Insertion co-translationnelle de protéines membranaires dans des nanodisques préformés
Summary
L’insertion co-translationnelle dans des nanodisques préformés permet d’étudier des protéines membranaires synthétisées acellulaires dans des environnements lipidiques définis sans contact avec des détergents. Ce protocole décrit la préparation des composants essentiels du système et les paramètres critiques pour améliorer l’efficacité de l’expression et la qualité de l’échantillon.
Abstract
Les systèmes d’expression acellulaires permettent la conception sur mesure d’environnements de réaction pour soutenir le repliement fonctionnel de protéines même complexes telles que les protéines membranaires. Les procédures expérimentales pour l’insertion et le repliement co-translationnels de protéines membranaires dans des membranes préformées et définies fournies sous forme de nanodisques sont démontrées. Le protocole est totalement exempt de détergent et peut générer des milligrammes d’échantillons purifiés en une journée. Les échantillons de protéines membranaires/nanodisques qui en résultent peuvent être utilisés pour une variété d’études fonctionnelles et d’applications structurelles telles que la cristallisation, la résonance magnétique nucléaire ou la microscopie électronique. La préparation de composants clés de base tels que les lysats acellulaires, les nanodisques avec des membranes conçues, les solutions mères critiques ainsi que l’assemblage de réactions d’expression sans cellules à deux compartiments sont décrites. Étant donné que les exigences de repliement des protéines membranaires peuvent être très diverses, l’un des principaux objectifs de ce protocole est la modulation des paramètres et des étapes de réaction importantes pour la qualité de l’échantillon, tels que les composés réactionnels de base critiques, la composition membranaire des nanodisques, l’environnement redox et chaperon, ou la conception de modèles d’ADN. L’ensemble du processus est démontré avec la synthèse de la protéorhodopsine et d’un récepteur couplé aux protéines G.
Introduction
Les protéines membranaires (MP) sont des cibles difficiles dans les études de production de protéines en raison de leur insolubilité dans des environnements aqueux. Les plates-formes de production MP conventionnelles comprennent des systèmes cellulaires tels que E. coli, la levure ou les cellules eucaryotes. Les MP recombinants synthétisés sont soit extraits des membranes cellulaires, soit repliés à partir des corps d’inclusion1. Après solubilisation du détergent, les MP peuvent être transférés dans des environnements membranaires appropriés par des protocoles de reconstitution in vitro établis. Outre les vésicules et les liposomes, la reconstitution de MP en membranes planes sous forme de nanodisques2 ou de particules de salipro3 est devenue une technique de routine ces derniers temps. Cependant, toutes ces stratégies impliquent un contact détergent avec les MP qui peut entraîner une déstabilisation, une dissociation des oligomères, voire une perte de structure et d’activitéprotéique 4. Le dépistage des conditions optimales de solubilisation et de reconstitution des détergents peut donc être fastidieux et chronophage5.
La nature ouverte des systèmes acellulaires (CF) permet d’alimenter directement la réaction d’expression avec des membranes préformées avec une composition lipidique définie. Dans ce mode d’expression à base de lipides (L-CF), les MP synthétisés ont la possibilité d’insérer en co-traduction dans les bicouchesfournies 6,7 (Figure 1). Les nanodisques constitués d’une protéine d’échafaudage membranaire (MSP) entourant un disque bicouche lipidique planaire8 semblent particulièrement adaptés à cette stratégie 9,10. Les nanodisques peuvent être assemblés in vitro avec une variété de lipides différents, ils sont très stables et les stocks peuvent être concentrés jusqu’à 1 mM. Cependant, l’expression du MSP dans E. coli et sa purification sont nécessaires. Comme stratégie alternative, le MSP peut être co-exprimé avec le MP cible dans les réactions de mucoviscidose fournies avec des liposomes11,12,13. Des modèles d’ADN pour MSP et MP sont ajoutés dans la réaction et MP / nanodisques peuvent se former lors de l’expression. Bien que la production de MSP soit évitée, la stratégie de co-expression nécessite un réglage minutieux des concentrations finales de la matrice d’ADN et on peut s’attendre à des variations plus importantes dans l’efficacité de la production d’échantillons.
L’insertion co-translationnelle de MP dans les membranes de nanodisques préformés est un mécanisme non physiologique et encore largement inconnu indépendant des machines de translocon et des séquences de signaux13,14,15,16. Les principaux déterminants de l’efficacité de l’insertion sont le type de protéine membranaire ainsi que la composition lipidique de la membrane fournie, avec une préférence fréquente pour les lipides chargés négativement15,17. Comme les membranes nanodisques sont relativement confinées en taille, une quantité importante de lipides est libérée lors de l’insertionde MP 18. La variation de la taille des nanodisques permet l’insertion et l’ajustement de complexes MP oligomères supérieurs15,18. Entre autres, l’assemblage correct de complexes homooligomères a été montré pour le canal ionique KcsA, pour la pompe ionique protéorhodopsine (PR) et pour le transporteur multidrogue EmrE15,18. Les MP sont susceptibles de pénétrer dans la membrane nanodisque symétrique des deux côtés à une fréquence relativement égale. Il faut donc considérer que différents monomères ou oligomères insérés dans un nanodisque peuvent avoir des orientations opposées. Cependant, un biais d’orientation pourrait être causé par des mécanismes d’insertion coopératifs tels que rapportés pour la formation d’hexamères PR et de tétramères KcsA18. Un autre biais dans l’orientation des MP pourrait résulter des commutateurs d’orientation des MP insérés probablement au bord des membranes nanodisques.
La production de lysats de mucoviscidose à partir de souches d’E. coli est une technique de routine fiable et peut être effectuée dans presque tous les laboratoires biochimiques19,20. Il faut considérer qu’en plus de la formation du pont disulfure, la plupart des autres modifications post-traductionnelles sont absentes si un MP est synthétisé à l’aide de lysats E. coli. Bien que cela puisse générer des échantillons plus homogènes pour les études structurelles, il peut être nécessaire d’exclure les effets potentiels sur la fonction des cibles MP individuelles. Cependant, la production efficace d’échantillons de haute qualité de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG)14,21,22, de transporteurs eucaryotes 23 ou de grands assemblages hétéromères 24 dans les lysats de E. coli CF indique leur adéquation même à des cibles complexes. Les quantités d’échelle préparative (≈ 1 mg/mL) d’un échantillon peuvent être obtenues avec la configuration sans cellule à échange continu (CECF) à deux compartiments, composée d’un compartiment de mélange réactionnel (RM) et d’un compartiment de mélange d’alimentation (FM). Le volume FM dépasse le volume RM de 15 à 20 fois et fournit un réservoir de composés énergétiques et de précurseurs de faible poids moléculaire19. La réaction d’expression est ainsi prolongée de plusieurs heures et le rendement final de la cible MP est augmenté. Les compartiments RM et FM sont séparés par une membrane de dialyse avec une coupure de 10-14 kDa. Les deux compartiments nécessitent une conception spéciale du récipient de réaction CECF (figure 1). Les cassettes de dialyse commerciales en tant que récipients RM en combinaison avec des récipients en plexiglas sur mesure contenant le FM sont des exemples appropriés. Les rendements MP peuvent en outre être manipulés en modifiant les rapports RM:FM ou en échangeant le FM après une certaine période d’incubation.
Le rendement et la qualité d’un MP nécessitent souvent une optimisation intense des paramètres de réaction. Un avantage important de l’expression CF est la possibilité de modifier et d’affiner presque n’importe quel composé en fonction des exigences individuelles d’un MP. Une stratégie simple consiste à se concentrer d’abord sur l’amélioration du rendement d’un MP en établissant un protocole de production de base, puis à optimiser la qualité du MP en affinant les conditions de réaction et de repliement. L’absence de processus physiologiques dans les lysats de mucoviscidose et leur complexité réduite se traduisent par des taux de réussite élevés pour la production efficace de MP25. Les considérations de routine pour la conception de modèles d’ADN et l’optimisation de la concentration d’ions Mg 2+ sont dans la plupart des cas suffisantes pour obtenir des rendements satisfaisants26. Selon le mode d’expression, l’optimisation de la qualité MP peut prendre beaucoup de temps, car une plus grande variété de paramètres doivent être examinés14,17,22.
Pour établir la plateforme d’expression de la mucoviscidose décrite, des protocoles sont nécessaires pour la production de lysat d’E. coli (i), d’ARN polymérase T7 (ii), de nanodisques (iii) et des composés réactionnels CECF de base (iv) (Figure 1). Les dérivés A1927 ou BL21 de la souche K12 d’E. coli sont fréquemment utilisés pour la préparation de lysats efficaces de S30 (centrifugation à 30 000 x g). Outre les lysats S30, des lysats correspondants centrifugés à d’autres forces g (par exemple S12) peuvent être utilisés. Les lysats diffèrent par l’efficacité de l’expression et la complexité du protéome. Le protéome du lysat S30 préparé par le protocole décrit a été étudié en détail28. Le protéome S30 contient encore des protéines résiduelles de la membrane externe qui pourraient donner des problèmes de fond lors de l’expression et de l’analyse des canaux ioniques. Pour de telles cibles, l’utilisation de lysats S80-S100 est recommandée. Une modification précieuse lors de la préparation du lysat est l’induction de la réponse SOS par un choc thermique combiné et un apport d’éthanol à mi-phase de croissance logarithmique des cellules. Les lysats HS30 qui en résultent sont enrichis en chaperons et peuvent être utilisés dans des mélanges avec des lysats S30 pour un repliement MP22 amélioré. L’expression de la mucoviscidose dans les lysats d’E. coli est exploitée comme un processus couplé de transcription/traduction avec des matrices d’ADN contenant des promoteurs contrôlés par l’ARN polymérase T7 (T7RNAP). L’enzyme peut être produite efficacement dans les cellules étoiles BL21 (DE3) portant le plasmide pAR121929.
Deux copies de MSP1E3D1 s’assemblent en un nanodisque d’un diamètre de 10 à 12 nm, mais le protocole décrit ci-dessous peut également fonctionner pour d’autres dérivés MSP. Cependant, les nanodisques plus grands que ceux formés avec MSP1E3D1 ont tendance à être moins stables, tandis que les nanodisques plus petits formés avec des dérivés MSP tels que MSP1 peuvent ne pas accueillir de plus grands MP ou complexes MP. Les nanodisques MSP1E3D1 peuvent être assemblés in vitro avec une grande variété de lipides différents ou des mélanges lipidiques. Les nanodisques préformés sont généralement stables pendant > 1 an à -80 °C, tandis que la stabilité peut varier pour différents composants lipidiques. Pour le criblage des effets lipidiques sur le repliement et la stabilité d’un MP, il est nécessaire de préparer un ensemble complet de nanodisques assemblés avec une variété représentative de lipides/mélanges lipidiques. Les lipides suivants peuvent donner un bon choix de départ: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycéro-3-phospho-(1′-rac-glycérol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DMPC), 1,2 dioléoyl-sn-glycéro-3-phospho-rac-(1-glycérol) (DOPG), 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phospho-(1′-rac-glycérol) (POPG) et 1-palmitoyl-2-oléoyl-glycéro-3-phosphocholine (POPC).
Un protocole pour la préparation d’une réaction CECF de 3 mL est décrit. Une mise à l’échelle plus élevée ou plus basse dans un rapport de 1:1 est possible. Pour la configuration CECF à deux compartiments, un RM contenant tous les composés et un FM contenant uniquement les composés de faible poids moléculaire doivent être préparés. Les appareils de dialyse commerciaux de 3 ml avec MWCO de 10 à 14 kDa peuvent être utilisés comme contenants RM, qui sont ensuite placés dans des contenants en plexiglas fabriqués sur mesure contenant le FM (Figure 1D)30. Le rapport RM:FM est de 1:20, donc 60 mL de FM doivent être préparés pour 3 mL RM. La qualité, la concentration ou le type de plusieurs composants peuvent être critiques pour le rendement final et/ou la qualité du MP synthétisé (tableau 1). Les modèles d’ADN doivent être préparés conformément aux lignes directrices publiées et l’optimisation du codon du cadre de lecture de la cible peut encore améliorer considérablement le rendement du produit26. Pour la réaction CECF à l’échelle préparatrice, un protocole établi pour la production de PN est décrit. Pour établir des protocoles d’expression pour les nouveaux MP, il est généralement nécessaire d’effectuer des criblages d’optimisation de certains composés (tableau 1) afin d’améliorer le rendement et la qualité. Pour les ions Mg2+ , il existe un optimum de concentration bien ciblé qui montre souvent une variation significative pour différents modèles d’ADN. D’autres composés réactionnels de la mucoviscidose, tels que de nouveaux lots de lysats T7RNAP ou S30, peuvent modifier davantage la concentration optimale de Mg2+ . À titre d’exemple, un écran Mg 2+ typique dans la plage de concentration de14-24 mM et par pas de 2 mM est décrit. Chaque concentration est examinée en double et dans des réactions CECF à l’échelle analytique. En tant que conteneur de réaction CECF, des conteneurs en plexiglas Mini-CECF30 sur mesure contenant le RM sont utilisés en combinaison avec des microplaques standard à 24 puits contenant le FM (Figure 1B). On peut aussi utiliser des cartouches de dialyse commerciales en combinaison avec des microplaques de puits de 96 profondeurs ou d’autres dispositifs de dialyseur commerciaux dans des configurations appropriées (figure 1C).
Protocol
Representative Results
Discussion
La configuration et les stratégies visant à optimiser l’expression de la mucoviscidose et l’insertion co-translationnelle de MP fonctionnels dans les nanodisques sont décrites. L’équipement requis comprend un bioréacteur, un dispositif de presse à Français ou similaire, un lecteur UV/VIS et de fluorescence, des cuves de réaction CF adaptées à une configuration à deux compartiments et un incubateur à température contrôlée. D’autres équipements standard sont des centrifugeuses pour la récolte de ce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier la subvention BE1911/8-1 de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), le projet LOEWE GLUE et le centre de recherche collaborative Transport and Communication across Membranes (SFB807) pour leur soutien financier.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG) | Avanti Polar Lipids (USA) | 840445P | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids (USA) | 850345C | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC) | Avanti Polar Lipids (USA) | 850375C | |
| 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG) | Avanti Polar Lipids (USA) | 840475C | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipids (USA) | 850457C | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG) | Avanti Polar Lipids (USA) | 840034C | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris) | Carl Roth (Germany) | 4855 | |
| 2-Mercaptoethanol | Carl Roth (Germany) | 4227 | |
| 2-Propanol | Carl Roth (Germany) | 9781 | |
| [3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride | American Radiolabeled Chemicals (USA) | ART0134 | |
| Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP) | Merck (Germany) | 1409 | |
| Adenosine 5’-triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich (Germany) | A9251 | |
| Alprenolol hydrochloride | Merck (Germany) | A0360000 | |
| Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose® | Sigma-Aldrich (Germany) | Q1126 | |
| Autoclave Type GE 446EC-1 | Gettinge (Germany) | ||
| Bioreactor Type 884 124/1 | B.Braun (Germany) | ||
| Centrifuge | Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany) | ||
| Cholic acid | Carl Roth (Germany) | 8137 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Carl Roth (Germany) | 3862 | |
| Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks | Schott Duran (Germany) | ||
| Cytidine 5'-triphosphate disodium salt | Sigma-Aldrich (Germany) | C1506 | |
| D-glucose monohydrate | Carl Roth (Germany) | 6780 | |
| Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate | Carl Roth (Germany) | 6878 | |
| Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing | Fisher Scientific (Germany) | 8700152 | |
| Dithiothreit | Carl Roth (Germany) | 6908 | |
| Ethanol | Carl Roth (Germany) | K928 | |
| Folinic acid calcium salt hydrate | Sigma-Aldrich (Germany) | 47612 | |
| French pressure cell disruptor | SLM; Amico Instruments (USA) | ||
| Glycerol | Carl Roth (Germany) | 3783 | |
| Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP) | Sigma-Aldrich (Germany) | G8877 | |
| Hydrochloric Acid | Carl Roth (Germany) | K025 | |
| IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL | GE Life Sciences (Germany) | GE17-5248 | |
| Imidazole | Carl Roth (Germany) | 3899 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth (Germany) | 2316 | |
| Kanamycin | Carl Roth (Germany) | T832 | |
| L-Alanine | Carl Roth (Germany) | 3076.1 | |
| L-Arginine | Carl Roth (Germany) | 6908 | |
| L-Asparagine | Carl Roth (Germany) | HN23 | |
| L-Aspartic Acid | Carl Roth (Germany) | T202 | |
| L-Cysteine | Carl Roth (Germany) | T203 | |
| L-Glutamic Acid | Carl Roth (Germany) | 3774 | |
| L-Glutamine | Carl Roth (Germany) | 3772 | |
| L-Glycine | Carl Roth (Germany) | 3187 | |
| L-Histidine | Carl Roth (Germany) | 3852 | |
| L-Isoleucine | Carl Roth (Germany) | 3922 | |
| L-Leucine | Carl Roth (Germany) | 1699 | |
| L-Lysine | Carl Roth (Germany) | 4207 | |
| L-Methionine | Carl Roth (Germany) | 9359 | |
| L-Proline | Carl Roth (Germany) | 1713 | |
| L-Phenylalanine | Carl Roth (Germany) | 1709 | |
| L-Serine | Carl Roth (Germany) | 4682 | |
| L-Threonine | Carl Roth (Germany) | 1738 | |
| L-Tryptophane | Carl Roth (Germany) | 7700 | |
| L-Tyrosine | Carl Roth (Germany) | T207 | |
| MD100 dialysis units | Scienova (Germany) | 40077 | |
| N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES) | Carl Roth (Germany) | 6763 | |
| n-dodecylphosphocholine | Antrace (USA) | F308S | |
| PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell | Biorad (Germany) | ||
| PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems | Biorad (Germany) | ||
| PAGE gel power supply: Power Pac 3000 | Biorad (Germany) | ||
| Tryptone/peptone from caseine | Carl Roth (Germany) | 6681 | |
| Peristaltic pump: ip-12 | Ismatec (Germany) | ||
| Phosphoenol pyruvate monopotassium salt | Sigma Aldrich (Germany) | 860077 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth (Germany) | P018 | |
| Potassium acetate | Carl Roth (Germany) | 4986 | |
| Potassium chloride | Carl Roth (Germany) | 6781 | |
| Pyruvate Kinase | Roche (Germany) | 10109045001 | |
| Scintillation counter: Hidex 300 SL | Hidex (Finland) | ||
| SDS pellets | Carl Roth (Germany) | 8029 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich (Germany) | K305 | |
| Sodium chloride | Carl Roth (Germany) | P029 | |
| Spectrophotometer Nanodrop | Peqlab (Germany) | ||
| Spectrophotometer/fluorescence reader Spark® | Tecan (Switzerland) | ||
| tRNA (E. coli) | Roche (Germany) | 10109550001 | |
| Ultra sonificator | Labsonic U, B. Braun (Germany) | ||
| Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP) | Sigma-Aldrich (Germany) | U6625 | |
| Y-30 antifoam | Sigma-Aldrich (Germany) | A6457 | |
| Yeast extract | Carl Roth (Germany) | 2904 |
References
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