Summary

Decellularizzazione del Complesso Cardiopolmonare Murino

Published: May 30, 2021
doi:

Summary

Questo protocollo mira a decellularizzare il cuore e i polmoni dei topi. Gli scaffold a matrice extracellulare (ECM) risultanti possono essere immunocolorati e ripresi per mappare la posizione e la topologia dei loro componenti.

Abstract

Presentiamo qui un protocollo di decellularizzazione per cuore e polmoni di topo. Produce scaffold ECM strutturali che possono essere utilizzati per analizzare la topologia e la composizione ECM. Si basa su una procedura microchirurgica progettata per cateterizzare la trachea e l’aorta di un topo eutanasizzato per perfondere il cuore e i polmoni con agenti decellularizzanti. Il complesso cardiopolmonare decellularizzato può successivamente essere immunocolorato per rivelare la posizione delle proteine ECM strutturali. L’intera procedura può essere completata in 4 giorni.

Gli scaffold ECM risultanti da questo protocollo sono privi di distorsioni dimensionali. L’assenza di cellule consente l’esame strutturale delle strutture ECM fino alla risoluzione submicron in 3D. Questo protocollo può essere applicato a tessuti sani e malati di topi di 4 settimane, compresi modelli murini di fibrosi e cancro, aprendo la strada a determinare il rimodellamento dell’ECM associato alla malattia cardiopolmonare.

Introduction

L’ECM è una rete tridimensionale fatta di proteine e glicani che ospita tutte le cellule in un organismo multicellulare, dando agli organi la loro forma e regolando il comportamento cellulare per tutta la vita1. Dalla fecondazione degli ovuli in poi, le cellule costruiscono e rimodellano l’ECM e sono a loro volta strettamente controllate da esso. Lo scopo di questo protocollo è quello di aprire un modo per analizzare e mappare l’ECM del topo, poiché i topi sono l’organismo modello più utilizzato nella fisiopatologia dei mammiferi.

Lo sviluppo di questo metodo è stato guidato dalla necessità di caratterizzare e isolare l’ECM2 nativo associato alle metastasi. Poiché i tumori mancano di un’adeguata vascolarizzazione anatomica e i topi sono organismi relativamente piccoli, le procedure microchirurgiche sono state progettate per cateterizzare retrogradamente l’aorta, isolando la circolazione del vaso principale che porta a un tumore (ad esempio, le vene polmonari), focalizzando così il flusso di reagenti e consentendo la decellularizzazione del tumore. Questo metodo produce scaffold ECM con una struttura conservata2 che possono essere immunocolorati e ripresi, consentendo la mappatura della struttura ECM nei dettagli submicronici. Per realizzare questo protocollo è necessario acquisire competenze chirurgiche e microchirurgiche (dissezione, microsuturazione e cateterizzazione) che possono rappresentare una potenziale limitazione al suo utilizzo. Per quanto ne sappiamo, questo metodo rappresenta lo stato dell’arte per l’analisi nativa della struttura ECM2,3.

Protocol

Tutte le procedure qui incluse sono state riviste e approvate dal comitato etico che regola la medicina sperimentale dell’Università di Copenaghen e concordano con la legislazione danese ed europea. Per dimostrare questo protocollo, abbiamo utilizzato topi BALB/cJ femmina di 8-12 settimane di età e un topo femmina MMTV-PyMT di 11 settimane di età. NOTA: evitare la contaminazione batterica dell’impalcatura ECM decellularizzata offre il miglior risultato di imaging e consente la conservazione…

Representative Results

Decellularizzazione cardiopolmonareDopo aver completato con successo il protocollo, il cuore e i polmoni, così come il tessuto annesso come l’arco aortico, saranno privi di cellule. La decellularizzazione può essere convalidata mediante colorazione ematossilina-eosina (Figura 1) degli scaffold ECM che mostrano la rimozione dei nuclei rispetto al tessuto nativo. Queste impalcature mantengono le dimensioni degli organi freschi e la sua st…

Discussion

Le tecniche di decellularizzazione basate sull’agitazione tissutale alterano la struttura dell’ECM, rendendole inadatte all’analisi della struttura ECM4. La decellularizzazione perfusione, utilizzando una via anatomica come l’aorta della trachea, permette di raggiungere il letto capillare, o alveoli terminali, e facilita la consegna di agenti decellularizzanti in tutto l’organo. L’uso di detergenti zwitterionionici, anionici e non ionici per decellularizzare il tessuto è segnala…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo la Prof.ssa Ivana Novak e la Dott.ssa Nynne Meyn Christensen (Centre for Advanced Bioimaging (CAB), Università di Copenaghen) per aver fornito l’accesso al microscopio. Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio europeo della ricerca (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR e JTE); una borsa di dottorato della Lundbeck Foundation (R286-2018-621; MR); il Consiglio svedese della ricerca (2017-03389; CDM); la Swedish Cancer Society, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj e 190007; CDM); Aiuto tedesco contro il cancro (Deutsche Krebshilfe; RR); e la Danish Cancer Society (R204-A12454; RR).

Materials

MICROSURGERY
6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) Ethicon 6301124
9-0 micro-suture (Safil) B Braun G1048611
Adson forceps Fine Science Tools 11006-12
Adson forceps with teeth Fine Science Tools 11027-12
Castroviejo microneedle holder Fine Science Tools no. 12061-01
CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)  Merck ZIQ7000T0
Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm)
Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) Leica S6 D
Double-ended microspatula Fine Science Tools 10091-12
Dumont microforceps (two) Fine Science Tools 11252-20
Dumont microforceps with 45° tips (two) Fine Science Tools 11251-35
Hair clippers Oster 76998-320-051
Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) Fine Science Tools 12500-12
Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) BD 381512
Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) Surflo-W SR+DM2619WX
Mayo scissors (tough cut, straight) Fine Science Tools 14110-15
Microforceps with ringed tips (two) Aesculap FM571R
Micro-spring scissors (Vannas, curved) Fine Science Tools 15001-08
Minicutter KLS Martin 80-008-03-04
Molt Periostotome Aesculap D0543R
Needles (27 gauge; Microlance) BD 21018
Paper towel (sterile) or surgical napkin 
Serrated scissors (CeramaCut, straight) Fine Science Tools 14958-09
Spatula (Freer-Yasargil) Aesculap OL166R
Syringes (1 mL; Plastipak) BD 3021001
Syringes (10 mL; Plastipak) BD 3021110
Tendon scissors (Walton) Fine Science Tools 14077-09
IMMUNOSTAINING
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG Thermo Fisher Scientific A-11055
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG Life Technologies A11037
BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)  Serva 11930.03
Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)  Millipore AB756P Host: rabbit
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)  Thermo Fisher Scientific 70011044 Host: goat
Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) Host: guinea pig
Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) VWR 233-5364)
Serum (normal donkey serum)  Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
IMAGING
 Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )  Leica
 Fluorescence light source  Leica EL6000
 Microscope (inverted multiphoton microscope)  Leica SP5-X MP
 Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)  Leica HCX PL APO
 Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) 
 White-light laser (WLL)  Leica
DECELLULARIZATION
70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water  Plum 1680766
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)  Merck ZIQ7000T0
Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) World Precision Instruments 13158-100
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)  Thermo Fisher Scientific 70011044
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
Peristaltic pump (with 12 channels) Ole Dich 110AC(R)20G75
Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) Ole Dich 31399
Sodium Azide Sigma-Aldrich 08591-1ML-F
Sodium deoxycholate (DOC) Sigma-Aldrich D6750-100G
Sodium Dodecyl Sulphate Sigma-Aldrich L3771-500G
H&E STAINING
4% PFA Fisher Scientific 15434389
96% Ethanol Plum 201446-5L
Absolute ethanol Plum 201152-1L
Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) Hounisen 422.245
Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) Tissue-Tek 4566
Cryostat Leica CM3050S
DPX mounting medium Hounisen 1001.0025
Eosin Y solution alcoholic 0.5% Sigma 1024390500
Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) Pfm medical 207500003

Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)
Thermofisher 6319483
Mayers hematoxylin Sigma MHS32-1L
OCT compound VWR 361603E
Slide scanner (Nanozoomer) Hamamatsu Photonics
Xylene Sigma 534056-4L

References

  1. Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
  2. Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
  3. Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
  4. White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
  5. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
  6. Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
  7. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
  8. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
  9. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
  10. Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).

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Cite This Article
Mayorca-Guiliani, A. E., Rafaeva, M., Willacy, O., Madsen, C. D., Reuten, R., Erler, J. T. Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex. J. Vis. Exp. (171), e61854, doi:10.3791/61854 (2021).

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