Summary

Murine Kardiyopulmoner Kompleksinin Hücreden Arındırılması

Published: May 30, 2021
doi:

Summary

Bu protokol farelerin kalbini ve akciğerlerini hücreden çıkarmayı amaçlamaktadır. Elde edilen hücre dışı matris (ECM) iskeleleri, bileşenlerinin konumunu ve topolojisini haritalamak için immünostain edilebilir ve görüntülenebilir.

Abstract

Burada fare kalbi ve akciğerleri için bir hücreden arındırma protokolü sunuyoruz. ECM topolojisini ve bileşimini analiz etmek için kullanılabilecek yapısal ECM iskeleleri üretir. Kalbi ve akciğerleri hücreden çıkarıcı ajanlarla boğmak için ötenazili bir farenin trakeasını ve aortlarını kateterize etmek için tasarlanmış mikrocerrahi bir prosedüre dayanmaktadır. Hücreden çıkarıcı kardiyopulmoner kompleks daha sonra yapısal ECM proteinlerinin yerini ortaya çıkarmak için immünositize edilebilir. Tüm prosedür 4 günde tamamlanabilir.

Bu protokolden kaynaklanan ECM iskeleleri boyutsal bozulmalardan arındırılmıştır. Hücrelerin yokluğu, ECM yapılarının 3D olarak mikrokron çözünürlüğe kadar yapısal olarak incelenmesini sağlar. Bu protokol, fibrozis ve kanserin fare modelleri de dahil olmak üzere 4 haftalık kadar genç farelerden sağlıklı ve hastalıklı dokulara uygulanabilir ve kardiyopulmoner hastalıkla ilişkili ECM tadilatını belirlemenin yolunu açar.

Introduction

ECM, çok hücreli bir organizmadaki tüm hücreleri barındıran, organlara şekil veren ve yaşam boyunca hücre davranışını düzenleyen protein ve glikanlardan oluşan üç boyutlu bir ağdır1. Yumurta döllenmesinden itibaren, hücreler ECM’yi oluşturur ve yeniden şekillendirir ve buna karşılık kesinlikle kontrol edilir. Bu protokolün amacı, fareler memeli patofizyolojisinde en çok kullanılan model organizma olduğu için fare ECM’yi analiz etmenin ve haritalamak için bir yol açmaktır.

Bu yöntemin gelişimi, metastaz ilişkili yerel ECM2’yi karakterize etme ve izole etme ihtiyacından kaynaklanmıştır. Tümörler uygun anatomik vaskülerizasyondan yoksun olduğundan ve fareler nispeten küçük organizmalar olduğundan, mikrocerrahi prosedürler aortu geriye dönük kateterize etmek için tasarlanmıştır, bu nedenle tümöre (örneğin pulmoner damarlara) giden ana damarın dolaşımını izole eder, böylece reaktif akışına odaklanır ve tümör desellülerizasyonuna izin verir. Bu yöntem, bağışıklık sistemi baskılanabilen ve görüntülenebilen korunmuş bir yapıya2 sahip ECM iskeleleri üreterek ecm yapısının altmikron detaylı olarak haritalandırılmasını sağlar. Bu protokolü gerçekleştirmek için, kullanımına potansiyel bir sınırlama oluşturabilecek cerrahi ve mikrocerrahi becerileri (diseksiyon, mikrosütür ve kateterizasyon) kazanmak gerekir. Bilgimize göre, bu yöntem yerel ECM yapı görüntüleme analizi için en son teknolojiyi temsil eder2,3.

Protocol

Burada yer alan tüm prosedürler Kopenhag Üniversitesi’nde deneysel tıbbı düzenleyen etik komite tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır ve Danimarka ve Avrupa mevzuatına uygundur. Bu protokolü göstermek için, 8-12 haftalık dişi BALB / cJ fareleri ve 11 haftalık bir MMTV-PyMT dişi fare kullandık. NOT: Hücreden çıkarımlı ECM iskelesinin bakteriyel kirlenmesini önlemek en iyi görüntüleme sonucunu verir ve uzun süreli numune depolamaya izin verir. Bu nedenle t…

Representative Results

Kardiyopulmoner desellülerizasyonProtokolü başarıyla tamamladıktan sonra kalp ve akciğerlerin yanı sıra aort arkı gibi ek dokular hücrelerden arındırılmış olacaktır. Desellülerizasyon, ecm iskelelerinin hematoksilin-eozin lekelenmesi (Şekil 1) ile doğrulanabilir. Bu iskeleler taze organların boyutlarını korur ve çözünmeyen ECM yapısı bozulmadan kalır2. Şekil 2</stro…

Discussion

Doku ajitasyonuna dayalı desellülerizasyon teknikleri ECM yapısını değiştirerek ECM yapı analizi için uygun hale getirir4. Trakea aort gibi anatomik bir yol kullanarak perfüzyon desellülerizasyonu kılcal yatağa veya terminal alveollere ulaşmayı sağlar ve hücreden çıkarıcı ajanların organ boyunca teslimini kolaylaştırır. Dokuyu hücreden çıkarmak için zwitteriyonik, anionik ve iyonik olmayan deterjanların kullanımı4,5,6<su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Prof. Ivana Novak ve Dr. Nynne Meyn Christensen’e (Kopenhag Üniversitesi İleri Biyogörüntleme Merkezi)’ne mikroskop erişimi sağladıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Avrupa Araştırma Konseyi (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR ve JTE); Lundbeck Vakfı’ndan doktora bursu (R286-2018-621; SN. ); İsveç Araştırma Konseyi (2017-03389; CDM); İsveç Kanser Derneği, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj ve 190007; CDM); Alman Kanser Yardımı (Deutsche Krebshilfe; RR); ve Danimarka Kanser Derneği (R204-A12454; RR).

Materials

MICROSURGERY
6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) Ethicon 6301124
9-0 micro-suture (Safil) B Braun G1048611
Adson forceps Fine Science Tools 11006-12
Adson forceps with teeth Fine Science Tools 11027-12
Castroviejo microneedle holder Fine Science Tools no. 12061-01
CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)  Merck ZIQ7000T0
Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm)
Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) Leica S6 D
Double-ended microspatula Fine Science Tools 10091-12
Dumont microforceps (two) Fine Science Tools 11252-20
Dumont microforceps with 45° tips (two) Fine Science Tools 11251-35
Hair clippers Oster 76998-320-051
Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) Fine Science Tools 12500-12
Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) BD 381512
Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) Surflo-W SR+DM2619WX
Mayo scissors (tough cut, straight) Fine Science Tools 14110-15
Microforceps with ringed tips (two) Aesculap FM571R
Micro-spring scissors (Vannas, curved) Fine Science Tools 15001-08
Minicutter KLS Martin 80-008-03-04
Molt Periostotome Aesculap D0543R
Needles (27 gauge; Microlance) BD 21018
Paper towel (sterile) or surgical napkin 
Serrated scissors (CeramaCut, straight) Fine Science Tools 14958-09
Spatula (Freer-Yasargil) Aesculap OL166R
Syringes (1 mL; Plastipak) BD 3021001
Syringes (10 mL; Plastipak) BD 3021110
Tendon scissors (Walton) Fine Science Tools 14077-09
IMMUNOSTAINING
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG Thermo Fisher Scientific A-11055
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG Life Technologies A11037
BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)  Serva 11930.03
Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)  Millipore AB756P Host: rabbit
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)  Thermo Fisher Scientific 70011044 Host: goat
Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) Host: guinea pig
Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) VWR 233-5364)
Serum (normal donkey serum)  Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
IMAGING
 Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )  Leica
 Fluorescence light source  Leica EL6000
 Microscope (inverted multiphoton microscope)  Leica SP5-X MP
 Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)  Leica HCX PL APO
 Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) 
 White-light laser (WLL)  Leica
DECELLULARIZATION
70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water  Plum 1680766
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)  Merck ZIQ7000T0
Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) World Precision Instruments 13158-100
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)  Thermo Fisher Scientific 70011044
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
Peristaltic pump (with 12 channels) Ole Dich 110AC(R)20G75
Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) Ole Dich 31399
Sodium Azide Sigma-Aldrich 08591-1ML-F
Sodium deoxycholate (DOC) Sigma-Aldrich D6750-100G
Sodium Dodecyl Sulphate Sigma-Aldrich L3771-500G
H&E STAINING
4% PFA Fisher Scientific 15434389
96% Ethanol Plum 201446-5L
Absolute ethanol Plum 201152-1L
Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) Hounisen 422.245
Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) Tissue-Tek 4566
Cryostat Leica CM3050S
DPX mounting medium Hounisen 1001.0025
Eosin Y solution alcoholic 0.5% Sigma 1024390500
Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) Pfm medical 207500003

Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)
Thermofisher 6319483
Mayers hematoxylin Sigma MHS32-1L
OCT compound VWR 361603E
Slide scanner (Nanozoomer) Hamamatsu Photonics
Xylene Sigma 534056-4L

References

  1. Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
  2. Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
  3. Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
  4. White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
  5. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
  6. Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
  7. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
  8. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
  9. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
  10. Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).

Play Video

Cite This Article
Mayorca-Guiliani, A. E., Rafaeva, M., Willacy, O., Madsen, C. D., Reuten, R., Erler, J. T. Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex. J. Vis. Exp. (171), e61854, doi:10.3791/61854 (2021).

View Video