Um Bioreator multi-cue para avaliar a capacidade inflamatória e regenerativa de biomateriais sob fluxo e estiramento

Summary

O objetivo deste protocolo é executar uma co-cultura dinâmica de macrófagos humanos e miofibroblasts em andaimes eletroscarados tubulares para investigar a regeneração de tecidos conduzidos por materiais, usando um bioreator que permite o desacoplamento do estresse da tesoura e do estiramento cíclico.

Abstract

O uso de biomateriais resorbáveis para induzir a regeneração diretamente no corpo é uma estratégia atraente do ponto de vista translacional. Tais materiais induzem uma resposta inflamatória após a implantação, que é o condutor da posterior resorção do material e da regeneração de novos tecidos. Essa estratégia, também conhecida como engenharia de tecidos in situ, é perseguida para obter substituições cardiovasculares, como enxertos vasculares projetados por tecidos. Tanto os processos inflamatórios quanto os regenerativos são determinados pelas pistas biomecânicas locais no andaime (ou seja, estresse de estiramento e calha). Aqui, descrevemos em detalhes o uso de um bioreator desenvolvido sob medida que permite exclusivamente a dissociação do estresse de estiramento e tesoura em um andaime tubular. Isso permite a avaliação sistemática e padronizada da capacidade inflamatória e regenerativa dos andaimes tubulares sob a influência de cargas mecânicas bem controladas, que demonstramos com base em um experimento dinâmico de co-cultura usando macrófagos humanos e miofibroblasts. As principais etapas práticas dessa abordagem — a construção e a configuração do bioreator, a preparação dos andaimes e a semeadura de células, a aplicação e a manutenção do fluxo de estiramento e cisalhamento e a colheita de amostras para análise — são discutidas detalhadamente.

Introduction

A engenharia de tecidos cardiovasculares (TE) está sendo perseguida como opção alternativa de tratamento às próteses cardiovasculares permanentes atualmente utilizadas (por exemplo, enxertos vasculares, substituições de válvulas cardíacas), que são subótimas para grandes coortes de pacientes^1,2,3,4. Aplicações muito procuradas incluem enxertos vasculares (TEVGs)^5,6 e válvulas cardíacas (TEHVs)^7,8. Na maioria das vezes, as metodologias cardiovasculares de TE fazem uso de biomateriais resorbáveis (naturais ou sintéticos) que servem como um andaime instrutivo para a formação do novo tecido. A formação de novos tecidos pode ser projetada completamente in vitro, semeando o andaime com células e culminando em um bioreator antes da implantação (te in vitro)^9,10,11, ou diretamente in situ, em que o andaime sintético é implantado sem pré-cultivo, a fim de induzir a formação de novos tecidos diretamente no corpo (in situ TE)^12,13,14. Tanto para abordagens in vitro quanto in situ cardiovascular TE, a regeneração funcional bem sucedida é predominantemente dependente tanto da resposta imune do hospedeiro à construção implantada quanto do carregamento biomecânico adequado.

A importância do carregamento biomecânico para te cardiovascular é bem reconhecida¹⁵. No caso dos implantes cardiovasculares, as células que povoam o andaime são expostas ao estiramento cíclico e estresses de cisalhamento que surgem como resultado do ambiente hemodinâmico. Inúmeros estudos têm relatado o efeito estimulante do estiramento (cíclico) na formação de componentes matriciais, como o colágeno^16,17,18,19, glicosaminoglicas (GAGs)²⁰e elastina^21,22, por vários tipos de células. Por exemplo, Huang et al. demonstraram que o estiramento biaxial elevou a deposição e organização do colágeno e da elastina em TEVGs in vitro usando um bioreator vascular²³. Embora a ênfase tipicamente reside no alongamento como a carga dominante, esses estudos muitas vezes fazem uso de bioreatores orientados pelo fluxo em que a amostra também é exposta ao fluxo de cisalhamento. Embora relativamente pouco se saiba sobre a influência isolada das tensões de tesoura na formação de tecidos e inflamação em 3D, alguns dados estão disponíveis. Por exemplo, Hinderer et al. e Eoh et al. demonstraram que o fluxo de cisalhamento, além de uma microestrutura de andaime 3D, foi importante para a formação de elastina madura por células musculares vasculares humanas em um sistema de modelo in vitro^24,25. Ao todo, esses achados ilustram a relevância tanto do alongamento cíclico quanto do estresse de cisalhamento para te cardiovascular.

Outro determinante importante para o sucesso ou falha dos implantes de TE é a resposta imune do hospedeiro ao enxerto implantado²⁶. Isso é particularmente importante para estratégias de TE in situ in situ, que realmente contam com a resposta inflamatória aguda ao andaime para iniciar os processos subsequentes de influxo celular e formação de tecido endógeno e remodelação²⁷. O macrófago é um iniciador crítico da regeneração do tecido funcional, que tem sido mostrado por múltiplos estudos^28,29,30. Análoga à cicatrização de feridas, a regeneração do tecido é regida pela sinalização paracrina entre macrófagos e células produtoras de tecidos, como fibroblastos e miofibroblasts^31,32,33. Além de coordenar a nova deposição tecidual, os macrófagos estão envolvidos na resorção ativa do material do andaime estrangeiro^34,35. Como tal, a resposta in vitro de macrófago a um bioma material foi identificada como parâmetro preditivo para o sucesso in vivo dos implantes^36,37,38.

A resposta do macrófago a um andaime implantado depende de características de design de andaimes, como composição de material e microestrutura^35,39,40. Além das propriedades do andaime, a resposta do macrófago a um andaime e seu crosstalk com myofibroblasts também é impactada por cargas hemodinâmicas. Por exemplo, o estiramento cíclico mostrou-se um importante modulador do fenótipo macrófago^41,42,43,44 e a secreção de citocinas^43,44,45,46 em andaimes eletroscardos 3D. Utilizando um sistema de co-cultura de macrófagos e células musculares lisas vasculares, Battiston et al. demonstraram que a presença de macrófagos levou ao aumento dos níveis de elastina e GAGs e que níveis moderados de estiramento cíclico (1,07-1,10) estimularam a deposição do colágeno I e elastina⁴⁷. Em trabalhos anteriores, demonstramos que o estresse da cisalhamento é um importante determinante para o recrutamento de monócitos em andaimes eletroscados^{3D 48,49}, e que tanto o estresse da cisalhamento quanto o estiramento cíclico impactam a sinalização paracrina entre monócitos humanos e células estrômicas mesenquimais⁵⁰. Fahy et al. demonstraram que o fluxo de cisalhamento aumentou a secreção de citocinas pró-inflamatórias por monócitos humanos⁵¹.

Em conjunto, as evidências acima mostram que uma compreensão adequada e controle sobre cargas hemodinâmicas é crucial para o TE cardiovascular, e que é importante considerar a resposta inflamatória para conseguir isso. Inúmeros bioreatores foram descritos anteriormente para a cultura in vitro^{52,53,54,55,56,57,58} ou ex vivo^59,60,61 cultura de tecidos cardiovasculares. No entanto, todos esses sistemas são projetados para imitar as condições fisiológicas de carregamento hemodinâmico tanto quanto possível. Embora isso seja altamente valioso para o propósito de criar tecidos cardiovasculares in vitro ou manter culturas ex vivo, tais sistemas não permitem estudos sistemáticos sobre os efeitos individuais das pistas individuais. Isso ocorre porque a aplicação tanto do estresse cíclico quanto do cisalhamento nesses bioreatores é impulsionada pelo mesmo fluxo pressurizado, que os liga intrinsecamente. Embora microsistemas que permitam manipulação mecânica precisa de várias pistas tenham sido descritos para substratos^{2D configurações de} hidrogel 62 ou 3D^63,64, tais configurações não permitem a incorporação de andaimes biomateriais 3D elastoméricos.

Aqui, apresentamos a aplicação de um sistema bioreator tubular que permite exclusivamente o desacoplamento do estresse da cisalhamento e do estiramento cíclico e ajuda a investigar mecanicamente seus efeitos individuais e combinados. Este sistema permite testar uma ampla variedade de enxertos vasculares projetados por tecido (por exemplo, origem sintética ou natural, microarquiteção diferente, várias porosidades). Para efetivamente desacoplar a aplicação do estresse e do alongamento da tesoura, os conceitos-chave que o bioreator usa são (1) separação do controle do estresse e do estiramento da tesoura usando sistemas de bomba distintos e (2) estimulação dos andaimes de forma "de dentro para fora" com dimensões computacionalmente orientadas. O fluxo é aplicado na superfície externa do andaime tubular através do uso de uma bomba de fluxo, enquanto o trecho circunferencial do andaime é induzido pela expansão de um tubo de silicone no qual o andaime é montado através do uso de uma bomba de tensão separada. As dimensões do tubo de silicone e do tubo de vidro que contém a construção são cuidadosamente escolhidas e validadas por meio de simulações de dinâmica computacional de fluidos, para garantir que o estresse da cisalhamento no andaime (devido ao fluxo) e o estiramento circunferencial (devido à expansão do tubo) não afetem significativamente uns aos outros. Este design de dentro para fora tem várias lógicas práticas. Se o estiramento for aplicado pela pressão do fluido luminal (semelhante ao carregamento fisiológico), ele requer inerentemente que o desenho da amostra seja livre de vazamentos. Além disso, a pressão necessária para esticar a amostra seria completamente determinada pela rigidez amostral, que pode variar entre amostras e dentro de uma amostra ao longo do tempo, dificultando o controle do trecho. Este bioreator monta o enxerto de tecido projetado em torno de um tubo de silicone e permite a aplicação de estresse de corte de parede (WSS) na parede externa do enxerto e pressuriza o enxerto por dentro. Dessa forma, condições iguais de carregamento entre amostras e dentro das amostras ao longo do tempo podem ser garantidas, e, além disso, as amostras podem ser vazadas, como é comum para andaimes vasculares porosos¹⁹. Este bioreator de dentro para fora destina-se especificamente a estudos sistemáticos sobre os efeitos da tesoura e/ou alongamento, em vez da engenharia de um vaso sanguíneo nativo in vitro, para o qual as configurações tradicionais de bioreatores vasculares são mais adequadas. Consulte a Figura 1A-B para os desenhos de design bioreator, e sua tabela correspondente 1 para uma descrição funcional e racionalidade por trás dos principais componentes do bioreator.

O uso do bioreator é demonstrado com base em uma série de estudos recentes do nosso grupo em que investigamos as influências individuais e combinadas do estresse da cisalhamento e do estiramento cíclico na inflamação e formação tecidual em andaimes eletrosopunis resorbáveis para in situ tecido cardiovascular^19,43,44. Para isso, usamos macrófagos humanos e miofibroblasts em mono ou em co-cultura para simular as várias fases da cascata regenerativa in situ. Demonstramos que a secreção de citocinas por macrófagos humanos é claramente impactada tanto pelo estresse do estiramento cíclico quanto pelo cisalhamento, afetando a deposição matricial e a organização por myofibroblasts humanos nestes andaimes, tanto via sinalização paracririna quanto pelo contato direto^19,43,44. Notavelmente, esses estudos revelaram que, no caso da aplicação combinada de estresse e alongamento da tesoura, os efeitos na formação e inflamação tecidual são dominados por uma das duas cargas, ou há efeitos sinérgicos de ambas as cargas. Esses achados ilustram a relevância da desacoplamento de ambas as cargas para obter uma melhor compreensão da contribuição do ambiente mecânico nos processos de TE. Esse entendimento pode ser aplicado para otimizar sistematicamente parâmetros de design de andaimes em regimes de carregamento hemodinâmicos relevantes. Além disso, os dados mecanicistas de ambientes tão bem controlados podem servir de entrada para modelos numéricos que estão sendo desenvolvidos para prever o curso da remodelação de tecidos in situ, como relatado recentemente para TEVGs⁶⁵ ou TEHVs⁶⁶, para melhorar ainda mais a capacidade preditiva.

Protocol

Nos estudos descritos neste protocolo, macrófagos humanos primários isolados de casacos periféricos de sangue e miofibroblasts humanos isolados da veia safena após cirurgia coronariana por passagem foram utilizados⁴⁴. Os casacos buffy foram obtidos de voluntários saudáveis e anonimizados que forneceram consentimento por escrito informado, que foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica Institucional da Sanquin Research. O uso de células vena saphena humanas (HVSCs) foi de acordo com o "Código De Uso Secundário Adequado do Tecido Humano" desenvolvido pela Federação das Sociedades Médicas (FMWV) nos Países Baixos.

1. Preparações Gerais e Ações Necessárias Antes de Configurar o Bioreator

NOTA: Para obter detalhes sobre os respectivos protocolos de isolamento e cultivo, consulte o trabalho anterior^19,43,44. Todos os cálculos no protocolo são dados como exemplos para um experimento de co-cultura com monócitos e miofibroblasts, semeados em 8 andaimes carregados hemodinamicamente e 2 controles estáticos (n=10).

1. Comece o isolamento celular e a cultura celular. As densidades de semeadura para as amostras co-cultivadas de monócitos e miofibroblasts (com uma razão de semeadura de 2:1) são de 30 × 10⁶ monócitos/cm³ e 15 × 10⁶ miofibroblasts/cm^{3, respectivamente.}
   NOTA: O material eletrospun tem alta porosidade (>90%). Para estimar o número necessário de células por enxerto, o volume do andaime é calculado com a fórmula para o volume de um cilindro oco: π*(espessura)²*comprimento ≈ 0,04 cm³. A quantidade total de células por enxerto é de 1,2 × 10⁶ monócitos e 0,6 × 10⁶ miofibroblasts. Para 10 amostras, são necessários pelo menos 12 × 10⁶ monócitos e 6 × 10⁶ miofibroblasts; começar com até ~10-15% mais células para explicar possíveis erros de pipetação.
2. Degas o meio de cultura celular que será usado para experimentos envolvendo o bioreator.
   1. Prepare o meio para coculturas, que consiste em RPMI-1640:aDMEM (1:1), complementado com 10% de soro bovino fetal, 1% penicilina-estreptomicina e 0,5% L-glutamina.
   2. Coloque o meio durante a noite (O/N) em uma incubadora em um frasco de cultura celular com tampa de filtro para degas.
   3. Substitua a tampa do filtro por uma tampa apertada e armazene a 4 °C.
   4. Pouco antes do uso, adicione 0,25 mg/mL L-ácido ascórbico L 2-fosfato (vitamina C) ao meio.
      NOTA: Para os cálculos, a quantidade de média exigida por câmara de cultura de fluxo é de 50 mL. Refrescar o meio três vezes por semana; O meio velho de 25 mL é substituído por um meio fresco de 25 mL. Para 10 amostras; após a semeadura, é necessário um total de 500 mL de meio fresco, e para cada alteração média subsequente, é utilizado um total de 250 mL de meio fresco. Prepare sempre o meio fresco, especialmente, a vitamina C deve ser adicionada pouco antes de mudar o meio.
3. Prepare andaimes eletroscópidos isotrópicos (3 mm de diâmetro luminal, 200 μm de espessura da parede), conforme descrito por Van Haaften et al.¹⁹ (Figura 1G-I). Em suma, os andaimes de policaprolactona tubular (PCL-BU) são produzidos por eletropinning a partir de 15% (w/w) soluções de clorofórmio-polímero. As soluções de polímero são eletrospunadas à temperatura ambiente e 30% de umidade relativa, a uma vazão de 40 μL/min, 16 cm de distância do alvo cilíndrico rotativo (Ø 3 mm, 500 rpm), e uma tensão aplicada de 16 kV no bocal de eletropinning e -1 kV no alvo.
   NOTA: Embora os enxertos PCL-BU tenham sido utilizados para esses experimentos, uma grande variedade de enxertos de tecido elastomérico podem ser montados neste bioreator (por exemplo, de diferentes origens sintéticas ou naturais, microarquiteturas diferentes, porosidades diferentes)
   1. Remova os andaimes eletrospundos do mandril.
      1. Faça um pequeno furo na tampa de um tubo de 15 mL para 'segurar' o mandril no centro e evitar que ele toque na parede do tubo.
      2. Coloque o mandril com o andaime eletrospun no tubo falcão e encha-o com água deionizada.
      3. Congele os tubos O/N a -20 °C.
      4. Coloque os tubos em temperatura ambiente (RT) e retire os mandrels após alguns minutos, deixando os enxertos eletrospun no gelo.
      5. Deixe o gelo descongelar completamente, remova o tubo eletrospun da água descongelada e 'pendure' para secar verticalmente por várias horas. Certifique-se de que os andaimes não 'colapsam' sob seu próprio peso.
   2. Andaimes secos sob vácuo O/N.
   3. Imagem uma pequena amostra dos enxertos eletrospun usando microscopia eletrônica de varredura (SEM) para avaliar sua microestrutura (por exemplo, morfologia de fibras, diâmetro da fibra). Os enxertos nos estudos de exemplo têm orientação de fibra isotrópica e diâmetro de fibra de 5 μm(Figura 1H-I).
4. Um dia antes de iniciar o experimento, coloque o reservatório hidráulico cheio de água deionizada na incubadora. Feche todas as oito conexões para câmaras de cultura de fluxo com tampas brancas de Luer. Conecte-se ao sistema de ar comprimido e insira o sensor de pressão. Execute a bomba de tensão (ver passo 5.6) O/N para permitir uma pequena expansão do foles de Teflon.
   NOTA: Certifique-se de que todos os materiais e equipamentos necessários sejam limpos e/ou autoclavados (ver Tabela de Materiais,Comentários/Descrição da coluna para os quais os materiais podem ser autoclavados), de acordo com o protocolo do fabricante ou conforme descrito nas etapas 7.3-7.6.
5. Assegurar condições de trabalho estéreis para o restante do protocolo.
   1. Execute as etapas 2-5.3 (configuração do sistema), passo 6.3 (mudança média) e etapas 7.1-7.2 (colheita de construções vasculares) em um armário de fluxo laminar estéril.
   2. Coloque materiais que não sejam diretamente necessários para as etapas subsequentes em pratos fechados de Petri para manter tudo o mais limpo possível.
   3. Superfícies de material limpo ou seco regularmente, encharcando um tecido de papel com 70% de etanol, e limpam as superfícies dos componentes bioreatores e do gabinete de fluxo laminar.

2. Configuração do Bioreator

NOTA: Realize o passo 2 em um gabinete de fluxo laminar.

1. Corte os andaimes eletrospunos em tubos de aproximadamente 25 mm de comprimento e documente-os antes do uso (por exemplo, fotografe para o comprimento, pese com equilíbrio para a massa inicial).
2. Descontaminar os andaimes eletroscarados.
   1. Coloque os andaimes eletrospunos inclinados em uma placa de poço ou placa de Petri, com uma abertura voltada para a fonte de luz ultravioleta (UV), para permitir que a luz UV (253,7 nm) ilumine o interior dos andaimes.
   2. Exponha os andaimes eletrospunos à luz UV por 5 minutos.
   3. Vire todos os andaimes e repita a iluminação UV para a outra abertura.
      NOTA: Após esta etapa, só toque no andaime eletroscado quando necessário. Use sempre pinças limpas ou luvas limpas.
   4. Pegue os tubos de vidro das câmaras de cultura de fluxo que são armazenados em 70%, lave os tubos de vidro em água ultrapura, seque e coloque em uma grande placa de Petri fechada.
      NOTA: As etapas a seguir, especialmente as etapas 2.3-2.5, são idealmente realizadas por dois experimentadores.
3. Monte os andaimes eletrospunes na tubulação de silicone.
   1. Conecte a sutura de 5-0 prolene a uma extremidade da tubulação de silicone, tomando a sutura através de um lado do tubo e para fora do outro, deixando duas suturas esticadas opostas abrangendo a seção transversal do tubo. Faça um pequeno nó em ambos os lados do tubo enquanto comprime o tubo no lócus dos nós e deixe aproximadamente 10 cm de fio em ambos os nós. Faça um terceiro nó no final dos dois fios de 10 cm que sobraram.
      1. Corte a agulha de sutura e todos os fios livres que possam se destacar e danificar o interior do andaime eletrospun. Corte as bordas da tubulação de silicone em uma forma triangular para ajudar a puxar a tubulação de silicone através do andaime eletrospun.
   2. Mergulhe o andaime eletrospun em 30% de etanol (isso serve como etapa extra de descontaminação e auxilia no deslizamento do andaime eletrospun sobre a tubulação de silício) e coloque o andaime eletrospun sobre o fio livre de 10 cm. Experimentador A estica a tubulação de silicone puxando suavemente tanto a tubulação de silicone quanto o nó do fio de sutura de 10 cm, enquanto o experimentador B desliza suavemente o andaime eletrospun sobre a tubulação de silicone usando pinças com uma ponta interna lisa para evitar danos nos andaimes.
   3. Solte lentamente o estiramento na tubulação de silicone, ao mesmo tempo em que suavize simultaneamente o andaime eletroscarado com pinças. Mergulhe o andaime eletrospun na tubulação de silicone em água ultrapura duas vezes.
      NOTA: É possível que ocorra alguma ruga do andaime eletroscado. Esta ruga desaparecerá durante o pré-alongamento aplicado antes de fixar os andaimes nos conduítes de pressão na etapa 2.5.3.
   4. Repita as etapas 2.3.2 e 2.3.3 para os outros andaimes eletrospunos. Dependendo do comprimento da tubulação de silicone, vários andaimes eletrospun podem ser montados na mesma tubulação de silicone.
   5. Quando todos os andaimes eletroscaridos forem montados na tubulação de silicone, corte a tubulação de silicone ao redor dos andaimes, tudo para o mesmo comprimento (5,5 cm); de um lado, perto da extremidade do andaime eletrospun, do outro lado, deixando ~2-3 cm de tubo de silicone livre.
4. Construa o compartimento inferior da câmara de cultura de fluxo(Figura 1A-B).
   1. Pegue a parte superior do compartimento inferior contendo a saída de fluxo e feche a saída de fluxo com um plugue Luer masculino.
   2. Empurre o conduíte de pressão com furos através do compartimento inferior, e coloque um anel O de silicone ao redor da extremidade inferior do conduíte de pressão para evitar vazamentos. Enrosque a parte inferior do compartimento inferior até a parte superior do compartimento inferior para fixar o conduíte de pressão. Certifique-se de que a ranhura mais baixa do conduíte de pressão esteja aproximadamente 3-5 mm acima da borda da bucha adaptador do compartimento inferior; isso mais tarde vai 'segurar' o nó apertado do fio de sutura, fixando o andaime eletrospun sobre a tubulação de silicone.
      NOTA: Se o conduíte de pressão pode ser facilmente manobrado para cima e para baixo, indica que o compartimento inferior não está bem protegido. Repita o passo 2.4.2 para evitar vazamentos em estágios posteriores(Figura 2D).
5. Fixar a tubulação de silicone com o andaime eletroscarado no conduíte de pressão.
   1. Puxe o tubo de silicone com o andaime eletrospundo sobre o conduíte de pressão.
   2. Faça um nó com o fio de sutura na extremidade inferior do andaime eletrospun no local da ranhura gravada no conduíte de pressão. Faça um segundo nó no lado oposto para fixar firmemente a tubulação de silicone com o enxerto eletrospun.
      ATENÇÃO: Este é um passo crítico. Certifique-se de que o nó exatamente 'cai' na ranhura gravada do conduíte de pressão para evitar o vazamento da água do reservatório hidráulico para as câmaras de cultura de fluxo. Se não tiver certeza, tente apertar o fio de sutura em várias posições, acima ou abaixo do local esperado da ranhura, para garantir que os nós finais estejam exatamente na ranhura gravada(Figura 2A).
   3. Coloque o grampo da tesoura na extremidade superior do tubo de silicone, e estique a tubulação de silicone para cima (isso vai testar diretamente o primeiro nó, se for possível mover a tubulação de silicone com o andaime eletrospun sobre o conduíte de pressão, não foi bem apertado o suficiente). Com a força de puxar, a tubulação de silicone é pré-esticada. Para garantir que a tubulação de silicone seja consistente entre as diferentes amostras, conecte uma régua ao grampo da tesoura. Puxe o grampo da tesoura para cima até que a extremidade inferior da régua atinja a altura da extremidade inferior do andaime.
      NOTA: É importante manter o pré-alongamento em cada amostra aproximadamente o mesmo (~5%) por dois motivos: (1) se a tubulação de silicone for pré-esticada, resultará em uma expansão mais homogênea ao longo do comprimento da amostra quando pressurizada; (2) o pré-alongamento impactará as propriedades mecânicas do silicone, portanto deve ser o mesmo em todas as amostras para garantir condições iguais de estiramento entre as amostras.
   4. Remova as rugas no andaime eletrospun, puxando suavemente o andaime eletrospun. Novamente, faça dois nós em ambos os lados com um fio de sutura na extremidade superior do andaime na localização da ranhura gravada superior no conduíte de pressão.
   5. Solte o grampo da tesoura e corte o excesso de tubos de silicone com uma faca, deixando 20 a 30% da rosca coberta com tubo de silicone, para evitar vazamentos quando o cone do nariz estiver montado na rosca do parafuso.
      NOTA: Repita as etapas 2.4 e 2.5 para todas as amostras dinâmicas.
   6. Para as amostras de controle estático, fixe o andaime eletrospun montado na tubulação de silicone em conduítes de pressão sem furos. Estes conduítes podem ser mantidos separadamente em um tubo de 15 mL até a semeadura (passo 4) e não precisam ser montados nos compartimentos da câmara de cultura de fluxo.
6. Descontaminar as câmaras de cultura de fluxo parcialmente construídas com andaime eletrospun expondo-o à luz UV por 10 minutos. Gire as câmaras de cultura de fluxo com andaimes eletrospunos para o outro lado, e repita a exposição à luz UV por 10 minutos.
7. Enrosque os cones do nariz na rosca do parafuso dos conduítes de pressão com orifícios para as amostras dinâmicas.
   1. Certifique-se de que a extremidade superior da tubulação de silicone se encaixa no cone do nariz para evitar vazamentos em estágios posteriores. Se houver muita tubulação de silicone, corte o excesso de tubos com uma faca.
   2. Coloque as câmaras de cultura de fluxo parcialmente construídas em uma grande placa de Petri, e aponte o cone do nariz em direção à fonte de luz UV. Aplique a iluminação UV por 5 minutos.
8. Construção completa da câmara de cultura de fluxo com o tubo de vidro e compartimento superior da câmara de cultura de fluxo(Figura 1A-B).
   1. Pré-molhar os andaimes eletrospun mergulhando o conduíte de pressão com a tubulação de silicone e andaime eletrospun em 30% de etanol, seguido por um mergulho na água ultrauso duas vezes.
   2. Coloque o tubo de vidro sobre o conduíte de pressão e empurre suavemente no compartimento inferior e segure-o suavemente.
   3. Pegue o compartimento superior contendo a entrada de fluxo, coloque um anel O de silicone, o alisador de fluxo e a bucha do adaptador na ordem correta(Figura 1A-B),e coloque sobre a extremidade aberta do tubo de vidro e segure-o suavemente.
   4. Enrosque uma tampa luer branca na entrada de fluxo do compartimento superior.
   5. Remova o plugue Luer masculino da saída de fluxo do compartimento inferior e limpe a superfície ao seu redor com um tecido de papel encharcado de etanol.
   6. Coloque uma seringa com 10 mL de água ultrapura na saída de fluxo, abra a tampa branca do Luer no compartimento superior e encha a câmara com água ultrapura. Feche a tampa branca de Luer novamente, remova a seringa, limpe novamente com etanol, e feche a saída de fluxo com um plugue Luer masculino.
      NOTA: Repita as etapas 2.6-2.8 para todas as câmaras de cultura de fluxo.
   7. Para os controles estáticos, adicione 10 mL de água ultrauso aos tubos de 15 mL que seguram as amostras montadas nos conduítes de pressão sem furos.
9. Coloque todas as câmaras de cultura de fluxo na incubadora. Substitua a água ultrauso por meio de cultura um dia antes da semeadura celular da mesma forma descrita nas etapas 2.8.5 e 2.8.6 (certifique-se de coletar a água ultrapura 'antiga' com um tecido de papel encharcado de etanol colocado diretamente na saída de fluxo).

[O protocolo pode ser pausado aqui]

3. Preparativos para a configuração da bomba de fluxo

NOTA: Realize o passo 3 em um gabinete de fluxo laminar.

1. Colete todos os materiais de configuração da bomba e prepare-se para uso.
   NOTA: Os experimentadores são encaminhados ao protocolo do fabricante para uma descrição detalhada da configuração da bomba, das unidades fluidas e da tubulação média através das válvulas da unidade fluidica.
   1. Coloque a bomba em 200 mbar de capacidade.
   2. Enrosque os porta-reservatórios de 60 mL para as unidades fluidas.
   3. Limpe os filtros de ar de borracha reutilizáveis com um tecido de papel encharcado de etanol, certifique-se de que o filtro de ar permaneça seco.
2. Coloque os reservatórios de 60 mL nos porta-reservatórios e coloque o tubo médio padrão através das válvulas da unidade fluidica. Conecte a tubulação média com um diâmetro interno maior com acotradores de fechadura Luer femininos em um laço fechado.
3. Fixar a tubulação média com um clipe de mangueira, diretamente abaixo dos reservatórios.
4. Encha os reservatórios com 25 mL de cultura média por reservatório de 60 mL. Solte o clipe da mangueira e deixe o meio entrar na tubulação.
5. Feche os reservatórios médios com os filtros de ar de borracha e coloque a configuração da bomba de fluxo na incubadora até o passo 4.

4. Semeadura celular usando fibrina como portador de célula

NOTA: Realize o passo 4 em um gabinete de fluxo laminar.

1. Prepare o gel de fibrina para a etapa de semeadura celular. Para obter detalhes, consulte Mol et al.⁶⁷ Para o gel de fibrina, a solução de fibrinogênio deve ter uma concentração final de 10 mg/mL (correto para a pureza do estoque de proteínas), e a solução de trombina deve ter uma concentração final de 10 U/mL.
   1. Descongele fibrinogen para RT, antes de pesar ~50 mg (o suficiente para 10 amostras) em um recipiente plástico com uma tampa vermelha.
   2. Adicione meio de cultura celular para preparar a solução fibrinogênio (a uma concentração de 10 mg/mL, correto para a pureza do estoque de proteínas). Misture bem e filtro para esterilizar a solução de fibrinogênio com um filtro de seringa de 0,2 μm em um tubo estéril de 15 mL. Mantenha a solução de fibrinogênio filtrada no gelo.
      NOTA: Evite preparar a solução fibrinogênio com muito tempo de antecedência, caso contrário, o fibrinogênio pode coagular espontaneamente.
   3. Descongele a trombina e faça uma solução de trombina (a uma concentração de 10 U/mL) em meio de cultura celular e coloque no gelo. Prepare a solução de trombbina 20 μL + células por amostra. Para n=10 amostras, são necessários 200 μL; portanto, prepare a solução de trombina de 250 μL para explicar possíveis erros de pipetação.
2. Coletar e contar as células dos frascos de cultura. Misture as células na razão e quantidade desejadas (1,2 × 10⁶ monócitos e 0,6 × 10⁶ miofibroblasts por andaime). Certifique-se de que há células suficientes para amostras n+1 para corrigir erros de pipetação. Centrifugar a 350 × g por 10 min na RT. Remova o supernatante.
3. Faça uma mistura das células suspensas e trombina.
   1. Para cada amostra, utilize 20 μL da solução de trombina. Para n=10 amostras, adicione 200 trombina μL à pelota celular e misture. Meça o volume da suspensão celular (células + trombina), e calcule como dividir uniformemente todos os 10 andaimes (por exemplo, se a suspensão da trombina + célula tiver um volume de 260 μL, cada amostra eletrospun receberá 260 amostras de μL/10 = 26 μL de trombbina + suspensão celular).
   2. Como a semeadura dos andaimes é realizada em duas etapas, prepare dois tubos de microfuça de 1,5 mL que conterão metade da suspensão celular para cada andaime (no cálculo do exemplo da etapa anterior: prepare dois tubos com 13 μL de trombina + suspensão celular). Coloque no gelo.
      NOTA: As etapas a seguir, especialmente a etapa 4.4, são realizadas idealmente por dois experimentadores.
4. Seque os andaimes eletroscarados pré-molhados com vácuo para preparar a semeadura celular.
   1. Conecte uma tubulação pasteur de vidro ao sistema de vácuo do gabinete de fluxo laminar e coloque em um tubo vazio de 50 mL para armazenamento temporário estéril.
   2. Pegue as câmaras de cultura de fluxo da incubadora, remova o plugue Luer masculino da saída de fluxo e remova o meio depois de abrir a tampa branca de Luer e coloque um tecido de papel encharcado de etanol na frente da saída de fluxo.
   3. Tire o compartimento superior e o tubo de vidro, e coloque em uma placa de Petri estéril para armazenamento temporário.
   4. Coloque o tubo pasteur de vácuo no andaime eletrospun e remova o máximo possível de meios.
      ATENÇÃO: A vácuo seque o andaime eletrospune muito suavemente. Em vez de um movimento linear de ida e volta sobre o andaime, coloque o tubo de vácuo em vários locais. Fixar a tubulação de vácuo em cima da tubulação do Pasteur entre os dedos para melhor controle.
   5. Misture a solução fibrinogênio em uma relação 1:1 com a suspensão da trombina + celular (por exemplo, misture 13 μL de fibrinogênio com 13 μL de trombina + suspensão celular). Para garantir que a fibrina polimerize no andaime e não no tubo de microfuge, encobre o fibrinogênio, gire a roda pipeta para o "volume extra" da suspensão da célula thrombin + e encobre uma vez no tubo de microfuge com suspensão celular para misturar.
   6. Gotear diretamente a solução sobre toda a extensão do andaime eletrospun. É aconselhável que o Experimentador A goteja a mistura de fibrina, enquanto o experimentador B segura o compartimento inferior com o andaime eletrospun montado no conduíte de pressão.
   7. Depois que a fibrina com as células é pingada sobre o andaime eletrospun, o Experimentador B move lentamente o andaime, da esquerda para a direita e para cima e para baixo, para dividir ainda mais as células uniformemente sobre o andaime.
   8. Repita o passo 4.4.5 - 4.4.7 do outro lado do andaime eletrospun.
   9. Monte a câmara de cultura de fluxo novamente colocando cuidadosamente o tubo de vidro (evite a aderência de fibrina e coagulação para o lado interno do tubo de vidro) e empurre para trás o compartimento superior da câmara de cultura de fluxo. Coloque diretamente a construção semeada sem qualquer solução salina tamponada de fosfato ou meio (PBS) na câmara de cultura de fluxo na incubadora.
   10. Repetição de passos 4.4.1-4.4.9 para todas as amostras dinâmicas. Para as amostras estáticas montadas em conduítes de pressão sem furos, a semente de acordo com as etapas 4.4.1-4.4.8, e coloque em um tubo de 15 mL depois.
   11. Deixe a fibrina polimerizar por 60 minutos na incubadora.

[O protocolo pode ser pausado aqui por 30-60 min.]

5. Após a polimerização, preencha as câmaras de cultura de fluxo (amostras dinâmicas) ou os tubos de 15 mL (amostras estáticas) com médio.

5. Acoplamento dos sistemas bioreatores e da bomba de fluxo antes de iniciar o experimento

NOTA: Execute as etapas 5.1-5.3 em um gabinete de fluxo laminar.

1. Leve a bandeja que carrega as câmaras de cultura de fluxo e as unidades fluidas com reservatórios médios preenchidos e tubos médios conectados dentro dos armários de fluxo laminar.
2. Posicione as câmaras de cultura de fluxo na base bioreatorial para os grupos experimentais carregados com estiramento cíclico e com cargas hemodinâmicas combinadas(Figura 1E).
   1. Incline a câmara de cultura de fluxo de cabeça para baixo, e encha o conduíte de pressão de baixo com água ultrapura usando uma seringa com tubos finos (este pode ser de qualquer tipo, desde que seja flexível e fino, neste experimento, um fio interno de 10 cm de comprimento e 0,15 mm de diâmetro interno foi anexado à agulha).
   2. Coloque a tubulação fina dentro do conduíte de pressão, e enquanto o conduíte de pressão estiver cheio de água ultrauso, empurrando gradualmente a água para fora da seringa, puxe o fio para fora do conduíte de pressão simultaneamente, para garantir que não haja bolhas de ar dentro do conduíte de pressão.
   3. Coloque a câmara de cultura de fluxo em um dos oito fios de parafuso na base bioreatorial. Coloque um anel O de silicone entre a base do bioreator e o conector Luer branco para evitar possíveis vazamentos e aperte o conector Luer branco do compartimento inferior.
   4. Repita as etapas 5.2.2 e 5.2.3 para todas as amostras ciclicamente esticadas.
3. Conecte as câmaras de cultura de fluxo para todos os grupos experimentais, exceto o controle estático, ao sistema de bomba de fluxo.
   1. Coloque um clipe de mangueira na tubulação média. Remova a tampa branca de Luer cobrindo a entrada de fluxo do compartimento superior da câmara de cultura de fluxo. Remova o acoplador Luer feminino da tubulação média e conecte a tubulação média de um lado com a entrada de fluxo no compartimento superior, e o outro lado da tubulação média com saída de fluxo no compartimento inferior.
   2. Repita o passo 5.3.1 para todas as câmaras de cultura de fluxo. Neste ponto, o bioreator e as câmaras de cultura de fluxo estão preenchidos com médio e conectado aos sistemas de fluxo.
   3. Para as amostras de controle estático, coloque as amostras verticalmente em um frasco de cultura celular com tampa de filtro usando o grampo da tesoura. Encha o frasco de cultura celular com meio e coloque na incubadora.
4. Transfira a configuração completa do gabinete de fluxo laminar para a incubadora e conecte as unidades fluidas ao tubo de pressão de ar e ao cabo elétrico.
5. Inicie o software e inicie as bombas de fluxo. Inicie o fluxo médio para as amostras um a um.
   1. Verifique se as válvulas da unidade fluidica estão clicando.
   2. Remova o grampo da mangueira da tubulação média.
   3. Inicie a bomba de fluxo com 100 mbar e 10 s de tempo de comutação.
   4. Verifique cuidadosamente a direção de fluxo para possíveis vazamentos ou bolhas de ar. Qualquer bolha de ar aprisionada pode ser removida virando a câmara de cultura de fluxo de cabeça para baixo.
      NOTA: Certifique-se de que os níveis médios nos reservatórios médios estejam equilibrados, para evitar a sucção do ar no sistema e bolhas de ar nas câmaras de cultura de fluxo, e para não permitir que os reservatórios sequem(Figura 2C).
   5. Repita o passo 5.5 para todas as unidades fluidas um a um.
6. Inicialize a bomba de tensão.
   1. Conecte a bomba pneumática acionada através da entrada de ar no cilindro pneumático ao ar comprimido. Conecte a saída de ar inferior com a tubulação azul para saída de ar(Figura 1F).
   2. Abra o software LabVIEW, execute o script LabVIEW e o sistema de aplicação de pressão de ar comprimido, conforme descrito por Van Kelle et al.⁶⁸, digite deslocamento e frequência (comece com baixa frequência de 0,2 Hz). Pare a bomba quando o fole de Teflon estiver no seu nível mais baixo.
   3. Coloque o sensor de pressão na entrada do sensor de pressão no reservatório hidráulico.
7. Altere as configurações da bomba para as configurações desejadas (para 1,5 Pa, use 150 mbar, 10 s tempo de comutação).
8. Inicie a bomba de tensão e aplique a configuração preferida (por exemplo, 0,5 Hz, 1,05 de estiramento).

6. Executar experimento por vários dias; Monitoramento de tesoura e alongamento durante a cultura e substituição média

1. Calcule o WSS na parede do andaime.
   1. Registo a magnitude do fluxo a cada dois dias (consulte o manual do fabricante da bomba de fluxo para obter detalhes). Em suma, observe a variação dos níveis líquidos (em mL) nos reservatórios médios entre a comutação do reservatório da unidade fluida para 10 s. Realizar pelo menos cinco medições, calcular o valor médio e multiplicar por 6 para obter a taxa de fluxo Q em mL/min.
   2. O fluxo é descrito por um fluxo poiseuille através de um canal anular. Assumindo o meio cultural como um fluido newtoniano, calcule o WSS na parede do andaime, r₁, pela Equação 1.
      (1)
      onde o WSS τ_w na parede do andaime (r₁; aqui r₁ = 1,7 mm), resultante de um fluxo de estado constante, é determinado pela pressão aplicada p e pelo raio interno do tubo de vidro r₂ (aqui r₂ = 2,3 mm). O gradiente de pressão na direção axial é considerado uniforme entre a entrada de fluxo e a saída de fluxo e é dado pela Equação 2 (Figura 1J).
      (2)
      com μ a viscosidade dinâmica (aqui a viscosidade média foi assumida constante, μ = 0,7 × 10^-3 Pa∙s a 37 °C) e Q a taxa de fluxo aplicada.
2. Monitore o trecho aplicado nos andaimes a cada dois dias.
   1. Coloque um fundo escuro atrás da câmara de cultura de fluxo para aumentar o contraste entre o andaime e o fundo. Posicione as lâmpadas led, apontando para o andaime, para ajudar na visualização do andaime.
   2. Tire fotos de lapso de tempo do andaime em uma frequência de 30 Hz para 6 s (ou seja, 3 ciclos de estiramento) com uma câmera de alta velocidade.
      NOTA: Uma menor frequência de gravação pode ser suficiente se a câmera permitir. No entanto, a frequência minimamente necessária não foi determinada.
   3. Determine manualmente o diâmetro mínimo e máximo do andaime das imagens.
   4. Calcule o diâmetro externo mínimo e máximo do andaime eletrospun para calcular os trechos máximos de acordo com a Equação 3.
      (3)
      onde o estiramento circunferencial (λ_φ) é dado pela razão entre o diâmetro externo do andaime, d₁, e seu diâmetro inicial, d₀.
3. Corrija para evaporação média e atualize o meio três vezes por semana.
   1. Pare e desvinpe os cabos dos sistemas de fluxo e da bomba de tensão.
   2. Coloque os clipes da mangueira na tubulação média.
   3. Determine quanto médio evaporado com base nas marcas de indicadores de volume nos reservatórios médios.
   4. Transfira a bandeja com o bioreator e as unidades fluidas para o gabinete de fluxo laminar.
   5. Remover os filtros de ar de borracha dos reservatórios médios; adicionar água ultrapura autoclavada para compensar o volume evaporado de meio. Feche os reservatórios médios novamente e conecte-se novamente à bomba para misturar o meio com a água ultrauso.
   6. Repetição de passos 6.3.1-6.3.5. Remova os filtros de ar de borracha novamente, retire 25 mL de meio de cultura e gire a 300 × g por 5 min no RT.
      1. Colete 1,5 mL de supernascimento e armazene a -30 °C para análise de perfis secretos (para análise com ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA)).
      2. Colete o volume desejado de supernasce para estudos de sinalização paracrina, utilizando o supernascido como meio^{condicionado 43}.
   7. Adicione 25 mL de médio fresco aos reservatórios médios.
   8. Coloque os filtros de ar de borracha de volta nos reservatórios médios.
   9. Coloque a configuração completa de volta na incubadora; conectar todos os cabos e tubos de ar à bomba e à bomba de tensão. Solte os clipes da mangueira e repita as etapas 5.4-5.8.
4. Verifique se as contas de secagem de sílica nas garrafas de secagem conectadas à bomba estão úmidas (aparência branca) e substitua por contas de sílica seca, se necessário (aparência laranja).

7. Experimento final, coleta de amostras e limpeza e armazenamento de equipamentos

1. No último dia do experimento, corrija para evaporação média conforme descrito nas etapas 6.3.1-6.3.5, e colher as amostras um por um.
   1. Para colher as amostras um por um, a bomba de fluxo e a bomba de tensão precisam ser pausadas várias vezes. Coloque um clipe de mangueira em tubos médios. Pare temporariamente a bomba de fluxo e a bomba de tensão. Desconectar uma câmara de cultura de fluxo da base bioreatorial; substituir por uma tampa luer branca na base bioreatorial. Leve a câmara de cultura de fluxo e a unidade fluida para o armário de fluxo laminar. Inicie a bomba de fluxo e a bomba de tensão novamente para aplicar a carga hemodinâmica nas outras amostras até a colheita.
   2. Recolher meio dos reservatórios médios para análise de produção de citocinas paracrinas via ELISA.
2. Unidades de fluxo de decouple e construção tubular de colheita. Seção de acordo com o esquema de corte desejado. As partes da construção podem ser armazenadas a 4 °C (após fixação de 15 min em formaldeído de 3,7% e 3 x 5 min de lavagem em PBS) ou -30 °C (após o congelamento de snap em nitrogênio líquido) até uma análise mais aprofundada.
3. Limpe os componentes do bioreator e da bomba. Além disso, o método de limpeza aconselhado por item é mencionado na Tabela de Materiais.
   1. Limpe os filtros de ar de borracha com 70% de etanol. Tenha muito cuidado para não umedecer o filtro interno!
   2. Colete todos os componentes separados: tubos médios, reservatórios médios, tubos de vidro, plugues Luer masculinos e fechaduras Luer femininas, tampas luer brancas, conduítes de pressão, cones de nariz, anéis O de silicone, buchas adaptadores, alisadores de fluxo (excluindo bombas, unidades fluidas, filtros de ar de borracha, base bioreator) e enxágüe em água da torneira corrente.
   3. Coloque O/N em 0,1% de dodecylsulfato de sódio em água desionizada.
      NOTA: Não use água ultrauso, pois as peças podem enferrujar.
   4. Enxágüe com água da torneira e sabão de lavagem de louça.
   5. Imersão em água desionizada, seguida de 70% de etanol duas vezes, seguida por água deionizada.
   6. Coloque todos os materiais separadamente em tecidos de papel e deixe-os secar. Use ar pressionado para secar tubos.
   7. Limpe todos os materiais não autoclaváveis com um tecido de papel embebido em 70% de etanol. Isso inclui o filtro de ar de borracha (tenha em mente que o filtro de ar deve permanecer seco) e a base bioreatorial (teflon bellow e cilindro pneumático).
   8. Autoclave os componentes da câmara fluida (incluindo o anel O de silicone), o tubo médio, os reservatórios médios (sem o filtro de ar de borracha), os plugues Luer masculinos e os acoaladores Luer femininos, tampas brancas luer, clipes de mangueira e equipamentos padrão (por exemplo, pinças, tesouras de fixação)
   9. Para uso conveniente durante os próximos experimentos, combine os componentes separados para uma câmara fluida completa em uma caixa autoclavável.
4. Remova a água do reservatório hidráulico. Limpo com 70% de etanol, seguido de água deionizada. Deixe secar. Refilia com água desinionizada e algumas gotas de desinfetante que preserva o banho de água.
5. Armazene os tubos de vidro para a câmara de cultura de fluxo em 70% de etanol.
6. Coloque as contas úmidas de secagem de sílica (aparência branca) no forno O/N a 120 °C para deixá-las secar (aparência laranja) e armazene em um frasco de ar apertado.

Representative Results

Este bioreator foi desenvolvido para estudar os efeitos individuais e combinados do estresse da cisalhamento e do estiramento cíclico no crescimento do tecido vascular e remodelação em andaimes biomateriais 3D. O desenho do bioreator permite a cultivo de até oito construções vasculares sob várias condições de carregamento(Figura 1A). As construções vasculares são posicionadas em uma câmara de cultura de fluxo (Figura 1B) na qual tanto o trecho circunferencial quanto o WSS podem ser controlados independentemente. O compartimento superior da câmara de cultura de fluxo contém um alisador de fluxo para estabilizar o fluxo em um comprimento de assentamento relativamente curto(Figura 1C). Diretamente rio abaixo do alisador de fluxo, o cone do nariz distribui o fluxo uniformemente através do canal anular(Figura 1D). Quando todas as etapas do protocolo são executadas da maneira correta, os andaimes vasculares na câmara de cultura de fluxo podem ser submetidos a um fluxo unidirecional contínuo através do canal anular entre o andaime e a parede de vidro e são circunferencialmente esticados pela bomba pneumática(Figura 1E-F). Antes do andaime ser montado, o tubo eletrospun deve ser cortado em tubos de 25 mm(Figura 1G) e pode ser examinado com SEM para analisar a microarquitetura(Figura 1H-I). É importante notar que os enxertos PCL-BU neste exemplo podem ser substituídos por qualquer outro enxerto de tecido elastomérico (origem natural ou sintética, microarquitetura ou porosidade diferente). O design de dentro para fora permite testes de enxertos altamente porosos, pois não precisa necessariamente ser livre de vazamentos. A imagem esquemática da câmara de cultura de fluxo mostra a interpretação física dos parâmetros utilizados nas equações para descrever o WSS (equação 1), o gradiente de pressão (equação 2) e o trecho circunferencial (equação 3)(Figura 1J).

A execução incorreta das etapas críticas do protocolo pode resultar em alguns cenários. Por exemplo, o vazamento do reservatório hidráulico pode ocorrer como resultado de nós montados incorretamente, levando ao vazamento de fluido hidráulico dos conduítes de pressão com furos passando pelo tubo de silicone e entrando na câmara de cultura de fluxo(Figura 2A). O vazamento do fluido hidráulico na conexão entre os fios do parafuso e a base bioreatorial também pode ocorrer quando o anel de silicone não está bem colocado ou se o fole de Teflon não foi permitido expandir ligeiramente O/N um dia antes do experimento(Figura 2B). Além disso, quando o médio não é desgaseado, ou se os níveis médios nos reservatórios médios não estão bem equilibrados e um reservatório médio secar, resultando em ar sendo sugado para dentro do sistema, bolhas de ar podem surgir na câmara de cultura de fluxo (Figura 2C), o que perturba os patters WSS, comprometendo a viabilidade celular e o crescimento subsequente do tecido. Por fim, quando o anel O de silicone no compartimento inferior não estiver corretamente colocado, o derramamento médio pode ser observado abaixo da câmara de cultura de fluxo(Figura 2D).

Como esta configuração bioreatorial permite a aplicação de cargas hemodinâmicas individuais e combinadas, vários grupos experimentais carregados hemodinamicamente podem ser incluídos em um experimento(Figura 3A). Anteriormente, diferentes cargas hemodinâmicas (ou seja, dois regimes de estresse de tesoura e dois regimes de estiramento) foram validadas aplicando várias configurações possíveis do sistema(Figura 3B). Quando o alongamento(Figura 3C) e WSS(Figura 3D) foram monitorados durante períodos de cultura de longo prazo, foi validado que estes podem ser mantidos em níveis relativamente constantes durante um período de até 20 dias.

O bioreator é especialmente adequado para estudar a influência do carregamento hemodinâmico no crescimento e remodelação em um contexto in situ vascular TE. Os estágios do in situ TE são hipóteses para espelhar os estágios da resposta natural de cicatrização da ferida(Figura 4A). As co-culturas de macrófagos derivados de monócitos e miofibroblasts derivados de veias safenas humanas, como descrito aqui, foram estabelecidas como uma imitação in vitro da fase proliferativa. Três dias após a semeadura, a coloração da imunofluorescência mostrou uma distribuição homogênea de ambos os tipos de células ao longo do andaime (Figura 4B). Após 20 dias de cocultura, o trecho cíclico sozinho resultou na deposição de fibras mais numerosas e espessas do colágeno I, enquanto no grupo com cargas hemodinâmicas combinadas, esse efeito do estiramento cíclico foi anulado pelo estresse da tesoura, resultando em deposição de colágeno menos pronunciada I, ilustrada aqui pela mancha de imunofluorescência(Figura 4C). Para o sucesso na regeneração do tecido situ, é necessário um equilíbrio apertado entre a produção de tecidos e a resorção do andaime. Além da formação tecidual, o bioreator permite a indução da resorção do andaime orientado por células. Por exemplo, ao cultivar uma monocultura de macrófagos por 8 dias nos enxertos eletrospun, a erosão da fibra e o decote de fibras foram observados em todos os regimes de carregamento hemodinâmico, com a resorção mais pronunciada no grupo estático e a resorção menos pronunciada no grupo de estresse cisalhamento(Figura 4D). Juntos, esses resultados mostram o impacto dos diferentes regimes hemodinâmicos de carregamento no crescimento e na remodelação. Esses insights são úteis na otimização dos parâmetros de design para TEVGs in situ in situ.

Outro determinante importante do processo de regeneração tecidual é a presença de citocinas pró e anti-inflamatórias. Como o bioreator é um sistema de loop fechado, as células do sistema serão continuamente expostas aos estímulos paracrinos de fatores secretados. Os perfis de secreção de citocinas no meio das co-culturas dinamicamente carregadas de macrófagos mononucleares de sangue periféricos (PBMC) e miofibroblasts humanos de veias safenas foram analisados em estágios iniciais e posteriores(Figura 5A). Esses resultados representativos ilustram o impacto tanto do estiramento cíclico quanto do estresse de cisalhamento no perfil de secreção de citocinas na configuração da cocultura. Curiosamente, os efeitos combinados de ambas as cargas mostraram tanto o domínio de uma das duas cargas (por exemplo, estiramento cíclico para interleucina-6 (IL-6) e proteína monoquímica 2moattractant protein-1 (MCP-1)) ou efeitos sinérgicos de ambas as cargas (por exemplo, para IL-10)(Figura 5B). Esses insights, reunidos usando esta plataforma de testes in vitro, fornecem informações valiosas para o desenvolvimento de TEVGs in situ que são baseados na lógica da regeneração tecidual in situ orientada pelo macrófago.

Experimentos de co-cultura de macrófagos e miofibroblast mostraram que o ambiente mecânico e os ambientes inflamatórios dependentes de carga resultantes modularam o fenótipo dos miofibroblasts. Após 20 dias de carregamento hemodinâmico, a expressão genética dos marcadores miofibroblast mostrou diferenças claras no impacto individual e combinado do carregamento e na sinalização direta e paracrina de macrófagos em miofibroblasts(Figura 6A). Além disso, os padrões de expressão genética do marcador títil alfa agiram musculares suaves correlacionados com a síntese proteica(Figura 6B). Além disso, o estiramento cíclico estimulou a expressão genética de colágeno e a matrânea elástica e a matriz atenuada metaloproteinase 1/matriz inibidora de tecido metaloproteinase 1 remodelação de colágeno mediado, enquanto um efeito estabilizador do estresse da tesoura foi observado na cocultura (Figura 6C). Esses experimentos de cocultura de longo prazo mostram a possibilidade de estudar a fase posterior de remodelação de tecidos(Figura 4A)em vários regimes de carregamento hemodinâmico em enxertos vasculares projetados por tecidos com este bioreator. Como o TEVG é montado "de dentro para fora" em um tubo de silicone, o trecho circular e o WSS podem ser aplicados por períodos de cultura mais longos.

Figura 1: Desenho e visão geral do bioreator. (A) Desenho de construção da base bioreatorial e (B) visão explodida da câmara de cultura fluida com todas as partes indicadas (etapas 2.4-2.8). O compartimento superior da câmara de cultura de fluxo contém um alisador de fluxo. (C) O cone de nariz esfericamente entupido é posicionado após o alisador de fluxo para distribuir o fluxo através do canal anular (direção de fluxo indicada em rosa). (D) Juntos, esses componentes controlam e orientam a direcionalidade do fluxo. Consulte a Tabela 1 para obter uma descrição funcional das partes mencionadas individualmente. (E) Fotografia de configuração bioreatorial completa (etapa 5.2) e (F) uma visão de perto das câmaras de cultura de fluxo e do cilindro pneumático (passo 5.6.1). (G) Aparência bruta do andaime PCL-BU eletrospun antes da semeadura (tique-1 mm). Escaneando imagens microscópicas eletrônicas do andaime pcl-BU eletrospun tubular com diâmetro interno de 3 mm e 5 μm de diâmetro médio de fibra em diferentes ampliações, barras de escala(H)100 μm e (I)10 μm (passo 1.3). (J) Imagem esquemática da câmara de cultura constituída por um andaime eletrospun tubular, com raio externo (r₁) centrado em um tubo de vidro de raio interno(r₂). As entradas e tomadas de fluxo(Q)estão conectadas ao anel anular, com altura do canal h para aplicação de estresse de cisalhamento de parede(t). A entrada de pressão/estiramento(P) é conectada ao andaime montado em silicone para a aplicação de um estiramento circunferencial(λ(t))aos andaimes eletroscarados montados do interior (etapa 6.1). Abreviaturas: policaprolactona bisurea (PCL-BU). Os painéis C, D e G-J foram adaptados de Van Haaften et al.¹⁹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Peças bioreatores	Descrição funcional
Aplicação de estiramento
Cilindro pneumático	Aciona Teflon abaixo.
Foles de Teflon	Carrega o reservatório hidráulico.
Reservatório hidráulico	Pode ser conectado com até 8 câmaras de cultura de fluxo, é preenchido com água demi, aplica pressão aos construtos montados em silicone.
Rosca	Conexão entre a câmara de cultura de fluxo e o reservatório hidráulico. A entrada de pressão para as construções montadas em silicone.
Conector luer branco	Usado para aparafusar a câmara de cultura de fluxo apertado a um dos oito fios de parafuso na base hidráulica do reservatório/bioreator.
Conduíte de pressão com pequenos orifícios	Diretamente conectado com água em reservatório hidráulico. Quando o reservatório hidráulico é pressurizado, os conduítes de pressão preenchem o espaço entre o tubo de silicone (que é montado no conduíte de pressão) com água, empurrando o tubo de silicone para fora, resultando em um estiramento circunferencial no enxerto montado em silicone por dentro.
Tubo de silicone	Para montar o enxerto eletrospun no conduíte de pressão. A tubulação de silicone é circunferencialmente esticada por dentro.
Aplicativo de fluxo
Sistema de bomba de fluxo	Usado para controlar o fluxo nas câmaras de cultura de fluxo. (em nosso exemplo: um sistema de bomba ibidi é usado.)
Compartimento superior e inferior com entrada de fluxo e saída	Conecta a câmara de cultura de fluxo ao loop de fluxo.
Tubo de vidro	Contém o andaime pressurizado no centro e permite a perfusão dos andaimes.
Alisador de fluxo	Estabiliza o fluxo em um comprimento relativamente curto de assentamento.
Nariz	Distribui o fluxo uniformemente.
Bucha adaptador	Conserta o tubo de vidro.
Anel O de silicone	Evita o vazamento de meio.

Tabela 1: Descrição funcional das principais características do bioreator corresponde com as partes indicadas na Figura 1A-D.

Figura 2: Resultados da execução imprecisa das etapas críticas do protocolo. Fotografias de algumas ocorrências que podem ser observadas na configuração do bioreator quando etapas críticas não são realizadas da maneira correta. (A) Se o nó não estiver apertado o suficiente ou não exatamente colocado na ranhura gravada (indicada por seta), pode ocorrer um leve vazamento de fluido hidráulico na câmara de cultura de fluxo(etapa 2.5). (B) Se o folado de Teflon não foi permitido expandir O/N um dia antes do experimento ou quando o anel de silicone não estiver bem colocado, pode ocorrer vazamento líquido hidráulico do líquido hidráulico na conexão entre os fios do parafuso e a base bioreatorial (indicado por seta) (passo 1.4 e 5.2.3). (C) Bolhas de ar na câmara de cultura de fluxo (indicadas por seta) resultarão em padrões de estresse de cisalhamento perturbados. Desgas sempre o meio cultura e certifique-se de que os níveis médios nos reservatórios médios sejam equilibrados para evitar que um reservatório fique seco e o ar seja sugado para o sistema de câmara de fluxo (etapas 1.2 e 5.5.4). (D) Quando o anel de silicone no compartimento inferior não estiver bem colocado, pode ser observado derramamento do meio (indicado por seta) (etapa 2.4.2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Controle do estresse da tesoura e do estiramento. Como o bioreator permite a aplicação independente e combinada de esticamento e corte, (A) vários grupos experimentais podem ser incluídos em um experimento. (B) Exemplos de variações nos trechos máximos e tensões de cisalhamento em um determinado ponto de tempo testado em quatro configurações distintas do sistema (indicados pelas cores). Retângulos pretos representam ± desvio padrão das medidas para cada configuração. As linhas pontilhadas são computadas como a média dos trechos(linha horizontal)e as tensões da tesoura(linha vertical)para indicar as quatro condições distintas de carregamento. (C) Trechos circunferenciais cíclicos no trecho cíclico e grupos combinados ao longo do experimento de 20 dias, com base em medições de diâmetro externo dos construtos do andaime monitorado com um lapso de tempo de câmera de alta velocidade (passo 6.2). (D) Tensões de tesoura de parede monitoradas no estresse da tesoura e grupos combinados ao longo do experimento, com base na mudança dos níveis médios na seringa (passo 6.1). Os painéis A, C e D foram adaptados de Van Haaften e Wissing et al.⁴⁴; painel B foi adaptado de Van Haaften et al.¹⁹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Conceito de engenharia de tecido vascular in situ, distribuição celular, produção de tecidos e degradação de andaimes. (A) Uma ilustração esquemática que retrata as fases hipotéticas da regeneração tecidual orientada por andaimes no local funcional do hospedeiro. Os resultados apresentados são derivados de experimentos que se concentraram na fase proliferativa, na qual macrófagos e células produtoras de tecidos colonizaram o material do andaime. (B) Myofibroblasts de veia safena humana(vermelho) e distribuição de macrófago derivado do PBMC(verde)no lado externo do andaime eletrospun(cinza) no dia 3. Barra de escala 200 μm. (C) Seção transversal da cocultura construída no dia 20 manchada para colágeno tipo I(verde),colágeno tipo III(vermelho)e DAPI(branco). Barra de escala 100 μm, *indica lado externo da construção, correspondente ao lado de fluxo. (D) Imagens SEM de enxertos descelularizados de 8 dias monocultura macrófago mostrando degradação do macrófago; barra de escala 20 μm. Abreviaturas: células venosas símulas humanas (HVSC); célula mononuclear de sangue periférico (PBMC); 4′,6-diamidino-2-fenilômado (DAPI); microscopia eletrônica de varredura (SEM). O Painel A foi adaptado de Wissing e Bonito et al.²⁷; os painéis B e C foram adaptados de Van Haaften e Wissing et al.⁴⁴; e o painel D foi adaptado de Wissing et al.⁴³. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Ambiente inflamatório em construções de cocultura hemodinamicamente carregadas em 3 dias e 20 dias. Co-cultura de macrófagos derivados do PBMC humano e miofibroblasts humanos de veias safenas. (A) Mapa térmico da secreção total de citocinas medida em sobrenaante via multiplex ELISA. (B) Boxplots para uma seleção de citocinas no dia 20, normalizada para total de conteúdo de DNA. Os valores P foram calculados utilizando-se o teste de Kruskal-Wallis com um teste de comparação múltipla de Dunn; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** Abreviaturas: inibidor de tecido de metaloproteinase (TIMP), metaloproteinase matricial (MMP), interleucina (IL), proteína quimioattractante monocito 1 (MCP-1), fator de crescimento transformador beta 1 (TGF-β1), fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), estática (ST), estiramento cíclico (CS), estresse de cisalhamento (SS). Os painéis A e B foram adaptados de Van Haaften e Wissing et al.⁴⁴. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Alterações no fenótipo de miofibroblast e marcadores de crescimento matricial e remodelação em resposta ao carregamento hemodinâmico nas construções vasculares no dia 20. (A) Expressão genética relativa de marcadores fenotípicos específicos do miofibroblast. (B) Seções transversais manchadas para αSMA(verde) e DAPI(azul),barra de escala 100 μm. (C) Expressão relativa de genes relacionados à matriz colágena, matriz elástica, proteoglycans e remodelação de genes. Os valores P foram calculados utilizando-se o teste de Kruskal-Wallis com um teste de comparação múltipla de Dunn; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Abreviaturas: Proteína de ligação de cálcio S100 A4 (S100A4), actina muscular alfa-lisa (αSMA ou ACTA2), calponina 1 (CNN1), talalina (SMTN), vimentina (VIM), colágeno I (COL1A1), elastina (ELN), versicano (VCAN), metaloproteinase matricial (MMP), inibidor de tecido de metaloproteinase (TIMP), estática (ST), estiramento cíclico (CS), estresse de cisalhamento (SS), 4′,6-diamidino-2-fenilídeole (DAPI). # medido em ou abaixo do limite de detecção. Os painéis A, B e C foram adaptados de Van Haaften e Wissing et al.⁴⁴. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar S1: Expressão proteica miofibroblast e monoculturas macrófagos submetidos a cargas hemodinâmicas individuais e combinadas. (A) As imagens confocalas representativas dos mofibroblasts, cultivadas por 10 dias com fibras de actina(verde),núcleos(vermelho),e andaimes(azul),mostram uma clara orientação de fibra de actina nas amostras carregadas, quando comparadas às amostras estáticas nas quais não se pode observar nenhuma direção preferencial de fibra actina. Barra de escala 50 μm. (B) Imagens confocal da mesma monocultura de miofibroblastis manchadas para colágeno(verde) e núcleos/andaimes(branco). Barra de escala 50 μm. (C) Boxplots de perfis de secreção de proteínas de macrófagos derivados de THP1 estaticamente e dinamicamente cultivados por 8 dias, com razões calculadas de M1/M2 com base nos níveis de secreção de citocinas de IL-6, TNF-α, MCP-1 (pro-inflamatório) e IL-10, IL-13, MMP-9 (anti-inflamatório). O ponto no gráfico MCP-1 representa um outlier estatístico. (D) Dados ELISA dos níveis relativos de secreção de proteínas de macrófagos estaticamente e dinamicamente cultivados no dia 8 em comparação com a secreção média de proteínas pró-inflamatórias, anti-inflamatórias, de crescimento e remodelagem (os níveis de proteína foram corrigidos para o teor médio de DNA por grupo). Os pontos e áreas sombreadas indicam, respectivamente, os percentis 50 e²⁵a 75. Abreviaturas: proteína quimioattractant monocito 1 (MCP-1), interleucina (IL), fator de crescimento transformador beta (TGF-β), metaloproteinase matricial (MMP), crescimento derivado de plaquetas fator (PDGF), fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA).* p < 0,05; ** p < 0,01, *** p < 0,001. Os painéis A e B foram adaptados de Van Haaften et al.¹⁹. Os painéis C e D foram adaptados de Wissing et al.⁴³. Clique aqui para baixar este número.

Discussion

O bioreator descrito aqui permite a avaliação sistemática das contribuições do indivíduo e efeitos combinados do estresse da cisalhamento e do estiramento cíclico na inflamação e regeneração tecidual em andaimes tubulares resorbáveis. Essa abordagem também permite que uma grande variedade de análises sejam realizadas em construções vasculares, conforme exemplificado na seção de resultados representativos. Esses resultados mostram o impacto característico dos diferentes regimes de carregamento hemodinâmico (ou seja, diferentes combinações de tesoura e estiramento) tanto no crescimento quanto na remodelação da construção do TEVG. Esses insights, coletados através desta plataforma in vitro, auxiliam na otimização dos parâmetros de design de andaimes para TEVGs recém-desenvolvidos. Para garantir um fluxo de trabalho experimental adequado, é importante a compreensão das etapas críticas e das limitações deste protocolo.

As etapas mais críticas do protocolo estão relacionadas à aplicação de alongamento às amostras. Para aplicação de estiramento, é essencial que a configuração seja livre de vazamentos. Há dois pontos fracos no sistema: os nós que montam os enxertos eletrospunos aos conduítes de pressão e a conexão entre a base bioreatorial e as câmaras de cultura de fluxo. Como descrito nas etapas 2.5.2 e 2.5.4, múltiplos nós apertados devem ser posicionados exatamente no sulco gravado. Se o nó não estiver apertado o suficiente ou for colocado ligeiramente acima ou abaixo da ranhura, pode ocorrer um leve vazamento de fluido hidráulico na câmara de cultura de fluxo. Este vazamento pode ser detectado como uma queda de pressão no reservatório hidráulico e uma tensão crescente na bomba de tensão para atingir o valor de pressão definido. Além disso, isso leva a um fluxo perturbado na câmara de cultura de fluxo, um risco aumentado de contaminação da cultura celular e uma diluição do meio. Uma vez que isso aconteça, a câmara de cultura de fluxo tem que ser retirada do experimento, e a rosca do parafuso no reservatório hidráulico deve ser fechada com uma tampa luer branca. Esta grande medida de tirar uma amostra completa, necessária para garantir a continuação adequada do experimento para as outras sete câmaras de cultura de fluxo, enfatiza a importância de colocar com precisão nós apertados, exatamente nas ranhuras gravadas. Só assim será assegurada a separação adequada entre a água no reservatório hidráulico e o meio nas câmaras de cultura de vazão. Para melhorar a robustez da montagem dos andaimes, as ranhuras nos conduítes de pressão serão ligeiramente mais profundas em uma versão revisada do bioreator, permitindo uma colocação mais fácil e melhor do nó e, assim, a separação segura do fluido hidráulico do meio.

Outra fonte potencial de vazamento é entre os fios de parafuso da base bioreatorial e os conectores Luer brancos da câmara de cultura de fluxo. Devido ao possível desgaste do material Teflon, um anel O de silicone extra pode ser adicionado para evitar vazamento (etapa 5.2.3). Além disso, o foles teflon da bomba de tensão deve ser permitido expandir ligeiramente O/N um dia antes do experimento (passo 1.4). Se ocorrer vazamento, o fluido hidráulico perdido deve ser compensado adicionando uma pequena quantidade de água ultrapura através de uma das oito roscas de parafuso (use uma seringa com agulha e fio flexível). Coloque a câmara de cultura de fluxo de volta com um pequeno pedaço de parafilm entre a rosca do parafuso e o conector Luer branco no compartimento inferior da câmara de cultura de fluxo. Para superar esse problema de vazamento em experimentos futuros, os fios atuais do parafuso Teflon na base bioreatorial serão substituídos por roscas de aço inoxidável na versão de próxima geração do bioreator para evitar o desgaste do sistema.

A variação no trecho (Figura 3C) é maior do que a variação do WSS(Figura 3D),pois o estiramento é mais difícil de controlar. No entanto, além das medidas para evitar vazamentos, existem outras medidas que limitam a variação do estiramento: (i) evitar bolhas de ar na flauta (etapa 1.4 e 5.2.1), (ii) garantir um pré-alongamento consistente entre as diferentes amostras (etapa 2.5.3) e (iii) garantir propriedades consistentes de andaimes entre diferentes amostras (etapa 1.3).

Por fim, é necessário um cuidado extra ao montar o andaime eletroscoco na tubulação de silicone (etapa 2.3). Especificamente, quando o frágil andaime eletrospun precisa ser puxado sobre a tubulação de silicone esticada, é importante não aplicar muita força para evitar que o enxerto eletrospun seja danificado, especialmente no interior do enxerto eletrospun. Se ocorrer danos no interior do enxerto eletrospun, seja por puxar forte ou por estiramento muito fraco do tubo de silicone, a extensão do dano às fibras eletrospun só se torna visível após a construção ser colhida e analisada. Na configuração atual, o sucesso da semeadura só pode ser confirmado mediante imunofluorescência ou análise imunohistoquímica, após o sacrifício da amostra. No entanto, o procedimento de semeadura com fibrina como portador de células é um método bem estabelecido⁶⁷ que normalmente leva a uma distribuição celular homogênea para andaimes com um tamanho de poros suficientemente grande. Um dos aspectos mais importantes em relação à semeadura celular é garantir que o andaime esteja o mais seco possível antes da semeadura (etapa 4.4), para evitar que o gel de fibrina com as células passe pelo andaime molhado, resultando em semeadura inhomogênea. Finalmente, embora o método de descontaminação do enxerto eletrospun por radiação UV e mergulhando em 30% de etanol não seja tão rigoroso quanto a esterilização de enxertos eletrospun preparados para estudos in vivo, que muitas vezes são esterilizados por óxido de etileno ou irradiação gama, é suficiente para experimentos de cultura in vitro que podem durar até 20 dias sem qualquer sinal de contaminação (por exemplo, ver Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6, e Van Haaften e Wissing (2020)⁴⁴). Além disso, o material PCL-BU que é utilizado aqui, não permite exposição longa a altas concentrações de etanol. O método de esterilização mais adequado pode ser escolhido dependendo do material utilizado.

Além dos resultados de estudos de cocultura previamente realizados, uma variedade mais ampla de estudos pode ser realizada com o mesmo sistema. O sistema foi previamente utilizado para realizar monoculturas dinâmicas de miofibroblasts (Figura Suplementar 1A-B) e macrófagos(Figura Suplementar 1C-D) para investigar os efeitos do carregamento hemodinâmico em tipos de células individuais e sua sinalização paracrina^19,43. Diferentes regimes de carregamento hemodinâmico resultaram em orientação clara da fibra de actina em mofibroblasts (Figura Suplementar 1A) e deposição de colágeno distintamente diferente(Figura Suplementar 1B) após 10 dias. A produção de citocinas por macrófagos derivados de THP1 foi drasticamente diferente entre as diferentes cargas hemodinâmicas(Figura Suplementar 1C) e mostrou um perfil mais pró-inflamatório quando carregado(Figura Suplementar 1D). Outras possibilidades validadas incluem a aplicação de fluxo oscilatório, utilizando uma bomba extra e unidade fluida. A viscosidade do meio pode ser aumentada para a faixa de viscosidade sanguínea (por exemplo, adicionando goma xantana)⁶⁹. A modulação da viscosidade média representa uma variável adicional para ampliar o leque de tensões de tesoura aplicáveis. Por fim, embora o protocolo descrito emprega a configuração de condicionamento de fluxo 'Ibidi', as configurações de outros fabricantes também podem ser usadas, desde que regimes de fluxo semelhantes possam ser aplicados.

Uma das principais vantagens do uso deste sistema bioreator é o construto relativamente grande (aproximadamente 15 mm x 10,5 mm) que pode ser carregado hemodinamicamente, permitindo que uma grande variedade de possíveis parâmetros de leitura sejam extraídos de uma única amostra. Ao mesmo tempo, o tamanho da construção pode ser visto como uma limitação também, uma vez que esta configuração requer uma quantidade relativamente grande de material (às vezes caro), especialmente se as células primárias são usadas, ou se o meio de cultura requer aditivos caros. Além disso, o throughput da configuração é relativamente baixo. Consequentemente, a configuração atual é particularmente adequada para pesquisas baseadas em hipóteses nas quais um número limitado de variáveis é amplamente testada, em vez da triagem de um grande número de variáveis com leitura limitada. Para experimentos futuros, pequenas melhorias na configuração atual estão sendo feitas para permitir a opção de montagem de andaimes menores e redução do tamanho dos reservatórios médios. Com relação a este último, o volume atual dos reservatórios médios é necessário para permitir que as vazões volumosas suficientes atinjam as tensões desejadas. As taxas de vazão necessárias — e com isso, o volume dos reservatórios médios — podem ser reduzidas aumentando a viscosidade do meio (por exemplo, adicionando goma xantana, conforme estabelecido anteriormente⁶⁹).

Para concluir, este bioreator permite a quantificação dos efeitos individuais e combinados do estresse da cisalhamento e do estiramento cíclico no crescimento do tecido e remodelação em uma grande variedade de andaimes biomateriais 3D elastoméricos. O bioreator pode cultivar até oito construções vasculares sob várias condições de carregamento. Devido ao seu design, o bioreator é especialmente adequado para estudar a interação entre hemodinâmica e processos in situ vascular TE.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
advanced Dulbecco’s modified EagleMedium (aDMEM)	Gibco	12491-015	cell culture medium for fibroblasts
Aqua Stabil	Julabo	8940012	prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir
Bovine fibrinogen	Sigma	F8630	to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Bovine thrombin	Sigma	T4648	to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Centrifuge	Eppendorf	5804	to spin down cells and conditioned medium
Clamp scissor - "kelly forceps"	Almedic	P-422	clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)
CO2 cell culture incubators	Sanyo	MCO-170AIC-PE	for cell culturing
Compressed air reservoir	Festo	CRVZS-5	smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up
Custom Matlab script to calculate the maximum stretches	Matlab	R2017. The Mathworks, Natick, MA	calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold
Data acquisition board	National Instruments	BNC-2090	data processing in between amplifier system and computer
Ethanol	VWR	VWRK4096-9005	to keep sterile working conditions
Fetal bovine calf serum (FBS)	Greiner	758087	cell culture medium supplement; serum-supplement
Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)
Glass Pasteur pipet	Assistant	HE40567002	apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)
Glass tubes of the flow culture chamber	Custon made, Equipment & Prototype Center, Eindhoven University of Technology	n.a.	part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)
GlutaMax	Gibco	35050061	cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up
High speed camera	MotionScope	M-5	to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
High speed camera lens - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - lens	Nikon	JAA616AB	to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
Hose clip	ibidi GmbH	10821	block medium flow (autoclave at step 1, step 7)
Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)
Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads	ibidi GmbH	10902	set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.
Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped)	Swann Morton	0301; 0933	to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material
LabVIEW Software	National Instruments	version 2018	to control the stretch applied to the scaffolds
Laminar flow biosafety cabinet with UV light	Labconco	302310001	to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving
Large and small petri dishes	Greiner	664-160	for sterile working conditions
L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C)	Sigma	A8960	cell culture medium supplement, important for collagen production
LED light cold source KL2500	Zeiss	Schott AG	to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch
Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps	ibidi GmbH	various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories)	to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)
Measuring amplifier (PICAS)	PEEKEL instruments B.V.	n.a.	to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView
Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders	ibidi GmbH	10974	medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)
Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter	Rubber BV	1805	to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing
Motion Studio Software	Idtvision	2.15.00	to make the high speed time lapse images for stretch monitoring
Needle (19G)	BD Microlance	301700	together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles
Needle driver	Adson	2429218	to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)
Paper tissues	Kleenex	38044001	for cleaning of the equipment with 70% ethanol
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	quick fix if leakage occurs
Penicillin/streptomycin (P/S)	Lonza	DE17-602E	cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P4417-100TAB	for storage and washing steps (autoclave at step 1)
Plastic containers (60 mL) with red screw caps	Greiner	206202	to prepare the fibrinogen solution
Pneumatic cylinder	Festo	AEVC-20-10-I-P	to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 µm wall thickness, 20 mm length)	SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands	n.a.	produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details
Pressure conduit without holes (for static control)	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)
Pressure sensor and transducer	BD	TC-XX and P 10 EZ	the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure
Proportional air pressure control valve and pressure sensor	Festo	MPPES-3-1/8-2-010, 159596	provides compressed air to the pneumatic actuated pump
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)	Gibco	A1049101	cell culture medium for monocyte/macrophage
Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL)	Eppendorf	30120086	multiple applications (autoclave at step 1)
Sodium dodecyl sulfate solution 20%	Sigma	5030	Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.
Silicone O-rings	Technirub	1250S	to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)
Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness)	Rubber BV	1805	to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)
Sterile tube (15 mL)	Falcon	352095	multiple applications
Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle	Ethicon, Johnson&Johnson	EH7404H	Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)
Syringe (24 mL)	B. Braun Melsungen AG	2057932	to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber
Syringe filter (0.2 µm)	Satorius	17597-K	to filter the fibrinogen solution
T150 cell culture flask with filter cap	Nunc	178983	to degas culture medium
T75 Cell culture flask with filter cap	Nunc	156499	to culture static control samples
Teflon bellow	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Tray (stainless steel)	PolarWare	15-248	for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)
Tweezers	Wironit	4910	sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)
Ultrapure water	Stakpure	Omniapure UV 18200002	to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)
UV light	Philips	TUV 30W/G30 T8	for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding