Decellularizzazione del Complesso Cardiopolmonare Murino
Summary
Questo protocollo mira a decellularizzare il cuore e i polmoni dei topi. Gli scaffold a matrice extracellulare (ECM) risultanti possono essere immunocolorati e ripresi per mappare la posizione e la topologia dei loro componenti.
Abstract
Presentiamo qui un protocollo di decellularizzazione per cuore e polmoni di topo. Produce scaffold ECM strutturali che possono essere utilizzati per analizzare la topologia e la composizione ECM. Si basa su una procedura microchirurgica progettata per cateterizzare la trachea e l’aorta di un topo eutanasizzato per perfondere il cuore e i polmoni con agenti decellularizzanti. Il complesso cardiopolmonare decellularizzato può successivamente essere immunocolorato per rivelare la posizione delle proteine ECM strutturali. L’intera procedura può essere completata in 4 giorni.
Gli scaffold ECM risultanti da questo protocollo sono privi di distorsioni dimensionali. L’assenza di cellule consente l’esame strutturale delle strutture ECM fino alla risoluzione submicron in 3D. Questo protocollo può essere applicato a tessuti sani e malati di topi di 4 settimane, compresi modelli murini di fibrosi e cancro, aprendo la strada a determinare il rimodellamento dell’ECM associato alla malattia cardiopolmonare.
Introduction
L’ECM è una rete tridimensionale fatta di proteine e glicani che ospita tutte le cellule in un organismo multicellulare, dando agli organi la loro forma e regolando il comportamento cellulare per tutta la vita1. Dalla fecondazione degli ovuli in poi, le cellule costruiscono e rimodellano l’ECM e sono a loro volta strettamente controllate da esso. Lo scopo di questo protocollo è quello di aprire un modo per analizzare e mappare l’ECM del topo, poiché i topi sono l’organismo modello più utilizzato nella fisiopatologia dei mammiferi.
Lo sviluppo di questo metodo è stato guidato dalla necessità di caratterizzare e isolare l’ECM2 nativo associato alle metastasi. Poiché i tumori mancano di un’adeguata vascolarizzazione anatomica e i topi sono organismi relativamente piccoli, le procedure microchirurgiche sono state progettate per cateterizzare retrogradamente l’aorta, isolando la circolazione del vaso principale che porta a un tumore (ad esempio, le vene polmonari), focalizzando così il flusso di reagenti e consentendo la decellularizzazione del tumore. Questo metodo produce scaffold ECM con una struttura conservata2 che possono essere immunocolorati e ripresi, consentendo la mappatura della struttura ECM nei dettagli submicronici. Per realizzare questo protocollo è necessario acquisire competenze chirurgiche e microchirurgiche (dissezione, microsuturazione e cateterizzazione) che possono rappresentare una potenziale limitazione al suo utilizzo. Per quanto ne sappiamo, questo metodo rappresenta lo stato dell’arte per l’analisi nativa della struttura ECM2,3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le tecniche di decellularizzazione basate sull’agitazione tissutale alterano la struttura dell’ECM, rendendole inadatte all’analisi della struttura ECM4. La decellularizzazione perfusione, utilizzando una via anatomica come l’aorta della trachea, permette di raggiungere il letto capillare, o alveoli terminali, e facilita la consegna di agenti decellularizzanti in tutto l’organo. L’uso di detergenti zwitterionionici, anionici e non ionici per decellularizzare il tessuto è segnala…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la Prof.ssa Ivana Novak e la Dott.ssa Nynne Meyn Christensen (Centre for Advanced Bioimaging (CAB), Università di Copenaghen) per aver fornito l’accesso al microscopio. Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio europeo della ricerca (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR e JTE); una borsa di dottorato della Lundbeck Foundation (R286-2018-621; MR); il Consiglio svedese della ricerca (2017-03389; CDM); la Swedish Cancer Society, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj e 190007; CDM); Aiuto tedesco contro il cancro (Deutsche Krebshilfe; RR); e la Danish Cancer Society (R204-A12454; RR).
Materials
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-suture (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson forceps with teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Castroviejo microneedle holder | Fine Science Tools | no. 12061-01 | |
| CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia | |||
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm) | |||
| Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) | Leica | S6 D | |
| Double-ended microspatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont microforceps (two) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont microforceps with 45° tips (two) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hair clippers | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) | BD | 381512 | |
| Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayo scissors (tough cut, straight) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Microforceps with ringed tips (two) | Aesculap | FM571R | |
| Micro-spring scissors (Vannas, curved) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Needles (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
| Paper towel (sterile) or surgical napkin | |||
| Serrated scissors (CeramaCut, straight) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatula (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| Syringes (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Syringes (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Tendon scissors (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized) | Serva | 11930.03 | |
| Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Host: rabbit |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: goat |
| Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Host: guinea pig | ||
| Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normal donkey serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| IMAGING | |||
| Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; ) | Leica | ||
| Fluorescence light source | Leica | EL6000 | |
| Microscope (inverted multiphoton microscope) | Leica | SP5-X MP | |
| Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) | |||
| White-light laser (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZATION | |||
| 70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water | Plum | 1680766 | |
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peristaltic pump (with 12 channels) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) | Ole Dich | 31399 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H&E STAINING | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
| Absolute ethanol | Plum | 201152-1L | |
| Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX mounting medium | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y solution alcoholic 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
| Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) |
Thermofisher | 6319483 | |
| Mayers hematoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT compound | VWR | 361603E | |
| Slide scanner (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
References
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- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).
