En Multi-Cue Bioreactor til at evaluere inflammatoriske og regenerative kapacitet Biomaterialer under Flow og Stretch

Summary

Målet med denne protokol er at udføre en dynamisk co-kultur af menneskelige makrofager og myofibroblaster i rørformede elektropun stilladser til at undersøge materiale-drevet væv regenerering, ved hjælp af en bioreaktor, som gør det muligt afkobling af shear stress og cyklisk stretch.

Abstract

Brugen af resorbable biomaterialer til at fremkalde regenerering direkte i kroppen er en attraktiv strategi fra et translationelt perspektiv. Sådanne materialer fremkalder en inflammatorisk reaktion ved implantation, som er drivkraften bag efterfølgende resorption af materialet og regenerering af nyt væv. Denne strategi, også kendt som in situ vævsteknik, forfølges for at opnå hjerte-kar-udskiftninger såsom væv-manipuleret vaskulære grafts. Både de inflammatoriske og regenerative processer bestemmes af de lokale biomekaniske signaler på stilladset (dvs. stræk og forskydningsstress). Her beskriver vi i detaljer brugen af en specialudviklet bioreaktor, der unikt muliggør afkobling af stræk- og forskydningsstress på et rørformet stillads. Dette giver mulighed for systematisk og standardiseret evaluering af den inflammatoriske og regenerative kapacitet af rørformede stilladser under påvirkning af velkontrollerede mekaniske belastninger, som vi demonstrerer på grundlag af et dynamisk co-kultur eksperiment ved hjælp af menneskelige makrofager og myofibroblasts. De vigtigste praktiske skridt i denne fremgangsmåde — konstruktion og opsætning af bioreaktoren, forberedelse af stilladser og cellesåning, anvendelse og vedligeholdelse af stræk- og forskydningsflow og prøvehøst til analyse — gennemgås i detaljer.

Introduction

Kardiovaskulær vævsteknik (TE) forfølges som en alternativ behandlingsmulighed til de aktuelt anvendte permanente hjerte-kar-proteser (f.eks. vaskulære grafts, hjerteklapproteser), som er suboptimale for store kohorter af patienter^1,2,3,4. Meget eftertragtede applikationer omfatter vævsfremstillede vaskulære grafts (TEVGs)^5,6 og hjerteklapper (TEHVs)^7,8. Oftest gør kardiovaskulære TE-metoder brug af resorbable biomaterialer (enten naturlige eller syntetiske), der tjener som et lærerigt stillads til det nye væv, der skal dannes. Dannelsen af nyt væv kan enten konstrueres fuldstændigt in vitro ved at så stilladset med celler og dyrkning i en bioreaktor inden implantation (in vitro TE)^9,10,11eller direkte in situ, hvor det syntetiske stillads implanteres uden forudgående dyrkning for at fremkalde dannelsen af nyt væv direkte i kroppen (in situ TE)^12,13,14. For både in vitro- og in situ-kar-te-tilgange er vellykket funktionel regenerering overvejende afhængig af både værtens immunrespons på den implanterede konstruktion og passende biomekanisk belastning.

Betydningen af biomekanisk belastning for hjerte-kar-TE er velkendt¹⁵. I tilfælde af hjerte-kar-implantater udsættes de celler, der befolker stilladset, for cyklisk stræk og forskydningsspændinger, der opstår som følge af det hæmodynamiske miljø. Talrige undersøgelser har rapporteret den stimulerende virkning af (cyklisk) strækning på dannelsen af matrixkomponenter, såsom kollagen^16,17,18,19, glycosaminoglycans (GAGs)²⁰, og elastin^21,22, af forskellige celletyper. For eksempel viste Huang et al. at toårig strækning forhøjede depositionen og organiseringen af kollagen og elastin i in vitro TEVGs ved hjælp af en vaskulær bioreaktor²³. Mens vægten typisk ligger på stræk som den dominerende belastning, gør disse undersøgelser ofte brug af flowdrevne bioreaktorer, hvor prøven også udsættes for forskydningsflow. Selv om relativt lidt er kendt om den isolerede indflydelse af forskydning understreger på væv dannelse og betændelse i 3D, nogle data er tilgængelige. For eksempel viste Hinderer et al. og Eoh et al., at forskydningsflow ud over en 3D-stilladsmikrostruktur var vigtig for dannelsen af moden elastin af menneskelige vaskulære glatte muskelceller i et in vitro-modelsystem^24,25. Alt i alt illustrerer disse resultater relevansen af både cyklisk stræk og forskydningsstress for kardiovaskulær TE.

En anden vigtig determinant for succes eller svigt af TE implantater er værtens immunrespons på den implanterede graft²⁶. Dette er især vigtigt for materialedrevne in situ TE-strategier, som faktisk er afhængige af den akutte inflammatoriske reaktion på stilladset for at kickstarte de efterfølgende processer med cellulær tilstrømning og endogen vævsdannelse og remodeling²⁷. Makrofaget er en kritisk initiator for funktionel vævsgendannelse, som er blevet vist ved flere undersøgelser^28,29,30. Svarende til sårheling, regenerering af væv er omfattet af parakrine signalering mellem makrofager og vævsproducerende celler såsom fibroblaster og myofibroblasts^31,32,33. Ud over at koordinere nye væv deposition, makrofager er involveret i aktiv resorption af udenlandske stillads materiale^34,35. Som sådan er in vitro-makrofagets reaktion på et biomateriale blevet identificeret som en prædiktiv parameter for implantaternes in vivo-succes^36,37,38.

Makrofagets respons på et implanteret stillads afhænger af stilladsdesignfunktioner som materialesammensætning og mikrostruktur^35,39,40. Ud over stilladsegenskaber påvirkes makrofagets reaktion på et stillads og deres krydstale med myofibroblaster også af hæmodynamiske belastninger. For eksempel viste cyklisk strækning sig at være en vigtig modulator af makrofagfostype^41,42,43,44 og sekretionen af cytokiner^43,44,45,46 i 3D elektrospun stilladser. Ved hjælp af et co-kultur system af makrofager og vaskulære glatte muskelceller, Battiston et al. vist, at tilstedeværelsen af makrofager førte til øgede niveauer af elastin og GAGs, og at moderate niveauer af cyklisk stretch (1,07-1,10) stimuleret deposition af kollagen I og elastin⁴⁷. I tidligere værker har vi vist, at forskydningsstress er en vigtig determinant for monocytrekruttering i 3D elektrospun stilladser^48,49, og at både forskydningsstress og cyklisk stræk påvirker parakrinesignalering mellem menneskelige monocytter og mesenchymale stromale celler⁵⁰. Fahy et al. påviste, at forskydningsstrømmen øgede udskillelsen af proinflammatoriske cytokiner ved menneskelige monocytter⁵¹.

Samlet set viser ovenstående beviser, at en passende forståelse af og kontrol over hæmodynamiske belastninger er afgørende for kardiovaskulær TE, og at det er vigtigt at overveje den inflammatoriske reaktion for at opnå dette. Talrige bioreaktorer er tidligere blevet beskrevet for in vitro^{52,53,54,55,56,57,58} eller ex vivo^59,60,61 kultur af hjerte-kar-væv. Men alle disse systemer er designet til at efterligne de fysiologiske hæmodynamiske belastningsforhold så meget som muligt. Selv om dette er meget værdifuldt med henblik på at skabe hjerte-kar-væv in vitro eller opretholde ex vivo kulturer, sådanne systemer ikke giver mulighed for systematiske undersøgelser af de enkelte virkninger af de enkelte signaler. Dette skyldes, at anvendelsen af både cyklisk stræk og forskydningsbelastning i disse bioreaktorer er drevet af det samme trykstrøm, som i sig selv forbinder dem. Mens mikrosystemer, der giver mulighed for nøjagtig multi-cue mekanisk manipulation er blevet beskrevet for 2D substrater⁶² eller 3D hydrogel opsætninger^63,64, sådanne opsætninger ikke giver mulighed for inkorporering af elastomeriske 3D biomateriale stilladser.

Her præsenterer vi anvendelsen af et rørformet bioreaktorsystem, der unikt muliggør afkobling af forskydningsstress og cyklisk stræk og hjælper med mekanisk at undersøge deres individuelle og kombinerede virkninger. Dette system giver mulighed for testning af en bred vifte af vævsfremstillede vaskulære grafts (f.eks syntetisk eller naturlig oprindelse, forskellige mikroarkitekturer, forskellige porøsiteter). For effektivt at afkoble anvendelsen af forskydningsstress og stræk er de nøglebegreber, som bioreaktoren bruger, (1) adskillelse af styringen af forskydningsstress og stræk ved hjælp af forskellige pumpesystemer og (2) stimulering af stilladserne på en 'inside-out' måde med beregningsmæssigt drevne dimensioner. Flow påføres på ydersiden af det rørformede stillads ved hjælp af en strømningspumpe, mens stilladsets omkredssstrækning induceres ved at udvide et silikonerør, hvor stilladset er monteret ved hjælp af en separat stammepumpe. Dimensionerne af silikonerøret og glasrøret, der indeholder konstruktionen, er omhyggeligt udvalgt og valideret ved hjælp af beregningsmæssige væskedynamiksimuleringer for at sikre, at forskydningsspændingen på stilladset (på grund af flow) og omkredsstrækningen (på grund af rørudvidelse) ikke påvirker hinanden væsentligt. Dette inside-out design har flere praktiske rationaler. Hvis strækningen påføres af det luminale væsketryk (svarende til fysiologisk belastning), kræver det i sagens natur, at prøvedesignet er lækagefrit. Desuden vil det tryk, der kræves for at strække prøven, blive fuldstændig bestemt af prøvestivheden, som kan variere mellem prøverne og inden for en prøve over tid, hvilket gør det vanskeligt at kontrollere strækningen. Denne bioreaktor monterer vævsfremstillet graft omkring et silikonerør og giver mulighed for vægforskydningsbelastning (WSS) på graftens ydervæg og presser graften indefra. På denne måde kan der sikres lige belastningsforhold mellem prøver og inden for prøver over tid, og desuden må prøverne være utætte, som det er almindeligt for porøse vaskulære stilladser¹⁹. Denne inside-out bioreaktor er specielt beregnet til systematiske undersøgelser af virkningerne af shear og / eller stretch, snarere end konstruktionen af en indfødt-lignende blodkar in vitro, som traditionelle vaskulære bioreaktor opsætninger er mere egnede. Se figur 1A-B for tegningerne af bioreaktordesign og den tilsvarende tabel 1 for en funktionel beskrivelse og begrundelse bag bioreaktorens hovedkomponenter.

Brugen af bioreaktoren demonstreres på grundlag af en række nylige undersøgelser fra vores gruppe, hvor vi undersøgte de individuelle og kombinerede påvirkninger af forskydningsstress og cyklisk strækning på inflammation og vævsdannelse i resorbable elektrospun stilladser til in situ hjerte-kar-væv^19,43,44. Til det formål brugte vi menneskelige makrofager og myofibroblaster enten i mono- eller i co-kultur til at simulere de forskellige faser af in situ regenerativ kaskade. Vi har vist, at cytokin sekretion af menneskelige makrofager er tydeligt påvirket af både cyklisk stræk og forskydning stress, påvirker matrix deposition og organisation af menneskelige myofibroblasts i disse stilladser, både via parakrine signalering og direkte kontakt^19,43,44. Især viste disse undersøgelser, at i tilfælde af kombineret anvendelse af forskydningsstress og stræk er virkningerne på vævsdannelse og betændelse enten domineret af en af de to belastninger, eller der er synergistiske virkninger af begge belastninger. Disse resultater illustrerer relevansen af afkobling af begge belastninger for at få en bedre forståelse af det mekaniske miljøs bidrag til TE-processer. Denne forståelse kan anvendes til systematisk at optimere stilladsdesignparametre i relevante hæmodynamiske belastningsregimer. Derudover kan de mekanistiske data fra sådanne velkontrollerede miljøer tjene som input til numeriske modeller, der udvikles for at forudsige forløbet af in situ-vævsombygning, som for nylig rapporteret for TEVGs⁶⁵ eller TEHVs⁶⁶, for yderligere at forbedre prædiktiv kapacitet.

Protocol

I de undersøgelser, der er beskrevet i denne protokol, er primære menneskelige makrofager isoleret fra perifere blod buffy frakker og humane myofibroblasts isoleret fra den saphenous vene efter koronar by-pass kirurgi er blevet brugt⁴⁴. De buffy frakker blev opnået fra sunde, anonymiserede frivillige, der gav skriftligt informeret samtykke, som blev godkendt af Sanquin Research Institutional Medical Ethical Committee. Brugen af humane vena saphena celler (HVSCs) var i overensstemmelse med "Code Korrekt sekundær brug af humant væv" udviklet af Federation of Medical Societies (FMWV) i Holland.

1. Generelle forberedelser og nødvendige foranstaltninger, før bioreaktoren oprettes

BEMÆRK: Nærmere oplysninger om de respektive isolations- og dyrkningsprotokoller findes i tidligere arbejde^19,43,44. Alle beregninger i protokollen er givet som eksempler på et co-kultur eksperiment med monocytter og myofibroblasts, seedet i 8 hæmodynamisk indlæst stilladser og 2 statiske kontroller (n = 10).

1. Start celleisolation og cellekultur. Såningstætheden for de co-dyrkede prøver af monocytter og myofibroblaster (med et såningsforhold på 2:1) er henholdsvis 30 ×^{10 6} monocytter/cm³ og 15 × 10⁶ myofibroblasts/cm^3.
   BEMÆRK: Elektrospunmaterialet har en høj porøsitet (>90%). For at anslå det krævede antal celler pr. graft beregnes stilladsets volumen med formlen for volumen af en hul cylinder: π*(tykkelse)²*længde ≈ 0,04 cm³. Den samlede mængde celler pr graft er 1,2 × 10⁶ monocytter og 0,6 × 10⁶ myofibroblasts. For 10 prøver kræves mindst 12 × 10⁶ monocytter og 6 × 10⁶ myofibroblaster; starte med op til ~10-15% flere celler for at tage højde for mulige pipetteringsfejl.
2. Afgas cellekulturmediet, der skal bruges til forsøg, der involverer bioreaktoren.
   1. Forbered mediet til samkulturer, som består af RPMI-1640:aDMEM (1:1), suppleret med 10% føtalt kvægserum, 1% penicillin-streptomycin og 0,5% L-glutamin.
   2. Mediet anbringes natten over (O/N) i en inkubator i en cellekulturkolbe med filterhætte til afgasning.
   3. Filterhætten udskiftes med en lufttæt hætte og opbevares ved 4 °C.
   4. Lige før brug tilsættes 0,25 mg/mL L-ascorbinsyre 2-fosfat (C-vitamin) til mediet.
      BEMÆRK: Ved beregninger er mængden af mellemstrøms påkrævet pr. flowkulturkammer 50 mL. Opdater mediet tre gange om ugen. 25 mL gammelt medium erstattes af 25 mL frisk medium. For 10 prøver; efter såning kræves der i alt 500 mL frisk medium, og for hver efterfølgende mediumændring anvendes i alt 250 mL frisk medium. Forbered altid medium frisk, især bør C-vitamin tilsættes lige før du skifter mediet.
3. Forbered isotropiske elektrospunstilladser (3 mm luminal diameter, 200 μm vægtykkelse) som beskrevet af Van Haaften et al.¹⁹ (Figur 1G-I). Kort sagt produceres rørformede polycaprolactone bisurea (PCL-BU) stilladser ved elektrospinning fra 15% (w/w) chloroform-polymeropløsninger. Polymeropløsningerne er elektrospun ved stuetemperatur og 30% relativ luftfugtighed med en strømningshastighed på 40 μL/min. 16 cm afstand fra det roterende cylindriske mål (Ø 3 mm, 500 omdrejninger i minuttet) og en påført spænding på 16 kV på elektrospinningdysen og -1 kV på målet.
   BEMÆRK: Selv om PCL-BU grafts blev anvendt til disse forsøg, kan der monteres en bred vifte af elastomeriske vævsfremstillede grafts i denne bioreaktor (f.eks. af forskellig syntetisk eller naturlig oprindelse, forskellige mikroarkitekturer, forskellige porøsiteter)
   1. Fjern elektrospun stilladser fra mandrel.
      1. Lav et lille hul i hætten på et 15 mL rør for at 'holde' mandrel i midten og forhindre det i at røre ved rørets væg.
      2. Placer mandrel med elektrospun stilladset i falkerøret og fyld det med deioniseret vand.
      3. Rør O/N fryses ved -20 °C.
      4. Placer rørene ved stuetemperatur (RT) og træk mandrels efter et par minutter, forlader elektrospun grafts i isen.
      5. Lad isen tø helt op, fjern elektrospunrøret fra det optøede vand, og 'hæng' til tørre lodret i flere timer. Sørg for, at stilladserne ikke 'kollapser' under deres egen vægt.
   2. Tørre stilladser under vakuum O/N.
   3. Billede en lille prøve af elektrospun grafts ved hjælp af scanning elektronmikroskopi (SEM) til at vurdere deres mikrostruktur (f.eks fiber morfologi, fiber diameter). Grafts i eksempelundersøgelserne har en isotropisk fiberorientering og en fiberdiameter på 5 μm (Figur 1H-I).
4. En dag før eksperimentet påbegyndes, skal du placere det hydrauliske reservoir fyldt med deioniseret vand i inkubatoren. Luk alle otte forbindelser for flowkulturkamre med hvide Luer-hætter. Opret forbindelse til trykluftsystemet, og indsæt tryksensoren. Kør stammepumpen (se trin 5.6) O/N for at give mulighed for en lille udvidelse af Teflon-bælgen.
   BEMÆRK: Sørg for, at alt nødvendigt materiale og udstyr rengøres og/eller autoklaveres (se kolonnen Materialeoversigt, Kommentar/Beskrivelse, for hvilke materialer der må autoklaveres) i overensstemmelse med producentens protokol eller som beskrevet i trin 7.3-7.6.
5. Sørg for sterile arbejdsforhold for resten af protokollen.
   1. Udfør trin 2-5.3 (opsætning af systemet), trin 6.3 (medium ændring) og trin 7.1-7.2 (høst af vaskulære konstruktioner) i et sterilt laminarflowkabinet.
   2. Placer materialer, der ikke er direkte nødvendige for de efterfølgende trin i lukkede petriskåle for at holde alt så rent som muligt.
   3. Rengør eller tørt materiale overflader regelmæssigt ved iblødsætning et papirvæv med 70% ethanol, og tør overfladerne af bioreaktor komponenter og laminar flow kabinet.

2. Oprettelse af bioreaktoren

BEMÆRK: Udfør trin 2 i et laminar-flowskab.

1. Skær elektrospunstilladserne i rør med en længde på ca. 25 mm, og dokumenter dem før brug (f.eks. fotografi for længden, vej med balance for den oprindelige masse).
2. Dekontaminere elektrospun stilladser.
   1. Elektrospunstilladserne placeres i en brøndplade eller petriskål med en åbning mod den ultraviolette (UV) lyskilde, så UV-lys (253,7 nm) kan belyse indersiden af stilladserne.
   2. Udsæt elektrospun stilladser til UV-lys i 5 min.
   3. Vend alle stilladser, og gentag UV-belysningen for den anden åbning.
      BEMÆRK: Efter dette trin må elektrospunstilladset kun berøres, når det er nødvendigt. Brug altid ren pincet eller rene handsker.
   4. Tag glasrørene i flowkulturkamrene, der opbevares i 70%, vask glasrørene i ultrapure vand, tør og læg dem i en stor, lukket petriskål.
      BEMÆRK: Følgende trin, især trin 2.3-2.5, udføres ideelt af to eksperimentatorer.
3. Monter elektrospun stilladser på silikone slange.
   1. Fastgør 5-0 prolen sutur til den ene ende af silikone slangen ved at tage suturen gennem den ene side af røret og ud af den anden, hvilket efterlader to modsatte stramme suturer spænder over tværsnit af slangen. Lav en lille knude på begge sider af røret, mens du komprimerer røret ved knudernes locus og efterlader ca. 10 cm ledning på begge knuder. Lav en tredje knude for enden af de to 10 cm venstre-over ledninger.
      1. Skær suturnålen og alle frie tråde, der kan stikke ud og beskadige indersiden af elektrospunstilladset. Skær kanterne af silikonerøret væk i trekantet form for at hjælpe med at trække silikonerøret gennem elektrospunstilladset.
   2. Dyp elektrospun stilladset i 30% ethanol (dette tjener som ekstra dekontamineringstrin og hjælper med at skubbe elektrospun stilladset over siliciumrøret) og læg elektrospunstilladset over den frie 10 cm ledning. Experimenter A strækker silikonerøret ved at trække forsigtigt på både silikonerøret og knuden på den 10 cm lange suturtråd, mens eksperimentator B forsigtigt glider elektrospunstilladset over silikonerøret ved hjælp af pincet med en glat indvendig spids for at forhindre beskadigelse af stilladserne.
   3. Slip langsomt stræk på silikonerøret, samtidig med at elektrospunstilladset udglattes med pincet. Dyp elektrospun stilladset på silikonerøret i ultrapure vand to gange.
      BEMÆRK: Det er muligt, at der opstår noget rynke af elektrospunstilladset. Denne rynke forsvinder under den påførte forstrækning lige før fastgørelse af stilladserne på trykledningerne ved trin 2.5.3.
   4. Gentag trin 2.3.2 og 2.3.3 for de andre elektrospun stilladser. Afhængigt af længden af silikonerøret kan flere elektrospun stilladser monteres på samme silikonerør.
   5. Når alle elektrospun stilladser er monteret på silikonerøret, skæres silikonerørene rundt om stilladserne, alle i samme længde (5,5 cm); på den ene side, tæt på enden af elektrospun stilladset, på den anden side, forlader ~ 2-3 cm fri silikone slange.
4. Det nederste rum i flowkulturkammeret (Figur 1A-B).
   1. Tag den øverste del af det nederste rum, der indeholder flowudløbet, og luk flowudløbet med et mandligt Luer-stik.
   2. Trykledningen med huller gennem det nederste rum, og placer en silikone O-ring omkring den nederste ende af trykledningen for at forhindre lækage. Skru den nederste del af det nederste rum til den øverste del af det nederste rum for at sikre trykledningen. Sørg for, at trykledningens nederste indgraverede rille er ca. 3-5 mm over kanten af adapterbøsningen i det nederste rum. dette vil senere 'holde' den stramme knude af suturtråden og fastgøre elektrospunstilladset over silikonerøret.
      BEMÆRK: Hvis trykledningen let kan manøvreres op og ned, indikerer det, at det nederste rum ikke er godt fastgjort. Gentag trin 2.4.2 for at forhindre lækage i senere faser (Figur 2D).
5. Fastgør silikoneslangen med elektrospunstilladset til trykledningen.
   1. Træk silikonerøret med elektrospunstilladset over trykledningen.
   2. Lav en knude med suturtråden i den nederste ende af elektrospunstilladset på placeringen af den indgraverede rille på trykledningen. Lav en anden knude på den modsatte side for at fastgøre silikonerøret tæt med elektropuntransplantationen.
      ADVARSEL: Dette er et kritisk skridt. Sørg for, at knuden præcis 'falder' ind i trykledningens indgraverede rille for at forhindre lækage af vandet fra det hydrauliske reservoir til flowkulturkamrene. Hvis du ikke er sikker, skal du forsøge at stramme suturledningen på flere positioner, over eller under rillens forventede placering, for at sikre, at de sidste knuder er nøjagtigt ved den indgraverede rille (Figur 2A).
   3. Placer saksekstrammen i den øvre ende af silikonerøret, og stræk silikonerøret opad (dette vil direkte teste den første knude, hvis det er muligt at flytte silikonerøret med elektrospunstilladset over trykledningen, blev den ikke strammet godt nok). Med trækkraften er silikonerøret forstrækninget. For at sikre, at silikonerøret er konsistent mellem de forskellige prøver, skal du fastgøre en lineal til saksekstfastningen. Træk saksekstrammen opad, indtil linealens nederste ende når højden af stilladsets nederste ende.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at holde forstrækningen i hver prøve nogenlunde den samme (~5%) af to grunde: (1) hvis silikonerøret er forstrækninget, vil det resultere i en mere homogen ekspansion langs prøvens længde under tryk; (2) forstrækningen vil påvirke silikonens mekaniske egenskaber, og den bør derfor være den samme på tværs af alle prøver for at sikre lige strækforhold mellem prøverne.
   4. Fjern rynker i elektrospun stilladset ved forsigtigt at trække på elektrospun stilladset. Igen, gøre to knob på begge sider med en sutur ledning på den øverste ende af stilladset på placeringen af den øverste indgraveret rille på trykledningen.
   5. Slip sakseklemmen, og skær overskuddet af silikonerør væk med en kniv, så 20-30% af skruetråden er dækket af silikonerør, for at forhindre lækage, når næsekeglet er monteret på skruetråden.
      BEMÆRK: Gentag trin 2.4 og 2.5 for alle dynamiske prøver.
   6. For de statiske kontrolprøver skal du fastgøre elektrospunstilladset monteret på silikonerøret på trykledninger uden huller. Disse ledninger kan opbevares separat i et 15 mL rør indtil såning (trin 4) og behøver ikke at blive monteret i flowkulturkammerrummene.
6. Dekontaminere den delvist konstruerede flow kultur kamre med elektrospun stillads ved at udsætte det for UV-lys i 10 min. Drej flowkulturkamrene med elektrospunstilladser til den anden side, og gentag UV-lyseksponering i 10 minutter.
7. Skru næsekeglerne på skruetråden på trykledningerne med huller til de dynamiske prøver.
   1. Sørg for, at den øverste ende af silikonerøret passer ind i næsekeglerne for at forhindre lækage i senere faser. Hvis der er for meget silikonerør, skæres overskuddet af slanger væk med en kniv.
   2. Placer de delvist konstruerede flowkulturkamre i en stor petriskål, og peg næsekegleren mod UV-lyskilden. Påfør UV-belysning i 5 min.
8. Komplet konstruktion af flowkulturkammeret med glasrøret og det øverste rum i flowkulturkammeret(figur 1A-B).
   1. Forvæd elektrospun stilladser ved at dyppe trykledningen med silikonerør og elektrospun stillads i 30% ethanol, efterfulgt af en dukkert i ultrapure vand to gange.
   2. Placer glasrøret over trykledningen, og skub forsigtigt i det nederste rum og fastgør det forsigtigt.
   3. Tag det øverste rum, der indeholder flowindløbet, placer en silikone-O-ring, flow glattejernet og adapterbøsningen i den rigtige rækkefølge (Figur 1A-B), og placer den over den åbne ende af glasrøret og fastgør det forsigtigt.
   4. Skru en hvid Luer-hætte på flowindløbet i det øverste rum.
   5. Fjern det mandlige Luer-stik fra strømningsåbningen i det nederste rum, og rengør overfladen omkring det med et ethanol-gennemblødt papirvæv.
   6. Placer en sprøjte med 10 mL ultrapure vand i flowudgangen, åbn den hvide Luer-hætte på det øverste rum, og fyld kammeret med ultrapure vand. Luk den hvide Luer-hætte igen, fjern sprøjten, rengør igen med ethanol, og luk flowudløbet med et han luer-stik.
      BEMÆRK: Gentag trin 2.6-2.8 for alle flowkulturkamre.
   7. Til de statiske styringer tilsættes 10 mL ultrapure vand til de 15 mL rør, der holder prøverne monteret på trykledningerne uden huller.
9. Placer alle flowkulturkamre i inkubatoren. Udskift ultrapurevandet med dyrkningsmedie en dag før cellesåning på samme måde som beskrevet i trin 2.8.5 og 2.8.6 (sørg for at opsamle det 'gamle' ultrapure vand med et ethanol-gennemblødt papirvæv placeret direkte på strømningsudløbet).

[Protokollen kan sættes på pause her]

3. Forberedelser til opsætning af flowpumpen

BEMÆRK: Udfør trin 3 i et laminar-flowskab.

1. Saml alle pumpe setup materialer og forberede brug.
   BEMÆRK: Forsøgsfolk henvises til fabrikantens protokol for en detaljeret beskrivelse af opsætningen af pumpen, de flydende enheder og medium slange gennem ventilerne på den fluidiske enhed.
   1. Sæt pumpen til 200 mbar kapacitet.
   2. Skru reservoirholderne til 60 mL reservoirer til de flydende enheder.
   3. Rengør de genanvendelige gummiluftfiltre med et papirvæv gennemblødt i ethanol, sørg for, at luftfilteret forbliver tørt.
2. Placer 60 mL-reservoirerne i reservoirholderne, og placer standardmedieslangen gennem ventilerne på den fluidiske enhed. Forbind mediumrøret med en større indvendig diameter med kvindelige Luer-låsekoblinger i en lukket løkke.
3. Klem mediumrøret med et slangeklemmer direkte under reservoirerne.
4. Fyld reservoirerne med 25 mL kulturmedium pr. 60 mL reservoir. Slip slangeclipsen, og lad mediet komme ind i slangen.
5. Luk de mellemstore reservoirer med gummiluftfiltrene, og placer flowpumpeopsætningen i inkubatoren indtil trin 4.

4. Celle såning Ved hjælp af Fibrin som en celle Carrier

BEMÆRK: Udfør trin 4 i et laminar-flowskab.

1. Forbered fibrin gel til celle såning trin. Nærmere oplysninger findes i Mol et al.⁶⁷ For fibringelen bør fibrinogenopløsningen have en endelig koncentration på 10 mg/mL (korrekt for proteinbestandens renhed), og thrombinopløsningen skal have en endelig koncentration på 10 U/mL.
   1. Tø fibrinogen til RT, før vejning ~ 50 mg (nok til 10 prøver) i en plastikbeholder med et rødt låg.
   2. Tilsæt cellekulturmedium for at forberede fibrinogenopløsningen (i en koncentration på 10 mg/mL korrigeres for proteinbestandens renhed). Bland godt og filtrer for at sterilisere fibrinogenopløsningen med et 0,2 μm sprøjtefilter i et sterilt 15 ml rør. Hold den filtrerede fibrinogenopløsning på is.
      BEMÆRK: Undgå at forberede fibrinogenopløsningen for længe i forvejen, da fibrinogen ellers kan størkne spontant.
   3. Tø thrombin og gøre en thrombin løsning (i en koncentration på 10 U / ml) i cellekultur medium og sted på is. Der fremstilles 20 μL thrombin + celleropløsning pr. prøve. For n=10 prøver er der behov for 200 μL. Derfor fremstilles 250 μL thrombinopløsning for at tage højde for mulige pipetteringsfejl.
2. Indsamle og tælle cellerne fra dyrkningskolberne. Bland cellerne i det ønskede forhold og beløb (1,2 × 10⁶ monocytter og 0,6 × 10⁶ myofibroblasts pr. stillads). Sørg for, at der er nok celler til n+1-prøver til at korrigere for pipetteringsfejl. Centrifuge ved 350 × g i 10 min ved RT. Fjern supernatanten.
3. Lav en blanding af de suspenderede celler og thrombin.
   1. For hver prøve anvendes 20 μL af thrombinopløsningen. For n=10 prøver tilsættes 200 μL thrombin til cellepillen og blandes. Måle mængden af celleaffjedringen (celler + thrombin) og beregne, hvordan man fordeler jævnt over alle 10 stilladser (f.eks. hvis thrombin + celleaffjedringen har et volumen på 260 μL, vil hver elektrospunprøve modtage 260 μL/10 prøver = 26 μL thrombin + celleaffjedring).
   2. Når såningen af stilladserne udføres i to trin, skal du forberede to 1,5 mL mikrofugerør, der holder halvdelen af celleophænget for hvert stillads (i eksempelberegningen af det foregående trin: forbered to rør med 13 μL thrombin + cellesuspension). Sted på is.
      BEMÆRK: Følgende trin, især trin 4.4, udføres ideelt af to eksperimentatorer.
4. Tør de forskudte elektrospun stilladser med vakuum for at forberede cellesåning.
   1. Tilslut et glas Pasteur-pipet til vakuumsystemet i laminar flowskabet, og læg det i et tomt 50 mL rør til steril midlertidig opbevaring.
   2. Tag flowkulturkamrene fra inkubatoren, fjern det mandlige Luer-stik fra flowudløbet, og fjern mediet efter åbning af den hvide Luer-hætte og placering af et ethanol-gennemblødt papirvæv foran strømningsudgangen.
   3. Tag det øverste rum og glasrøret af, og læg det i en steril petriskål til midlertidig opbevaring.
   4. Placer vakuum Pasteur pipet på elektrospun stilladset, og fjern så meget medium som muligt.
      ADVARSEL: Støvsug elektrospunstilladset meget forsigtigt. I stedet for en lineær bevægelse frem og tilbage over stilladset skal du placere vakuumrøret flere steder. Klem vakuumrøret oven på Pasteurs pipet ind mellem fingrene for bedre kontrol.
   5. Fibrinogenopløsningen blandes i et 1:1-forhold med thrombin + celleophæng (f.eks. blandes 13 μL fibrinogen med 13 μL thrombin + celleaffjedring). For at sikre, at fibrin polymeriserer i stilladset og ikke i mikrofugerøret, pipetter fibrinogen, drej pipethjulet for det 'ekstra volumen' af thrombin + celleaffjedring, og rør op og ned en gang i mikrofugerøret med celleaffjedring for at blande.
   6. Direkte homogent dryppe opløsningen over hele længden af elektrospun stilladset. Det tilrådes, at Experimenter A drypper fibrin blandingen, mens eksperimentator B holder det nederste rum med elektrospun stillads monteret på trykledningen.
   7. Efter at fibrinen med cellerne er dryppet over elektrospun stilladset, flytter Experimenter B langsomt stilladset, fra venstre mod højre og op og ned, for yderligere at opdele cellerne jævnt over stilladset.
   8. Gentag trin 4.4.5 - 4.4.7 på den anden side af elektrospun stilladset.
   9. Monter flowkulturkammeret igen ved omhyggeligt at placere glasrøret (undgå fibrin stikning og koagulation på indersiden af glasrøret), og skub det øverste rum i flowkulturkammeret tilbage. Placer den seedede konstruktion direkte uden medium eller fosfatbufferet saltvand (PBS) i flowkulturkammeret i inkubatoren.
   10. Gentag trin 4.4.1-4.4.9 for alle dynamiske prøver. For statiske prøver monteret på trykledninger uden huller, frø i henhold til trin 4.4.1-4.4.8, og sted i en 15 mL rør bagefter.
   11. Lad fibrin polymerisere i 60 minutter i inkubatoren.

[Protokollen kan sættes på pause her i 30-60 min.]

5. Efter polymerisering fyldes flowkulturkamrene (dynamiske prøver) eller de 15 mL rør (statiske prøver) med medium.

5. Kobling af bioreaktor- og flowpumpesystemerne, inden eksperimentet påbegyndes

BEMÆRK: Udfør trin 5.1-5.3 i et laminar-flowkabinet.

1. Tag bakken med flowkulturkamrene og de flydende enheder med fyldte mellemstore reservoirer og tilsluttede mellemstore slanger inde i laminar flowskabene.
2. Placer flowkulturkamrene på bioreaktorbasen for forsøgsgrupperne fyldt med cyklisk stræk og med kombinerede hæmodynamiske belastninger (Figur 1E).
   1. Vip flowkulturkammeret på hovedet, og fyld trykledningen nedefra med ultrapure vand ved hjælp af en sprøjte med tynd slange (dette kan være af enhver art, så længe det er fleksibelt og tyndt, i dette eksperiment blev en 10 cm lang, 0,15 mm indvendig diametertråd fastgjort til nålen).
   2. Placer den tynde slange inde i trykledningen, og mens trykledningen er fyldt med ultrapurt vand ved gradvist at skubbe vandet ud af sprøjten, skal du trække ledningen ud af trykledningen samtidigt for at sikre, at der ikke er luftbobler inde i trykledningen.
   3. Placer flowkulturkammeret på en af de otte skruetråde på bioreaktorbasen. Placer en silikone O-ring mellem bioreaktorbasen og det hvide Luer-stik for at forhindre mulig lækage, og stram det hvide Luer-stik fra det nederste rum.
   4. Gentag trin 5.2.2 og 5.2.3 for alle cyklisk strakte prøver.
3. Tilslut flowkulturkamrene for alle eksperimentelle grupper, undtagen den statiske styring, til flowpumpesystemet.
   1. Placer en slangeclips på mediumslangen. Fjern den hvide Luer-hætte, der dækker flowindløbet i det øverste rum i flowkulturkammeret. Fjern den kvindelige Luer-kobling af mediumrøret, og tilslut mediumrøret på den ene side med flowindløbet på det øverste rum og den anden side af mediumrøret med strømningsudgang i det nederste rum.
   2. Gentag trin 5.3.1 for alle flowkulturkamre. På dette tidspunkt er bioreaktoren og flowkulturkamrene fyldt med medium og forbundet til flowsystemerne.
   3. For de statiske kontrolprøver anbringes prøverne lodret i en cellekulturkolbe med filterhætte ved hjælp af sakseksakslen. Fyld cellekulturkolben med medium, og læg den i inkubatoren.
4. Overfør den komplette opsætning fra laminar flowskabet til inkubatoren, og tilslut de flydende enheder til lufttryksrøret og det elektriske kabel.
5. Start softwaren, og initialiser flowpumperne. Start mellemflowet for prøverne en efter en.
   1. Kontroller, om ventilerne på den fluidiske enhed klikker.
   2. Fjern slangeklemmen fra mediumslangen.
   3. Start flowpumpen med 100 mbar og 10 s skiftetid.
   4. Kontroller forsigtigt strømningsretningen for mulig lækage eller luftbobler. Eventuelle fastspændte luftbobler kan fjernes ved at vende flowkulturkammeret på hovedet.
      BEMÆRK: Sørg for, at mediumniveauerne i mediumreservoirerne er afbalancerede, for at forhindre sugning af luft ind i systemet og luftbobler i flowkulturkamrene og for ikke at tillade reservoirerne at løbe tør (Figur 2C).
   5. Gentag trin 5.5 for alle fluidiske enheder en efter en.
6. Initialiser belastningspumpen.
   1. Tilslut den pneumatiske aktiverede pumpe via luftindtaget på den pneumatiske cylinder til trykluften. Tilslut den nederste luftudtag med den blå slange for luft ud(Figur 1F).
   2. Åbn LabVIEW-software, kør LabVIEW-scriptet og tryklufttryksapplikationssystemet, som beskrevet af Van Kelle et al.⁶⁸, indtast forskydning og frekvens (start med lav frekvens på 0,2 Hz). Sæt pumpen på pause, når Teflon-bælgen er på sit laveste niveau.
   3. Placer tryksensoren i tryksensorindløbet på det hydrauliske reservoir.
7. Skift pumpeindstillingerne til de ønskede indstillinger (for 1,5 Pa skal du bruge 150 mbar, 10 s skiftetid).
8. Start belastningspumpen, og påfør den foretrukne indstilling (f.eks. 0,5 Hz, 1,05 strækning).

6. Kører Eksperiment i flere dage; Overvågning af shear og stræk under kultur og medium udskiftning

1. Beregn WSS ved stilladsvæggen.
   1. Registrer flowstørrelsen hver anden dag (se flowpumpeproducentens manual for at få flere oplysninger). Kort sagt skal du observere ændringen i flydende niveauer (i mL) i mediumbeholderne mellem koblingen af væskeenhedsbeholderen i 10 s. Udfør mindst fem målinger, beregn middelværdien, og gang med 6 for at få strømningshastigheden Q i mL/min.
   2. Strømmen er beskrevet af en Poiseuille flow gennem en ringformet kanal. Antages kultur medium som en newtonsk væske, beregne WSS på stilladset væggen, r₁, ved Equation 1.
      (1)
      hvor WSS τ_w ved stilladsvæggen (r₁; her r₁ = 1,7 mm), som følge af en jævn strømning, bestemmes af det påførte tryk p og glasrørets inderradius r₂ (her r₂ = 2,3 mm). Trykgradienten i aksial retning antages at være ensartet mellem strømningsindtaget og strømningsåbningen og er angivet ved Ligning 2 (Figur 1J).
      (2)
      med μ den dynamiske viskositet (her blev medium viskositet antaget konstant, μ = 0,7 × 10^-3 Pa∙s ved 37 °C) og Q den anvendte strømningshastighed.
2. Overvåg strækningen på stilladserne hver anden dag.
   1. Placer en mørk baggrund bag flowkulturkammeret for at øge kontrasten mellem stilladset og baggrunden. Placer LED-lyslamperne, der peger mod stilladset, for at hjælpe med at visualisering af stilladset.
   2. Tag time-lapse fotografier af stilladset med en frekvens på 30 Hz for 6 s (dvs. 3 strækcyklusser) med et højhastighedskamera.
      BEMÆRK: En lavere optagelsesfrekvens kan være tilstrækkelig, hvis kameraet tillader det. Den minimalt krævede frekvens blev imidlertid ikke bestemt.
   3. Bestem manuelt stilladsets mindste og maksimale diameter ud fra billederne.
   4. Den mindste og maksimale ydre diameter af elektropunstilladset beregnes for at beregne de maksimale strækninger i henhold til ligning 3.
      (3)
      hvor omkredsstrækningen (λ_θ) er angivet ved forholdet mellem stilladsets ydre diameter, d₁, og dens oprindelige diameter, d₀.
3. Korrekt til medium fordampning, og opdater medium tre gange om ugen.
   1. Stop og afkoble kablerne til flowsystemerne og belastningspumpen.
   2. Placer slangeklemmer på mediumrøret.
   3. Bestem, hvor meget medium der er fordampet baseret på volumenindikatormærkerne på mediumreservoirerne.
   4. Overfør bakken med bioreaktoren og de flydende enheder til laminar flow kabinettet.
   5. Fjern gummiluftfiltrene i mediumbeholderne; tilsæt autoklaveret ultrapure vand for at kompensere for det fordampede volumen af medium. Luk medium reservoirer igen, og oprette forbindelse til pumpen igen for at blande mediet med ultrapure vand.
   6. Gentag trin 6.3.1-6.3.5. Fjern gummiluftfiltrene igen, tag 25 mL dyrkningsmedie ud, og drej ned ved 300 × g i 5 minutter ved RT.
      1. 1,5 mL supernatant opsamles ved -30 °C til analyse af sekretoriske profiler (til analyse med enzymrelateret immunosorbentanalyse (ELISA)).
      2. Den ønskede mængde supernatant indsamles til parakrinesignaleringsundersøgelser ved at anvende supernatanten som konditioneret medium⁴³.
   7. Tilsæt 25 mL frisk medium til de mellemstore reservoirer.
   8. Placer gummiluftfiltre tilbage på de mellemstore reservoirer.
   9. Placer hele opsætningen tilbage i inkubatoren. tilslutte alle kabler og luftrør til pumpen og stammepumpen. Slip slangeklemmerne, og gentag trin 5.4-5.8.
4. Kontroller, om silicatørringsperler i de tørreflasker, der er tilsluttet pumpen, er fugtige (hvidt udseende), og udskift om nødvendigt med tørre silicaperler (orange udseende).

7. Afslutning af eksperiment, prøveindsamling og udstyrsrensning og -opbevaring

1. På eksperimentets sidste dag skal prøverne korrigeres en efter en for medium fordampning som beskrevet i trin 6.3.1-6.3.5.
   1. For at høste prøverne en efter en skal flowpumpen og belastningspumpen sættes på pause flere gange. Placer en slange klip på medium slange. Stop midlertidigt flowpumpen og belastningspumpen. Afbryd et flowkulturkammer fra bioreaktorbasen. erstattes af en hvid Luer-hætte på bioreaktorbasen. Tag flowkulturkammeret og den flydende enhed til laminar-flowskabet. Start flowpumpen og belastningspumpen igen for at påføre den hæmodynamiske belastning på de andre prøver, indtil de høstes.
   2. Opsamlingsmedium fra mediumreservoirerne til parakrinecytokinproduktionsanalyse via ELISA.
2. Afkoble flow enheder og høst rørformede konstruere. afsnit i henhold til den ønskede skæreordning. Dele af konstruktionen kan opbevares ved 4 °C (efter 15 minutters fiksering i 3,7% formaldehyd og 3 x 5 minutters vask i PBS) eller -30 °C (efter snap-frysning i flydende nitrogen) indtil yderligere analyse.
3. Rengør bioreaktor- og pumpekomponenterne. Derudover er den anbefalede rengøringsmetode pr. vare nævnt i materialebordet.
   1. Rengør gummiluftfiltrene med 70% ethanol. Vær meget omhyggelig med ikke at fugte det indre filter!
   2. Saml alle separate komponenter: medium slange, mellemstore reservoirer, glasrør, mandlige Luer stik og kvindelige Luer låse, hvide Luer hætter, trykledninger, næse kegler, silikone O-ringe, adapter bøsning, flow glattejern (undtagen pumper, fluidic enheder, gummi luftfiltre, bioreaktor base), og skyl i rindende vand fra hanen.
   3. O/N anbringes i 0,1% natrium-dodecylsulfat i deioniseret vand.
      BEMÆRK: Brug ikke ultrapure vand, da delene kan ruste.
   4. Skyl med postevand og opvaskesæbe.
   5. Fordyb i deioniseret vand, efterfulgt af 70% ethanol to gange, efterfulgt af deioniseret vand.
   6. Placer alle materialer separat på papirvæv og lad dem tørre. Brug trykluft til at tørre slanger.
   7. Rengør alle materialer, der ikke kan autoslaves, med et papirvæv gennemblødt i 70% ethanol. Dette omfatter gummiluftfilteret (husk, at luftfilteret skal forblive tørt) og bioreaktorbasen (Teflon bellow og pneumatisk cylinder).
   8. Autoklave komponenterne i det fluidiske kammer (herunder silikone O-ring), medium slange, medium reservoirer (uden gummi luftfilter), mandlige Luer stik og kvindelige Luer koblinger, hvide Luer hætter, slange klip, og standardudstyr (f.eks pincet, fastspænding saks)
   9. Til praktisk brug under næste forsøg skal du kombinere de separate komponenter til et komplet fluidisk kammer i en autokrabbar kasse.
4. Fjern vand fra det hydrauliske reservoir. Rengør med 70% ethanol, efterfulgt af deioniseret vand. Lad det tørre. Genopfyld med deioniseret vand og et par dråber vandbadbevarende desinfektionsmiddel.
5. Opbevar glasrørene til flowkulturkammeret i 70% ethanol.
6. De fugtige silicatørringsperler (hvidt udseende) anbringes i ovnen O/N ved 120 °C for at lade dem tørre (orange udseende) og opbevares i en lufttæt kolbe.

Representative Results

Denne bioreaktor blev udviklet til at studere de individuelle og kombinerede virkninger af forskydningsstress og cyklisk stræk på vaskulær vævsvækst og remodeling i 3D biomateriale stilladser. Bioreaktorens design gør det muligt at dyrke op til otte vaskulære konstruktioner under forskellige belastningsforhold (figur 1A). De vaskulære konstruktioner er placeret i et flowkulturkammer (Figur 1B), hvor både omkredsen og WSS kan styres uafhængigt. Det øverste rum i flowkulturkammeret har et flow-glattejern for at stabilisere strømmen i en relativt kort afregningslængde (Figur 1C). Umiddelbart efter flowudretningen fordeler næsekegen strømmen jævnt gennem den ringformede kanal (Figur 1D). Når alle trin i protokollen udføres korrekt, kan de vaskulære stilladser i flowkulturkammeret udsættes for en kontinuerlig envejsstrøm gennem ringkanalen mellem stilladset og glasvæggen og strækkes omkreds af den pneumatiske pumpe (Figur 1E-F). Før stilladset monteres, skal elektrospunrøret skæres i 25 mm rør (Figur 1G) og kan undersøges med SEM for at analysere mikroarkitekturen (Figur 1H-I). Det er vigtigt at bemærke, at PCL-BU grafts i dette eksempel kan erstattes af andre elastomeriske væv manipuleret grafts (naturlig eller syntetisk oprindelse, forskellige mikroarkitektur eller porøsitet). Inside-out designet gør det muligt at teste meget porøse grafts, da det ikke nødvendigvis behøver at være lækagefrit. Det skematiske billede af flowkulturkammeret viser den fysiske fortolkning af de parametre, der bruges i ligningerne til at beskrive WSS (ligning 1), trykgradienten (ligning 2) og omkredsstrækningen (ligning 3) (Figur 1J).

Forkert udførelse af protokollens kritiske trin kan resultere i nogle få scenarier. For eksempel kan lækage fra det hydrauliske reservoir forekomme som følge af forkert monterede knuder, hvilket fører til lækage af hydraulisk væske fra trykledningerne med huller, der passerer silikonerøret og kommer ind i flowkulturkammeret (Figur 2A). Lækage af hydraulikvæsken ved forbindelsen mellem skruetrådene og bioreaktorbasen kan også forekomme, når silikoneringen ikke er godt placeret, eller hvis Teflon-bælgen ikke fik lov til at udvide O/N en dag før forsøget (Figur 2B). Når mediet ikke afgasses, eller hvis mediumniveauerne i mediumreservoirerne ikke er velafbalancerede, og et medium reservoir løber tørt, hvilket resulterer i, at luft suges ind i systemet, kan der opstå luftbobler i flowkulturkammeret (Figur 2C), som forstyrrer WSS-mønstrene, kompromitterer cellegabiliteten og den efterfølgende vævsvækst. Endelig kan der, når silikone-O-ringen i det nederste rum ikke er placeret korrekt, observeres medium spild under flowkulturkammeret (Figur 2D).

Da denne bioreaktoropsætning giver mulighed for anvendelse af individuelle og kombinerede hæmodynamiske belastninger, kan flere hæmodynamisk belastede eksperimentelle grupper indgå i et eksperiment (Figur 3A). Tidligere blev forskellige hæmodynamiske belastninger (dvs. to forskydningsstressregimer og to strækregimer) valideret ved at anvende forskellige mulige systemindstillinger (Figur 3B). Da strækningen (figur 3C) og WSS (figur 3D) blev overvåget over langsigtede kulturperioder, blev det valideret, at disse kan opretholdes på relativt konstante niveauer over en periode på op til 20 dage.

Bioreaktoren er særligt velegnet til at studere hæmodynamisk belastnings indflydelse på vækst og ombygning i en in situ vaskulær TE-sammenhæng. Stadierne i in situ TE er hypotese at spejle stadier af den naturlige sårheling svar (Figur 4A). De co-kulturer monocyt-afledte makrofager og myofibroblasts stammer fra menneskelige saphenous vener, som beskrevet her, blev etableret som en in vitro efterligne den proliferative fase. Tre dage efter såningen viste immunfluorescensfarvningen en homogen fordeling af begge celletyper i hele stilladset (figur 4B). Efter 20 dages co-kultur, cyklisk stretch alene resulterede i aflejring af mere talrige og tykkere kollagen type I fibre, mens der i gruppen med kombineret hæmodynamiske belastninger, denne effekt af cyklisk stretch blev underkendt af shear stress, hvilket resulterer i mindre udtalt kollagen type jeg deposition, illustreret her ved immunfluorescens farvning (Figur 4C). For at opnå en vellykket regenerering af in situ-væv kræves der en tæt balance mellem vævsproduktion og stilladsreorption. Ud over vævsdannelse giver bioreaktoren mulighed for induktion af celledrevet stilladsreorption. For eksempel, når man dyrker en monokultur af makrofager i 8 dage på elektrospuntransplantationerne, blev fibererosion og fiberspaltning observeret i alle hæmodynamiske belastningsregimer med den mest udtalte resorption i den statiske gruppe og mindst udtalt resorption i forskydningsstressgruppen (Figur 4D). Tilsammen viser disse resultater virkningen af de forskellige hæmodynamiske belastningsordninger på både vækst og ombygning. Disse indsigter er nyttige til at optimere designparametrene for nyudviklede in situ TEVGs.

En anden vigtig determinant for vævsregenereringsprocessen er tilstedeværelsen af pro- og antiinflammatoriske cytokiner. Da bioreaktoren er et lukket kredsløbssystem, vil cellerne i systemet løbende blive udsat for parakrinestimuli af udskillede faktorer. Cytokin sekretion profiler i midten af dynamisk lastet co-kulturer af humane perifere blod mononukleare celle (PBMC) afledt makrofager og menneskelige myofibroblasts fra saphenous vener blev analyseret i de tidlige og senere stadier (Figur 5A). Disse repræsentative resultater illustrerer virkningen af både cyklisk stræk og forskydningsstress på cytokinse sekretionsprofilen i co-culture-opsætningen. Interessant nok viste de kombinerede virkninger af begge belastninger enten dominans af en af de to belastninger (f.eks. cyklisk strækning for interleukin-6 (IL-6) og monocyt kemoattraktivt protein-1 (MCP-1)) eller synergistiske virkninger af begge belastninger (f.eks. for IL-10) (Figur 5B). Denne indsigt, der er indsamlet ved hjælp af denne in vitro-testplatform, giver værdifulde oplysninger til udvikling af in situ-TEVG'er, der er baseret på rationalet bag makrofaget in situ-vævsgendannelse.

Co-kultur eksperimenter af makrofager og myofibroblast viste, at det mekaniske miljø og den deraf følgende belastning-afhængige inflammatoriske miljøer moduleret fænotype af myofibroblasts. Efter 20 dages hæmodynamisk belastning viste genekspressionen af myofibroblastmarkører klare forskelle i den individuelle og kombinerede virkning af belastningen og i direkte og parakrine signalering af makrofager på myofibroblaster (Figur 6A). Endvidere er genekspressionsmønstrene for kontraktil markør alpha smooth muscle actin korreleret med proteinsyntese (Figur 6B). Desuden stimulerede cyklisk stræk kollagen og elastisk matrixgenudtryk og svækket matrix metalloproteinase 1/vævshæmmermatrix metalloproteinase 1-medieret kollagenombygning, mens der blev observeret en stabiliserende effekt af forskydningsstress i co-kulturen (Figur 6C). Disse langsigtede co-kultur eksperimenter viser muligheden for at studere den senere fase væv remodeling fase (Figur 4A) i forskellige hæmodynamiske belastning regimer i væv manipuleret vaskulære grafts med denne bioreaktor. Da TEVG er monteret "vrangen ud" på et silikonerør, kan den cirkulære strækning og WSS anvendes i længere kulturperioder.

Figur 1: Design og oversigt over bioreaktoren. (A) Konstruktionstegning af bioreaktorbasen og (B) eksploderet udsyn til væskekulturkammeret med alle angivne dele (trin 2.4-2.8). Det øverste rum i flowkulturkammeret har et flow-glattejern. (C) Den sfærisk afstumpede næsekegler er placeret efter flowudretningen for at fordele strømmen gennem ringkanalen (strømningsretning angivet med pink). (D) Tilsammen styrer og styrer disse komponenter strømningsretningen. Se tabel 1 for en funktionel beskrivelse af de individuelt nævnte dele. (E) Fotografi af komplet bioreaktoropsætning (trin 5.2) og (F) et nærbillede af flowkulturkamrene og pneumatiske cylinder (trin 5.6.1). (G)Elektrospun PCL-BU stilladsets bruttoudseende før såning (lineal flåter 1 mm). Scanning af elektronmikroskopiske billeder af rørformede elektrospun PCL-BU stilladser med 3 mm indvendig diameter og 5 μm gennemsnitlig fiberdiameter ved forskellige forstørrelser, skalastænger (H) 100 μm og (I) 10 μm (trin 1.3). (J) Skematisk billede af kulturkammeret bestående af et rørformet elektrospunstillads medydreradius ( r₁) centreret i et glasrør med indre radius (r₂). Flow(Q)indløb og udløb er forbundet til ringformede ring, med kanalhøjde h for anvendelse væg forskydning stress (t). Tryk/stræk (P) indløbet er forbundet med det silikonemonterede stillads til påføring af en omkredsstrækning (λ(t))på de monterede elektrospunstilladser indefra (trin 6.1). Forkortelser: polycaprolactone bisurea (PCL-BU). Panel C, D og G-J er tilpasset fra Van Haaften et al.¹⁹. Klik her for at se en større version af dette tal.

Bioreaktordele	Beskrivelse af funktioner
Stræk program
Pneumatisk cylinder	Aktiverer Teflon bælg.
Teflon bælge	Indlæser det hydrauliske reservoir.
Hydraulisk reservoir	Kan forbindes med op til 8 flow kulturkamre, er fyldt med demi vand, lægger pres på silikone monteret konstruktioner.
Skruetråd	Forbindelse mellem flowkulturkammeret og det hydrauliske reservoir. Trykindløbet for de silikonemonterede konstruktioner.
Hvid luer-stik	Bruges til at skrue flowkulturkammeret tæt på en af de otte skruetråde på det hydrauliske reservoir/ bioreaktorbasen.
Trykledning med små huller	Direkte forbundet med vand i hydraulisk reservoir. Når det hydrauliske reservoir er under tryk, fylder trykledningerne rummet mellem silikonerøret (der er monteret på trykledningen) med vand og skubber silikonerøret udad, hvilket resulterer i en omkredsstrækning på silikonemonteret graft indefra.
Silikonerør	At montere elektrospun graft på trykledningen. Silikonerøret er omkredset strakt indefra.
Flow-program
Flow pumpesystem	Bruges til at styre strømmen i flowkulturkamrene. (i vores eksempel: der anvendes et ibidi pumpesystem.)
Top- og bundrum med flowindløb og udløb	Forbinder flowkulturkammeret i flowsløjfen.
Glasrør	Indeholder stilladset under tryk i midten og tillader perfusion af stilladserne.
Flowudretning	Stabiliserer strømmen i en relativt kort afregningslængde.
Næse kegle	Fordeler flowet jævnt.
Kortbøsning	Fikserer glasrøret.
Silikone O-ring	Forhindrer lækage af medium.

Tabel 1: Funktionel beskrivelse af bioreaktorens hovedtræk svarer til de angivne dele i figur 1A-D.

Figur 2: Resultater af unøjagtig udførelse af de kritiske trin i protokollen. Fotografier af nogle hændelser, der kan observeres i bioreaktoropsætningen, når kritiske trin ikke udføres på den rigtige måde. (a)Hvis knuden ikke er stram nok eller ikke ligefrem er placeret i den indgraverede rille (angivet med pil), kan der forekomme en let udsivning af hydraulikvæske i flowkulturkammeret (trin 2.5). (B) Hvis Teflon-bælgen ikke fik lov til at udvide O/N en dag før forsøget, eller når silikoneringen ikke er godt placeret, kan der forekomme hydraulisk væskelækage fra hydraulikvæsken ved forbindelsen mellem skruetrådene og bioreaktorbasen (angivet med pil) (trin 1.4 og 5.2.3). (C) Luftbobler i flowkulturkammeret (angivet med pil) vil resultere i forstyrrede forskydningsbelastningsmønstre. Afgas altid kulturmediet, og sørg for, at mediumniveauerne i de mellemstore reservoirer er afbalancerede for at forhindre, at et reservoir løber tørt, og at luften suges ind i flowkammersystemet (trin 1.2 og 5.5.4). (D) Når silikoneringen i det nederste rum ikke er placeret korrekt, kan mediets udslip observeres (angivet med pil) (trin 2.4.2). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Kontrol af forskydningsstress og stræk. Da bioreaktoren giver mulighed for uafhængig og kombineret anvendelse af stræk og forskydning, (A) kan flere eksperimentelle grupper indgå i et eksperiment. (B) Eksempler på variationer i maksimale strækninger og forskydningsspændinger på et bestemt tidspunkt, der er testet under fire forskellige systemindstillinger (angivet med farverne). Sorte rektangler repræsenterer middelværdi ± standardafvigelse for målingerne for hver indstilling. De syrrede linjer beregnes som gennemsnittet af strækningerne(vandret linje),og forskydningsbelastningen (lodret linje) for at angive de fire forskellige belastningsforhold. (C) Cykliske omkredse i den cykliske strækning og kombinerede grupper i løbet af forsøget på 20 dage baseret på målinger af stilladsets ydre diameter, der overvåges med et tidsforskydning af højhastighedskameraet (trin 6.2). (D) Overvåget vægforskydningsspænding i forskydningsspændingen og kombinerede grupper i løbet af forsøget baseret på de skiftende mellemniveauer i sprøjten (trin 6.1). Panel A, C og D er blevet tilpasset fra Van Haaften og Wissing et al.^44; panel B er tilpasset fra Van Haaften et al.¹⁹. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Begrebet in situ vaskulær vævsteknik, cellefordeling, vævsproduktion og stilladsforringelse. (a)En skematisk illustration, der viser de hypotesefaser af stilladsdrevet vævsregenerering på værtens funktionelle sted. De viste resultater er afledt af eksperimenter, der fokuserede på den proliferative fase, hvor makrofager og vævsproducerende celler har koloniseret stilladsmaterialet. (B) Myofibroblaster fra human saphenous vene (rød) og PBMC-afledt makrofag (grøn) fordeling på ydersiden af elektrospun stilladset (grå) på dag 3. Skalalinje 200 μm. (C) Tværsnit af cokulturkonstruktionen på dag 20 farves for kollagentype I (grøn), kollagentype III (rød) og DAPI (hvid). Skalalinje 100 μm, *angiver ydersiden af konstruktionen, svarende til flowsiden. d) SEM-billeder af decellulariserede grafts af 8 dages makrofagmonokultur, der viser nedbrydning af makrofaget skalabjælke 20 μm. Forkortelser: humane saphenous venøse celler (HVSC); perifer blodmononnuklear celle (PBMC); 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI); scanning af elektronmikroskopi (SEM). Panel A er blevet tilpasset fra Wissing og Bonito et al.^27; panel B og C er blevet tilpasset fra Van Haaften og Wissing et al.^44; og panel D blev tilpasset fra Wissing et al.⁴³. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Inflammatorisk miljø i hæmodynamisk belastet co-kultur konstruktioner på 3 dage og 20 dage. Co-kultur af menneskelige PBMC-afledte makrofager og menneskelige myofibroblasts fra saphenous vener. (A) Varmekort over den samlede cytokinse sekretion målt i supernatant via multiplex ELISA. (B) Boxplots for et udvalg af cytokiner på dag 20, normaliseret til det samlede DNA-indhold. P-værdier blev beregnet ved hjælp af Kruskal-Wallis test med en Dunns multiple sammenligningstest; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** Forkortelser: vævshæmmer af metalloproteinase (TIMP), matrixmetalloproteinase (MMP), interleukin (IL), monocyt kemoattratprotein 1 (MCP-1), transformering af vækstfaktor beta 1 (TGF-β1), bindevævsvækstfaktor (CTGF), tumornekrosefaktor alpha (TNF-α), blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF), statisk (ST), cyklisk strækning (CS), forskydningsstress (SS). Panel A og B blev tilpasset fra Van Haaften og Wissing et al.^44. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: Ændringer i myofibroblast fænotype og markører for matrixvækst og remodeling som reaktion på hæmodynamisk belastning i vaskulære konstruktioner på dag 20. (A) Relativ genekspression af myofibroblast-specifikke fænotypiske markører. (B) Tværsnit, der er farvede for αSMA (grøn) og DAPI (blå), skalabjælke 100 μm. (C) Relativt udtryk for gener relateret til kollagenmatrix, elastisk matrix, proteoglycaner og remodellering af gener. P-værdier blev beregnet ved hjælp af Kruskal-Wallis test med en Dunns multiple sammenligningstest; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Forkortelser: S100 calciumbindingsprotein A4 (S100A4), alfa-glat muskelaktil (αSMA eller ACTA2), calponin 1 (CNN1), smoothelin (SMTN), vimentin (VIM), kollagen I (COL1A1), elastin (ELN), versikan (VCAN), matrix metalloproteinase (MMP), vævshæmmer af metalloproteinase (TIMP), statisk (ST), cyklisk strækning (CS), forskydningsstress (SS), 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI). # målt ved eller under detektionsgrænsen. Panel A, B og C blev tilpasset fra Van Haaften og Wissing et al.⁴⁴. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur S1: Proteinudtryk myofibroblast- og makrofagmonokulturer udsat for individuelle og kombinerede hæmodynamiske belastninger. (A) Repræsentative konfokale billeder af myofibroblaster, dyrket i 10 dage med actinfibre (grøn), kerner (rød) og stillads (blå), viser en klar actin fiber orientering i de indlæste prøver, sammenlignet med de statiske prøver, hvor der ikke kan observeres nogen præference actin fiber retning. Skala bar 50 μm. (B) Konfokale billeder af samme myofibroblast monokultur farves til kollagen (grøn) og nuclei / stillads (hvid). Skalastang 50 μm. (C) Boxplots af protein sekretion profiler af statisk og dynamisk dyrket THP1-afledte makrofager i 8 dage, med beregnet M1/M2 nøgletal baseret på cytokin sekretion niveauer af IL-6, TNF-α, MCP-1 (pro-inflammatorisk) og IL-10, IL-13, MMP-9 (anti-inflammatorisk). Prikken i MCP-1 grafen repræsenterer en statistisk outlier. (D) ELISA-data om de relative proteinserorptionsniveauer for statisk og dynamisk dyrkede makrofager på dag 8 sammenlignet med den gennemsnitlige udskillelse af proinflammatoriske, antiinflammatoriske, vækst- og remodelingproteiner (proteinniveauer blev korrigeret for det gennemsnitlige DNA-indhold pr. gruppe). Prikkerne og de skraverede områder angiver henholdsvis 50. Forkortelser: monocyt chemoattractant protein 1 (MCP-1), interleukin (IL), transformering af vækstfaktor beta (TGF-β), matrix metalloproteinase (MMP), blodplade-afledt vækst faktor (PDGF), vækstfaktor for bindevæv (CTGF), tumornekrosefaktor alpha (TNF-α), enzymrelateret immunosorbentanalyse (ELISA).* p < 0,05; ** p < 0,01, *** p < 0,001. Panel A og B er tilpasset fra Van Haaften et al.¹⁹. Panel C og D blev tilpasset fra Wissing et al.⁴³. Klik her for at downloade dette tal.

Discussion

Den bioreaktor, der er beskrevet heri, giver mulighed for systematisk evaluering af bidragene fra de individuelle og kombinerede virkninger af forskydningsstress og cyklisk strækning på inflammation og vævsgendannelse i rørformede resorbable stilladser. Denne fremgangsmåde gør det også muligt at foretage en lang række analyser af vaskulære konstruktioner, som eksemplificeret i afsnittet om repræsentative resultater. Disse resultater viser den karakteristiske virkning af de forskellige hæmodynamiske belastningsordninger (dvs. forskellige kombinationer af forskydning og stræk) på både vækst og ombygning af TEVG-konstruktionen. Denne indsigt, der indsamles via denne in vitro-platform, hjælper med optimering af stilladsdesignparametre for nyuu TEVGs. For at sikre en korrekt eksperimentel arbejdsproces er det vigtigt at forstå de kritiske trin og begrænsningerne i denne protokol.

De mest kritiske trin i protokollen er relateret til anvendelsen af stræk til prøverne. For strækapplikation er det vigtigt, at opsætningen er lækagefri. Der er to svage punkter i systemet: knuderne, der monterer elektrospuntransplantationerne på trykledningerne og forbindelsen mellem bioreaktorbasen og flowkulturkamrene. Som beskrevet i trin 2.5.2 og 2.5.4 skal flere, stramme knuder placeres nøjagtigt ved den indgraverede rille. Hvis knuden ikke er stram nok eller er placeret lidt over eller under rillen, kan der forekomme en lille lækage af hydraulisk væske i flowkulturkammeret. Denne lækage kan påvises som et trykfald i det hydrauliske reservoir og en støt stigende spænding på stammepumpen for at nå den indstillede trykværdi. Desuden fører dette til en forstyrret strøm i flowkulturkammeret, en øget risiko for forurening af cellekulturen og en fortynding af mediet. Når dette sker, skal flowkulturkammeret tages ud af eksperimentet, og skruetråden på det hydrauliske reservoir skal lukkes med en hvid Luer-hætte. Dette vigtige mål for at udtage en komplet prøve, som er nødvendig for at sikre en korrekt fortsættelse af eksperimentet for de andre syv flowkulturkamre, understreger vigtigheden af nøjagtigt at placere stramme knuder, nøjagtigt i de indgraverede riller. Først da kan der sikres korrekt adskillelse mellem vandet i det hydrauliske reservoir og mediet i flowkulturkamrene. For at forbedre robustheden af stilladsernes montering vil rillerne i trykledningerne blive lavet lidt dybere i en revideret version af bioreaktoren, hvilket giver mulighed for lettere og bedre knudeplacering og dermed sikker adskillelse af hydraulikvæsken fra mediet.

En anden potentiel kilde til lækage er mellem skruetrådene i bioreaktorbasen og de hvide Luer-stik i flowkulturkammeret. På grund af mulig slitage af Teflon-materialet kan der tilsættes en ekstra silikone O-ring for at forhindre lækage (trin 5.2.3). Desuden bør belastningspumpens Teflon-bælge have mulighed for at udvide O/N en smule en dag før forsøget (trin 1.4). Hvis der opstår lækage, skal den tabte hydraulikvæske kompenseres ved at tilsætte en lille mængde ultrapure vand via en af de otte skruetråde (brug en sprøjte med nål og fleksibel ledning). Placer flowkulturkammeret tilbage med et lille stykke parafilm mellem skruetråden og det hvide Luer-stik på det nederste rum i flowkulturkammeret. For at løse dette lækageproblem i fremtidige eksperimenter vil de nuværende Teflon-skruetråde på bioreaktorbasen blive erstattet af tråde i rustfrit stål i næste generations version af bioreaktoren for at forhindre slid på systemet.

Variationen i stræk (Figur 3C) er større end variationen i WSS (Figur 3D), da stræk er vanskeligere at kontrollere. Ud over foranstaltningerne til forebyggelse af lækage er der dog andre foranstaltninger, der begrænser variationen i stræk: (i) undgåelse af luftbobler i fløjten (trin 1.4 og 5.2.1), ii) sikring af en ensartet forstrækning mellem de forskellige prøver (trin 2.5.3) og iii) sikring af ensartede stilladsegenskaber blandt forskellige prøver (trin 1.3).

Endelig er der behov for ekstra forsigtighed, når elektrospunstilladset monteres på silikonerøret (trin 2.3). Specifikt, når det skrøbelige elektrospun stillads skal trækkes over den strakte silikonerør, er det vigtigt ikke at anvende for meget kraft for at forhindre elektrospuntransplantationen i at blive beskadiget, især på indersiden af elektrospuntransplantationen. Hvis der opstår skader på indersiden af elektrospuntransplantationen, enten fra kraftig træk eller fra for svag strækning af silikonerøret, bliver omfanget af skaden på elektrospunfibrene først synligt, når konstruktionen er høstet og analyseret. I den nuværende opsætning kan såningens succes kun bekræftes ved immunfluorescens eller immunohistokemisk analyse efter at have ofret prøven. Såningsproceduren med fibrin som cellebærer er imidlertid en veletableret metode^67, der typisk fører til en homogen cellefordeling for stilladser med en tilstrækkelig stor porestørrelse. Et af de vigtigste aspekter med hensyn til cellesåning er at sikre, at stilladset er så tørt som muligt før såning (trin 4.4)for at forhindre fibringelen med cellerne i at passere gennem det våde stillads, hvilket resulterer i inhomogene såning. Endelig, selv om dekontamineringsmetoden for elektrospuntransplantationen ved UV-stråling og dypning i 30% ethanol ikke er så streng som sterilisering af elektrospuntransplantationer, der er forberedt til in vivo-undersøgelser, som ofte steriliseres af ethylenoxid eller gammabestråling, er det tilstrækkeligt til in vitro-kulturforsøg, der kan vare op til 20 dage uden tegn på kontaminering (se f.eks. figur 3, figur 4, figur 5, figur 6og Van Haaften og Wissing (2020)⁴⁴). Desuden giver det PCL-BU-materiale, der anvendes her, ikke mulighed for lang eksponering for høje ethanolkoncentrationer. Den mest egnede steriliseringsmetode kan vælges afhængigt af det anvendte materiale.

Ud over resultaterne af tidligere udførte co-kultur undersøgelser, en bredere vifte af undersøgelser kan udføres med det samme system. Systemet har tidligere været anvendt til at udføre dynamiske monokulturer af myofibroblaster (supplerende figur 1A-B) og makrofager (supplerende figur 1C-D) til at undersøge virkningerne af hæmodynamisk belastning på individuelle celletyper og deres parakrine signalering^19,43. Forskellige hæmodynamiske belastningsordninger resulterede i klar actinfiberorientering i myofibroblaster (supplerende figur 1A) og klart forskellige kollagenaflejring(supplerende figur 1B) efter 10 dage. Cytokinproduktionen ved THP1-afledte makrofager var drastisk forskellig mellem de forskellige hæmodynamiske belastninger (Supplerende figur 1C) og viste en mere proinflammatorisk profil, når den blev indlæst (Supplerende figur 1D). Andre validerede muligheder omfatter anvendelse af oscillatorisk flow ved hjælp af en ekstra pumpe og fluidic enhed. Viskositeten af mediet kan øges i retning af området af blodviskositet (f.eks. ved at tilsætte xanthangummi)⁶⁹. Modulering af medium viskositet repræsenterer en ekstra variabel for at udvide rækkevidden af gældende forskydningsbelastninger. Endelig kan opsætninger fra andre producenter også anvendes, selv om den beskrevne protokol anvender opsætningen af "Ibidi"-flowkonditioneringsanlæg, så længe lignende flowregimer kan anvendes.

En af de største fordele ved at bruge dette bioreaktorsystem er den relativt store konstruktion (ca. 15 mm x 10,5 mm), der kan hæmodynamisk indlæses, hvilket gør det muligt at udtrække en lang række mulige udlæsningsparametre fra en enkelt prøve. Samtidig kan konstruktionsstørrelsen også ses som en begrænsning, da denne opsætning kræver en relativt stor mængde (undertiden dyrt) materiale, især hvis der anvendes primære celler, eller hvis kulturmediet kræver dyre tilsætningsstoffer. Desuden er gennemløbet af opsætningen relativt lavt. Derfor er det nuværende setup særligt velegnet til hypotesedrevet forskning, hvor et begrænset antal variabler testes grundigt, snarere end screening af et stort antal variabler med begrænset udlæsning. Til fremtidige eksperimenter foretages der små forbedringer af den aktuelle opsætning for at gøre det muligt at montere mindre stilladser og nedskalere størrelsen af de mellemstore reservoirer. Med hensyn til sidstnævnte kræves det nuværende volumen af de mellemstore reservoirer for at muliggøre tilstrækkelige volumetriske strømningshastigheder til at opnå de ønskede forskydningsspændinger. De krævede strømningshastigheder — og dermed mængden af de mellemstore reservoirer — kan reduceres ved at øge mediets viskositet (f.eks. ved at tilsætte xanthangummi som tidligere fastsat⁶⁹).

Afslutningsvis vil jeg sige, at denne bioreaktor giver mulighed for kvantificering af de individuelle og kombinerede virkninger af forskydningsstress og cyklisk stræk på vævsvækst og remodellering på en lang række elastomeriske 3D biomateriale stilladser. Bioreaktoren kan kultur op til otte vaskulære konstruktioner under forskellige belastningsforhold. På grund af dens design er bioreaktoren specielt velegnet til at studere samspillet mellem hæmodynamik og in situ vaskulære TE-processer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
advanced Dulbecco’s modified EagleMedium (aDMEM)	Gibco	12491-015	cell culture medium for fibroblasts
Aqua Stabil	Julabo	8940012	prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir
Bovine fibrinogen	Sigma	F8630	to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Bovine thrombin	Sigma	T4648	to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Centrifuge	Eppendorf	5804	to spin down cells and conditioned medium
Clamp scissor - "kelly forceps"	Almedic	P-422	clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)
CO2 cell culture incubators	Sanyo	MCO-170AIC-PE	for cell culturing
Compressed air reservoir	Festo	CRVZS-5	smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up
Custom Matlab script to calculate the maximum stretches	Matlab	R2017. The Mathworks, Natick, MA	calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold
Data acquisition board	National Instruments	BNC-2090	data processing in between amplifier system and computer
Ethanol	VWR	VWRK4096-9005	to keep sterile working conditions
Fetal bovine calf serum (FBS)	Greiner	758087	cell culture medium supplement; serum-supplement
Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)
Glass Pasteur pipet	Assistant	HE40567002	apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)
Glass tubes of the flow culture chamber	Custon made, Equipment & Prototype Center, Eindhoven University of Technology	n.a.	part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)
GlutaMax	Gibco	35050061	cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up
High speed camera	MotionScope	M-5	to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
High speed camera lens - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - lens	Nikon	JAA616AB	to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
Hose clip	ibidi GmbH	10821	block medium flow (autoclave at step 1, step 7)
Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)
Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads	ibidi GmbH	10902	set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.
Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped)	Swann Morton	0301; 0933	to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material
LabVIEW Software	National Instruments	version 2018	to control the stretch applied to the scaffolds
Laminar flow biosafety cabinet with UV light	Labconco	302310001	to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving
Large and small petri dishes	Greiner	664-160	for sterile working conditions
L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C)	Sigma	A8960	cell culture medium supplement, important for collagen production
LED light cold source KL2500	Zeiss	Schott AG	to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch
Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps	ibidi GmbH	various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories)	to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)
Measuring amplifier (PICAS)	PEEKEL instruments B.V.	n.a.	to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView
Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders	ibidi GmbH	10974	medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)
Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter	Rubber BV	1805	to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing
Motion Studio Software	Idtvision	2.15.00	to make the high speed time lapse images for stretch monitoring
Needle (19G)	BD Microlance	301700	together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles
Needle driver	Adson	2429218	to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)
Paper tissues	Kleenex	38044001	for cleaning of the equipment with 70% ethanol
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	quick fix if leakage occurs
Penicillin/streptomycin (P/S)	Lonza	DE17-602E	cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P4417-100TAB	for storage and washing steps (autoclave at step 1)
Plastic containers (60 mL) with red screw caps	Greiner	206202	to prepare the fibrinogen solution
Pneumatic cylinder	Festo	AEVC-20-10-I-P	to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 µm wall thickness, 20 mm length)	SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands	n.a.	produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details
Pressure conduit without holes (for static control)	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)
Pressure sensor and transducer	BD	TC-XX and P 10 EZ	the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure
Proportional air pressure control valve and pressure sensor	Festo	MPPES-3-1/8-2-010, 159596	provides compressed air to the pneumatic actuated pump
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)	Gibco	A1049101	cell culture medium for monocyte/macrophage
Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL)	Eppendorf	30120086	multiple applications (autoclave at step 1)
Sodium dodecyl sulfate solution 20%	Sigma	5030	Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.
Silicone O-rings	Technirub	1250S	to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)
Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness)	Rubber BV	1805	to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)
Sterile tube (15 mL)	Falcon	352095	multiple applications
Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle	Ethicon, Johnson&Johnson	EH7404H	Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)
Syringe (24 mL)	B. Braun Melsungen AG	2057932	to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber
Syringe filter (0.2 µm)	Satorius	17597-K	to filter the fibrinogen solution
T150 cell culture flask with filter cap	Nunc	178983	to degas culture medium
T75 Cell culture flask with filter cap	Nunc	156499	to culture static control samples
Teflon bellow	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Tray (stainless steel)	PolarWare	15-248	for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)
Tweezers	Wironit	4910	sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)
Ultrapure water	Stakpure	Omniapure UV 18200002	to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)
UV light	Philips	TUV 30W/G30 T8	for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding