Samtranslationell insättning av membranproteiner i förformade nanodiscs
Summary
Samtranslationell insättning i förformade nanodiscs gör det möjligt att studera cellfria syntetiserade membranproteiner i definierade lipidmiljöer utan kontakt med tvättmedel. Detta protokoll beskriver beredningen av väsentliga systemkomponenter och de kritiska parametrarna för att förbättra uttryckseffektiviteten och provkvaliteten.
Abstract
Cellfria uttryckssystem möjliggör skräddarsydd design av reaktionsmiljöer för att stödja funktionell vikning av även komplexa proteiner såsom membranproteiner. De experimentella procedurerna för samtranslationell införande och vikning av membranproteiner i förformade och definierade membran som levereras som nanodiscs demonstreras. Protokollet är helt tvättmedelsfritt och kan generera milligram renade prover inom en dag. De resulterande membranprotein/ nanodisc-proverna kan användas för en mängd olika funktionella studier och strukturella applikationer såsom kristallisering, kärnmagnetisk resonans eller elektronmikroskopi. Beredningen av grundläggande nyckelkomponenter såsom cellfria lysater, nanodiscs med designade membran, kritiska stamlösningar samt montering av tvåfacks cellfria uttrycksreaktioner beskrivs. Eftersom vikningskraven för membranproteiner kan vara mycket olika, är ett huvudfokus i detta protokoll modulering av parametrar och reaktionssteg som är viktiga för provkvalitet, såsom kritiska grundläggande reaktionsföreningar, membransammansättning av nanodiscs, redox- och chaperonmiljö eller DNA-malldesign. Hela processen demonstreras med syntesen av proteorhodopsin och en G-proteinkopplad receptor.
Introduction
Membranproteiner (MPs) är utmanande mål i proteinproduktionsstudier på grund av deras olöslighet i vattenhaltiga miljöer. Konventionella MP-produktionsplattformar består av cellbaserade system som E. coli, jäst eller eukaryota celler. De syntetiserade rekombinanta mp:erna extraheras antingen från cellmembran eller viks om från inklusionskroppar1. Efter tvättmedelslöslighet kan parlamentsledamöter överföras till lämpliga membranmiljöer genom etablerade in vitro-beredningsprotokoll. Förutom vesiklar och liposomer har MP-rekonstituering till plana membran i form av nanodiscs2 eller salipro3-partiklar blivit rutintekniker på senare tid. Alla dessa strategier innebär emellertid tvättmedelskontakt med parlamentsledamöter som kan leda till destabilisering, dissociation av oligomerer och till och med förlust av proteinstruktur och aktivitet4. Screening för optimal tvättmedelsupplösning och beredningsförhållanden kan därför vara tråkigt och tidskrävande5.
Den öppna naturen hos cellfria (CF) system gör att uttrycksreaktionen kan levereras direkt med förformade membran med en definierad lipidkomposition. I detta lipidbaserade uttrycksläge (L-CF) har de syntetiserade mp:erna möjlighet att samtranslationellt infoga 6,7 i de tillhandahållna dubbelskikten(figur 1). Nanodiscs som består av ett membranställningsprotein (MSP) som omger en plan lipid-dubbelskiktsskiva8 verkar vara särskilt lämpliga för denna strategi 9,10. Nanodiscs kan rutinmässigt monteras in vitro med en mängd olika lipider, de är mycket stabila och lager kan koncentreras upp till 1 mM. MSP-uttryck i E. coli och dess rening är emellertid nödvändigt. Som en alternativ strategi kan MSP uttryckas tillsammans med mål-MP i CF-reaktioner som levereras med liposomer11,12,13. DNA-mallar för både MSP och MP läggs till i reaktionen och MP/nanodiscs kan bildas vid uttryck. Även om MSP-produktion undviks kräver samuttrycksstrategin noggrann finjustering av de slutliga DNA-mallkoncentrationerna och högre variationer i effektiviteten i provproduktionen kan förväntas.
Den samtranslationella insättningen av mps i membran av förformade nanodiscs är en icke-fysiologisk och fortfarande till stor del okänd mekanism oberoende av translogonmaskiner och signalsekvenser13,14,15,16. Viktiga determinanter för införingseffektiviteten är typen av membranprotein såväl som lipidkompositionen hos det tillhandahållna membranet, med en frekvent preferens för negativt laddade lipider15,17. Eftersom nanodiscmembranen är relativt begränsade i storlek frigörs en betydande mängd lipider vid MP-insättning18. Variation av nanodiscstorlek möjliggör insättning och inställning av högre oligomera MP-komplex15,18. Bland annat visades korrekt sammansättning av homooligomera komplex för jonkanalen KcsA, för jonpumpen proteorhodopsin (PR) och för multidrogtransportören EmrE15,18. Parlamentsledamöter kommer sannolikt att komma in i det symmetriska nanodiscmembranet från båda sidor med relativt lika frekvens. Det bör därför beaktas att olika monomerer eller oligomerer som sätts in i en nanodisc kan ha motsatta orienteringar. En bias i orientering kan dock orsakas av kooperativa insättningsmekanismer som rapporterats för bildandet av PR-hexamerer och KcsA-tetramerer18. En ytterligare bias i MP-orientering kan bero på orienteringsomkopplare av insatta parlamentsledamöter troligen vid kanten av nanodiscmembranen.
Produktionen av CF-lysater från E. coli-stammar är en pålitlig rutinteknik och kan utföras i nästan alla biokemiska laboratorier19,20. Det bör beaktas att förutom disulfidbrobildning saknas de flesta andra post-translationella modifieringar om en MP syntetiseras med användning av E. coli-lysater. Även om detta kan generera mer homogena urval för strukturstudier, kan det vara nödvändigt att utesluta potentiella effekter på funktionen hos enskilda mp-mål. Den effektiva produktionen av högkvalitativa prover av G-proteinkopplade receptorer (GPCR)14,21,22, eukaryota transportörer 23 eller stora heteromera enheter 24 i E. coli CF-lysater indikerar dock deras lämplighet för även komplexa mål. Preparativa skalmängder (≈ 1 mg/ml) av ett prov kan erhållas med CECF-konfigurationen (Continuous Exchange Cell-Free) med två fack, bestående av en reaktionsblandning (RM) och ett matningsblandningsfack (FM). FM-volymen överstiger RM-volymen 15 till 20 gånger och ger en reservoar av lågmolekylära energiföreningar och prekursorer19. Uttrycksreaktionen förlängs således i flera timmar och det slutliga utbytet av MP-målet ökas. RM- och FM-facken separeras av ett dialysmembran med en 10-14 kDa-avstängning. De två avdelningarna kräver en särskild utformning av CECF:s reaktionsbehållare (figur 1). Kommersiella dialyskassetter som RM-behållare i kombination med skräddarsydda plexiglasbehållare som håller FM är lämpliga exempel. MP-utbyten kan vidare manipuleras genom att ändra RM: FM-förhållandena eller genom att byta FM efter en viss inkubationsperiod.
Utbyte och kvalitet hos en MP kräver ofta intensiv optimering av reaktionsparametrar. En viktig fördel med CF-uttryck är möjligheten att modifiera och finjustera nästan vilken förening som helst enligt de individuella kraven för en MP. En enkel strategi är att först fokusera på att förbättra utbytet av en MP genom att upprätta ett grundläggande produktionsprotokoll och sedan optimera MP-kvaliteten genom att finjustera reaktions- och vikningsförhållandena. Frånvaron av fysiologiska processer i CF-lysater och deras minskade komplexitet resulterar i höga framgångsgrader för effektiv produktion av parlamentsledamöter25. Rutinmässiga överväganden för DNA-malldesign och optimering av Mg 2+ jonkoncentration är i de flesta fall tillräckliga för att uppnå tillfredsställande utbyten26. Beroende på uttrycksläge kan optimering av MP-kvalitet bli tidskrävande, eftersom en större mängd parametrar måste screenas14,17,22.
För att upprätta den beskrivna CF-uttrycksplattformen krävs protokoll för produktion av E. coli CF-lysat (i), T7-RNA-polymeras (ii), nanodiscs (iii) och de grundläggande CECF-reaktionsföreningarna (iv) (figur 1). E. coli K12-stammen A1927 – eller BL21-derivaten används ofta för framställning av effektiva S30 -lysater (centrifugering vid 30 000 x g). Förutom S30-lysater kan motsvarande lysater centrifugerade vid andra g-krafter (t.ex. S12) användas. Lysaterna skiljer sig åt i uttryckseffektivitet och i proteomkomplexitet. Proteomet hos S30-lysatet framställt av det beskrivna protokollet har studerats i detalj28. S30-proteomet innehåller fortfarande några kvarvarande yttre membranproteiner som kan ge bakgrundsproblem vid uttryck och analys av jonkanaler. För sådana mål rekommenderas användning av S80-S100-lysater. En värdefull modifiering under lysatberedningen är induktionen av SOS-svaret genom kombinerad värmechock och etanoltillförsel vid mitten av logtillväxtfasen av cellerna. De resulterande HS30-lysaterna är berikade i chaperoner och kan användas i blandningar med S30-lysater för förbättrad MP-vikning22. CF-uttryck i E. coli lysater drivs som en kopplad transkriptions-/translationsprocess med DNA-mallar som innehåller promotorer som styrs av T7-RNA-polymeras (T7RNAP). Enzymet kan produceras effektivt i BL21(DE3)-stjärnceller som bär pAR1219-plasmiden29.
Två kopior av MSP1E3D1 monteras i en nanodisc med en diameter på 10-12 nm, men protokollet som beskrivs nedan kan också fungera för andra MSP-derivat. Nanodiscs som är större än de som bildas med MSP1E3D1 tenderar dock att vara mindre stabila medan mindre nanodiscs som bildas med MSP-derivat som MSP1 kanske inte rymmer större parlamentsledamöter eller MP-komplex. MSP1E3D1 nanodiscs kan monteras in vitro med ett stort antal olika lipider eller lipidblandningar. Förformade nanodiscs är vanligtvis stabila i > 1 år vid -80 °C, medan stabiliteten kan variera för olika lipidkomponenter. För screening av lipideffekter på vikning och stabilitet hos en MP är det nödvändigt att förbereda en omfattande uppsättning nanodiscs monterade med en representativ mängd lipider / lipidblandningar. Följande lipider kan ge ett bra startval: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1′-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DMPC), 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-fosfo-rac-(1-glycerol) (DOPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1′-rac-glycerol) (POPG) och 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfokolin (POPC).
Ett protokoll för beredning av en 3 ml CECF-reaktion beskrivs. Ytterligare upp- eller nedskalning i förhållandet 1: 1 är möjlig. För CECF-konfigurationen med två avdelningar måste ett RM som innehåller alla föreningar och ett FM som endast innehåller föreningar med låg molekylvikt framställas. Kommersiella 3 ml dialysanordningar med 10-14 kDa MWCO kan användas som RM-behållare, som sedan placeras i skräddarsydda plexiglasbehållare som håller FM (Figur 1D)30. Förhållandet mellan RM: FM är 1:20, så 60 ml FM måste förberedas för 3 ml RM. Kvalitet, koncentration eller typ av flera komponenter kan vara avgörande för det slutliga utbytet och / eller kvaliteten på den syntetiserade MP (tabell 1). DNA-mallar bör utarbetas enligt publicerade riktlinjer och kodonoptimering av målets läsram kan ytterligare förbättra produktutbytet26. För CECF-reaktion i preparativ skala beskrivs ett etablerat protokoll för produktion av PR. För att upprätta uttrycksprotokoll för nya parlamentsledamöter är det vanligtvis nödvändigt att utföra optimeringsskärmar av vissa föreningar (tabell 1) för att förbättra utbytet och kvaliteten. För Mg2+ joner finns det ett välfokuserat koncentrationsoptimum som ofta visar betydande variation för olika DNA-mallar. Andra CF-reaktionsföreningar såsom nya satser av T7RNAP- eller S30-lysater kan ytterligare förändra den optimala Mg2+ koncentrationen. Som ett exempel beskrivs en typisk Mg 2+ skärm inom intervallet 14-24 mM koncentration och i steg om 2 mM. Varje koncentration screenas i dubbletter och i CECF-reaktioner i analytisk skala. Som CECF-reaktionsbehållare används skräddarsydda Mini-CECF plexiglasbehållare30 som håller RM i kombination med vanliga 24-brunns mikroplattor som håller FM (figur 1B). Alternativt kan kommersiella dialyspatroner i kombination med 96-djupa brunnsmikroplattor eller andra kommersiella dialysatoranordningar i lämpliga inställningar användas (figur 1C).
Protocol
Representative Results
Discussion
Upplägget och strategierna för att optimera CF-uttrycket och samtranslationell insättning av funktionella MPs i nanodiscs beskrivs. Den utrustning som krävs består av en bioreaktor, en fransk pressanordning eller liknande, en UV/VIS- och fluorescensläsare, CF-reaktionskärl som är lämpliga för en konfiguration med två fack och en temperaturkontrollerad inkubator. Ytterligare standardutrustning är centrifuger för skörd av E. coli-celler samt bordscentrifuger som når minst 30 000 x g för be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) bidrag BE1911/8-1, LOEWE-projektet GLUE och samarbetsforskningscentret Transport and Communication across Membranes (SFB807) för ekonomiskt stöd.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG) | Avanti Polar Lipids (USA) | 840445P | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids (USA) | 850345C | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC) | Avanti Polar Lipids (USA) | 850375C | |
| 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG) | Avanti Polar Lipids (USA) | 840475C | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipids (USA) | 850457C | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG) | Avanti Polar Lipids (USA) | 840034C | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris) | Carl Roth (Germany) | 4855 | |
| 2-Mercaptoethanol | Carl Roth (Germany) | 4227 | |
| 2-Propanol | Carl Roth (Germany) | 9781 | |
| [3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride | American Radiolabeled Chemicals (USA) | ART0134 | |
| Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP) | Merck (Germany) | 1409 | |
| Adenosine 5’-triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich (Germany) | A9251 | |
| Alprenolol hydrochloride | Merck (Germany) | A0360000 | |
| Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose® | Sigma-Aldrich (Germany) | Q1126 | |
| Autoclave Type GE 446EC-1 | Gettinge (Germany) | ||
| Bioreactor Type 884 124/1 | B.Braun (Germany) | ||
| Centrifuge | Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany) | ||
| Cholic acid | Carl Roth (Germany) | 8137 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Carl Roth (Germany) | 3862 | |
| Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks | Schott Duran (Germany) | ||
| Cytidine 5'-triphosphate disodium salt | Sigma-Aldrich (Germany) | C1506 | |
| D-glucose monohydrate | Carl Roth (Germany) | 6780 | |
| Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate | Carl Roth (Germany) | 6878 | |
| Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing | Fisher Scientific (Germany) | 8700152 | |
| Dithiothreit | Carl Roth (Germany) | 6908 | |
| Ethanol | Carl Roth (Germany) | K928 | |
| Folinic acid calcium salt hydrate | Sigma-Aldrich (Germany) | 47612 | |
| French pressure cell disruptor | SLM; Amico Instruments (USA) | ||
| Glycerol | Carl Roth (Germany) | 3783 | |
| Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP) | Sigma-Aldrich (Germany) | G8877 | |
| Hydrochloric Acid | Carl Roth (Germany) | K025 | |
| IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL | GE Life Sciences (Germany) | GE17-5248 | |
| Imidazole | Carl Roth (Germany) | 3899 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth (Germany) | 2316 | |
| Kanamycin | Carl Roth (Germany) | T832 | |
| L-Alanine | Carl Roth (Germany) | 3076.1 | |
| L-Arginine | Carl Roth (Germany) | 6908 | |
| L-Asparagine | Carl Roth (Germany) | HN23 | |
| L-Aspartic Acid | Carl Roth (Germany) | T202 | |
| L-Cysteine | Carl Roth (Germany) | T203 | |
| L-Glutamic Acid | Carl Roth (Germany) | 3774 | |
| L-Glutamine | Carl Roth (Germany) | 3772 | |
| L-Glycine | Carl Roth (Germany) | 3187 | |
| L-Histidine | Carl Roth (Germany) | 3852 | |
| L-Isoleucine | Carl Roth (Germany) | 3922 | |
| L-Leucine | Carl Roth (Germany) | 1699 | |
| L-Lysine | Carl Roth (Germany) | 4207 | |
| L-Methionine | Carl Roth (Germany) | 9359 | |
| L-Proline | Carl Roth (Germany) | 1713 | |
| L-Phenylalanine | Carl Roth (Germany) | 1709 | |
| L-Serine | Carl Roth (Germany) | 4682 | |
| L-Threonine | Carl Roth (Germany) | 1738 | |
| L-Tryptophane | Carl Roth (Germany) | 7700 | |
| L-Tyrosine | Carl Roth (Germany) | T207 | |
| MD100 dialysis units | Scienova (Germany) | 40077 | |
| N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES) | Carl Roth (Germany) | 6763 | |
| n-dodecylphosphocholine | Antrace (USA) | F308S | |
| PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell | Biorad (Germany) | ||
| PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems | Biorad (Germany) | ||
| PAGE gel power supply: Power Pac 3000 | Biorad (Germany) | ||
| Tryptone/peptone from caseine | Carl Roth (Germany) | 6681 | |
| Peristaltic pump: ip-12 | Ismatec (Germany) | ||
| Phosphoenol pyruvate monopotassium salt | Sigma Aldrich (Germany) | 860077 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth (Germany) | P018 | |
| Potassium acetate | Carl Roth (Germany) | 4986 | |
| Potassium chloride | Carl Roth (Germany) | 6781 | |
| Pyruvate Kinase | Roche (Germany) | 10109045001 | |
| Scintillation counter: Hidex 300 SL | Hidex (Finland) | ||
| SDS pellets | Carl Roth (Germany) | 8029 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich (Germany) | K305 | |
| Sodium chloride | Carl Roth (Germany) | P029 | |
| Spectrophotometer Nanodrop | Peqlab (Germany) | ||
| Spectrophotometer/fluorescence reader Spark® | Tecan (Switzerland) | ||
| tRNA (E. coli) | Roche (Germany) | 10109550001 | |
| Ultra sonificator | Labsonic U, B. Braun (Germany) | ||
| Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP) | Sigma-Aldrich (Germany) | U6625 | |
| Y-30 antifoam | Sigma-Aldrich (Germany) | A6457 | |
| Yeast extract | Carl Roth (Germany) | 2904 |
References
- Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
- Ritchie, T. K., et al. Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs. Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).
- Frauenfeld, J., et al. A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
- Yang, Z., et al. Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains. Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Junge, F., et al. Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins. New Biotechnology. 28 (3), (2011).
- Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).
- Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
- Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Membrane protein expression: no cells required. Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).
- Roos, C., et al. Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).
- Cappuccio, J. A., et al. Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles. Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).
- Patriarchi, T., et al. Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).
- Rues, R. B., Dötsch, V., Bernhard, F. Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).
- Henrich, E., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 1-19 (2017).
- Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Henrich, E., et al. Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway. Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).
- Peetz, O., et al. Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).
- Kigawa, T., et al. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).
- Schwarz, D., et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).
- Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs. BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).
- Rues, R. B., Dong, F., Dötsch, V., Bernhard, F. Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding. Methods. 147 (1), 73-83 (2018).
- Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., Dötsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer. Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).
- Matthies, D., et al. Cell-free expression and assembly of ATP synthase. Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).
- Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., Dötsch, V., Bernhard, F. Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins. Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).
- Haberstock, S., et al. A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems. Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).
- Falkinham, J. O., Clark, A. J. Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12. Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).
- Foshag, D., et al. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).
- Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).
- Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
- Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation. Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).
- Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein. European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).
- Henrich, E., et al. From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs. Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).
- Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).
