Deux approches cytométriques en flux de détection de surface de ligand NKG2D pour distinguer les cellules souches des sous-populations en vrac dans la leucémie myéloïde aiguë
Summary
Nous présentons deux protocoles de souillure différents pour la détection du ligand NKG2D (NKG2DL) dans les échantillons humains primaires de leucémie myéloïde aiguë (AML). La première approche est basée sur une protéine de fusion, capable de reconnaître tous les ligands connus et potentiellement encore inconnus, tandis que le second protocole repose sur l’ajout de plusieurs anticorps anti-NKG2DL.
Abstract
Dans le même patient, l’absence de l’expression de surface des ligands de NKG2D (NKG2DL) a été montrée pour distinguer des sous-populations leucémiques avec des propriétés de cellules souches (soi-disant cellules souches leucémiques, LSCs) des cellules leucémiques de contrepartie plus différenciées qui manquent de potentiel d’initiation de la maladie bien qu’elles portent des mutations génétiques spécifiques de leucémie semblables. Les NKG2DL sont des auto-molécules biochimiquement très diversifiées de type CMH de classe I. Les cellules saines dans des conditions homéostatiques n’expriment généralement pas NKG2DL à la surface cellulaire. Au lieu de cela, l’expression de ces ligands est induite lors de l’exposition au stress cellulaire (par exemple, transformation oncogène ou stimuli infectieux) pour déclencher l’élimination des cellules endommagées par la lyse par les cellules immunitaires exprimant les récepteurs NKG2D telles que les cellules tueuses naturelles (NK). Fait intéressant, l’expression de surface de NKG2DL est sélectivement supprimée dans les sous-populations de LSC, permettant à ces cellules d’échapper à la surveillance immunitaire médiée par NKG2D. Ici, nous présentons une analyse côte à côte de deux méthodes différentes de cytometry d’écoulement qui permettent la recherche sur l’expression de surface de NKG2DL sur des cellules cancéreuses c.-à-d., une méthode impliquant l’identification de pan-ligand et une méthode impliquant la souillure avec des anticorps multiples contre des ligands simples. Ces méthodes peuvent être utilisées pour séparer les sous-populations cellulaires négatives viables de NKG2DL ayant des propriétés putatives de cellules souches cancéreuses de NKG2DL non-LSC positives.
Introduction
Les cellules NK sont des effecteurs importants du système immunitaire inné qui peuvent reconnaître et éliminer les cellules malignes ou les cellules saines stressées (par exemple, par une infection virale) sans stimulation antigénique préalable1. Ce processus est étroitement régulé par un répertoire complexe de récepteurs activants ( tels que les récepteurs de cytotoxicité naturelle (RCN), NKG2D et CD16 – et de récepteurs inhibiteurs qui sont largement représentés par des récepteurs tueurs de type immunoglobuline (KIRs)2. La liaison des KIRs aux molécules humaines de classe I de l’antigène leucocytaire (HLA) sur les cellules somatiques assure l’auto-reconnaissance et transmet la tolérance des cellules NK. D’autre part, l’absence d’auto-reconnaissance et la liaison accrue des récepteurs activateurs à leurs ligands sur les cellules cibles déclenchent la libération de granules cytotoxiques conduisant à la cytotoxicité à médiation cellulaire NK1. Enfin, les cellules NK peuvent exercer une cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) en liant le récepteur activateur CD16 à des cibles exprimant la partie Fc d’Ig (FcR)2. Outre la cytotoxicité directe, les cellules NK peuvent également déclencher la libération de cytokines reliant l’inné au système immunitaire adaptatif3.
NKG2D est un récepteur activateur majeur exprimé sur les cellules T NK, NKT, γδ T et NAÏves CD8+4 qui permet à ces cellules immunitaires cytotoxiques de reconnaître et de lyser le ligand NKG2D (NKG2DL) exprimant les cellules cibles. Les cellules saines n’expriment généralement pas NKG2DL. Au lieu de cela, l’expression de NKG2DL est régulée à la hausse sur les cellules malignes ou infectées par un virus pour les rendre susceptibles de se prêter à la clairance immunitaire5.
La famille humaine NKG2DL comprend huit molécules connues parmi lesquelles les deux molécules A et B liées à la chaîne du CMH I (MICA et MICB6)et les protéines de liaison au cytomégalovirus UL16 1–6 (ULBP1-67). L’expression de NKG2DL est régulée sur les niveaux transcriptionnel, post-transcriptionnel ainsi que post-traductionnel8. En tant que tel, tandis que l’expression de NKG2DL n’est généralement pas discernable à la surface des cellules saines, NKG2DL ADN messagère9 et expression intracellulaire de protéine ont été rapportés dans les tissus sains. La pertinence fonctionnelle d’une telle expression et les mécanismes sous-jacents à de tels modèles d’expression discordants restent à définir10.
La régulation mécaniste de l’expression de NKG2DL dans les cellules cancéreuses est un domaine fascinant de recherche. Les voies connues pour être impliquées dans le stress cellulaire, par exemple la voie de stress de choc thermique9,ou les voies associées aux dommages à l’ADN, telles que l’ataxie télangiectasie mutée (ATM) et la voie Rad3 connexe (ATR)11,ainsi que les infections virales ou bactériennes ont été directement liées à l’induction de l’expression NKG2DL12. Cependant, même si l’expression de surface de NKG2DL a été effectivement induite, cette expression peut être perdue à nouveau par l’excrétion protéolytique-négociée, un mécanisme associé à l’évasion immunitaire et au mauvais pronostic clinique dans certains cancers13.
L’absence de NKG2DL de surface cellulaire peut également jouer des rôles importants dans les patients avec AML. Ici, le traitement par chimiothérapie intensive induit souvent une rémission, mais la rechute se produit souvent à partir de cellules souches leucémiques (LSC), qui survivent sélectivement aux chimiothérapies et échappent à la réponse immunitaire. Comme nous l’avons récemment montré, les LSC, par exemple, échappent à la lyse des cellules NK en supprimant l’expression de surface NKG2DL14.
Inversement, l’absence d’expression de NKG2DL de surface peut être utilisée comme méthode pour identifier et isoler de manière viative des sous-populations de cellules de type radical putatif de sous-populations leucémiques homologues en vrac. Ici, nous présentons deux approches cytométriques en flux qui peuvent être utilisées pour détecter l’expression de surface de NKG2DL et identifier ainsi les cellules souches négatives de NKG2DL dans la leucémie et peut-être aussi dans d’autres cancers: Une méthode pour la reconnaissance de surface de pan-ligand et une méthode impliquant la coloration avec des anticorps simples ou regroupés reconnaissant des protéines NKG2DL connues individuelles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous présentons deux méthodes cytométriques de flux qui peuvent détecter l’expression de surface de NKG2DL sur les cellules primaires humaines d’AML. Nous montrons que les deux méthodes de détection peuvent être utilisées en conjonction avec d’autres colorations d’anticorps (par exemple, la détection de l’expression de CD34). Des taches similaires peuvent également être effectuées sur d’autres types de cellules primaires et lignées cellulaires.
Nous avons récemme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par des subventions du Fonds national suisse de la recherche scientifique (179239), de la Fondation de lutte contre le cancer (Zuerich), de la Fondation Wilhelm Sander au CL (2019.042.1) et de la Fondation Novartis pour la recherche médico-biologique à C.L. En outre, ce projet a reçu un financement du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention Marie Skłodowska-Curie n° 765104. Nous remercions le Centre de cytométrie en flux de Bâle pour son soutien.
Materials
| 7-amminoactinomycin D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Viability dye |
| 96 well plate U bottom | Sarstedt | 833925500 | 96 Well plate for our Flow cytometer |
| APC Mouse Anti-Human cd34 | BD | 555824 | Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614 |
| Bovine Serum Albumin | PanReac AppliChem | A1391,0050 | Component of the staining buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Roth | 8043.1 | Component of the staining buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | Component of the supplemented RPMI medium |
| FlowJo 10.2 | BD | / | Software enabling data analysis for flow cytometry experiment |
| Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853 |
| Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R&D | 1299-NK-050 | Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID: |
| Human ULBP-1 Antibody | R&D | AF1380 | Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765 |
| Human ULBP-2/5/6 Antibody | R&D | AF1298 | Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725 |
| Human ULBP-3 Antibody | R&D | AF1517 | Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835 |
| MICA Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-35346 | Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656 |
| MICB Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-66698 | Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413 |
| One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions | Miltenyibiotec | 130-093-385 | Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-500ML | Component of the staining buffer |
| Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217 |
| Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um | Spherotech Inc. | RCP-30-20A | Beads used for flow cytometry device maintainance |
| RPMI medium | Sigma Aldrich | R8758-500ML | Cell culture medium |
| RayBright Universal Compensation Beads | Raybiotech | 137-00013-100 | Beads used to create the compensation matrix |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) – 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection |
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