Summary

שתי גישות ציטומטריות זרימה של גילוי משטח ליגנד NKG2D כדי להבחין בין תאי גזע לבין תת אוכלוסין בתפזורת בלוקמיה מיאלואידית חריפה

Published: February 21, 2021
doi:

Summary

אנו מציגים שני פרוטוקולי הכתמה שונים עבור NKG2D ליגנד (NKG2DL) זיהוי בלוקמיה מיאלואידית חריפה אנושית (AML) דגימות. הגישה הראשונה מבוססת על חלבון היתוך, המסוגל לזהות את כל הליבנדים הידועים ואולי עדיין לא ידועים, בעוד הפרוטוקול השני מסתמך על תוספת של נוגדנים מרובים נגד NKG2DL.

Abstract

בתוך אותו חולה, היעדר ליגנדים NKG2D (NKG2DL) ביטוי פני השטח הוכח להבחין בין תת אוכלוסין לוקמי עם תכונות תאי גזע (מה שנקרא תאי גזע לויקמיים, LSCs) מתאים לויקמיים עמיתים מובחנים יותר חסרי פוטנציאל חניכת מחלות למרות שהם נושאים מוטציות גנטיות ספציפיות לוקמיה דומות. NKG2DL הן ביוכימיות מגוונות מאוד MHC בכיתה I כמו מולקולות עצמיות. תאים בריאים בתנאים הומיאוסטטיים בדרך כלל אינם מבטאים NKG2DL על פני התא. במקום זאת, ביטוי של ליגנדים אלה מושרה עם חשיפה ללחץ תאי (למשל, טרנספורמציה אונקוגנית או גירויים זיהומיים) כדי לעורר חיסול של תאים פגומים באמצעות תמוגה באמצעות תאי מערכת החיסון קולטן NKG2D כגון תאי רוצח טבעי (NK). מעניין, ביטוי פני השטח NKG2DL מודחק באופן סלקטיבי בתת-אוכלוסין LSC, ומאפשר לתאים אלה להתחמק ממעקב חיסוני בתיווך NKG2D. כאן, אנו מציגים ניתוח זה לצד זה של שתי שיטות ציטומטריית זרימה שונות המאפשרות חקירה של ביטוי פני השטח NKG2DL על תאים סרטניים כלומר, שיטה הכוללת זיהוי פאן-ליגנד ושיטה הכוללת כתמים עם נוגדנים מרובים נגד ליגנדים בודדים. שיטות אלה ניתן להשתמש כדי להפריד תת-אוכלוסין תאיים שלילי NKG2DL קיימא עם תכונות תאי גזע סרטן putative מ NKG2DL חיובי שאינו LSC.

Introduction

תאי NK הם משפיעים חשובים של מערכת החיסון המולדת שיכולים לזהות ולחסל תאים ממאירים או תאים בריאים לחוצים (למשל, על ידי זיהום ויראלי) ללא גירוי אנטיגן קודם1. תהליך זה מוסדר היטב באמצעות רפרטואר מורכב של הפעלת קולטנים – כגון קולטני ציטוטוקסיות טבעיים (NCRs), NKG2D ו- CD16 – וקולטנים מעכבים המיוצגים במידה רבה על ידי קולטנים דמויי אימונוגלובולין רוצח (KIRs)2. קשירת KIRs למולקולות אנטיגן מסוג לויקוציטים אנושי (HLA) מסוג I על תאים סומטיים מבטיחה הכרה עצמית ומעבירה סובלנות לתאי NK. מצד שני, היעדר הכרה עצמית וקשירה מוגברת של הפעלת קולטנים לליגנדים שלהם על תאי היעד מפעילים את שחרורם של גרגירים ציטוטוקסיים המובילים לציטוקסיות בתיווך תא NK1. לבסוף, תאי NK יכולים להפעיל ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים (ADCC) על ידי כריכה של קולטן הפעלת CD16 ליעדים המבטאים את החלק Fc של Ig (FcR)2. מלבד ציטוטוקסיות ישירה, תאי NK יכולים גם לעורר שחרור ציטוקינים המגשר בין המולדת למערכת החיסון האדפטיבית3.

NKG2D הוא קולטן הפעלה מרכזי המתבטא ב- NK, NKT, γδ T, ותאי CD8 + T נאיביים4 המאפשרים לתאי חיסון ציטוקסיים כאלה לזהות וליזה ליגנד NKG2D (NKG2DL) המבטאים תאי יעד. תאים בריאים בדרך כלל אינם מבטאים NKG2DL. במקום זאת, ביטוי NKG2DL הוא upregulated על תאים ממאירים או נגועים בווירוס כדי להפוך אותם נוחים לאישור מערכת החיסון5.

משפחת NKG2DL האנושית כוללת שמונה מולקולות ידועות ביניהן שתי המולקולות הקשורות לשרשרת MHC I A ו- B (MICA ו- MICB6) וחלבוני cytomegalovirus UL16 מחייבים 1-6 (ULBP1-67). הביטוי של NKG2DL מוסדר על תמלול, לאחר תמלול, כמו גם את הרמות שלאחר התרגום8. ככזה, בעוד ביטוי NKG2DL הוא בדרך כלל לא ניתן לזהות על פני השטח של תאים בריאים, NKG2DL mRNA9 וביטוי חלבון תאי דווחו ברקמות בריאות. הרלוונטיות התפקודית של ביטוי כזה והמנגנונים שבביד דפוסי ביטוי אי התאמה כאלה נותרים מוגדרים10.

הרגולציה המכניסטית של ביטוי NKG2DL בתאי הסרטן היא תחום חקירה מרתק. מסלולים ידועים להיות מעורבים או מתח תאי, למשל, מסלול הלחץ הלם חום9, או נתיבים הקשורים נזק DNA, כגון אטקסיה telangiectasia מוטציה (ATM) ו Rad3 הקשורים (ATR) מסלול11, כמו גם זיהומים ויראליים או חיידקיים קושרו ישירות אינדוקציה של ביטוי NKG2DL12. עם זאת, גם אם ביטוי פני השטח של NKG2DL הושרה ביעילות, ביטוי זה יכול ללכת לאיבוד שוב באמצעות שפיכה בתיווך פרוטאוליטי, מנגנון הקשורים לבריחה חיסונית ופרוגנוזה קלינית לקויה בכמה סוגי סרטן13.

היעדר משטח התא NKG2DL עשוי גם לשחק תפקידים חשובים בחולים עם AML. כאן, טיפול עם כימותרפיה אינטנסיבית לעתים קרובות גורם הפוגה, אבל הישנות מתרחשת לעתים קרובות מתאי גזע לויקמיים (LSC), אשר באופן סלקטיבי לשרוד כימותרפיה ולהתחמק תגובה חיסונית. כפי שהראינו לאחרונה, LSCs, למשל, לברוח תמוגה תא NK על ידי דיכוי ביטוי פני השטח NKG2DL14.

הפוך, היעדר ביטוי NKG2DL משטח יכול לשמש כשיטה לזהות ולבודד באופן מעשי תת-אוכלוסין דמוי גזע putative של תאים מתת אוכלוסין לויקמי מקביל בתפזורת. כאן, אנו מציגים שתי גישות ציטומטריות זרימה שניתן להשתמש בהן כדי לזהות ביטוי פני שטח NKG2DL ובכך לזהות תאי גזע שליליים NKG2DL בלוקמיה ואולי גם בסרטנים אחרים: שיטה לזיהוי משטח פאן-ליגנד ושיטה הכוללת כתמים בנוגדנים בודדים או מרופדים המזהים חלבוני NKG2DL ידועים בודדים.

Protocol

דגימות מטופלים נאספו לאחר אישור הוועדה לבדיקת אתיקה של בתי החולים האוניברסיטאיים באזל וטובינגן. 1. ביו-טינילציה של חלבון ההיתוך NKG2D הערה: שלב זה מבוצע עם ערכת ביוטינילציה (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראת היצרן. שלב זה של הפרוטוקול חייב להתבצע לפחות 24 שעו?…

Representative Results

שני הפרוטוקולים המוצגים כאן מאפשרים העשרה של AML LSC על ידי ניתוחים ציטומטריים זרימה באמצעות CD34, סמן ידוע של LSC17, בשילוב עם ביטוי פני השטח NKG2DL על ידי שימוש בזיהוי פאן-ליגנד או כתמים עם נוגדנים משולבים נגד ליגנדים בודדים. באיור 1, אנו מראים כי דגימות AML המנותחות חיוב?…

Discussion

כאן אנו מציגים שתי שיטות ציטומטריות זרימה שיכולות לזהות ביטוי פני שטח NKG2DL על תאי AML ראשיים אנושיים. אנו מראים כי ניתן להשתמש בשתי שיטות הזיהוי בשילוב עם כתמי נוגדנים אחרים (למשל, זיהוי ביטוי CD34). כתמים דומים עשויים להתבצע גם בסוגי תאים ראשיים אחרים וקווי תאים.

לאחרונה הראינו ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענקים של הקרן הלאומית למדע השוויצרית (179239), הקרן למאבק בסרטן (Zuerich), קרן וילהלם סנדר ל- CL (2019.042.1) וקרן נוברטיס למחקר רפואי-ביולוגי ל- C.L. יתר על כן, פרויקט זה קיבל מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענקים מארי Skłodowska-Curie מס ‘765104. אנו מודים למתקן ציטומטריית הזרימה בבאזל על התמיכה.

Materials

7-amminoactinomycin D (7-AAD) Invitrogen A1310 Viability dye
96 well plate U bottom Sarstedt 833925500 96 Well plate for our Flow cytometer
APC Mouse Anti-Human cd34 BD 555824 Antibody detecting CD34
RRID: AB_398614
Bovine Serum Albumin PanReac AppliChem A1391,0050 Component of the staining buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid Roth 8043.1 Component of the staining buffer
Fetal Calf Serum (FCS) BioConcept 2-01F10-I Component of the supplemented RPMI medium
FlowJo 10.2 BD / Software enabling data analysis for flow cytometry experiment
Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Thermo Scientific A21222 Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB
RRID: AB_1037853
Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF R&D 1299-NK-050 Fusion Protein detecting all NKG2DLs
RRID:
Human ULBP-1 Antibody R&D AF1380 Antibody detecting ULBP1
RRID: AB_354765
Human ULBP-2/5/6 Antibody R&D AF1298 Antibody detecting ULBP2/5/6
RRID: AB_354725
Human ULBP-3 Antibody R&D AF1517 Antibody detecting ULBP3
RRID: AB_354835
MICA Polyclonal Antibody Thermo Scientific PA5-35346 Antibody detecting MICA
RRID: AB_2552656
MICB Polyclonal Antibody Thermo Scientific PA5-66698 Antibody detecting MICB
RRID: AB_2663413
One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions Miltenyibiotec 130-093-385 Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537-500ML Component of the staining buffer
Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Thermo Scientific A11034 Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs
RRID: AB_2576217
Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um Spherotech Inc. RCP-30-20A Beads used for flow cytometry device maintainance
RPMI medium Sigma Aldrich R8758-500ML Cell culture medium
RayBright Universal Compensation Beads Raybiotech 137-00013-100 Beads used to create the compensation matrix
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) – 1 mg/mL Invitrogen S866 Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection

References

  1. Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
  2. Campbell, K. S., Hasegawa, J. Natural killer cell biology: an update and future directions. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).
  3. Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
  4. Wensveen, F. M., Jelenčić, V., Polić, B. NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness. Frontiers in Immunology. 9, 441 (2018).
  5. Zingoni, A., et al. NKG2D and its ligands: “One for All, All for One”. Frontiers in Immunology. 9, 476 (2018).
  6. Eagle, R. A., Trowsdale, J. Promiscuity and the single receptor: NKG2D. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).
  7. El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer. Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).
  8. Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D. Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).
  9. Long, E. O. Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm. Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).
  10. Hüe, S., et al. A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease. Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).
  11. Gasser, S., Raulet, D. H. Activation and self-tolerance of natural killer cells. Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).
  12. Groh, V., et al. Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).
  13. Maurer, S., et al. Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells. Oncoimmunology. 7 (2), 1364827 (2018).
  14. Paczulla, A. M., et al. Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion. Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).
  15. Paczulla, A. M., et al. Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice. Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).
  16. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
  17. Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
  18. Taussig, D. C., et al. Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction. Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).
  19. Zhou, J., Chng, W. J. Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia. World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).

Play Video

Cite This Article
Landerer, H., Arnone, M., Wieboldt, R., Goersch, E., Stanger, A. M. P., Konantz, M., Lengerke, C. Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia. J. Vis. Exp. (168), e61803, doi:10.3791/61803 (2021).

View Video