Ein Multi-Cue-Bioreaktor zur Bewertung der entzündlichen und regenerativen Kapazität von Biomaterialien unter Strömung und Dehnung

Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine dynamische Kokultur von menschlichen Makrophagen und Myofibroblasten in röhrenförmigen elektrogesponnenen Gerüsten durchzuführen, um die materialgetriebene Geweberegeneration mit einem Bioreaktor zu untersuchen, der die Entkopplung von Scherspannung und zyklischer Dehnung ermöglicht.

Abstract

Die Verwendung resorbierbarer Biomaterialien zur Induktion der Regeneration direkt im Körper ist aus translationaler Sicht eine attraktive Strategie. Solche Materialien induzieren bei der Implantation eine Entzündungsreaktion, die der Treiber für die anschließende Resorption des Materials und die Regeneration von neuem Gewebe ist. Diese Strategie, auch bekannt als In-situ-Gewebe-Engineering, wird verfolgt, um kardiovaskulären Ersatz wie Gewebe-Engineering-Gefäßtransplantate zu erhalten. Sowohl der entzündungsbedingte als auch der regenerative Prozess wird durch die lokalen biomechanischen Hinweise auf dem Gerüst (d.h. Dehnungs- und Scherstress) bestimmt. Hier beschreiben wir detailliert den Einsatz eines speziell entwickelten Bioreaktors, der auf einzigartige Weise die Entkopplung von Dehnungs- und Scherspannung an einem Rohrgerüst ermöglicht. Dies ermöglicht die systematische und standardisierte Bewertung der Entzündungs- und Regenerationsfähigkeit von Rohrgerüsten unter dem Einfluss gut kontrollierter mechanischer Belastungen, die wir anhand eines dynamischen Kokulturexperiments mit menschlichen Makrophagen und Myofibroblasten demonstrieren. Die wichtigsten praktischen Schritte in diesem Ansatz – der Bau und die Einrichtung des Bioreaktors, die Vorbereitung der Gerüste und die Zellaussaat, die Anwendung und Aufrechterhaltung des Stretch- und Scherflusses sowie die Probenernte für die Analyse – werden ausführlich diskutiert.

Introduction

Kardiovaskuläres Tissue Engineering (TE) wird als alternative Behandlungsoption zu den derzeit verwendeten permanenten Herz-Kreislauf-Prothesen (z.B. Gefäßtransplantate, Herzklappenersatz) verfolgt, die für große Kohorten von Patienten suboptimal sind^1,2,3,4. Zu den gefragten Anwendungen gehören Gewebe-Engineering-Gefäßtransplantate (TEVGs)^5,6 und Herzklappen (TEHVs)^7,8. Meistens verwenden kardiovaskuläre TE-Methoden resorbierbare Biomaterialien (entweder natürliche oder synthetische), die als lehrreiches Gerüst für das neu zu bildende Gewebe dienen. Die Bildung von neuem Gewebe kann entweder vollständig in vitro erfolgen, indem das Gerüst mit Zellen ausgesät und vor der Implantation in einem Bioreaktor (in vitro TE)^9,10,11oder direkt in situ, in dem das synthetische Gerüst ohne Vorkultivierung implantiert wird, um die Bildung von neuem Gewebe direkt im Körper (in situ TE) 12 ,^13,14zu induzieren . Sowohl bei in vitro als auch bei in situ kardiovaskulären TE-Ansätzen hängt eine erfolgreiche funktionelle Regeneration sowohl von der Immunantwort des Wirts auf das implantierte Konstrukt als auch von der entsprechenden biomechanischen Belastung ab.

Die Bedeutung der biomechanischen Belastung für kardiovaskuläre TE ist anerkannt¹⁵. Bei kardiovaskulären Implantaten sind die Zellen, die das Gerüst bevölkern, zyklischen Dehnungs- und Scherspannungen ausgesetzt, die durch die hämodynamische Umgebung entstehen. Zahlreiche Studien haben die stimulierende Wirkung von (zyklischer) Dehnung auf die Bildung von Matrixkomponenten wie Kollagen^{16 , 17,18,19,}Glykosaminoglykanen (GAGs)²⁰und Elastin^21,22, durch verschiedene Zelltypen berichtet. Zum Beispiel zeigten Huang et al., dass biaxiale Dehnung die Ablagerung und Organisation von Kollagen und Elastin in in vitro TEVGs erhöhte, indem sie einen vaskulären Bioreaktor²³verwendeten. Während der Schwerpunkt typischerweise auf der Dehnung als dominanter Last liegt, verwenden diese Studien oft strömungsgetriebene Bioreaktoren, bei denen die Probe auch dem Scherfluss ausgesetzt ist. Obwohl relativ wenig über den isolierten Einfluss von Scherspannungen auf Gewebebildung und Entzündungen in 3D bekannt ist, liegen einige Daten vor. Zum Beispiel zeigten Hinderer et al. und Eoh et al., dass der Scherfluss neben einer 3D-Gerüstmikrostruktur für die Bildung von reifem Elastin durch menschliche vaskuläre glatte Muskelzellen in einem In-vitro-Modellsystem wichtig ist^24,25. Insgesamt veranschaulichen diese Ergebnisse die Relevanz von zyklischer Dehnung und Scherstress für kardiovaskuläre TE.

Eine weitere wichtige Determinante für den Erfolg oder Misserfolg von TE-Implantaten ist die Immunantwort des Wirts auf das implantierte Transplantat²⁶. Dies ist besonders wichtig für materialgetriebene In-situ-TE-Strategien, die tatsächlich auf die akute Entzündungsreaktion auf das Gerüst angewiesen sind, um die nachfolgenden Prozesse des zellulären Zustroms und der endogenen Gewebebildung und -umgestaltung anzukurbeln²⁷. Der Makrophagen ist ein kritischer Initiator der funktionellen Geweberegeneration, was durch mehrere Studien^28,29,30gezeigt wurde. Analog zur Wundheilung wird die Regeneration des Gewebes durch parakrine Signalisierung zwischen Makrophagen und gewebeproduzierenden Zellen wie Fibroblasten und Myofibroblasten^{gesteuert 31,32,33}. Neben der Koordination neuer Gewebeablagerungen sind Makrophagen an der aktiven Resorption von Fremdgerüstmaterial beteiligt^34,35. Als solches wurde die In-vitro-Makrophagenreaktion auf ein Biomaterial als prädiktiver Parameter für den In-vivo-Erfolg von Implantaten^{identifiziert 36,37,38}.

Die Makrophagenreaktion auf ein implantiertes Gerüst hängt von Gerüstdesignmerkmalen wie Materialzusammensetzung und Mikrostruktur^{ab 35,39,40}. Neben den Gerüsteigenschaften wird auch die Makrophagenreaktion auf ein Gerüst und deren Übersprechen mit Myofibroblasten durch hämodynamische Belastungen beeinflusst. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass zyklische Dehnung ein wichtiger Modulator des Makrophagenphänotyps^41,42,43,44 und der Sekretion von Zytokinen^43,44,45,46 in 3D-Elektrosponngerüsten ist. Battiston et al. zeigten unter Verwendung eines Co-Kultursystems aus Makrophagen und vaskulären glatten Muskelzellen, dass das Vorhandensein von Makrophagen zu erhöhten Elastin- und GAGsspiegeln führte und dass moderate Konzentrationen von zyklischer Dehnung (1,07-1,10) die Ablagerung von Kollagen I und Elastin^{stimulierten 47}. In früheren Arbeiten haben wir gezeigt, dass Scherstress eine wichtige Determinante für die Rekrutierung von Monozyten in 3D-Elektrosponngerüste^48,49ist und dass sowohl Scherstress als auch zyklische Dehnung die parakrine Signalübertragung zwischen menschlichen Monozyten und mesenchymalen Stromazellen^{beeinflussen 50}. Fahy et al. zeigten, dass der Scherfluss die Sekretion von entzündungsfördernden Zytokinen durch menschliche Monozyten erhöhte⁵¹.

Zusammengenommen zeigen die oben genannten Beweise, dass ein angemessenes Verständnis und eine angemessene Kontrolle der hämodynamischen Belastungen für die kardiovaskuläre TE von entscheidender Bedeutung sind und dass es wichtig ist, die Entzündungsreaktion zu berücksichtigen, um dies zu erreichen. Zahlreiche Bioreaktoren wurden zuvor für die in vitro 52 ,^{53,54,55,56,57,58} oder ex vivo⁵⁹,^60,61 Kultur von kardiovaskulären Geweben beschrieben. Alle diese Systeme sind jedoch so konzipiert, dass sie die physiologischen hämodynamischen Belastungsbedingungen so weit wie möglich nachahmen. Während dies für die Herstellung von Kardiovaskulärem Gewebe in vitro oder die Aufrechterhaltung von Ex-vivo-Kulturen sehr wertvoll ist, erlauben solche Systeme keine systematischen Untersuchungen der individuellen Auswirkungen einzelner Hinweise. Dies liegt daran, dass die Anwendung sowohl der zyklischen Dehnung als auch der Scherspannung in diesen Bioreaktoren durch die gleiche Druckströmung angetrieben wird, die sie untrennbar verbindet. Während Mikrosysteme, die eine genaue mechanische Manipulation mit mehreren Cues ermöglichen, für 2D-Substrate⁶² oder 3D-Hydrogel-Setups^63,64beschrieben wurden, erlauben solche Setups nicht die Integration von elastomeren 3D-Biomaterialgerüsten.

Hier stellen wir die Anwendung eines röhrenförmigen Bioreaktorsystems vor, das auf einzigartige Weise die Entkopplung von Scherspannung und zyklischer Dehnung ermöglicht und hilft, ihre individuellen und kombinierten Wirkungen mechanistisch zu untersuchen. Dieses System ermöglicht die Prüfung einer Vielzahl von gewebezüchtigten Gefäßtransplantaten (z. B. synthetischer oder natürlicher Ursprung, unterschiedliche Mikroarchitektur, verschiedene Porositäten). Um die Anwendung von Scherspannung und Dehnung effektiv zu entkoppeln, sind die Schlüsselkonzepte, die der Bioreaktor verwendet, (1) die Trennung der Kontrolle von Scherspannung und Dehnung durch verschiedene Pumpensysteme und (2) die Stimulation der Gerüste in einer "Inside-Out" -Weise mit rechnerisch angetriebenen Abmessungen. Die Strömung wird auf der Außenfläche des Rohrgerüsts durch die Verwendung einer Strömungspumpe angewendet, während die umfangsbespannte Dehnung des Gerüsts durch Die Erweiterung eines Silikonrohrs, auf dem das Gerüst durch die Verwendung einer separaten Dehnungspumpe montiert ist, induziert wird. Die Abmessungen des Silikonrohrs und des Glasrohrs, das das Konstrukt enthält, werden sorgfältig ausgewählt und mit Hilfe von strömungsgestützten Simulationen validiert, um sicherzustellen, dass sich die Scherspannung auf dem Gerüst (aufgrund der Strömung) und die Umfangsdehnung (aufgrund der Rohrausdehnung) nicht signifikant beeinflussen. Dieses Inside-Out-Design hat mehrere praktische Gründe. Wenn die Dehnung durch den Luminalflüssigkeitsdruck (ähnlich der physiologischen Belastung) angelegt wird, muss das Probendesign von Natur aus leckagefrei sein. Darüber hinaus würde der druck, der zum Dehnen der Probe erforderlich ist, vollständig durch die Probensteifigkeit bestimmt, die zwischen den Proben und innerhalb einer Probe im Laufe der Zeit variieren kann, was es schwierig macht, die Dehnung zu kontrollieren. Dieser Bioreaktor montiert das Gewebe-Engineered Graft um einen Silikonschlauch und ermöglicht die Anwendung von Wall Shear Stress (WSS) an der Außenwand des Transplantats und druckt das Transplantat von innen. Auf diese Weise können gleiche Belastungsbedingungen zwischen Proben und innerhalb der Proben im Laufe der Zeit sichergestellt werden, und darüber hinaus dürfen die Proben undicht sein, wie es bei porösen Gefäßgerüsten üblich ist¹⁹. Dieser Inside-Out-Bioreaktor ist speziell für systematische Studien über die Auswirkungen von Scherung und / oder Dehnung gedacht, anstatt für die Entwicklung eines nativen Blutgefäßes in vitro, für das traditionelle vaskuläre Bioreaktor-Setups besser geeignet sind. Siehe Abbildung 1A–B für die Konstruktionszeichnungen des Bioreaktors und die entsprechende Tabelle 1 für eine funktionale Beschreibung und Begründung hinter den Hauptkomponenten des Bioreaktors.

Der Einsatz des Bioreaktors wird anhand einer Reihe neuerer Studien unserer Gruppe nachgewiesen, in denen wir die individuellen und kombinierten Einflüsse von Scherstress und zyklischer Dehnung auf Entzündung und Gewebebildung in resorbierbaren elektrosponnen Gerüsten für in situ kardiovaskuläres Gewebe untersucht haben^19,43,44. Dazu haben wir menschliche Makrophagen und Myofibroblasten entweder in Mono- oder in Kokultur verwendet, um die verschiedenen Phasen der in situ regenerativen Kaskade zu simulieren. Wir haben gezeigt, dass die Zytokinsekretion durch menschliche Makrophagen sowohl durch zyklische Dehnung als auch durch Scherstress deutlich beeinflusst wird, was die Matrixablagerung und -organisation durch menschliche Myofibroblasten in diesen Gerüsten beeinflusst, sowohl über parakrine Signalisierung als auch durch direkten Kontakt^19,43,44. Insbesondere zeigten diese Studien, dass bei kombinierter Anwendung von Scherstress und Dehnung die Auswirkungen auf Gewebebildung und Entzündung entweder von einer der beiden Lasten dominiert werden oder synergistische Effekte beider Lasten auftreten. Diese Ergebnisse verdeutlichen die Relevanz der Entkopplung beider Lasten, um den Beitrag der mechanischen Umgebung zu TE-Prozessen besser zu verstehen. Dieses Verständnis kann angewendet werden, um Gerüstkonstruktionsparameter in relevanten hämodynamischen Belastungsregimen systematisch zu optimieren. Darüber hinaus können die mechanistischen Daten aus solchen gut kontrollierten Umgebungen als Input für numerische Modelle dienen, die entwickelt werden, um den Verlauf des In-situ-Gewebeumbaus vorherzusagen, wie kürzlich für TEVGs⁶⁵ oder TEHVs⁶⁶berichtet, um die Vorhersagefähigkeit weiter zu verbessern.

Protocol

In den in diesem Protokoll beschriebenen Studien wurden primäre menschliche Makrophagen, die aus peripheren Blutschichten isoliert wurden, und menschliche Myofibroblasten, die nach einer koronaren Umgehungsoperation aus der Vena saphena isoliert wurden, verwendet⁴⁴. Die Buffy-Mäntel wurden von gesunden, anonymisierten Freiwilligen bezogen, die eine schriftliche Einwilligung nach Aufklärung erteilten, die vom Sanquin Research Institutional Medical Ethical Committee genehmigt wurde. Die Verwendung von humanen Vena-Saphena-Zellen (HVSCs) erfolgte in Übereinstimmung mit dem "Code Proper Secondary Use of Human Tissue", der von der Federation of Medical Societies (FMWV) in den Niederlanden entwickelt wurde.

1. Allgemeine Vorbereitungen und erforderliche Maßnahmen vor der Einrichtung des Bioreaktors

HINWEIS: Einzelheiten zu den jeweiligen Isolations- und Kultivierungsprotokollen entnehmen Sie bitte den früheren Arbeiten^19,43,44. Alle Berechnungen im Protokoll sind als Beispiele für ein Co-Kulturexperiment mit Monozyten und Myofibroblasten angegeben, die in 8 hämodynamisch belasteten Gerüsten und 2 statischen Kontrollen (n= 10) ausgesät sind.

1. Starten Sie die Zellisolierung und Zellkultur. Die Aussaatdichten für die ko-kultivierten Proben von Monozyten und Myofibroblasten (mit einem Aussaatverhältnis von 2:1) betragen 30 ×^{10 6} Monozyten/cm³ bzw. 15 × 10⁶ Myofibroblasten/cm3.
   HINWEIS: Das elektrosponnte Material hat eine hohe Porosität (>90%). Um die erforderliche Anzahl von Zellen pro Transplantat zu schätzen, wird das Volumen des Gerüsts mit der Formel für das Volumen eines Hohlzylinders berechnet: π * (Dicke)²* Länge ≈ 0,04 cm³. Die Gesamtmenge der Zellen pro Transplantat beträgt 1,2 × 10⁶ Monozyten und 0,6 × 10⁶ Myofibroblasten. Für 10 Proben sind mindestens 12 × 10⁶ Monozyten und 6 × 10⁶ Myofibroblasten erforderlich; Beginnen Sie mit bis zu ~10-15% mehr Zellen, um mögliche Pipettierfehler zu berücksichtigen.
2. Entgasen Sie das Zellkulturmedium, das für Experimente mit dem Bioreaktor verwendet wird.
   1. Bereiten Sie das Medium für Co-Kulturen vor, das aus RPMI-1640:aDMEM (1:1) besteht, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, 1% Penicillin-Streptomycin und 0,5% L-Glutamin.
   2. Legen Sie das Medium über Nacht (O/N) in einen Inkubator in einen Zellkulturkolben mit Filterkappe, um zu entgasen.
   3. Ersetzen Sie die Filterkappe durch eine luftdichte Kappe und lagern Sie sie bei 4 °C.
   4. Kurz vor Gebrauch 0,25 mg/ml L-Ascorbinsäure 2-phosphat (Vitamin C) in das Medium geben.
      HINWEIS: Für Berechnungen beträgt die benötigte Mediummenge pro Durchflusskulturkammer 50 ml. Aktualisieren Sie das Medium dreimal pro Woche; 25 ml altes Medium wird durch 25 ml frisches Medium ersetzt. Für 10 Proben; Nach der Aussaat werden insgesamt 500 ml frisches Medium benötigt, und für jeden nachfolgenden Mediumwechsel werden insgesamt 250 ml frisches Medium verwendet. Bereiten Sie immer Medium frisch vor, vor allem vitamin C sollte kurz vor dem Wechsel des Mediums hinzugefügt werden.
3. Isotrope elektrosponnene Gerüste (3 mm Leuchtdurchmesser, 200 μm Wandstärke) wie von Van Haaften et al.¹⁹ beschrieben (Abbildung 1G–I). Kurz gesagt, röhrenförmige Polycaprolacton-Bisurea(PCL-BU)-Gerüste werden durch Elektrospinnen aus 15% (w/w) Chloroform-Polymer-Lösungen hergestellt. Die Polymerlösungen werden bei Raumtemperatur und 30% relativer Luftfeuchtigkeit, bei einer Durchflussrate von 40 μL/min, 16 cm Abstand vom rotierenden zylindrischen Target (Ø 3 mm, 500 U/min) und einer angelegten Spannung von 16 kV an der Elektrospinndüse und -1 kV am Target elektrosponniert.
   HINWEIS: Obwohl für diese Experimente PCL-BU-Transplantate verwendet wurden, kann in diesem Bioreaktor eine Vielzahl von elastomeren Gewebetransplantaten montiert werden (z. B. unterschiedlichen synthetischen oder natürlichen Ursprungs, unterschiedliche Mikroarchitektur, unterschiedliche Porositäten).
   1. Entfernen Sie die elektrosponnenen Gerüste vom Dorn.
      1. Machen Sie ein kleines Loch in der Kappe eines 15-ml-Rohrs, um den Dorn in der Mitte zu "halten" und zu verhindern, dass er die Wand des Rohrs berührt.
      2. Legen Sie den Dorn mit dem elektrosponnierten Gerüst in das Falkenrohr und füllen Sie ihn mit entionisiertem Wasser.
      3. Gefrieren Sie die Röhrchen O/N bei -20 °C.
      4. Legen Sie die Schläuche auf Raumtemperatur (RT) und ziehen Sie die Dorne nach einigen Minuten heraus, wobei die elektrosponnen transplantierten Transplantate im Eis bleiben.
      5. Lassen Sie das Eis vollständig auftauen, entfernen Sie das elektrosponnierte Rohr aus dem aufgetauten Wasser und "hängen", um es mehrere Stunden lang vertikal zu trocknen. Stellen Sie sicher, dass die Gerüste nicht unter ihrem eigenen Gewicht "zusammenbrechen".
   2. Trockengerüste unter Vakuum O/N.
   3. Stellen Sie eine kleine Probe der elektrosponnierten Transplantate mit Rasterelektronenmikroskopie (REM) ab, um ihre Mikrostruktur (z. B. Fasermorphologie, Faserdurchmesser) zu beurteilen. Die Transplantate in den Beispielstudien haben eine isotrope Faserorientierung und einen Faserdurchmesser von 5 μm (Abbildung 1H–I).
4. Legen Sie einen Tag vor Beginn des Experiments das mit entionisiertem Wasser gefüllte Hydraulikreservoir in den Inkubator. Schließen Sie alle acht Anschlüsse für Strömungskulturkammern mit weißen Luer-Kappen. Schließen Sie das Druckluftsystem an und setzen Sie den Drucksensor ein. Führen Sie die Dehnungspumpe (siehe Schritt 5.6) O/N aus, um eine kleine Ausdehnung des Teflonbalgs zu ermöglichen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle erforderlichen Materialien und Geräte gemäß dem Protokoll des Herstellers oder wie in den Schritten 7.3–7.6 beschrieben gereinigt und/oder autoklaviert werden (siehe Materialtabelle,Kommentare/Beschreibungsspalte, für die Materialien autoklaviert werden dürfen).
5. Stellen Sie sterile Arbeitsbedingungen für den Rest des Protokolls sicher.
   1. Führen Sie die Schritte 2–5.3 (Einrichten des Systems), Schritt 6.3 (Mittelwechsel) und die Schritte 7.1–7.2 (Ernte von Gefäßkonstrukten) in einem sterilen Laminar-Flow-Schrank aus.
   2. Legen Sie Materialien, die nicht direkt für die nachfolgenden Schritte benötigt werden, in geschlossene Petrischalen, um alles so sauber wie möglich zu halten.
   3. Reinigen oder trocknen Sie Materialoberflächen regelmäßig, indem Sie ein Papiertuch mit 70% Ethanol einweichen und die Oberflächen der Bioreaktorkomponenten und des Laminar-Flow-Schranks abwischen.

2. Einrichtung des Bioreaktors

HINWEIS: Führen Sie Schritt 2 in einem Laminar-Flow-Schrank aus.

1. Schneiden Sie die elektrosponnierten Gerüste in Rohre von ca. 25 mm Länge und dokumentieren Sie sie vor Gebrauch (z. B. Foto für die Länge, Wiegen mit Waage für die Anfangsmasse).
2. Dekontaminieren Sie die elektrogesponnenen Gerüste.
   1. Legen Sie die elektrosponnierten Gerüste in eine Brunnenplatte oder Petrischale, wobei eine Öffnung der ultravioletten (UV) Lichtquelle zugewandt ist, damit UV-Licht (253,7 nm) das Innere der Gerüste beleuchten kann.
   2. Setzen Sie die elektrosponnenen Gerüste für 5 min UV-Licht aus.
   3. Drehen Sie alle Gerüste und wiederholen Sie die UV-Beleuchtung für die andere Öffnung.
      HINWEIS: Berühren Sie nach diesem Schritt das elektrosponnene Gerüst nur bei Bedarf. Verwenden Sie immer eine saubere Pinzette oder saubere Handschuhe.
   4. Nehmen Sie die Glasröhren der Strömungskulturkammern, die in 70% gelagert werden, waschen Sie die Glasröhren in Reinstwasser, trocknen Sie sie und legen Sie sie in eine große, geschlossene Petrischale.
      HINWEIS: Die folgenden Schritte, insbesondere die Schritte 2.3–2.5, werden idealerweise von zwei Experimentatoren durchgeführt.
3. Montieren Sie die elektrosponnenen Gerüste auf dem Silikonschlauch.
   1. Befestigen Sie die 5-0-Prolennaht an einem Ende des Silikonschlauchs, indem Sie die Naht durch eine Seite des Rohrs und aus der anderen herausnehmen, wobei zwei gegenüberliegende gespannte Nähte den Querschnitt des Schlauchs überspannen. Machen Sie einen kleinen Knoten auf beiden Seiten des Rohres, während Sie das Rohr an der Stelle der Knoten komprimieren und lassen Sie etwa 10 cm Draht auf beiden Knoten. Machen Sie einen dritten Knoten am Ende der beiden 10 cm restgleichen Drähte.
      1. Schneiden Sie die Nahtnadel und alle freien Fäden ab, die herausragen und die Innenseite des elektrogesponnenen Gerüsts beschädigen könnten. Schneiden Sie die Kanten des Silikonschlauchs in eine dreieckige Form, um den Silikonschlauch durch das elektrosponnierte Gerüst zu ziehen.
   2. Tauchen Sie das elektrogesponnene Gerüst in 30% Ethanol (dies dient als zusätzlicher Dekontaminationsschritt und hilft beim Schieben des elektrogesponnenen Gerüsts über den Silikonschlauch) und legen Sie das elektrogesponnene Gerüst über den freien 10 cm Draht. Experimentator A dehnt den Silikonschlauch, indem er sowohl den Silikonschlauch als auch den Knoten des 10 cm langen Nahtdrahtes sanft zieht, während Experimentator B das elektrogesponnene Gerüst mit einer Pinzette mit einer glatten Innenspitze vorsichtig über den Silikonschlauch schiebt, um eine Beschädigung der Gerüste zu verhindern.
   3. Lösen Sie langsam die Dehnung am Silikonschlauch und glätten Sie gleichzeitig das elektrosponnende Gerüst mit einer Pinzette. Tauchen Sie das elektrosponnende Gerüst auf dem Silikonschlauch zweimal in Reinstwasser.
      HINWEIS: Es ist möglich, dass eine Faltenbildung des elektrosponnen Gerüsts auftritt. Diese Faltenbildung verschwindet während der angelegten Vordehnung, bevor die Gerüste in Schritt 2.5.3 an den Druckrohren fixiert werden.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.2 und 2.3.3 für die anderen elektrosponnenen Gerüste. Je nach Länge des Silikonschlauches können mehrere elektrosponnierte Gerüste auf demselben Silikonschlauch montiert werden.
   5. Wenn alle elektrogespannten Gerüste auf dem Silikonschlauch montiert sind, schneiden Sie den Silikonschlauch um die Gerüste herum, alle auf die gleiche Länge (5,5 cm); auf der einen Seite, nahe dem Ende des elektrosponnen gesponnenen Gerüsts, auf der anderen Seite, so dass ~ 2-3 cm freier Silikonschlauch übrig bleiben.
4. Konstruieren Sie das untere Kompartiment der Strömungskulturkammer (Abbildung 1A–B).
   1. Nehmen Sie den oberen Teil des unteren Fachs, in dem sich der Durchflussauslass befindet, und schließen Sie den Durchflussauslass mit einem männlichen Luer-Stecker.
   2. Drücken Sie die Druckleitung mit Löchern durch das untere Fach und legen Sie einen Silikon-O-Ring um das untere Ende der Druckleitung, um ein Auslaufen zu verhindern. Schrauben Sie den unteren Teil des unteren Fachs mit dem oberen Teil des unteren Fachs, um die Druckleitung zu sichern. Stellen Sie sicher, dass sich die untere gravierte Nut der Druckleitung etwa 3–5 mm über dem Rand der Adapterbuchse des unteren Fachs befindet. Dies wird später den engen Knoten des Nahtdrahtes "halten" und das elektrogesponnene Gerüst über dem Silikonschlauch fixieren.
      HINWEIS: Wenn die Druckleitung leicht nach oben und unten manövriert werden kann, zeigt dies an, dass das untere Fach nicht gut gesichert ist. Wiederholen Sie Schritt 2.4.2, um Leckagen in späteren Phasen zu vermeiden (Abbildung 2D).
5. Befestigen Sie den Silikonschlauch mit dem elektrosponnierten Gerüst an der Druckleitung.
   1. Ziehen Sie den Silikonschlauch mit dem elektrosponnierten Gerüst über die Druckleitung.
   2. Machen Sie einen Knoten mit dem Nahtdraht am unteren Ende des elektrogesponnenen Gerüsts an der Stelle der gravierten Nut auf der Druckleitung. Machen Sie einen zweiten Knoten auf der gegenüberliegenden Seite, um den Silikonschlauch mit dem elektrosponnierten Transplantat fest zu sichern.
      ACHTUNG: Dies ist ein kritischer Schritt. Stellen Sie sicher, dass der Knoten genau in die gravierte Nut der Druckleitung "fällt", um ein Austreten des Wassers aus dem Hydraulikbehälter in die Strömungskulturkammern zu verhindern. Wenn Sie sich nicht sicher sind, versuchen Sie, den Nahtdraht an mehreren Positionen oberhalb oder unterhalb der erwarteten Position der Nut festzuziehen, um sicherzustellen, dass sich die endgültigen Knoten genau an der gravierten Nut befinden (Abbildung 2A).
   3. Setzen Sie die Scherenklemme am oberen Ende des Silikonschlauchs ein und strecken Sie den Silikonschlauch nach oben (dies wird den ersten Knoten direkt testen, wenn es möglich ist, den Silikonschlauch mit dem elektrosponnierten Gerüst über die Druckleitung zu bewegen, wurde er nicht gut genug angezogen). Mit der Zugkraft wird der Silikonschlauch vorgeredet. Um sicherzustellen, dass der Silikonschlauch zwischen den verschiedenen Proben konsistent ist, befestigen Sie ein Lineal an der Scherenklemme. Ziehen Sie die Scherenklemme nach oben, bis das untere Ende des Lineals die Höhe des unteren Endes des Gerüsts erreicht.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Vordehnung in jeder Probe aus zwei Gründen ungefähr gleich zu halten (~ 5%): (1) Wenn Silikonschläuche vorgedehnt werden, führt dies zu einer homogeneren Ausdehnung entlang der Länge der Probe, wenn sie unter Druck steht; (2) Die Vordehnung wirkt sich auf die mechanischen Eigenschaften des Silikons aus, daher sollte sie in allen Proben gleich sein, um gleiche Dehnungsbedingungen zwischen den Proben zu gewährleisten.
   4. Entfernen Sie Falten im elektrosponnenen Gerüst, indem Sie sanft am elektrosponnenen Gerüst ziehen. Machen Sie wieder zwei Knoten auf beiden Seiten mit einem Nahtdraht am oberen Ende des Gerüsts an der Stelle der oberen gravierten Nut auf der Druckleitung.
   5. Lösen Sie die Scherenklemme und schneiden Sie den Überschuss an Silikonschläuchen mit einem Messer weg, wobei 20-30% des Schraubgewindes mit Silikonschläuchen bedeckt bleiben, um ein Auslaufen zu vermeiden, wenn der Nasenkegel am Schraubgewinde montiert wird.
      HINWEIS: Wiederholen Sie die Schritte 2.4 und 2.5 für alle dynamischen Samples.
   6. Für die statischen Kontrollproben befestigen Sie das auf dem Silikonschlauch montierte elektrosponnenförmige Gerüst an Druckrohren ohne Löcher. Diese Leitungen können bis zur Aussaat (Schritt 4) separat in einem 15-ml-Rohr aufbewahrt werden und müssen nicht in den Strömungskulturkammerfächern montiert werden.
6. Dekontaminieren Sie die teilweise konstruierten Strömungskulturkammern mit einem elektrogesponnenen Gerüst, indem Sie sie 10 min UV-Licht aussetzen. Drehen Sie die Strömungskulturkammern mit elektrogesponnenen Gerüsten auf die andere Seite und wiederholen Sie die UV-Lichteinwirkung für 10 Minuten.
7. Schrauben Sie die Nasenkegel auf das Schraubgewinde der Druckleitungen mit Löchern für die dynamischen Proben.
   1. Stellen Sie sicher, dass das obere Ende des Silikonschlauchs in den Nasenkegel passt, um ein Auslaufen in späteren Stadien zu verhindern. Wenn zu viele Silikonschläuche vorhanden sind, schneiden Sie den Überschuss an Schläuchen mit einem Messer weg.
   2. Legen Sie die teilweise konstruierten Strömungskulturkammern in eine große Petrischale und richten Sie den Nasenkegel auf die UV-Lichtquelle. UV-Beleuchtung für 5 min.
8. Vollständiger Aufbau der Strömungskulturkammer mit Glasrohr und oberem Fach der Strömungskulturkammer (Abbildung 1A–B).
   1. Befeuchten Sie die elektrosponnierten Gerüste, indem Sie die Druckleitung mit dem Silikonschlauch und dem elektrogesponnenen Gerüst in 30% Ethanol tauchen, gefolgt von einem zweimaligen Eintauchen in Reinstwasser.
   2. Legen Sie das Glasrohr über die Druckleitung, drücken Sie es vorsichtig in das untere Fach und befesten Sie es vorsichtig.
   3. Nehmen Sie das obere Fach mit dem Durchlass, legen Sie einen Silikon-O-Ring, das Strömungsglätter und die Adapterbuchse in der richtigen Reihenfolge (Abbildung 1A-B), legen Sie es über das offene Ende des Glasrohrs und befestigen Sie es vorsichtig.
   4. Schrauben Sie eine weiße Luer-Kappe auf den Durchflusseinlass des oberen Fachs.
   5. Entfernen Sie den männlichen Luer-Stecker aus dem Durchflussauslass des unteren Fachs und reinigen Sie die Oberfläche um ihn herum mit einem ethanolgetränkten Papiertuch.
   6. Legen Sie eine Spritze mit 10 ml Reinstwasser in den Durchflussauslass, öffnen Sie die weiße Luer-Kappe auf dem oberen Fach und füllen Sie die Kammer mit Reinstwasser. Schließen Sie die weiße Luer-Kappe erneut, entfernen Sie die Spritze, reinigen Sie sie erneut mit Ethanol und schließen Sie den Durchflussauslass mit einem männlichen Luer-Stecker.
      HINWEIS: Wiederholen Sie die Schritte 2.6 bis 2.8 für alle Strömungskulturkammern.
   7. Für die statischen Kontrollen fügen Sie 10 ml Reinstwasser in die 15-ml-Röhrchen hinzu, die die Proben ohne Löcher auf den Druckrohren halten.
9. Legen Sie alle Fließkulturkammern in den Inkubator. Ersetzen Sie das Reinstwasser einen Tag vor der Zellaussaat auf die gleiche Weise wie in den Schritten 2.8.5 und 2.8.6 beschrieben durch Kulturmedium (stellen Sie sicher, dass Sie das "alte" Reinstwasser mit einem ethanolgetränkten Papiertuch sammeln, das direkt auf dem Durchflussauslass platziert wird).

[Das Protokoll kann hier pausiert werden]

3. Vorbereitungen für den Aufbau der Durchflusspumpe

HINWEIS: Führen Sie Schritt 3 in einem Laminar-Flow-Schrank aus.

1. Sammeln Sie alle Pumpeneinrichtungsmaterialien und bereiten Sie sich auf den Gebrauch vor.
   HINWEIS: Experimentatoren werden auf das Protokoll des Herstellers verwiesen, um eine detaillierte Beschreibung des Aufbaus der Pumpe, der fluidischen Einheiten und der mittleren Schläuche durch die Ventile der fluidischen Einheit zu erhalten.
   1. Stellen Sie die Pumpe auf 200 mbar Kapazität ein.
   2. Schrauben Sie die Behälterhalter für 60 mL Behälter an die fluidischen Einheiten.
   3. Reinigen Sie die wiederverwendbaren Gummiluftfilter mit einem in Ethanol getränkten Papiertuch, stellen Sie sicher, dass der Luftfilter trocken bleibt.
2. Legen Sie die 60-ml-Behälter in die Behälterhalter und legen Sie den Standard-Mediumschlauch durch die Ventile der Fluideinheit. Verbinden Sie den mittleren Schlauch mit einem größeren Innendurchmesser mit weiblichen Luer-Verschlusskupplungen zu einer geschlossenen Schlaufe.
3. Klemmen Sie den mittleren Schlauch mit einem Schlauchclip direkt unter den Behältern.
4. Füllen Sie die Reservoirs mit 25 mL Kulturmedium pro 60 mL Reservoir. Lassen Sie den Schlauchclip los und lassen Sie das Medium in den Schlauch gelangen.
5. Schließen Sie die Mediumbehälter mit den Gummiluftfiltern und legen Sie die Strömungspumpe bis Schritt 4 in den Inkubator.

4. Zellaussaat mit Fibrin als Zellträger

HINWEIS: Führen Sie Schritt 4 in einem Laminar-Flow-Schrank aus.

1. Bereiten Sie das Fibringel für den Zellaussaatschritt vor. Für Details siehe Mol et al.⁶⁷ Für das Fibringel sollte die Fibrinogenlösung eine Endkonzentration von 10 mg / ml haben (korrekt für die Reinheit des Proteinbestands), und die Thrombinlösung sollte eine Endkonzentration von 10 U / ml haben.
   1. Auftauen Sie Fibrinogen auf RT, bevor Sie ~ 50 mg (genug für 10 Proben) in einem Kunststoffbehälter mit rotem Deckel wiegen.
   2. Fügen Sie Zellkulturmedium hinzu, um die Fibrinogenlösung herzustellen (in einer Konzentration von 10 mg / ml, korrekt für die Reinheit des Proteinbestandes). Gut mischen und filtern, um die Fibrinogenlösung mit einem 0,2 μm Spritzenfilter in ein steriles 15 ml Röhrchen zu sterilisieren. Halten Sie die gefilterte Fibrinogenlösung auf Eis.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Fibrinogenlösung zu lange im Voraus vorzubereiten, da das Fibrinogen sonst spontan gerinnen kann.
   3. Thrombin auftauen und eine Thrombinlösung (in einer Konzentration von 10 U/ml) im Zellkulturmedium herstellen und auf Eis legen. Bereiten Sie 20 μL Thrombin + Zelllösung pro Probe vor. Für n=10 Proben werden 200 μL benötigt; Bereiten Sie daher eine 250 μL-Thrombinlösung vor, um mögliche Pipettierfehler zu berücksichtigen.
2. Sammeln und zählen Sie die Zellen aus den Kulturkolben. Mischen Sie die Zellen im gewünschten Verhältnis und in der gewünschten Menge (1,2 ×^{10 6} Monozyten und 0,6 × 10⁶ Myofibroblasten pro Gerüst). Stellen Sie sicher, dass genügend Zellen für n+1-Proben vorhanden sind, um Pipettierfehler zu korrigieren. Zentrifuge bei 350 × g für 10 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand.
3. Machen Sie eine Mischung aus den suspendierten Zellen und Thrombin.
   1. Verwenden Sie für jede Probe 20 μL der Thrombinlösung. Für n=10 Proben 200 μL Thrombin in das Zellpellet geben und mischen. Messen Sie das Volumen der Zellsuspension (Zellen + Thrombin) und berechnen Sie, wie sie gleichmäßig auf alle 10 Gerüste aufgeteilt werden (z. B. wenn die Thrombin + Zellsuspension ein Volumen von 260 μL hat, erhält jede elektrospunte Probe 260 μL / 10 Proben = 26 μL Thrombin + Zellsuspension).
   2. Da die Aussaat der Gerüste in zwei Schritten erfolgt, bereiten Sie zwei 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen vor, die die Hälfte der Zellsuspension für jedes Gerüst enthalten (in der Beispielberechnung des vorherigen Schritts: Zwei Röhrchen mit 13 μL Thrombin + Zellsuspension vorbereiten). Auf Eis legen.
      HINWEIS: Die folgenden Schritte, insbesondere Schritt 4.4, werden idealerweise von zwei Experimentatoren durchgeführt.
4. Trocknen Sie die vorbenetzten elektrosponnierten Gerüste mit Vakuum, um sich auf die Zellaussaat vorzubereiten.
   1. Schließen Sie eine Pasteur-Glaspipette an das Vakuumsystem des Laminar-Flow-Schranks an und legen Sie sie zur sterilen Zwischenlagerung in ein leeres 50-ml-Rohr.
   2. Nehmen Sie die Strömungskulturkammern aus dem Inkubator, entfernen Sie den männlichen Luer-Stecker aus dem Durchflussauslass und entfernen Sie das Medium, nachdem Sie die weiße Luer-Kappe geöffnet und ein ethanolgetränktes Papiertuch vor den Durchflussauslass gelegt haben.
   3. Nehmen Sie das obere Fach und den Glasschlauch ab und legen Sie es zur vorübergehenden Lagerung in eine sterile Petrischale.
   4. Legen Sie die Vakuum-Pasteur-Pipett auf das elektrogesponnene Gerüst und entfernen Sie so viel Medium wie möglich.
      ACHTUNG: Vakuumtrocknen Sie das elektrosponnierte Gerüst sehr vorsichtig. Anstelle einer linearen Hin- und Herbewegung über das Gerüst platzieren Sie die Vakuumpipette an mehreren Stellen. Klemmen Sie den Vakuumschlauch zur besseren Kontrolle auf die Pipett des Pasteurs zwischen die Finger.
   5. Mischen Sie die Fibrinogenlösung im Verhältnis 1:1 mit der Thrombin + Zellsuspension (z. B. mischen Sie 13 μL Fibrinogen mit 13 μL Thrombin + Zellsuspension). Um sicherzustellen, dass das Fibrin im Gerüst und nicht im Mikrofugenröhrchen polymerisiert, pipeten Sie das Fibrinogen, drehen Sie das Pipettrad für das "zusätzliche Volumen" der Thrombin + Zellsuspension und pipetieren Sie es einmal im Mikrofugenröhrchen mit Zellsuspension auf und ab.
   6. Tropfen Sie die Lösung direkt homogen über die gesamte Länge des elektrosponnen Gerüsts. Es wird empfohlen, dass Experimentator A die Fibrinmischung tropft, während Experimentator B das untere Fach mit dem elektrosponnierten Gerüst hält, das an der Druckleitung montiert ist.
   7. Nachdem das Fibrin mit den Zellen über das elektrosponnierte Gerüst getröpft wurde, bewegt Experimentator B das Gerüst langsam von links nach rechts und auf und ab, um die Zellen gleichmäßig über das Gerüst weiter zu teilen.
   8. Wiederholen Sie schritt 4.4.5 - 4.4.7 auf der anderen Seite des elektrosponnen gesponnenen Gerüsts.
   9. Montieren Sie die Strömungskulturkammer erneut, indem Sie das Glasrohr vorsichtig platzieren (verhindern Sie, dass Fibrin an der Innenseite des Glasrohrs klebt und gerinnt), und drücken Sie das obere Fach der Strömungskulturkammer zurück. Legen Sie das ausgesäte Konstrukt ohne medium oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) direkt in die Strömungskulturkammer im Inkubator.
   10. Wiederholen Sie die Schritte 4.4.1 bis 4.4.9 für alle dynamischen Beispiele. Für die statischen Proben, die an Druckrohren ohne Löcher montiert sind, gemäß den Schritten 4.4.1–4.4.8 aussäen und anschließend in ein 15-ml-Röhrchen geben.
   11. Lassen Sie das Fibrin 60 min im Inkubator polymerisieren.

[Das Protokoll kann hier für 30–60 Min. pausiert werden.]

5. Füllen Sie nach der Polymerisation die Fließkulturkammern (dynamische Proben) oder die 15-ml-Röhrchen (statische Proben) mit Medium.

5. Kopplung der Bioreaktor- und Durchflusspumpensysteme vor Beginn des Experiments

HINWEIS: Führen Sie die Schritte 5.1 bis 5.3 in einem Laminar-Flow-Schrank aus.

1. Nehmen Sie das Tablett mit den Strömungskulturkammern und den fluidischen Einheiten mit gefüllten Mediumbehältern und angeschlossenen Mediumschläuchen in den laminaren Strömungsschränken.
2. Positionieren Sie die Strömungskulturkammern auf der Bioreaktorbasis für die experimentellen Gruppen, die mit zyklischer Dehnung und kombinierten hämodynamischen Lasten beladen sind (Abbildung 1E).
   1. Kippen Sie die Strömungskulturkammer auf den Kopf und füllen Sie die Druckleitung von unten mit Reinstwasser mit einer Spritze mit dünnem Schlauch (dies kann von jeder Art sein, solange sie flexibel und dünn ist, in diesem Experiment wurde ein 10 cm langer Draht mit einem Innendurchmesser von 0,15 mm an der Nadel befestigt).
   2. Legen Sie den dünnen Schlauch in die Druckleitung, und während die Druckleitung mit Reinstwasser gefüllt wird, indem Sie das Wasser allmählich aus der Spritze drücken, ziehen Sie den Draht gleichzeitig aus der Druckleitung, um sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen in der Druckleitung befinden.
   3. Legen Sie die Fließkulturkammer auf eines der acht Schraubgewinde auf bioreaktorer Basis. Legen Sie einen Silikon-O-Ring zwischen die Bioreaktorbasis und den weißen Luer-Stecker, um ein mögliches Auslaufen zu verhindern, und ziehen Sie den weißen Luer-Stecker aus dem unteren Fach fest.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 5.2.2 und 5.2.3 für alle zyklisch gestreckten Proben.
3. Verbinden Sie die Strömungskulturkammern für alle Versuchsgruppen, mit Ausnahme der statischen Steuerung, mit dem Durchflusspumpensystem.
   1. Legen Sie einen Schlauchclip auf den mittleren Schlauch. Entfernen Sie die weiße Luer-Kappe, die den Durchflusseinlass des oberen Fachs der Fließkulturkammer bedeckt. Entfernen Sie die weibliche Luer-Kupplung des mittleren Schlauchs und verbinden Sie den mittleren Schlauch auf der einen Seite mit dem Strömungseinlass im oberen Fach und der anderen Seite des mittleren Schlauchs mit Durchflussauslass im unteren Fach.
   2. Wiederholen Sie Schritt 5.3.1 für alle Strömungskulturkammern. An dieser Stelle werden der Bioreaktor und die Strömungskulturkammern mit Medium gefüllt und mit den Strömungssystemen verbunden.
   3. Für die statischen Kontrollproben legen Sie die Proben mit der Scherenklemme vertikal in einen Zellkulturkolben mit Filterkappe. Füllen Sie den Zellkulturkolben mit Medium und legen Sie ihn in den Inkubator.
4. Übertragen Sie das komplette Setup vom Laminar-Flow-Schrank in den Inkubator und verbinden Sie die Fluideinheiten mit dem Luftdruckschlauch und dem elektrischen Kabel.
5. Starten Sie die Software und initialisieren Sie die Durchflusspumpen. Starten Sie den Mediumfluss für die Proben nacheinander.
   1. Überprüfen Sie, ob die Ventile der Fluideinheit klicken.
   2. Entfernen Sie die Schlauchklemme aus dem mittleren Schlauch.
   3. Starten Sie die Durchflusspumpe mit 100 mbar und 10 s Schaltzeit.
   4. Überprüfen Sie sorgfältig die Strömungsrichtung auf mögliche Leckagen oder Luftblasen. Eingekleinerte Luftblasen können durch Drehen der Strömungskulturkammer auf den Kopf gestellt werden.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Mediumspegel in den Mediumbehältern ausgeglichen sind, um ein Ansaugen von Luft in das System und Luftblasen in den Strömungskulturkammern zu verhindern und die Behälter nicht austrocknen zu lassen (Abbildung 2C).
   5. Wiederholen Sie Schritt 5.5 für alle fluidischen Einheiten nacheinander.
6. Initialisieren Sie die Dehnungspumpe.
   1. Verbinden Sie die pneumatische Betätigungspumpe über den Lufteinlass am Pneumatikzylinder mit der Druckluft. Schließen Sie den unteren Luftauslass mit dem blauen Schlauch für den Luftaustritt an(Abbildung 1F).
   2. Öffnen Sie die LabVIEW-Software, führen Sie das LabVIEW-Skript und das Druckluftdruck-Anwendungssystem aus, wie von Van Kelle et al.⁶⁸beschrieben, geben Sie Verschiebung und Frequenz ein (beginnen Sie mit einer niedrigen Frequenz von 0,2 Hz). Pausieren Sie die Pumpe, wenn sich der Teflonbalg auf dem niedrigsten Stand befindet.
   3. Platzieren Sie den Drucksensor in den Drucksensoreinlass am Hydraulikbehälter.
7. Ändern Sie die Pumpeneinstellungen auf die gewünschten Einstellungen (für 1,5 Pa verwenden Sie 150 mbar, 10 s Schaltzeit).
8. Starten Sie die Dehnungspumpe und wenden Sie die bevorzugte Einstellung an (z. B. 0,5 Hz, 1,05 Dehnung).

6. Ausführen des Experiments für mehrere Tage; Überwachung von Scherung und Dehnung während der Kultur und Des Mediumaustauschs

1. Berechnen Sie das WSS an der Gerüstwand.
   1. Notieren Sie die Durchflussgröße jeden zweiten Tag (siehe Handbuch des Herstellers der Durchflusspumpe für Details). Kurz gesagt, beobachten Sie die Änderung des Flüssigkeitsstandes (in ml) in den Mediumreservoirs zwischen dem Schalten des Flüssigkeitseinheitenreservoirs für 10 s. Führen Sie mindestens fünf Messungen durch, berechnen Sie den Mittelwert und multiplizieren Sie ihn mit 6, um die Durchflussrate Q in ml/min zu erhalten.
   2. Die Strömung wird durch eine Poiseuille-Strömung durch einen ringförmigen Kanal beschrieben. Unter der Annahme eines Kulturmediums als Newtonsche Flüssigkeit berechnen Sie das WSS an der Gerüstwand, r_1,nach Gleichung 1.
      (1)
      wobei das WSS τ_w an der Gerüstwand (r1; hier r₁ = 1,7 mm), das sich aus einer stationären Strömung ergibt, durch den angelegten Druck p und den innenradius des Glasrohrs r2 (hier r2 = 2,3 mm) bestimmt wird. Der Druckgradient in axialer Richtung wird als gleichmäßig zwischen Strömungseinlass und Strömungsauslass angenommen und ist durch Gleichung 2 gegeben (Abbildung 1J).
      (2)
      mit μ der dynamischen Viskosität (hier wurde die mittlere Viskosität konstant angenommen, μ = 0,7 × 10^-3 Pa∙s bei 37 °C) und Q der angelegten Durchfluss.
2. Überwachen Sie die Dehnung, die jeden zweiten Tag auf die Gerüste aufgetragen wird.
   1. Platzieren Sie einen dunklen Hintergrund hinter der Strömungskulturkammer, um den Kontrast zwischen dem Gerüst und dem Hintergrund zu erhöhen. Positionieren Sie die LED-Lichtlampen, die auf das Gerüst zeigen, um die Visualisierung des Gerüsts zu unterstützen.
   2. Machen Sie Zeitrafferfotos des Gerüsts mit einer Frequenz von 30 Hz für 6 s (dh 3 Dehnungszyklen) mit einer Hochgeschwindigkeitskamera.
      HINWEIS: Eine niedrigere Aufnahmefrequenz kann ausreichen, wenn die Kamera dies zulässt. Die minimal benötigte Frequenz wurde jedoch nicht bestimmt.
   3. Bestimmen Sie manuell den minimalen und maximalen Durchmesser des Gerüsts aus den Bildern.
   4. Berechnen Sie den minimalen und maximalen Außendurchmesser des elektrosponnen gesponnenen Gerüsts, um die maximalen Dehnungen gemäß Gleichung 3 zu berechnen.
      (3)
      wobei die Umfangsdehnung (λ_θ) durch das Verhältnis zwischen dem Außendurchmesser des Gerüsts, d₁, und seinem Anfangsdurchmesser d₀gegeben ist.
3. Korrigieren Sie die mittlere Verdunstung und erfrischen Sie das Medium dreimal pro Woche.
   1. Stoppen und entkoppeln Sie die Kabel für die Strömungssysteme und die Dehnungspumpe.
   2. Legen Sie Schlauchclips auf den mittleren Schlauch.
   3. Bestimmen Sie anhand der Volumenindikatormarkierungen auf den Mediumbehältern, wie viel Medium verdampft ist.
   4. Übertragen Sie das Tray mit dem Bioreaktor und den fluidischen Einheiten in den Laminar-Flow-Schrank.
   5. Entfernen Sie die Gummiluftfilter der Mediumbehälter; Fügen Sie autoklaviertes Reinstwasser hinzu, um das verdampfte Volumen des Mediums zu kompensieren. Schließen Sie die Mediumbehälter wieder und schließen Sie sie erneut an die Pumpe an, um das Medium mit dem Reinstwasser zu mischen.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 6.3.1 bis 6.3.5. Entfernen Sie die Gummiluftfilter erneut, nehmen Sie 25 ml Kulturmedium heraus und drehen Sie bei 300 × g für 5 min bei RT herunter.
      1. 1,5 ml Überstand sammeln und bei -30 °C für die Analyse sekretorischer Profile lagern (zur Analyse mit enzymgebundenen Immunosorbent-Assay (ELISA)).
      2. Sammeln Sie das gewünschte Überstandsvolumen für parakrine Signalstudien, indem Sie den Überstand als konditioniertes Medium^{verwenden 43}.
   7. Fügen Sie 25 ml frisches Medium zu den mittleren Reservoirs hinzu.
   8. Legen Sie Gummiluftfilter wieder auf die mittleren Behälter.
   9. Legen Sie das komplette Setup wieder in den Inkubator; Verbinden Sie alle Kabel und Luftschläuche mit der Pumpe und Dehnungspumpe. Lassen Sie die Schlauchclips los, und wiederholen Sie die Schritte 5.4–5.8.
4. Überprüfen Sie, ob Kieselsäuretrocknungsperlen in den an die Pumpe angeschlossenen Trocknungsflaschen feucht sind (weißes Aussehen), und ersetzen Sie sie bei Bedarf durch trockene Kieselsäureperlen (orangefarbenes Aussehen).

7. Beenden von Experiment, Probenentnahme und Gerätereinigung und -lagerung

1. Korrigieren Sie am letzten Tag des Experiments die mittlere Verdampfung, wie in den Schritten 6.3.1–6.3.5 beschrieben, und ernten Sie die Proben nacheinander.
   1. Um die Proben einzeln zu entnehmen, müssen Durchflusspumpe und Dehnungspumpe mehrmals pausiert werden. Legen Sie einen Schlauchclip auf einen mittleren Schlauch. Stoppen Sie vorübergehend die Durchflusspumpe und die Dehnungspumpe. Trennen Sie eine Strömungskulturkammer von der Bioreaktorbasis; durch eine weiße Luer-Kappe auf der Bioreaktorbasis ersetzen. Bringen Sie die Strömungskulturkammer und die Fluideinheit in den Laminar-Strömungsschrank. Starten Sie die Durchflusspumpe und die Dehnungspumpe erneut, um die hämodynamische Last bis zur Ernte auf die anderen Proben aufzutragen.
   2. Sammeln Sie Medium aus den Mediumreservoirs für die parakrine Zytokinproduktionsanalyse über ELISA.
2. Entkoppeln Sie Strömungseinheiten und ernterohrförmiges Konstrukt. Schnitt nach dem gewünschten Schnittschema. Teile des Konstrukts können bis zur weiteren Analyse bei 4 °C (nach 15 min Fixierung in 3,7% Formaldehyd und 3 x 5 min Waschen in PBS) oder -30 °C (nach Schnappgefrieren in flüssigem Stickstoff) gelagert werden.
3. Reinigen Sie den Bioreaktor und die Pumpenkomponenten. Zusätzlich wird die empfohlene Reinigungsmethode pro Artikel in der Materialtabelle erwähnt.
   1. Reinigen Sie die Gummiluftfilter mit 70% Ethanol. Achten Sie sehr darauf, den Innenfilter nicht zu befeuchten!
   2. Sammeln Sie alle einzelnen Komponenten: mittlere Schläuche, mittlere Behälter, Glasröhren, männliche Luer-Stecker und weibliche Luer-Schlösser, weiße Luer-Kappen, Druckkanäle, Nasenkegel, Silikon-O-Ringe, Adapterbuchsen, Strömungsglätter (ausgenommen Pumpen, Fluideinheiten, Gummiluftfilter, die Bioreaktorbasis) und spülen Sie in fließendem Leitungswasser.
   3. O / N in 0,1% Natriumdodecylsulfat in deionisiertem Wasser geben.
      HINWEIS: Verwenden Sie kein Reinstwasser, da die Teile rosten könnten.
   4. Mit Leitungswasser und Spülmittel abspülen.
   5. Tauchen Sie in entionisiertes Wasser ein, gefolgt von zweimal 70% Ethanol, gefolgt von entionisiertem Wasser.
   6. Legen Sie alle Materialien separat auf Papiertaschentücher und lassen Sie sie trocknen. Verwenden Sie Druckluft, um Schläuche zu trocknen.
   7. Reinigen Sie alle nicht autoklavierbaren Materialien mit einem Papiertuch, das mit 70% Ethanol getränkt ist. Dazu gehören der Gummiluftfilter (beachten Sie, dass der Luftfilter trocken bleiben sollte) und die Bioreaktorbasis (Teflonbalg und Pneumatikzylinder).
   8. Autoklaven sie die Komponenten der Fluidkammer (einschließlich des Silikon-O-Rings), des Mediumschlauchs, der Mediumbehälter (ohne Gummiluftfilter), der männlichen Luer-Stecker und der weiblichen Luer-Kupplungen, der weißen Luer-Kappen, der Schlauchclips und der Standardausrüstung (z. B. Pinzette, Klemmschere)
   9. Für den bequemen Einsatz bei den nächsten Experimenten kombinieren Sie die einzelnen Komponenten zu einer vollständigen fluidischen Kammer in einer autoklavierbaren Box.
4. Entfernen Sie Wasser aus dem Hydraulikbehälter. Mit 70% Ethanol reinigen, gefolgt von entionisiertem Wasser. Trocknen lassen. Nachfüllen Sie mit entionisiertem Wasser und ein paar Tropfen wasserbadkonservierendem Desinfektionsmittel.
5. Lagern Sie die Glasröhren für die Strömungskulturkammer in 70% Ethanol.
6. Die feuchten Kieselsäure-Trocknungsperlen (weißes Aussehen) bei 120 °C in den Ofen O/N geben, um sie trocknen zu lassen (orange Aussehen), und in einem luftdichten Kolben aufbewahren.

Representative Results

Dieser Bioreaktor wurde entwickelt, um die individuellen und kombinierten Auswirkungen von Scherstress und zyklischer Dehnung auf das Wachstum und den Umbau von Gefäßgewebe in 3D-Biomaterialgerüsten zu untersuchen. Das Design des Bioreaktors ermöglicht die Kultivierung von bis zu acht Gefäßkonstrukten unter verschiedenen Belastungsbedingungen (Abbildung 1A). Die Gefäßkonstrukte sind in einer Strömungskulturkammer (Abbildung 1B) positioniert, in der sowohl die umfangsente Dehnung als auch WSS unabhängig voneinander gesteuert werden können. Das obere Fach der Strömungskulturkammer hält einen Strömungsglätter zur Stabilisierung der Strömung in einer relativ kurzen Absetzlänge (Abbildung 1C). Direkt hinter dem Strömungsglätter verteilt der Nasenkegel die Strömung gleichmäßig durch den Ringkanal (Abbildung 1D). Wenn alle Schritte des Protokolls korrekt ausgeführt werden, können die Gefäßgerüste in der Strömungskulturkammer einer kontinuierlichen unidirektionalen Strömung durch den Ringkanal zwischen dem Gerüst und der Glaswand ausgesetzt und von der pneumatischen Pumpe umlaufend gedehnt werden (Abbildung 1E–F). Bevor das Gerüst montiert wird, sollte das elektrosponnierte Rohr in 25 mm Rohre geschnitten werden (Bild 1G) und kann mit REM untersucht werden, um die Mikroarchitektur zu analysieren (Abbildung 1H-I). Es ist wichtig zu beachten, dass die PCL-BU-Transplantate in diesem Beispiel durch alle anderen elastomeren Gewebetransplantate (natürlicher oder synthetischer Ursprung, unterschiedliche Mikroarchitektur oder Porosität) ersetzt werden können. Das Inside-Out-Design ermöglicht die Prüfung von hochporösen Transplantaten, da diese nicht unbedingt leckagefrei sein müssen. Das schematische Bild der Strömungskulturkammer zeigt die physikalische Interpretation der Parameter, die in den Gleichungen zur Beschreibung des WSS (Gleichung 1), des Druckgradienten (Gleichung 2) und der Umfangsdehnung (Gleichung 3) verwendet werden(Abbildung 1J).

Eine fehlerhafte Ausführung der kritischen Schritte des Protokolls kann zu einigen Szenarien führen. Beispielsweise kann es durch falsch montierte Knoten zu Leckagen aus dem Hydraulikbehälter kommen, was zu einem Austreten von Hydraulikflüssigkeit aus den Druckrohren mit Löchern führt, die das Silikonrohr passieren und in die Strömungskulturkammer gelangen (Abbildung 2A). Ein Auslaufen der Hydraulikflüssigkeit an der Verbindung zwischen den Schraubgewinden und dem Bioreaktorboden kann auch auftreten, wenn der Silikonring nicht gut platziert ist oder wenn sich der Teflonbalg einen Tag vor dem Experiment nicht leicht ausdehnen durfte (Abbildung 2B). Wenn das Medium nicht entgast wird oder wenn die Mediumsstände in den Mediumreservoirs nicht gut ausbalanciert sind und ein Mediumreservoir trocken läuft, was dazu führt, dass Luft in das System gesaugt wird, können luftblasen in der Strömungskulturkammer entstehen (Abbildung 2C), die die WSS-Patter stören und die Zelllebensfähigkeit und das anschließende Gewebewachstum beeinträchtigen. Wenn der Silikon-O-Ring im unteren Fach nicht richtig platziert ist, kann unterhalb der Strömungskulturkammer ein Mediumsaustritt beobachtet werden (Abbildung 2D).

Da dieser Bioreaktoraufbau die Anwendung individueller und kombinierter hämodynamischer Belastungen ermöglicht, können mehrere hämodynamisch belastete Versuchsgruppen in ein Experiment einbezogen werden (Abbildung 3A). Bisher wurden verschiedene hämodynamische Belastungen (d.h. zwei Scherspannungsregime und zwei Dehnungsregime) durch Anwendung verschiedener möglicher Systemeinstellungen validiert (Abbildung 3B). Bei der Überwachung von Stretch (Abbildung 3C) und WSS (Abbildung 3D) über langfristige Kulturperioden wurde validiert, dass diese über einen Zeitraum von bis zu 20 Tagen auf relativ konstanten Niveaus gehalten werden können.

Der Bioreaktor eignet sich besonders gut, um den Einfluss der hämodynamischen Belastung auf Wachstum und Umbau in einem in situ vaskulären TE-Kontext zu untersuchen. Die Stadien der In-situ-TE werden hypothetisiert, um die Stadien der natürlichen Wundheilungsreaktion widerzuspiegeln (Abbildung 4A). Die hier beschriebenen Co-Kulturen von Aus Monozyten abgeleiteten Makrophagen und Myofibroblasten aus menschlichen Saphenadern wurden als In-vitro-Nachahmung der proliferativen Phase etabliert. Drei Tage nach der Aussaat zeigte die Immunfluoreszenzfärbung eine homogene Verteilung beider Zelltypen im gesamten Gerüst (Abbildung 4B). Nach 20 Tagen Kokultur führte die zyklische Dehnung allein zur Ablagerung von zahlreicheren und dickeren Kollagen-Typ-I-Fasern, während in der Gruppe mit kombinierten hämodynamischen Belastungen dieser Effekt der zyklischen Dehnung durch Scherstress überwunden wurde, was zu einer weniger ausgeprägten Kollagentyp-I-Ablagerung führte, die hier durch Immunfluoreszenzfärbung veranschaulicht wird (Abbildung 4C). Für eine erfolgreiche In-situ-Geweberegeneration ist ein enges Gleichgewicht zwischen Gewebeproduktion und Gerüstresorption erforderlich. Neben der Gewebebildung ermöglicht der Bioreaktor die Induktion der zellgetriebenen Gerüstresorption. Zum Beispiel wurden bei der Kultivierung einer Monokultur von Makrophagen für 8 Tage auf den elektrogesponnenen Transplantaten Fasererosion und Faserspaltung in allen hämodynamischen Belastungsregimen beobachtet, wobei die stärkste Resorption in der statischen Gruppe und die am wenigsten ausgeprägte Resorption in der Scherspannungsgruppe (Abbildung 4D) beobachtet wurden. Zusammen zeigen diese Ergebnisse die Auswirkungen der verschiedenen hämodynamischen Belastungsregime sowohl auf das Wachstum als auch auf den Umbau. Diese Erkenntnisse sind hilfreich bei der Optimierung der Designparameter für neu entwickelte in situ TEVGs.

Eine weitere wichtige Determinante des Geweberegenerationsprozesses ist das Vorhandensein von pro- und entzündungshemmenden Zytokinen. Da der Bioreaktor ein geschlossenes Kreislaufsystem ist, werden die Zellen im System kontinuierlich den parakrinen Reizen sezernierter Faktoren ausgesetzt. Die Zytokinsekretionsprofile im Medium der dynamisch belasteten Co-Kulturen von humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC)-abgeleiteten Makrophagen und humanen Myofibroblasten aus Saphenvenen wurden in frühen und späteren Stadien analysiert (Abbildung 5A). Diese repräsentativen Ergebnisse veranschaulichen den Einfluss sowohl der zyklischen Dehnung als auch der Scherspannung auf das Zytokinsekretionsprofil im Co-Kulturaufbau. Interessanterweise zeigten die kombinierten Effekte beider Lasten entweder eine Dominanz einer der beiden Lasten (z. B. zyklische Dehnung für Interleukin-6 (IL-6) und Monozyten-Chemoattraktionsprotein-1 (MCP-1)) oder synergistische Effekte beider Lasten (z. B. für IL-10) (Abbildung 5B). Diese Erkenntnisse, die mithilfe dieser In-vitro-Testplattform gewonnen werden, liefern wertvolle Informationen für die Entwicklung von In-situ-TEVGs, die auf der Logik der makrophagengetriebenen In-situ-Geweberegeneration basieren.

Co-Kulturexperimente von Makrophagen und Myofibroblasten zeigten, dass die mechanische Umgebung und die daraus resultierenden belastungsabhängigen Entzündungsumgebungen den Phänotyp der Myofibroblasten modulierten. Nach 20 Tagen hämodynamischer Belastung zeigte die Genexpression von Myofibroblastenmarkern deutliche Unterschiede in der individuellen und kombinierten Wirkung der Belastung und in der direkten und parakrinen Signalisierung von Makrophagen auf Myofibroblasten (Abbildung 6A). Darüber hinaus korrelierten die Genexpressionsmuster des kontraktilen Markers alpha glatte Muskulaturaktin mit der Proteinsynthese (Abbildung 6B). Darüber hinaus stimulierte die zyklische Dehnung die kollagene und elastische Matrixgenexpression und die abgeschwächte Matrix-Metalloproteinase 1/Gewebeinhibitor-Matrix-Metalloproteinase-1-vermittelte Kollagenumbauung, während in der Kokultur eine stabilisierende Wirkung von Scherstress beobachtet wurde (Abbildung 6C). Diese Langzeit-Co-Kulturexperimente zeigen die Möglichkeit, die spätere Phase des Gewebeumbaus (Abbildung 4A) in verschiedenen hämodynamischen Belastungsregimen in gewebezüchtigten Gefäßtransplantaten mit diesem Bioreaktor zu untersuchen. Da die TEVG "inside out" auf einem Silikonschlauch montiert sind, können die Runddehnung und WSS für längere Kulturperioden aufgetragen werden.

Abbildung 1: Aufbau und Überblick über den Bioreaktor. (A) Konstruktionszeichnung der Bioreaktorbasis und (B) Explosionsansicht der Fluidkulturkammer mit allen angegebenen Teilen (Schritte 2.4–2.8). Das obere Fach der Strömungskulturkammer hält einen Strömungsglätter. (C) Der kugelförmig abgestumpfte Nasenkegel wird nach dem Strömungsglätter positioniert, um den Durchfluss durch den Ringkanal zu verteilen (Fließrichtung rosa angegeben). (D) Zusammen steuern und leiten diese Komponenten die Strömungsrichtung. Eine Funktionsbeschreibung der einzelnen genannten Teile finden Sie in Tabelle 1. (E) Foto des vollständigen Bioreaktoraufbaus (Stufe 5.2) und (F) eine Nahaufnahme der Strömungskulturkammern und des Pneumatikzylinders (Stufe 5.6.1). (G) Bruttoerscheinung des elektrogesponnenen PCL-BU-Gerüsts vor der Aussaat (Lineal tickt 1 mm). Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von röhrenförmigen elektrosponnendem PCL-BU-Gerüst mit 3 mm Innendurchmesser und 5 μm mittlerem Faserdurchmesser bei unterschiedlichen Vergrößerungen, Maßstabsbalken (H) 100 μm und (I) 10 μm (Schritt 1.3). (J) Schematische Darstellung der Kulturkammer, bestehend aus einem röhrenförmigen elektrosponnierten Gerüst, mit äußerem Radius (r₁) zentriert in einem Glasrohr mit innerem Radius (r₂). DieDurchflussein-und -auslässe sind mit dem Ringring verbunden, mit Kanalhöhe h zur Anwendung von Wandscherspannung (t). Der Druck-/Dehnungseinlass (P) wird mit dem silikonmontierten Gerüst verbunden, um von innen eine umlaufende Dehnung (λ(t))auf die montierten elektrosponnierten Gerüste aufzutragen (Stufe 6.1). Abkürzungen: Polycaprolacton bisurea (PCL-BU). Die Tafeln C, D und G–J wurden von Van Haaften et al.¹⁹adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Bioreaktor-Teile	Funktionsbeschreibung
Stretch-Anwendung
Pneumatikzylinder	Betätigt Teflonbalg.
Teflonbalg	Lädt den Hydraulikbehälter.
Hydraulikbehälter	Kann mit bis zu 8 Strömungskulturkammern verbunden werden, wird mit Demiwasser gefüllt, übt Druck auf die silikonmontierten Konstrukte aus.
Gewinde	Verbindung zwischen Strömungskulturkammer und Hydraulikbehälter. Der Druckeinlass für die silikonmontierten Konstrukte.
Weißer Luer-Anschluss	Wird verwendet, um die Strömungskulturkammer fest an einem der acht Schraubgewinde auf der Basis des Hydraulikbehälters / Bioreaktors zu verschrauben.
Druckleitung mit kleinen Löchern	Direkt mit Wasser im Hydraulikbehälter verbunden. Wenn der Hydraulikbehälter unter Druck gesetzt wird, füllen die Druckkanäle den Raum zwischen dem Silikonrohr (das auf der Druckleitung montiert ist) mit Wasser und drücken den Silikonschlauch nach außen, was zu einer umlaufenden Dehnung des silikonmontierten Transplantats von innen führt.
Silikonschläuche	Zur Montage des elektrosponnierten Transplantats auf der Druckleitung. Der Silikonschlauch wird von innen umlaufend gestreckt.
Flow-Anwendung
Durchflusspumpensystem	Wird verwendet, um den Durchfluss in den Strömungskulturkammern zu steuern. (in unserem Beispiel: Es wird ein Ibidi-Pumpensystem verwendet.)
Ober- und Unterfach mit Durchlaufein- und -auslass	Verbindet die Strömungskulturkammer mit dem Strömungskreislauf.
Glasröhre	Enthält das Druckgerüst in der Mitte und ermöglicht die Durchblutung der Gerüste.
Strömungsglätter	Stabilisiert die Strömung in einer relativ kurzen Absetzlänge.
Nasenkegel	Verteilt den Fluss gleichmäßig.
Adapterbuchse	Fixiert das Glasrohr.
Silikon-O-Ring	Verhindert das Austreten von Medium.

Tabelle 1: Funktionsbeschreibung der Hauptmerkmale des Bioreaktors, entspricht den in Abbildung 1A-D angegebenen Teilen.

Abbildung 2: Ergebnisse der ungenauen Ausführung der kritischen Schritte im Protokoll. Fotos einiger Vorkommnisse, die im Bioreaktoraufbau beobachtet werden können, wenn kritische Schritte nicht korrekt ausgeführt werden. (A) Ist der Knoten nicht dicht genug oder nicht genau in der gravierten Nut platziert (durch Pfeil gekennzeichnet), kann es zu einem leichten Austritt von Hydraulikflüssigkeit in die Strömungskulturkammer kommen (Schritt 2.5). (B) Wenn der Teflonbalg einen Tag vor dem Versuch O/N nicht ausdehnen durfte oder wenn der Silikonring nicht gut platziert ist, kann es zu einem Austritt von Hydraulikflüssigkeit aus der Hydraulikflüssigkeit an der Verbindung zwischen den Schraubengewinden und der Bioreaktorbasis kommen (durch Pfeil gekennzeichnet) (Schritt 1.4 und 5.2.3). (C) Luftblasen in der Strömungskulturkammer (durch Pfeil gekennzeichnet) führen zu gestörten Scherspannungsmustern. Entgasen Sie das Kulturmedium immer und stellen Sie sicher, dass die Mediumsstände in den Mediumbehältern ausgeglichen sind, um zu verhindern, dass ein Reservoir trocken läuft und Luft in das Strömungskammersystem gesaugt wird (Schritte 1.2 und 5.5.4). (D) Wenn der Silikonring im unteren Fach nicht richtig platziert ist, kann ein Verschütten des Mediums beobachtet werden (durch Pfeil gekennzeichnet) (Schritt 2.4.2). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Kontrolle von Scherspannung und Dehnung. Da der Bioreaktor eine unabhängige und kombinierte Anwendung von Stretch und Scherung ermöglicht, können(A)mehrere experimentelle Gruppen in ein Experiment einbezogen werden. (B) Beispiele für Variationen der maximalen Dehnungen und Scherspannungen zu einem bestimmten Zeitpunkt, der unter vier verschiedenen Systemeinstellungen (durch die Farben angegeben) getestet wurde. Schwarze Rechtecke stellen die mittlere ± Standardabweichung der Messungen für jede Einstellung dar. Die gepunkteten Linien werden als Mittelwert der Strecken (horizontale Linie) und der Scherspannungen (vertikale Linie) berechnet, um die vier unterschiedlichen Belastungsbedingungen anzuzeigen. (C) Zyklische Umfangsdehnungen in der zyklischen Dehnung und kombinierte Gruppen im Laufe des Experiments von 20 Tagen, basierend auf Außendurchmessermessungen der Gerüstkonstruktionen, die mit einem Zeitraffer einer Hochgeschwindigkeitskamera überwacht wurden (Schritt 6.2). (D) Überwachte Wandscherspannungen in der Scherspannung und kombinierte Gruppen im Laufe des Experiments, basierend auf den sich ändernden Mittleren werten in der Spritze (Schritt 6.1). Die Tafeln A, C und D wurden von Van Haaften und Wissing et al.⁴⁴adaptiert; Panel B wurde von Van Haaften et al.¹⁹adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Konzept des in situ vaskulären Gewebe-Engineerings, der Zellverteilung, der Gewebeproduktion und des Gerüstabbaus. (A) Eine schematische Darstellung, die die hypothetischen Phasen der gerüstgetriebenen Geweberegeneration an der Funktionsstelle des Wirts darstellt. Die gezeigten Ergebnisse stammen aus Experimenten, die sich auf die proliferative Phase konzentrierten, in der Makrophagen und gewebeproduzierende Zellen das Gerüstmaterial besiedelt haben. (B) Myofibroblasten aus menschlicher Saphenvene (rot) und PBMC-abgeleitete Makrophagen (grün) Verteilung an der Außenseite des elektrogesponnenen Gerüsts (grau) an Tag 3. Maßstabsbalken 200 μm. (C) Querschnitt des Kokulturkonstrukts an Tag 20 gefärbt für Kollagen Typ I(grün),Kollagen Typ III(rot)und DAPI(weiß). Maßstabsbalken 100 μm, *zeigt die Außenseite des Konstrukts an, entsprechend der Strömungsseite. (D) REM-Bilder von dezellularisierten Transplantaten von 8 Tagen Makrophagen-Monokultur, die makrophagenabbau zeigen; Maßstabsleiste 20 μm. Abkürzungen: human saphenous venous cells (HVSC); periphere mononukleäre Blutzelle (PBMC); 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI); Rasterelektronenmikroskopie (REM). Panel A wurde von Wissing und Bonito et al.²⁷adaptiert; Tafeln B und C wurden von Van Haaften und Wissing et al.⁴⁴adaptiert; und Panel D wurde von Wissing et al.⁴³adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Entzündliche Umgebung in hämodynamisch belasteten Kokulturkonstrukten nach 3 Tagen und 20 Tagen. Co-Kultur von humanen PBMC-abgeleiteten Makrophagen und humanen Myofibroblasten aus Saphenvenen. (A) Wärmekarte der gesamten Zytokinsekretion, gemessen im Überstand mittels Multiplex-ELISA. (B) Boxplots für eine Auswahl von Zytokinen am Tag 20, normalisiert auf den Gesamten DNA-Gehalt. P-Werte wurden mit Kruskal-Wallis-Test mit einem Dunn-Mehrfachvergleichstest berechnet; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** Abkürzungen: Gewebeinhibitor der Metalloproteinase (TIMP), Matrixmetalloproteinase (MMP), Interleukin (IL), Monozyten-Chemoattraktionsprotein 1 (MCP-1), transformierender Wachstumsfaktor beta 1 (TGF-β1), Bindegewebswachstumsfaktor (CTGF), Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α), Thrombozytenwachstumsfaktor (PDGF), statisch (ST), zyklische Dehnung (CS), Scherstress (SS). Die Tafeln A und B wurden von Van Haaften und Wissing et al.⁴⁴adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Veränderungen des Myofibroblasten-Phänotyps und Marker des Matrixwachstums und des Umbaus als Reaktion auf die hämodynamische Belastung der Gefäßkonstrukte am Tag 20. (A) Relative Genexpression von myofibroblastenspezifischen phänotypischen Markern. (B) Querschnitte gefärbt für αSMA (grün) und DAPI (blau), Maßstabsbalken 100 μm. (C) Relative Expression von Genen, die mit kollagener Matrix, elastischer Matrix, Proteoglykanen und Umbaugenen zusammenhängen. P-Werte wurden mit Kruskal-Wallis-Test mit einem Dunn-Mehrfachvergleichstest berechnet; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Abkürzungen: S100 Calcium bindendes Protein A4 (S100A4), alpha-glatte Muskelaktin (αSMA oder ACTA2), Calponin 1 (CNN1), Smoothelin (SMTN), Vimentin (VIM), Kollagen I (COL1A1), Elastin (ELN), Versican (VCAN), Matrix metalloproteinase (MMP), Gewebeinhibitor der Metalloproteinase (TIMP), statisch (ST), zyklische Dehnung (CS), Scherstress (SS), 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI). # gemessen an oder unterhalb der Nachweisgrenze. Die Tafeln A, B und C wurden von Van Haaften und Wissing et al.⁴⁴adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung S1: Proteinexpression Myofibroblasten- und Makrophagen-Monokulturen, die individuellen und kombinierten hämodynamischen Belastungen ausgesetzt sind. (A) Repräsentative konfokale Bilder von Myofibroblasten, die 10 Tage lang mit Aktinfasern(grün),Kernen(rot)und Gerüst(blau)kultiviert wurden, zeigen eine klare Aktinfaserorientierung in den geladenen Proben im Vergleich zu den statischen Proben, in denen keine bevorzugte Actinfaserrichtung beobachtet werden kann. Maßstabsbalken 50 μm. (B) Konfokale Bilder derselben Myofibroblasten-Monokultur, die für Kollagen (grün) und Kerne / Gerüste (weiß) gefärbt sind. Skala bar 50 μm. (C) Boxplots von Proteinsekretionsprofilen von statisch und dynamisch kultivierten THP1-abgeleiteten Makrophagen für 8 Tage, mit berechneten M1/M2-Verhältnissen basierend auf den Zytokinsekretionsspiegeln von IL-6, TNF-α, MCP-1 (entzündungsfördernd) und IL-10, IL-13, MMP-9 (entzündungshemmend). Der Punkt im MCP-1-Diagramm stellt einen statistischen Ausreißer dar. (D) ELISA-Daten der relativen Proteinsekretionsniveaus von statisch und dynamisch kultivierten Makrophagen an Tag 8 im Vergleich zur durchschnittlichen Sekretion von entzündungsfördernden, entzündungshemmenden, Wachstums- und Umbauproteinen (Proteinspiegel wurden für den durchschnittlichen DNA-Gehalt pro Gruppe korrigiert). Die Punkte und schattierten Bereiche zeigen das 50.bzw. 25. bis 75.^{Perzentil an.} Abkürzungen: Monozyten-Chemoattractant Protein 1 (MCP-1), Interleukin (IL), transformierender Wachstumsfaktor beta (TGF-β), Matrix-Metalloproteinase (MMP), Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF), Bindegewebswachstumsfaktor (CTGF), Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α), enzymgebundener Immunosorbent-Assay (ELISA).* p < 0,05; ** p < 0,01, *** p < 0,001. Die Tafeln A und B wurden von Van Haaften et al.¹⁹adaptiert. Die Tafeln C und D wurden von Wissing et al.⁴³adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Figur herunterzuladen.

Discussion

Der hier beschriebene Bioreaktor ermöglicht die systematische Bewertung der Beiträge der einzelnen und kombinierten Wirkungen von Scherstress und zyklischer Dehnung auf Entzündungen und Geweberegeneration in röhrenförmigen resorbierbaren Gerüsten. Dieser Ansatz ermöglicht auch eine Vielzahl von Analysen an vaskulären Konstrukten, wie im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" veranschaulicht. Diese Ergebnisse zeigen den unverwechselbaren Einfluss der verschiedenen hämodynamischen Belastungsregime (d.h. verschiedene Kombinationen von Scherung und Dehnung) sowohl auf das Wachstum als auch auf den Umbau des TEVG-Konstrukts. Diese Erkenntnisse, die über diese In-vitro-Plattform gesammelt werden, helfen bei der Optimierung von Gerüstdesignparametern für neu entwickelte In-situ-TEVGs. Um einen ordnungsgemäßen experimentellen Workflow zu gewährleisten, ist ein Verständnis der kritischen Schritte und der Einschränkungen dieses Protokolls wichtig.

Die kritischsten Schritte im Protokoll beziehen sich auf die Anwendung von Stretch auf die Proben. Für die Stretch-Anwendung ist es wichtig, dass das Setup leckagefrei ist. Es gibt zwei Schwachstellen im System: die Knoten, die die elektrosponnierten Transplantate an den Druckrohren befestigen, und die Verbindung zwischen der Bioreaktorbasis und den Strömungskulturkammern. Wie in den Schritten 2.5.2 und 2.5.4 beschrieben, müssen mehrere, enge Knoten genau an der gravierten Nut positioniert werden. Wenn der Knoten nicht dicht genug ist oder etwas über oder unter der Nut platziert ist, kann es zu einem leichten Austreten von Hydraulikflüssigkeit in die Strömungskulturkammer kommen. Diese Leckage kann als Druckabfall im Hydraulikbehälter und eine stetig steigende Spannung an der Dehnungspumpe erkannt werden, um den eingestellten Druckwert zu erreichen. Außerdem führt dies zu einer gestörten Strömung in der Fließkulturkammer, einem erhöhten Risiko einer Kontamination der Zellkultur und einer Verdünnung des Mediums. Sobald dies geschieht, muss die Strömungskulturkammer aus dem Experiment herausgenommen werden, und das Schraubgewinde am Hydraulikbehälter sollte mit einer weißen Luer-Kappe verschlossen werden. Diese wichtige Maßnahme der Entnahme einer vollständigen Probe, die erforderlich ist, um eine ordnungsgemäße Fortsetzung des Experiments für die anderen sieben Strömungskulturkammern zu gewährleisten, unterstreicht die Wichtigkeit, enge Knoten genau in die gravierten Rillen zu legen. Nur so kann eine ordnungsgemäße Trennung zwischen dem Wasser im Hydraulikbehälter und dem Medium in den Strömungskulturkammern gewährleistet werden. Um die Robustheit der Montage der Gerüste zu verbessern, werden die Rillen in den Druckrohren in einer überarbeiteten Version des Bioreaktors etwas tiefer gemacht, was eine einfachere und bessere Knotenplatzierung und damit eine sichere Trennung der Hydraulikflüssigkeit vom Medium ermöglicht.

Eine weitere mögliche Leckagequelle liegt zwischen den Schraubgewinden der Bioreaktorbasis und den weißen Luer-Anschlüssen der Strömungskulturkammer. Aufgrund eines möglichen Verschleißes des Teflonmaterials kann ein zusätzlicher Silikon-O-Ring hinzugefügt werden, um ein Auslaufen zu verhindern (Schritt 5.2.3). Darüber hinaus sollte der Teflonbalg der Dehnungspumpe einen Tag vor dem Experiment (Schritt 1.4) O/Nleicht ausdehnen können. Bei Leckagen sollte die verlorene Hydraulikflüssigkeit durch Zugabe einer kleinen Menge Reinstwasser über eines der acht Schraubgewinde kompensiert werden (verwenden Sie eine Spritze mit Nadel und flexiblem Draht). Setzen Sie die Strömungskulturkammer mit einem kleinen Stück Parafilm zwischen das Schraubgewinde und den weißen Luer-Stecker auf das untere Fach der Strömungskulturkammer. Um dieses Leckageproblem in zukünftigen Experimenten zu überwinden, werden die aktuellen Teflon-Schraubgewinde auf der Bioreaktorbasis in der nächsten Generation des Bioreaktors durch Edelstahlgewinde ersetzt, um einen Verschleiß des Systems zu verhindern.

Die Variation der Dehnung (Abbildung 3C) ist größer als die Variation in WSS (Abbildung 3D), da die Dehnung schwieriger zu kontrollieren ist. Neben den Maßnahmen zur Verhinderung von Leckagen gibt es jedoch noch andere Maßnahmen, die die Dehnungsschwankung begrenzen: (i) Vermeidung von Luftblasen in der Flöte (Schritt 1.4 und 5.2.1),(ii) Gewährleistung einer konsistenten Vordehnung zwischen den verschiedenen Proben (Schritt 2.5.3) und (iii) Sicherstellung konsistenter Gerüsteigenschaften zwischen verschiedenen Proben (Schritt 1.3).

Schließlich ist bei der Montage des elektrosponnen gesponnenen Gerüsts auf dem Silikonschlauch besondere Vorsicht geboten (Schritt 2.3). Insbesondere wenn das zerbrechliche elektrosponnierte Gerüst über den gestreckten Silikonschlauch gezogen werden muss, ist es wichtig, nicht zu viel Kraft anzuwenden, um zu verhindern, dass das elektrosponnende Transplantat beschädigt wird, insbesondere auf der Innenseite des elektrosponnenden Transplantats. Wenn Schäden an der Innenseite des elektrosponnierten Transplantats auftreten, entweder durch kräftiges Ziehen oder durch zu schwache Dehnung des Silikonschlauchs, wird das Ausmaß der Schädigung der elektrosponnierten Fasern erst sichtbar, nachdem das Konstrukt geerntet und analysiert wurde. Im aktuellen Setup kann der Erfolg der Aussaat nur durch Immunfluoreszenz oder immunhistochemische Analyse nach Opferung der Probe bestätigt werden. Das Aussaatverfahren mit Fibrin als Zellträger ist jedoch eine etablierte Methode^67, die typischerweise zu einer homogenen Zellverteilung bei Gerüsten mit ausreichend großer Porengröße führt. Einer der wichtigsten Aspekte in Bezug auf die Zellaussaat besteht darin, sicherzustellen, dass das Gerüst vor der Aussaat so trocken wie möglich ist (Schritt 4.4),um zu verhindern, dass das Fibringel mit den Zellen durch das nasse Gerüst geht, was zu einer inhomogenen Aussaat führt. Obwohl die Dekontaminationsmethode des elektrosponnierten Transplantats durch UV-Strahlung und das Eintauchen in 30% Ethanol nicht so streng ist wie die Sterilisation von elektrosponnierten Transplantaten, die für In-vivo-Studien hergestellt wurden und häufig durch Ethylenoxid- oder Gammabestrahlung sterilisiert werden, reicht sie für In-vitro-Kulturexperimente aus, die bis zu 20 Tage ohne Anzeichen einer Kontamination dauern können (siehe Beispielsweise Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 5, Abbildung 6und Van Haaften und Wissing (2020)⁴⁴). Darüber hinaus erlaubt das PCL-BU-Material, das hier verwendet wird, keine lange Exposition gegenüber hohen Ethanolkonzentrationen. Die am besten geeignete Sterilisationsmethode kann je nach verwendetem Material gewählt werden.

Zusätzlich zu den Ergebnissen zuvor durchgeführter Co-Kulturstudien kann eine breitere Palette von Studien mit dem gleichen System durchgeführt werden. Das System wurde bisher zur Durchführung dynamischer Monokulturen von Myofibroblasten (Ergänzende Abbildung 1A-B) und Makrophagen (Ergänzende Abbildung 1C-D) eingesetzt, um die Auswirkungen der hämodynamischen Belastung auf einzelne Zelltypen und deren parakrine Signalisierung zu untersuchen^19,43. Unterschiedliche hämodynamische Belastungsregime führten zu einer klaren Aktinfaserorientierung in Myofibroblasten (Ergänzende Abbildung 1A) und einer deutlich unterschiedlichen Kollagenablagerung (Ergänzende Abbildung 1B) nach 10 Tagen. Die Zytokinproduktion durch THP1-abgeleitete Makrophagen unterschied sich drastisch zwischen den verschiedenen hämodynamischen Belastungen (Ergänzende Abbildung 1C) und zeigte bei Belastung ein entzündungsfördernderes Profil (Ergänzende Abbildung 1D). Weitere validierte Möglichkeiten umfassen die Anwendung von oszillierendem Durchfluss durch den Einsatz einer zusätzlichen Pumpe und einer fluidischen Einheit. Die Viskosität des Mediums kann in Richtung des Bereichs der Blutviskosität erhöht werden (z.B. durch Zugabe von Xanthangummi)⁶⁹. Die Modulation der mittleren Viskosität stellt eine zusätzliche Variable dar, um den Bereich der anwendbaren Scherspannungen zu erweitern. Obwohl das beschriebene Protokoll das "Ibidi" Flow-Conditioning-Setup verwendet, können auch Setups anderer Hersteller verwendet werden, solange ähnliche Strömungsregime angewendet werden können.

Einer der Hauptvorteile der Verwendung dieses Bioreaktorsystems ist das relativ große Konstrukt (ca. 15 mm x 10,5 mm), das hämodynamisch belastet werden kann, so dass eine Vielzahl möglicher Ausleseparameter aus einer einzigen Probe extrahiert werden können. Gleichzeitig kann die Konstruktgröße auch als Einschränkung angesehen werden, da dieser Aufbau eine relativ große Menge an (manchmal kostspieligem) Material erfordert, insbesondere wenn Primärzellen verwendet werden oder wenn das Kulturmedium kostspielige Additive erfordert. Darüber hinaus ist der Durchsatz des Setups relativ gering. Folglich eignet sich der aktuelle Aufbau besonders für hypothesengetriebene Forschung, bei der eine begrenzte Anzahl von Variablen umfassend getestet wird, anstatt eine große Anzahl von Variablen mit begrenzter Auslesung zu screeningen. Für zukünftige Experimente werden kleine Verbesserungen am aktuellen Setup vorgenommen, um die Möglichkeit zu ermöglichen, kleinere Gerüste zu montieren und die Größe der mittleren Reservoirs zu verkleinern. Bei letzterem ist das Stromvolumen der Mediumspeicher erforderlich, um ausreichende Volumenströme zu ermöglichen, um die gewünschten Scherspannungen zu erreichen. Die erforderlichen Durchflussmengen – und damit das Volumen der Mediumsbehälter – können durch Erhöhung der Viskosität des Mediums reduziert werden (z. B. durch Zugabe von Xanthangummi, wie zuvor festgelegt⁶⁹).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser Bioreaktor die Quantifizierung der individuellen und kombinierten Auswirkungen von Scherspannung und zyklischer Dehnung auf das Gewebewachstum und den Umbau auf einer Vielzahl von elastomeren 3D-Biomaterialgerüsten ermöglicht. Der Bioreaktor kann bis zu acht Gefäßkonstrukte unter verschiedenen Belastungsbedingungen kulturen. Aufgrund seines Designs eignet sich der Bioreaktor besonders, um das Zusammenspiel zwischen Hämodynamik und in situ vaskulären TE-Prozessen zu untersuchen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
advanced Dulbecco’s modified EagleMedium (aDMEM)	Gibco	12491-015	cell culture medium for fibroblasts
Aqua Stabil	Julabo	8940012	prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir
Bovine fibrinogen	Sigma	F8630	to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Bovine thrombin	Sigma	T4648	to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Centrifuge	Eppendorf	5804	to spin down cells and conditioned medium
Clamp scissor - "kelly forceps"	Almedic	P-422	clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)
CO2 cell culture incubators	Sanyo	MCO-170AIC-PE	for cell culturing
Compressed air reservoir	Festo	CRVZS-5	smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up
Custom Matlab script to calculate the maximum stretches	Matlab	R2017. The Mathworks, Natick, MA	calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold
Data acquisition board	National Instruments	BNC-2090	data processing in between amplifier system and computer
Ethanol	VWR	VWRK4096-9005	to keep sterile working conditions
Fetal bovine calf serum (FBS)	Greiner	758087	cell culture medium supplement; serum-supplement
Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)
Glass Pasteur pipet	Assistant	HE40567002	apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)
Glass tubes of the flow culture chamber	Custon made, Equipment & Prototype Center, Eindhoven University of Technology	n.a.	part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)
GlutaMax	Gibco	35050061	cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up
High speed camera	MotionScope	M-5	to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
High speed camera lens - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - lens	Nikon	JAA616AB	to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
Hose clip	ibidi GmbH	10821	block medium flow (autoclave at step 1, step 7)
Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)
Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads	ibidi GmbH	10902	set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.
Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped)	Swann Morton	0301; 0933	to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material
LabVIEW Software	National Instruments	version 2018	to control the stretch applied to the scaffolds
Laminar flow biosafety cabinet with UV light	Labconco	302310001	to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving
Large and small petri dishes	Greiner	664-160	for sterile working conditions
L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C)	Sigma	A8960	cell culture medium supplement, important for collagen production
LED light cold source KL2500	Zeiss	Schott AG	to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch
Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps	ibidi GmbH	various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories)	to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)
Measuring amplifier (PICAS)	PEEKEL instruments B.V.	n.a.	to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView
Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders	ibidi GmbH	10974	medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)
Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter	Rubber BV	1805	to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing
Motion Studio Software	Idtvision	2.15.00	to make the high speed time lapse images for stretch monitoring
Needle (19G)	BD Microlance	301700	together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles
Needle driver	Adson	2429218	to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)
Paper tissues	Kleenex	38044001	for cleaning of the equipment with 70% ethanol
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	quick fix if leakage occurs
Penicillin/streptomycin (P/S)	Lonza	DE17-602E	cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P4417-100TAB	for storage and washing steps (autoclave at step 1)
Plastic containers (60 mL) with red screw caps	Greiner	206202	to prepare the fibrinogen solution
Pneumatic cylinder	Festo	AEVC-20-10-I-P	to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 µm wall thickness, 20 mm length)	SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands	n.a.	produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details
Pressure conduit without holes (for static control)	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)
Pressure sensor and transducer	BD	TC-XX and P 10 EZ	the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure
Proportional air pressure control valve and pressure sensor	Festo	MPPES-3-1/8-2-010, 159596	provides compressed air to the pneumatic actuated pump
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)	Gibco	A1049101	cell culture medium for monocyte/macrophage
Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL)	Eppendorf	30120086	multiple applications (autoclave at step 1)
Sodium dodecyl sulfate solution 20%	Sigma	5030	Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.
Silicone O-rings	Technirub	1250S	to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)
Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness)	Rubber BV	1805	to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)
Sterile tube (15 mL)	Falcon	352095	multiple applications
Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle	Ethicon, Johnson&Johnson	EH7404H	Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)
Syringe (24 mL)	B. Braun Melsungen AG	2057932	to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber
Syringe filter (0.2 µm)	Satorius	17597-K	to filter the fibrinogen solution
T150 cell culture flask with filter cap	Nunc	178983	to degas culture medium
T75 Cell culture flask with filter cap	Nunc	156499	to culture static control samples
Teflon bellow	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Tray (stainless steel)	PolarWare	15-248	for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)
Tweezers	Wironit	4910	sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)
Ultrapure water	Stakpure	Omniapure UV 18200002	to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)
UV light	Philips	TUV 30W/G30 T8	for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding