שתי גישות ציטומטריות זרימה של גילוי משטח ליגנד NKG2D כדי להבחין בין תאי גזע לבין תת אוכלוסין בתפזורת בלוקמיה מיאלואידית חריפה
Summary
אנו מציגים שני פרוטוקולי הכתמה שונים עבור NKG2D ליגנד (NKG2DL) זיהוי בלוקמיה מיאלואידית חריפה אנושית (AML) דגימות. הגישה הראשונה מבוססת על חלבון היתוך, המסוגל לזהות את כל הליבנדים הידועים ואולי עדיין לא ידועים, בעוד הפרוטוקול השני מסתמך על תוספת של נוגדנים מרובים נגד NKG2DL.
Abstract
בתוך אותו חולה, היעדר ליגנדים NKG2D (NKG2DL) ביטוי פני השטח הוכח להבחין בין תת אוכלוסין לוקמי עם תכונות תאי גזע (מה שנקרא תאי גזע לויקמיים, LSCs) מתאים לויקמיים עמיתים מובחנים יותר חסרי פוטנציאל חניכת מחלות למרות שהם נושאים מוטציות גנטיות ספציפיות לוקמיה דומות. NKG2DL הן ביוכימיות מגוונות מאוד MHC בכיתה I כמו מולקולות עצמיות. תאים בריאים בתנאים הומיאוסטטיים בדרך כלל אינם מבטאים NKG2DL על פני התא. במקום זאת, ביטוי של ליגנדים אלה מושרה עם חשיפה ללחץ תאי (למשל, טרנספורמציה אונקוגנית או גירויים זיהומיים) כדי לעורר חיסול של תאים פגומים באמצעות תמוגה באמצעות תאי מערכת החיסון קולטן NKG2D כגון תאי רוצח טבעי (NK). מעניין, ביטוי פני השטח NKG2DL מודחק באופן סלקטיבי בתת-אוכלוסין LSC, ומאפשר לתאים אלה להתחמק ממעקב חיסוני בתיווך NKG2D. כאן, אנו מציגים ניתוח זה לצד זה של שתי שיטות ציטומטריית זרימה שונות המאפשרות חקירה של ביטוי פני השטח NKG2DL על תאים סרטניים כלומר, שיטה הכוללת זיהוי פאן-ליגנד ושיטה הכוללת כתמים עם נוגדנים מרובים נגד ליגנדים בודדים. שיטות אלה ניתן להשתמש כדי להפריד תת-אוכלוסין תאיים שלילי NKG2DL קיימא עם תכונות תאי גזע סרטן putative מ NKG2DL חיובי שאינו LSC.
Introduction
תאי NK הם משפיעים חשובים של מערכת החיסון המולדת שיכולים לזהות ולחסל תאים ממאירים או תאים בריאים לחוצים (למשל, על ידי זיהום ויראלי) ללא גירוי אנטיגן קודם1. תהליך זה מוסדר היטב באמצעות רפרטואר מורכב של הפעלת קולטנים – כגון קולטני ציטוטוקסיות טבעיים (NCRs), NKG2D ו- CD16 – וקולטנים מעכבים המיוצגים במידה רבה על ידי קולטנים דמויי אימונוגלובולין רוצח (KIRs)2. קשירת KIRs למולקולות אנטיגן מסוג לויקוציטים אנושי (HLA) מסוג I על תאים סומטיים מבטיחה הכרה עצמית ומעבירה סובלנות לתאי NK. מצד שני, היעדר הכרה עצמית וקשירה מוגברת של הפעלת קולטנים לליגנדים שלהם על תאי היעד מפעילים את שחרורם של גרגירים ציטוטוקסיים המובילים לציטוקסיות בתיווך תא NK1. לבסוף, תאי NK יכולים להפעיל ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים (ADCC) על ידי כריכה של קולטן הפעלת CD16 ליעדים המבטאים את החלק Fc של Ig (FcR)2. מלבד ציטוטוקסיות ישירה, תאי NK יכולים גם לעורר שחרור ציטוקינים המגשר בין המולדת למערכת החיסון האדפטיבית3.
NKG2D הוא קולטן הפעלה מרכזי המתבטא ב- NK, NKT, γδ T, ותאי CD8 + T נאיביים4 המאפשרים לתאי חיסון ציטוקסיים כאלה לזהות וליזה ליגנד NKG2D (NKG2DL) המבטאים תאי יעד. תאים בריאים בדרך כלל אינם מבטאים NKG2DL. במקום זאת, ביטוי NKG2DL הוא upregulated על תאים ממאירים או נגועים בווירוס כדי להפוך אותם נוחים לאישור מערכת החיסון5.
משפחת NKG2DL האנושית כוללת שמונה מולקולות ידועות ביניהן שתי המולקולות הקשורות לשרשרת MHC I A ו- B (MICA ו- MICB6) וחלבוני cytomegalovirus UL16 מחייבים 1-6 (ULBP1-67). הביטוי של NKG2DL מוסדר על תמלול, לאחר תמלול, כמו גם את הרמות שלאחר התרגום8. ככזה, בעוד ביטוי NKG2DL הוא בדרך כלל לא ניתן לזהות על פני השטח של תאים בריאים, NKG2DL mRNA9 וביטוי חלבון תאי דווחו ברקמות בריאות. הרלוונטיות התפקודית של ביטוי כזה והמנגנונים שבביד דפוסי ביטוי אי התאמה כאלה נותרים מוגדרים10.
הרגולציה המכניסטית של ביטוי NKG2DL בתאי הסרטן היא תחום חקירה מרתק. מסלולים ידועים להיות מעורבים או מתח תאי, למשל, מסלול הלחץ הלם חום9, או נתיבים הקשורים נזק DNA, כגון אטקסיה telangiectasia מוטציה (ATM) ו Rad3 הקשורים (ATR) מסלול11, כמו גם זיהומים ויראליים או חיידקיים קושרו ישירות אינדוקציה של ביטוי NKG2DL12. עם זאת, גם אם ביטוי פני השטח של NKG2DL הושרה ביעילות, ביטוי זה יכול ללכת לאיבוד שוב באמצעות שפיכה בתיווך פרוטאוליטי, מנגנון הקשורים לבריחה חיסונית ופרוגנוזה קלינית לקויה בכמה סוגי סרטן13.
היעדר משטח התא NKG2DL עשוי גם לשחק תפקידים חשובים בחולים עם AML. כאן, טיפול עם כימותרפיה אינטנסיבית לעתים קרובות גורם הפוגה, אבל הישנות מתרחשת לעתים קרובות מתאי גזע לויקמיים (LSC), אשר באופן סלקטיבי לשרוד כימותרפיה ולהתחמק תגובה חיסונית. כפי שהראינו לאחרונה, LSCs, למשל, לברוח תמוגה תא NK על ידי דיכוי ביטוי פני השטח NKG2DL14.
הפוך, היעדר ביטוי NKG2DL משטח יכול לשמש כשיטה לזהות ולבודד באופן מעשי תת-אוכלוסין דמוי גזע putative של תאים מתת אוכלוסין לויקמי מקביל בתפזורת. כאן, אנו מציגים שתי גישות ציטומטריות זרימה שניתן להשתמש בהן כדי לזהות ביטוי פני שטח NKG2DL ובכך לזהות תאי גזע שליליים NKG2DL בלוקמיה ואולי גם בסרטנים אחרים: שיטה לזיהוי משטח פאן-ליגנד ושיטה הכוללת כתמים בנוגדנים בודדים או מרופדים המזהים חלבוני NKG2DL ידועים בודדים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מציגים שתי שיטות ציטומטריות זרימה שיכולות לזהות ביטוי פני שטח NKG2DL על תאי AML ראשיים אנושיים. אנו מראים כי ניתן להשתמש בשתי שיטות הזיהוי בשילוב עם כתמי נוגדנים אחרים (למשל, זיהוי ביטוי CD34). כתמים דומים עשויים להתבצע גם בסוגי תאים ראשיים אחרים וקווי תאים.
לאחרונה הראינו ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים של הקרן הלאומית למדע השוויצרית (179239), הקרן למאבק בסרטן (Zuerich), קרן וילהלם סנדר ל- CL (2019.042.1) וקרן נוברטיס למחקר רפואי-ביולוגי ל- C.L. יתר על כן, פרויקט זה קיבל מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענקים מארי Skłodowska-Curie מס ‘765104. אנו מודים למתקן ציטומטריית הזרימה בבאזל על התמיכה.
Materials
| 7-amminoactinomycin D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Viability dye |
| 96 well plate U bottom | Sarstedt | 833925500 | 96 Well plate for our Flow cytometer |
| APC Mouse Anti-Human cd34 | BD | 555824 | Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614 |
| Bovine Serum Albumin | PanReac AppliChem | A1391,0050 | Component of the staining buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Roth | 8043.1 | Component of the staining buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | Component of the supplemented RPMI medium |
| FlowJo 10.2 | BD | / | Software enabling data analysis for flow cytometry experiment |
| Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853 |
| Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R&D | 1299-NK-050 | Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID: |
| Human ULBP-1 Antibody | R&D | AF1380 | Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765 |
| Human ULBP-2/5/6 Antibody | R&D | AF1298 | Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725 |
| Human ULBP-3 Antibody | R&D | AF1517 | Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835 |
| MICA Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-35346 | Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656 |
| MICB Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-66698 | Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413 |
| One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions | Miltenyibiotec | 130-093-385 | Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-500ML | Component of the staining buffer |
| Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217 |
| Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um | Spherotech Inc. | RCP-30-20A | Beads used for flow cytometry device maintainance |
| RPMI medium | Sigma Aldrich | R8758-500ML | Cell culture medium |
| RayBright Universal Compensation Beads | Raybiotech | 137-00013-100 | Beads used to create the compensation matrix |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) – 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection |
References
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Campbell, K. S., Hasegawa, J. Natural killer cell biology: an update and future directions. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
- Wensveen, F. M., Jelenčić, V., Polić, B. NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness. Frontiers in Immunology. 9, 441 (2018).
- Zingoni, A., et al. NKG2D and its ligands: “One for All, All for One”. Frontiers in Immunology. 9, 476 (2018).
- Eagle, R. A., Trowsdale, J. Promiscuity and the single receptor: NKG2D. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).
- El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer. Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).
- Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D. Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).
- Long, E. O. Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm. Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).
- Hüe, S., et al. A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease. Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).
- Gasser, S., Raulet, D. H. Activation and self-tolerance of natural killer cells. Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).
- Groh, V., et al. Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).
- Maurer, S., et al. Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells. Oncoimmunology. 7 (2), 1364827 (2018).
- Paczulla, A. M., et al. Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion. Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).
- Paczulla, A. M., et al. Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice. Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Taussig, D. C., et al. Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction. Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).
- Zhou, J., Chng, W. J. Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia. World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).
