Decellularisering af Murine Cardiopulmonal Complex
Summary
Denne protokol har til formål at decellularisere hjertet og lungerne af mus. Den resulterende ekstracellulære matrix (ECM) stilladser kan immunstained og afbildet til at kortlægge placeringen og topologi af deres komponenter.
Abstract
Vi præsenterer her en decellularisering protokol for mus hjerte og lunger. Det producerer strukturelle ECM stilladser, der kan bruges til at analysere ECM topologi og sammensætning. Det er baseret på en mikrokirurgisk procedure designet til at kateterisere luftrøret og aorta af en aflivet mus til at gennemtrænge hjerte og lunger med decellulariserende midler. Det decellulære kardiopulmonalkompleks kan efterfølgende immunplettet for at afsløre placeringen af strukturelle ECM-proteiner. Hele proceduren kan afsluttes om 4 dage.
ECM-stilladserne som følge af denne protokol er fri for dimensionelle forvrængninger. Fraværet af celler muliggør strukturel undersøgelse af ECM-strukturer ned til submicronopløsning i 3D. Denne protokol kan anvendes på sundt og sygt væv fra mus så unge som 4 uger gamle, herunder musemodeller af fibrose og kræft, åbner vejen for at bestemme ECM remodeling forbundet med kardiopulmonal sygdom.
Introduction
ECM er et tredimensionelt netværk lavet af proteiner og glycaner, der rummer alle celler i en flercellet organisme, hvilket giver organer deres form og regulerer celleadfærd gennem hele livet1. Fra ægbefrugtning og fremefter bygger og ombygger cellerne ECM og kontrolleres igen strengt af den. Formålet med denne protokol er at åbne en måde at analysere og kortlægge mus ECM, da mus er den mest anvendte modelorganisme i pattedyrs patofysiologi.
Udviklingen af denne metode var drevet af behovet for at karakterisere og isolere metastaser-associerede indfødte ECM2. Da tumorer mangler korrekt anatomisk vascularization og mus er relativt små organismer, mikrokirurgiske procedurer blev designet til retrogradely kateterisere aorta, samtidig med at cirkulationen af de store fartøj, der fører til en tumor (f.eks lungevener), således at fokus reagens flow og tillader tumor decellularisering. Denne metode producerer ECM stilladser med en bevaret struktur2, der kan immun farves og afbildes, så ECM struktur kortlægning i submicron detaljer. For at udføre denne protokol er det nødvendigt at erhverve kirurgiske og mikrokirurgiske færdigheder (dissektion, mikrosuturing og kateterisering), der kan udgøre en potentiel begrænsning af dets anvendelse. Så vidt vi ved, repræsenterer denne metode den nyeste teknologi til native ECM struktur imaging analysis2,3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Decellulariseringsteknikker baseret på vævs agitation ændrer ECM-strukturen, hvilket gør dem uegnede til ECM-strukturanalyse4. Perfusion decellularisering, ved hjælp af en anatomisk rute som aorta af luftrøret, gør det muligt at nå kapillær seng, eller terminal alveol, og letter leveringen af decellulariserende midler i hele organet. Brugen af zwitterioniske, anioniske og ikke-ioniske rengøringsmidler til at decellulisere væv er rapporteret4,5,6, dog, natrium dodecyl sulfat (SDS, anioni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker professor Ivana Novak og Dr. Nynne Meyn Christensen (Center for Advanced Bioimaging (CAB), Københavns Universitet) for at have givet mikroskopadgang. Dette arbejde blev støttet af Det Europæiske Forskningsråd (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR og JTE); ph.d.-stipendium fra Lundbeckfonden (R286-2018-621; HR); det svenske forskningsråd (2017-03389; CDM); Kræftens Bekæmpelse, Kræftens Bekæmpelse (CAN 2016/783, 19 0632 Pj og 190007; CDM); German Cancer Aid (Deutsche Krebshilfe; RR); kræftforeningen (R204-A12454; RR).
Materials
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-suture (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson forceps with teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Castroviejo microneedle holder | Fine Science Tools | no. 12061-01 | |
| CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia | |||
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm) | |||
| Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) | Leica | S6 D | |
| Double-ended microspatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont microforceps (two) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont microforceps with 45° tips (two) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hair clippers | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) | BD | 381512 | |
| Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayo scissors (tough cut, straight) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Microforceps with ringed tips (two) | Aesculap | FM571R | |
| Micro-spring scissors (Vannas, curved) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Needles (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
| Paper towel (sterile) or surgical napkin | |||
| Serrated scissors (CeramaCut, straight) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatula (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| Syringes (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Syringes (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Tendon scissors (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized) | Serva | 11930.03 | |
| Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Host: rabbit |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: goat |
| Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Host: guinea pig | ||
| Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normal donkey serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| IMAGING | |||
| Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; ) | Leica | ||
| Fluorescence light source | Leica | EL6000 | |
| Microscope (inverted multiphoton microscope) | Leica | SP5-X MP | |
| Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) | |||
| White-light laser (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZATION | |||
| 70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water | Plum | 1680766 | |
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peristaltic pump (with 12 channels) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) | Ole Dich | 31399 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H&E STAINING | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
| Absolute ethanol | Plum | 201152-1L | |
| Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX mounting medium | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y solution alcoholic 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
| Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) |
Thermofisher | 6319483 | |
| Mayers hematoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT compound | VWR | 361603E | |
| Slide scanner (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
References
- Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).
