Inserção Co-Translacional de Proteínas de Membrana em Nanodiscos Pré-Formados
Summary
A inserção co-translacional em nanodiscos pré-formados torna possível estudar proteínas de membrana sintetizadas livres de células em ambientes lipídicos definidos sem contato com detergentes. Este protocolo descreve a preparação de componentes essenciais do sistema e os parâmetros críticos para melhorar a eficiência da expressão e a qualidade da amostra.
Abstract
Os sistemas de expressão livre de células permitem o design personalizado de ambientes de reação para suportar o dobramento funcional de proteínas complexas até mesmo, como proteínas de membrana. Os procedimentos experimentais para a inserção co-translacional e dobramento de proteínas de membrana em membranas pré-formadas e definidas fornecidas como nanodiscos são demonstrados. O protocolo é completamente livre de detergente e pode gerar miligramas de amostras purificadas dentro de um dia. As amostras de proteína/nanodisco de membrana resultantes podem ser usadas para uma variedade de estudos funcionais e aplicações estruturais, como cristalização, ressonância magnética nuclear ou microscopia eletrônica. A preparação de componentes-chave básicos, como lisatos livres de células, nanodiscos com membranas projetadas, soluções de estoque críticas, bem como a montagem de reações de expressão livre de células de dois compartimentos é descrita. Como os requisitos de dobramento das proteínas de membrana podem ser altamente diversos, um dos principais focos deste protocolo é a modulação de parâmetros e etapas de reação importantes para a qualidade da amostra, como compostos críticos básicos de reação, composição de membrana de nanodiscos, ambiente redox e chaperona ou design de modelo de DNA. Todo o processo é demonstrado com a síntese de proteorhodopsina e um receptor acoplado à proteína G.
Introduction
As proteínas de membrana (MPs) são alvos desafiadores em estudos de produção de proteínas devido à sua insolubilidade em ambientes aquosos. As plataformas convencionais de produção de MP compreendem sistemas baseados em células, como E. coli, levedura ou células eucarióticas. As MPs recombinantes sintetizadas são extraídas das membranas celulares ou redobradas dos corpos de inclusão1. Após a solubilização do detergente, os MPs podem ser transferidos para ambientes de membrana adequados por protocolos de reconstituição in vitro estabelecidos. Além de vesículas e lipossomas, a reconstituição de MP em membranas planares na forma de nanodiscos2 ou partículas de salipro3 tornaram-se técnicas rotineiras nos últimos tempos. No entanto, todas essas estratégias implicam o contato detergente com MPs que pode resultar em desestabilização, dissociação de oligômeros e até mesmo perda de estrutura e atividade proteica4. A triagem para condições ideais de solubilização e reconstituição de detergentes pode, portanto, ser tediosa e demorada5.
A natureza aberta dos sistemas livres de células (FC) permite que a reação de expressão seja diretamente fornecida com membranas pré-formadas com uma composição lipídica definida. Nesse modo de expressão à base de lipídios (L-CF), os MPs sintetizados têm a oportunidade de inserir co-translacionalmente nas bicamadas fornecidas 6,7 (Figura 1). Nanodiscos constituídos por uma proteína de andaime de membrana (MSP) em torno de um disco planar de bicamada lipídica8 parecem ser particularmente adequados para essa estratégia 9,10. Os nanodiscos podem ser rotineiramente montados in vitro com uma variedade de lipídios diferentes, são muito estáveis e os estoques podem ser concentrados até 1 mM. No entanto, a expressão de MSP em E. coli e sua purificação são necessárias. Como estratégia alternativa, a MSP pode ser coexpressa em conjunto com a MP alvo em reações de FC fornecidas com lipossomas11,12,13. Modelos de DNA para MSP e MP são adicionados à reação e MP / nanodiscos podem se formar após a expressão. Embora a produção de MSP seja evitada, a estratégia de co-expressão requer um ajuste fino cuidadoso das concentrações finais do molde de DNA e maiores variações na eficiência da produção de amostras podem ser esperadas.
A inserção co-translacional de MPs em membranas de nanodiscos pré-formados é um mecanismo não fisiológico e ainda amplamente desconhecido, independente de máquinas de translocon e sequências de sinais13,14,15,16. Os principais determinantes da eficiência de inserção são o tipo de proteína de membrana, bem como a composição lipídica da membrana fornecida, com preferência frequente por lipídios carregados negativamente15,17. Como as membranas dos nanodiscos são relativamente confinadas em tamanho, uma quantidade substancial de lipídios é liberada após a inserção do MP18. A variação do tamanho do nanodisco permite a inserção e o ajuste de complexos de MP oligoméricos superiores15,18. Entre outros, a montagem correta de complexos homooligoméricos foi mostrada para o canal iônico KcsA, para a bomba iônica proteorhodopsina (PR) e para o transportador multifármaco EmrE15,18. É provável que os MPs entrem na membrana simétrica do nanodisco de ambos os lados em frequência relativamente igual. Por conseguinte, deve considerar-se que diferentes monómeros ou oligômeros inseridos em um nanodisco podem ter orientações opostas. No entanto, um viés na orientação pode ser causado por mecanismos de inserção cooperativa, conforme relatado para a formação de hexâmeros PR e tetrâmeros KcsA18. Um viés adicional na orientação do MP pode resultar de interruptores de orientação de MPs inseridos provavelmente na borda das membranas de nanodisco.
A produção de lisados de FC a partir de cepas de E. coli é uma técnica de rotina confiável e pode ser realizada em praticamente qualquer laboratório bioquímico19,20. Deve-se considerar que, além da formação de pontes dissulfeto, a maioria das outras modificações pós-translacionais está ausente se um MP for sintetizado usando lisatos de E. coli. Embora isso possa gerar amostras mais homogêneas para estudos estruturais, pode ser necessário excluir efeitos potenciais sobre a função de alvos individuais de MP. No entanto, a produção eficiente de amostras de alta qualidade de receptores acoplados à proteína G (GPCR)14,21,22, transportadores eucarióticos 23 ou grandes conjuntos heteroméricos 24 em lisados de E. coli CF indica sua adequação até mesmo para alvos complexos. As quantidades de escala preparativa (≈ 1 mg/mL) de uma amostra podem ser obtidas com a configuração livre de células de troca contínua de dois compartimentos (CECF), composta por uma mistura de reação (RM) e um compartimento de mistura alimentar (FM). O volume de FM excede o volume RM de 15 a 20 vezes e fornece um reservatório de compostos e precursores de energia de baixo peso molecular19. A reação de expressão é, portanto, estendida por várias horas e o rendimento final do alvo MP é aumentado. Os compartimentos RM e FM são separados por uma membrana de diálise com um ponto de corte de 10-14 kDa. Os dois compartimentos requerem um projeto especial do recipiente de reação do CECF (Figura 1). de diálise comerciais como recipientes RM em combinação com recipientes de plexiglass sob medida que seguram o FM são exemplos adequados. Os rendimentos de MP podem ainda ser manipulados modificando as relações RM:FM ou trocando o FM após um certo período de incubação.
O rendimento e a qualidade de um MP frequentemente exigem intensa otimização dos parâmetros de reação. Uma vantagem importante da expressão da FC é a possibilidade de modificar e ajustar quase qualquer composto de acordo com os requisitos individuais de um MP. Uma estratégia simples é concentrar-se primeiro em melhorar o rendimento de um MP, estabelecendo um protocolo básico de produção e, em seguida, otimizar a qualidade do MP ajustando as condições de reação e dobramento. A ausência de processos fisiológicos nos lisados da FC e sua reduzida complexidade resultam em altas taxas de sucesso para a produção eficiente de MPs25. Considerações de rotina para o desenho do molde de DNA e otimização da concentração de íons Mg 2+ são, na maioria dos casos, suficientes para a obtenção de rendimentos satisfatórios26. Dependendo do modo de expressão, a otimização da qualidade do MP pode se tornar demorada, pois uma maior variedade de parâmetros precisa ser rastreada14,17,22.
Para estabelecer a plataforma de expressão de FC descrita, são necessários protocolos para a produção de lisado de E. coli CF (i), RNA polimerase T7 (ii), nanodiscos (iii) e os compostos básicos de reação do CECF (iv) (Figura 1). Os derivados A1927 ou BL21 da cepa de E. coli K12 são frequentemente utilizados para a preparação de lisatos eficientes de S30 (centrifugação a 30.000 x g). Além dos lisatos S30, os lisados correspondentes centrifugados em outras forças-g (por exemplo, S12) podem ser usados. Os lisados diferem na eficiência da expressão e na complexidade do proteoma. O proteoma do lisado S30 preparado pelo protocolo descrito tem sido estudado em detalhes28. O proteoma S30 ainda contém algumas proteínas residuais da membrana externa que podem causar problemas de fundo na expressão e análise dos canais iônicos. Para tais alvos, recomenda-se o uso de lisados S80-S100. Uma modificação valiosa durante a preparação do lisado é a indução da resposta SOS por choque térmico combinado e fornecimento de etanol na fase de crescimento do tronco médio das células. Os lisados HS30 resultantes são enriquecidos em chaperonas e podem ser usados em misturas com lisados S30 para melhorar a dobragem MP22. A expressão de FC em lisados de E. coli é operada como um processo de transcrição/tradução acoplado com moldes de DNA contendo promotores controlados pela RNA polimerase T7 (T7RNAP). A enzima pode ser eficientemente produzida em células estelares BL21(DE3) que transportam o plasmídeo pAR121929.
Duas cópias do MSP1E3D1 se reúnem em um nanodisco com um diâmetro de 10-12 nm, mas o protocolo descrito abaixo também pode funcionar para outros derivados do MSP. No entanto, nanodiscos maiores do que aqueles formados com MSP1E3D1 tendem a ser menos estáveis, enquanto nanodiscos menores formados com derivados de MSP, como MSP1, podem não acomodar MPs maiores ou complexos de MP. Os nanodiscos MSP1E3D1 podem ser montados in vitro com uma grande variedade de diferentes lipídios ou misturas lipídicas. Os nanodiscos pré-formados são geralmente estáveis por > 1 ano a -80 °C, enquanto a estabilidade pode variar para diferentes componentes lipídicos. Para a triagem dos efeitos lipídicos no dobramento e estabilidade de um MP, é necessário preparar um conjunto abrangente de nanodiscos montados com uma variedade representativa de lipídios/misturas lipídicas. Os seguintes lipídios podem dar uma boa seleção inicial: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (DOPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) (POPG) e 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC).
Um protocolo para a preparação de uma reação de 3 mL de CECF é descrito. É possível aumentar ou diminuir ainda mais a escala em uma proporção de 1:1. Para a configuração do CECF de dois compartimentos, deve ser preparado um RM contendo todos os compostos e um FM contendo apenas os compostos de baixo peso molecular. Dispositivos comerciais de diálise de 3 mL com MWCO de 10-14 kDa podem ser usados como recipientes RM, que são então colocados em recipientes de plexiglass feitos sob medida que seguram o FM (Figura 1D)30. A proporção de RM:FM é de 1:20, de modo que 60 mL de FM devem ser preparados para 3 mL RM. Qualidade, concentração ou tipo de vários componentes podem ser críticos para o rendimento final e/ou qualidade do MP sintetizado (Tabela 1). Os modelos de DNA devem ser preparados de acordo com as diretrizes publicadas e a otimização do códon do quadro de leitura do alvo pode melhorar significativamente o rendimento do produto26. Para a reação do CECF em escala preparativa, descreve-se um protocolo estabelecido para a produção de RP. Para estabelecer protocolos de expressão para novos MPs, geralmente é necessário realizar telas de otimização de determinados compostos (Tabela 1) para melhorar o rendimento e a qualidade. Para íons Mg2+ , existe uma concentração ótima bem focada que frequentemente mostra variação significativa para diferentes modelos de DNA. Outros compostos de reação da FC, como novos lotes de lisados T7RNAP ou S30, podem alterar ainda mais a concentração idealde Mg 2 +. Como exemplo, uma tela típica de Mg 2+ dentro da faixa de concentração de14-24 mM e em etapas de 2 mM é descrita. Cada concentração é rastreada em duplicatas e em reacções do CECF à escala analítica. Como recipiente de reação CECF, os recipientes de plexiglas Mini-CECF30 feitos sob medida que contêm o RM são usados em combinação com microplacas padrão de 24 poços que seguram o FM (Figura 1B). Alternativamente, cartuchos de diálise comerciais em combinação com microplacas de poço de 96 profundidades ou outros dispositivos dialisadores comerciais em configurações apropriadas podem ser usados (Figura 1C).
Protocol
Representative Results
Discussion
A configuração e as estratégias para otimizar a expressão da FC e a inserção co-translacional de MPs funcionais em nanodiscos são descritas. O equipamento necessário compreende um biorreator, um dispositivo de prensa francês ou similar, um leitor UV/VIS e de fluorescência, vasos de reação CF adequados para uma configuração de dois compartimentos e uma incubadora com temperatura controlada. Outros equipamentos padrão são centrífugas para a colheita de células de E. coli, bem como centrífugas de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer à bolsa BE1911/8-1 da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), ao projeto GLUE da LOEWE e ao centro de pesquisa colaborativa Transport and Communication across Membranes (SFB807) pelo apoio financeiro.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG) | Avanti Polar Lipids (USA) | 840445P | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids (USA) | 850345C | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC) | Avanti Polar Lipids (USA) | 850375C | |
| 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG) | Avanti Polar Lipids (USA) | 840475C | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipids (USA) | 850457C | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG) | Avanti Polar Lipids (USA) | 840034C | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris) | Carl Roth (Germany) | 4855 | |
| 2-Mercaptoethanol | Carl Roth (Germany) | 4227 | |
| 2-Propanol | Carl Roth (Germany) | 9781 | |
| [3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride | American Radiolabeled Chemicals (USA) | ART0134 | |
| Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP) | Merck (Germany) | 1409 | |
| Adenosine 5’-triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich (Germany) | A9251 | |
| Alprenolol hydrochloride | Merck (Germany) | A0360000 | |
| Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose® | Sigma-Aldrich (Germany) | Q1126 | |
| Autoclave Type GE 446EC-1 | Gettinge (Germany) | ||
| Bioreactor Type 884 124/1 | B.Braun (Germany) | ||
| Centrifuge | Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany) | ||
| Cholic acid | Carl Roth (Germany) | 8137 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Carl Roth (Germany) | 3862 | |
| Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks | Schott Duran (Germany) | ||
| Cytidine 5'-triphosphate disodium salt | Sigma-Aldrich (Germany) | C1506 | |
| D-glucose monohydrate | Carl Roth (Germany) | 6780 | |
| Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate | Carl Roth (Germany) | 6878 | |
| Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing | Fisher Scientific (Germany) | 8700152 | |
| Dithiothreit | Carl Roth (Germany) | 6908 | |
| Ethanol | Carl Roth (Germany) | K928 | |
| Folinic acid calcium salt hydrate | Sigma-Aldrich (Germany) | 47612 | |
| French pressure cell disruptor | SLM; Amico Instruments (USA) | ||
| Glycerol | Carl Roth (Germany) | 3783 | |
| Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP) | Sigma-Aldrich (Germany) | G8877 | |
| Hydrochloric Acid | Carl Roth (Germany) | K025 | |
| IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL | GE Life Sciences (Germany) | GE17-5248 | |
| Imidazole | Carl Roth (Germany) | 3899 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth (Germany) | 2316 | |
| Kanamycin | Carl Roth (Germany) | T832 | |
| L-Alanine | Carl Roth (Germany) | 3076.1 | |
| L-Arginine | Carl Roth (Germany) | 6908 | |
| L-Asparagine | Carl Roth (Germany) | HN23 | |
| L-Aspartic Acid | Carl Roth (Germany) | T202 | |
| L-Cysteine | Carl Roth (Germany) | T203 | |
| L-Glutamic Acid | Carl Roth (Germany) | 3774 | |
| L-Glutamine | Carl Roth (Germany) | 3772 | |
| L-Glycine | Carl Roth (Germany) | 3187 | |
| L-Histidine | Carl Roth (Germany) | 3852 | |
| L-Isoleucine | Carl Roth (Germany) | 3922 | |
| L-Leucine | Carl Roth (Germany) | 1699 | |
| L-Lysine | Carl Roth (Germany) | 4207 | |
| L-Methionine | Carl Roth (Germany) | 9359 | |
| L-Proline | Carl Roth (Germany) | 1713 | |
| L-Phenylalanine | Carl Roth (Germany) | 1709 | |
| L-Serine | Carl Roth (Germany) | 4682 | |
| L-Threonine | Carl Roth (Germany) | 1738 | |
| L-Tryptophane | Carl Roth (Germany) | 7700 | |
| L-Tyrosine | Carl Roth (Germany) | T207 | |
| MD100 dialysis units | Scienova (Germany) | 40077 | |
| N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES) | Carl Roth (Germany) | 6763 | |
| n-dodecylphosphocholine | Antrace (USA) | F308S | |
| PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell | Biorad (Germany) | ||
| PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems | Biorad (Germany) | ||
| PAGE gel power supply: Power Pac 3000 | Biorad (Germany) | ||
| Tryptone/peptone from caseine | Carl Roth (Germany) | 6681 | |
| Peristaltic pump: ip-12 | Ismatec (Germany) | ||
| Phosphoenol pyruvate monopotassium salt | Sigma Aldrich (Germany) | 860077 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth (Germany) | P018 | |
| Potassium acetate | Carl Roth (Germany) | 4986 | |
| Potassium chloride | Carl Roth (Germany) | 6781 | |
| Pyruvate Kinase | Roche (Germany) | 10109045001 | |
| Scintillation counter: Hidex 300 SL | Hidex (Finland) | ||
| SDS pellets | Carl Roth (Germany) | 8029 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich (Germany) | K305 | |
| Sodium chloride | Carl Roth (Germany) | P029 | |
| Spectrophotometer Nanodrop | Peqlab (Germany) | ||
| Spectrophotometer/fluorescence reader Spark® | Tecan (Switzerland) | ||
| tRNA (E. coli) | Roche (Germany) | 10109550001 | |
| Ultra sonificator | Labsonic U, B. Braun (Germany) | ||
| Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP) | Sigma-Aldrich (Germany) | U6625 | |
| Y-30 antifoam | Sigma-Aldrich (Germany) | A6457 | |
| Yeast extract | Carl Roth (Germany) | 2904 |
References
- Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
- Ritchie, T. K., et al. Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs. Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).
- Frauenfeld, J., et al. A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
- Yang, Z., et al. Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains. Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Junge, F., et al. Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins. New Biotechnology. 28 (3), (2011).
- Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).
- Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
- Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Membrane protein expression: no cells required. Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).
- Roos, C., et al. Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).
- Cappuccio, J. A., et al. Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles. Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).
- Patriarchi, T., et al. Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).
- Rues, R. B., Dötsch, V., Bernhard, F. Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).
- Henrich, E., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 1-19 (2017).
- Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Henrich, E., et al. Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway. Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).
- Peetz, O., et al. Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).
- Kigawa, T., et al. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).
- Schwarz, D., et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).
- Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs. BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).
- Rues, R. B., Dong, F., Dötsch, V., Bernhard, F. Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding. Methods. 147 (1), 73-83 (2018).
- Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., Dötsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer. Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).
- Matthies, D., et al. Cell-free expression and assembly of ATP synthase. Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).
- Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., Dötsch, V., Bernhard, F. Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins. Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).
- Haberstock, S., et al. A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems. Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).
- Falkinham, J. O., Clark, A. J. Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12. Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).
- Foshag, D., et al. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).
- Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).
- Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
- Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation. Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).
- Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein. European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).
- Henrich, E., et al. From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs. Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).
- Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).
