Human ULBP-3 Antibody R&D AF1517 Antibody detecting ULBP3
RRID: AB_354835
MICA Polyclonal Antibody Thermo Scientific PA5-35346 Antibody detecting MICA
RRID: AB_2552656
MICB Polyclonal Antibody Thermo Scientific PA5-66698 Antibody detecting MICB
RRID: AB_2663413
One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions Miltenyibiotec 130-093-385 Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537-500ML Component of the staining buffer
Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Thermo Scientific A11034 Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs
RRID: AB_2576217
Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um Spherotech Inc. RCP-30-20A Beads used for flow cytometry device maintainance
RPMI medium Sigma Aldrich R8758-500ML Cell culture medium
RayBright Universal Compensation Beads Raybiotech 137-00013-100 Beads used to create the compensation matrix
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) – 1 mg/mL Invitrogen S866 Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection

References

  1. Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
  2. Campbell, K. S., Hasegawa, J. Natural killer cell biology: an update and future directions. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).
  3. Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
  4. Wensveen, F. M., Jelenčić, V., Polić, B. NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness. Frontiers in Immunology. 9, 441 (2018).
  5. Zingoni, A., et al. NKG2D and its ligands: “One for All, All for One”. Frontiers in Immunology. 9, 476 (2018).
  6. Eagle, R. A., Trowsdale, J. Promiscuity and the single receptor: NKG2D. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).
  7. El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer. Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).
  8. Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D. Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).
  9. Long, E. O. Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm. Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).
  10. Hüe, S., et al. A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease. Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).
  11. Gasser, S., Raulet, D. H. Activation and self-tolerance of natural killer cells. Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).
  12. Groh, V., et al. Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).
  13. Maurer, S., et al. Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells. Oncoimmunology. 7 (2), 1364827 (2018).
  14. Paczulla, A. M., et al. Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion. Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).
  15. Paczulla, A. M., et al. Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice. Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).
  16. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
  17. Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
  18. Taussig, D. C., et al. Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction. Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).
  19. Zhou, J., Chng, W. J. Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia. World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).

Play Video

Cite This Article
Landerer, H., Arnone, M., Wieboldt, R., Goersch, E., Stanger, A. M. P., Konantz, M., Lengerke, C. Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia. J. Vis. Exp. (168), e61803, doi:10.3791/61803 (2021).

View Video