एक्यूट माइलॉयड ल्यूकेमिया में बल्क सबपॉपुलेशन से स्टेम सेल को अलग करने के लिए NKG2D Ligand सतह का पता लगाने के दो प्रवाह साइटोमेट्रिक दृष्टिकोण
Summary
हम मानव प्राथमिक तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) नमूनों में NKG2D ligand (NKG2DL) का पता लगाने के लिए दो अलग-अलग धुंधला प्रोटोकॉल पेश करते हैं। पहला दृष्टिकोण एक संलयन प्रोटीन पर आधारित है, जो सभी ज्ञात और संभावित रूप से अभी तक अज्ञात लिगामेंट्स को पहचानने में सक्षम है, जबकि दूसरा प्रोटोकॉल कई एंटी-एनके2डीएल एंटीबॉडी के अलावा पर निर्भर करता है।
Abstract
एक ही रोगी के भीतर, NKG2D ligands (NKG2DL) सतह अभिव्यक्ति की अनुपस्थिति को स्टेम सेल गुणों (तथाकथित ल्यूकेमिक स्टेम सेल, एलएससी) के साथ ल्यूकेमिक सबपॉलेशन को अलग करने के लिए दिखाया गया था, जो अधिक विभेदित समकक्ष ल्यूकेमिक कोशिकाओं से होता है, जिसमें रोग दीक्षा क्षमता की कमी होती है, हालांकि वे समान ल्यूकेमिया विशिष्ट आनुवंशिक उत्परिवर्तन ले जाते हैं। एनकेजी2डीएल जैव रासायनिक रूप से अत्यधिक विविध एमएचसी वर्ग I-जैसे आत्म-अणु हैं। होम्योस्टेटिक स्थितियों में स्वस्थ कोशिकाएं आमतौर पर कोशिका की सतह पर NKG2DL व्यक्त नहीं करती हैं। इसके बजाय, इन लिगांड की अभिव्यक्ति सेलुलर तनाव (जैसे, ऑन्कोजेनिक परिवर्तन या संक्रामक उत्तेजनाओं) के संपर्क में आने पर प्रेरित होती है ताकि एनकेजी2डी-रिसेप्टर-प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं जैसी प्रतिरक्षा कोशिकाओं को व्यक्त करने के माध्यम से लाइसिस के माध्यम से क्षतिग्रस्त कोशिकाओं के उन्मूलन को ट्रिगर किया जा सके। दिलचस्प बात यह है कि एनकेजी2डीएल सतह अभिव्यक्ति को एलएससी उपआबादी में चुनिंदा रूप से दबा दिया जाता है, जिससे इन कोशिकाओं को NKG2D-मध्यस्थता प्रतिरक्षा निगरानी से बचने की अनुमति होती है। यहां, हम दो अलग-अलग प्रवाह साइटोमेट्री विधियों का एक साथ-साथ विश्लेषण प्रस्तुत करते हैं जो कैंसर कोशिकाओं पर NKG2DL सतह अभिव्यक्ति की जांच की अनुमति देते हैं यानी, पैन-लिगांड मान्यता और एकल लिगांड के खिलाफ कई एंटीबॉडी के साथ धुंधला करने वाली विधि शामिल है। इन तरीकों का उपयोग एनकेजी2डीएल सकारात्मक गैर-एलएससी से ख्यात कैंसर स्टेम सेल गुणों के साथ व्यवहार्य NKG2DL नकारात्मक सेलुलर उपजनसंख्या को अलग करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
एनके कोशिकाएं जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के महत्वपूर्ण प्रभावक हैं जो पूर्व एंटीजन उत्तेजना1के बिना घातक कोशिकाओं को पहचान और समाप्त कर सकती हैं या स्वस्थ कोशिकाओं (जैसे, वायरल संक्रमण से) पर बल दिया जा सकता है। इस प्रक्रिया को रिसेप्टर्स को सक्रिय करने के जटिल प्रदर्शनों की सूची के माध्यम से कसकर विनियमित किया जाता है-जैसे प्राकृतिक साइटोटॉक्सीसिटी रिसेप्टर्स (एनसीआरएस), एनके2डी और सीडी 16-और निरोधात्मक रिसेप्टर्स जो काफी हद तक किलर इम्यूनोग्लोबुलिन जैसे रिसेप्टर्स (KIRs)2द्वारा प्रतिनिधित्व करते हैं । दैहिक कोशिकाओं पर मानव ल्यूकोसाइट एंटीजन (एचएलए) वर्ग I अणुओं के लिए KIRs का बंधन आत्म-मान्यता सुनिश्चित करता है और एनके सेल सहिष्णुता को व्यक्त करता है। दूसरी ओर, आत्म-मान्यता की अनुपस्थिति और लक्ष्य कोशिकाओं पर अपने लिगामेंट्स को सक्रिय करने के लिए रिसेप्टर्स को सक्रिय करने की बाध्यकारी वृद्धि से साइटोटॉक्सिक कणिकाओं की रिहाई को ट्रिगर किया जाता है जिससे एनके सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिकिटी1होता है। अंत में, एनके कोशिकाएं आईजी (एफसीआर)2के एफसी हिस्से को व्यक्त करने के लक्ष्यों को सक्रिय रिसेप्टर सीडी 16 के बाध्यकारी द्वारा एंटीबॉडी-निर्भर सेलुलर साइटोटॉक्सिटी (एडीसीसी) लागू कर सकती हैं। प्रत्यक्ष साइटोटॉक्सिकिटी के अलावा, एनके कोशिकाएं अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली3के साथ जन्मजात को पाटने के लिए साइटोकिन रिलीज को भी ट्रिगर कर सकती हैं।
NKG2D एनके, एनकेटी, γδ टी और भोली सीडी 8 + टी कोशिकाओं पर व्यक्त किया गया एक प्रमुख सक्रिय रिसेप्टर है जो इसतरह के साइटोटॉक्सिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं को लक्षित कोशिकाओं को व्यक्त करने और NKG2D ligand (NKG2DL) को पहचानने और lyse करने में सक्षम बनाता है। स्वस्थ कोशिकाएं आमतौर पर NKG2DL व्यक्त नहीं करती हैं। इसके बजाय, NKG2DL अभिव्यक्ति घातक या वायरस संक्रमित कोशिकाओं पर विनियमित करने के लिए इन प्रतिरक्षा निकासी5के लिए उत्तरदायी बनाने के लिए है ।
मानव NKG2DL परिवार में आठ ज्ञात अणु शामिल हैं जिनमें से दो MHC I श्रृंखला से संबंधित अणु ए और बी (MICA और MICB6)और साइटोमेगालोवायरस UL16-बाध्यकारी प्रोटीन 1-6 (ULBP1-67)शामिल हैं । NKG2DL की अभिव्यक्ति ट्रांसक्रिप्शनल, पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल के साथ-साथ पोस्ट-ट्रांसलेशनल स्तर8पर विनियमित है। जैसे, जबकि NKG2DL अभिव्यक्ति आमतौर पर स्वस्थ कोशिकाओं की सतह पर पता लगाने योग्य नहीं है, NKG2DL mRNA9 और इंट्रासेलुलर प्रोटीन अभिव्यक्ति स्वस्थ ऊतकों में सूचित किया गया । ऐसी अभिव्यक्ति की कार्यात्मक प्रासंगिकता और ऐसे विकृत अभिव्यक्ति पैटर्न में अंतर्निहित तंत्र कोपरिभाषितकिया जाना बाकी है ।
कैंसर कोशिकाओं में NKG2DL अभिव्यक्ति का यंत्रवादी नियमन जांच का एक आकर्षक क्षेत्र है । या तो सेलुलर तनाव में शामिल होने के लिए जाना जाता रास्ते, उदाहरण के लिए, गर्मी सदमे तनाव मार्ग9,या डीएनए क्षति से जुड़े रास्ते, जैसे ataxia telangiectasia उत्परिवर्तित (ATM) और Rad3 संबंधित (एटीआर) मार्ग11,साथ ही वायरल या जीवाणु संक्रमण सीधे NKG2DL अभिव्यक्ति12के शामिल होने से जुड़ा हुआ है । हालांकि, भले ही NKG2DL की सतह अभिव्यक्ति को प्रभावी ढंग से प्रेरित किया गया है, इस अभिव्यक्ति को प्रोटियोलिटिक-मध्यस्थता शेडिंग के माध्यम से फिर से खोया जा सकता है, कुछ कैंसर13में प्रतिरक्षा भागने और खराब नैदानिक पूर्वानुमान से जुड़े तंत्र।
सेल सरफेस एनके2डीएल की अनुपस्थिति भी एएमएल के साथ रोगियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती है। यहां, गहन कीमोथेरेपी के साथ उपचार अक्सर छूट लाती है, लेकिन पतन अक्सर ल्यूकेमिक स्टेम सेल (एलएससी) से होता है, जो चुनिंदा रूप से कीमोथेरपी से बचते हैं और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बचते हैं। जैसा कि हमने हाल ही में दिखाया, उदाहरण के लिए, एलएससी, एनके 2डीएल सतह अभिव्यक्ति14को दबाकर एनके सेल लाइसिस से बच गया।
इसके विपरीत, सतह NKG2DL अभिव्यक्ति की अनुपस्थिति को थोक समकक्ष ल्यूकेमिक उप-आबादी से कोशिकाओं की ख्यात स्टेम जैसी उप-आबादी की पहचान करने और उन्हें अलग करने के लिए एक विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। यहां, हम दो प्रवाह साइटोमेट्रिक दृष्टिकोण पेश करते हैं जिनका उपयोग NKG2DL सतह अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए किया जा सकता है और इस तरह ल्यूकेमिया में NKG2DL नकारात्मक स्टेम कोशिकाओं की पहचान करता है और शायद अन्य कैंसर में भी: पैन-लिगांड सतह मान्यता के लिए एक विधि और व्यक्तिगत ज्ञात NKG2DL प्रोटीन को पहचानने वाले एकल या पूल किए गए एंटीबॉडी के साथ धुंधला करने वाली विधि।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम दो फ्लो साइटोमेट्रिक तरीके पेश करते हैं जो मानव प्राथमिक एएमएल कोशिकाओं पर NKG2DL सतह अभिव्यक्ति का पता लगा सकते हैं। हम बताते हैं कि दोनों डिटेक्शन विधियों का उपयोग अन्य एंटीबॉडी स्टेनिंग (उदाहर?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (179239), कैंसर के खिलाफ लड़ाई के लिए फाउंडेशन (Zuerich), विल्हेम सैंडर फाउंडेशन सीएल (2019.042.1) और मेडिकल-बायोलॉजिकल रिसर्च के लिए नोवार्टिस फाउंडेशन से सी.एल. इसके अलावा, इस परियोजना को मैरी Skłodowska-क्यूरी अनुदान समझौते नंबर 765104 के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से धन प्राप्त हुआ है । हम समर्थन के लिए बेसल में फ्लो साइटोमेट्री सुविधा का शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| 7-amminoactinomycin D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Viability dye |
| 96 well plate U bottom | Sarstedt | 833925500 | 96 Well plate for our Flow cytometer |
| APC Mouse Anti-Human cd34 | BD | 555824 | Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614 |
| Bovine Serum Albumin | PanReac AppliChem | A1391,0050 | Component of the staining buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Roth | 8043.1 | Component of the staining buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | Component of the supplemented RPMI medium |
| FlowJo 10.2 | BD | / | Software enabling data analysis for flow cytometry experiment |
| Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853 |
| Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R&D | 1299-NK-050 | Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID: |
| Human ULBP-1 Antibody | R&D | AF1380 | Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765 |
| Human ULBP-2/5/6 Antibody | R&D | AF1298 | Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725 |
| Human ULBP-3 Antibody | R&D | AF1517 | Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835 |
| MICA Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-35346 | Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656 |
| MICB Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-66698 | Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413 |
| One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions | Miltenyibiotec | 130-093-385 | Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-500ML | Component of the staining buffer |
| Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217 |
| Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um | Spherotech Inc. | RCP-30-20A | Beads used for flow cytometry device maintainance |
| RPMI medium | Sigma Aldrich | R8758-500ML | Cell culture medium |
| RayBright Universal Compensation Beads | Raybiotech | 137-00013-100 | Beads used to create the compensation matrix |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) – 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection |
References
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Campbell, K. S., Hasegawa, J. Natural killer cell biology: an update and future directions. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
- Wensveen, F. M., Jelenčić, V., Polić, B. NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness. Frontiers in Immunology. 9, 441 (2018).
- Zingoni, A., et al. NKG2D and its ligands: “One for All, All for One”. Frontiers in Immunology. 9, 476 (2018).
- Eagle, R. A., Trowsdale, J. Promiscuity and the single receptor: NKG2D. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).
- El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer. Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).
- Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D. Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).
- Long, E. O. Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm. Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).
- Hüe, S., et al. A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease. Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).
- Gasser, S., Raulet, D. H. Activation and self-tolerance of natural killer cells. Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).
- Groh, V., et al. Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).
- Maurer, S., et al. Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells. Oncoimmunology. 7 (2), 1364827 (2018).
- Paczulla, A. M., et al. Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion. Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).
- Paczulla, A. M., et al. Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice. Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Taussig, D. C., et al. Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction. Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).
- Zhou, J., Chng, W. J. Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia. World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).
