इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य चूहों के दिल और फेफड़ों को डीसेलुलराइज करना है। परिणामी बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) scaffolds immunostained किया जा सकता है और उनके घटकों के स्थान और टोपोलॉजी नक्शा करने के लिए imaged.
हम यहां माउस दिल और फेफड़ों के लिए एक डीसेल्युलराइजेशन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह संरचनात्मक ईसीएम scaffolds है कि ईसीएम टोपोलॉजी और संरचना का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है का उत्पादन करता है. यह एक माइक्रोसर्जिकल प्रक्रिया पर आधारित है जिसे एक euthanized माउस के श्वासनली और महाधमनी को कैथेटराइज़ करने के लिए डिज़ाइन किया गया है ताकि दिल और फेफड़ों को डीसेल्युलराइज़िंग एजेंटों के साथ परफ्यूज किया जा सके। Decellularized cardiopulmonary परिसर बाद में संरचनात्मक ईसीएम प्रोटीन के स्थान को प्रकट करने के लिए immunostained किया जा सकता है। पूरी प्रक्रिया को 4 दिनों में पूरा किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप ईसीएम scaffolds आयामी विकृतियों से मुक्त हैं. कोशिकाओं की अनुपस्थिति 3 डी में सबमाइक्रोन रिज़ॉल्यूशन के नीचे ईसीएम संरचनाओं की संरचनात्मक परीक्षा को सक्षम बनाती है। इस प्रोटोकॉल को 4 सप्ताह के रूप में छोटे चूहों से स्वस्थ और रोगग्रस्त ऊतक पर लागू किया जा सकता है, जिसमें फाइब्रोसिस और कैंसर के माउस मॉडल शामिल हैं, कार्डियोपल्मोनरी रोग से जुड़े ईसीएम रीमॉडलिंग को निर्धारित करने का रास्ता खोलते हैं।
ईसीएम एक तीन आयामी नेटवर्क है जो प्रोटीन और ग्लाइकन से बना है जो एक बहुकोशिकीय जीव में सभी कोशिकाओं को समायोजित करता है, अंगों को उनका आकार देता है और पूरे जीवन में सेल व्यवहार को विनियमित करता है। अंडे के निषेचन के बाद से, कोशिकाएं ईसीएम का निर्माण और पुनर्निर्माण करती हैं, और बदले में इसके द्वारा सख्ती से नियंत्रित होती हैं। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य माउस ईसीएम का विश्लेषण और मानचित्र बनाने का एक तरीका खोलना है, क्योंकि चूहे स्तनधारी पैथोफिजियोलॉजी में सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले मॉडल जीव हैं।
इस विधि का विकास मेटास्टेसिस से जुड़े देशी ईसीएम 2 को चिह्नित करने और अलग करने की आवश्यकता से प्रेरित था। चूंकि ट्यूमर में उचित शारीरिक संवहन की कमी होती है और चूहे अपेक्षाकृत छोटे जीव होते हैं, इसलिए माइक्रोसर्जिकल प्रक्रियाओं को महाधमनी को प्रतिगामी रूप से कैथेटराइज़ करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जबकि ट्यूमर (जैसे, फुफ्फुसीय नसों) के लिए अग्रणी प्रमुख पोत के परिसंचरण को अलग करना, इस प्रकार अभिकर्मक प्रवाह पर ध्यान केंद्रित करना और ट्यूमर डीसेल्युलराइजेशन की अनुमति देना। यह विधि एक संरक्षित संरचना 2 के साथ ईसीएम मचानों का उत्पादन करती है जिसे इम्यूनोस्टेन और इमेज किया जा सकता है, जिससे सबमाइक्रोन विस्तार में ईसीएम संरचना मैपिंग की अनुमति मिलती है। इस प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए, सर्जिकल और माइक्रोसर्जिकल कौशल (विच्छेदन, माइक्रोस्यूटरिंग और कैथीटेराइजेशन) प्राप्त करना आवश्यक है जो इसके उपयोग के लिए एक संभावित सीमा का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। हमारे ज्ञान के लिए, यह विधि देशी ईसीएम संरचना इमेजिंग विश्लेषण 2,3 के लिए अत्याधुनिक का प्रतिनिधित्व करती है।
ऊतक आंदोलन के आधार पर डीसेल्युलराइजेशन तकनीकें ईसीएम संरचना को बदल देती हैं, जिससे उन्हें ईसीएम संरचना विश्लेषण के लिए अनुपयुक्त बना दिया जाता है। परफ्यूजन डीसेल्युलराइजेशन, ट्रेकिआ के महा…
The authors have nothing to disclose.
हम प्रोफेसर इवाना नोवाक और डॉ Nynne Meyn Christensen (उन्नत Bioimaging (सीएबी), कोपेनहेगन विश्वविद्यालय के लिए केंद्र) माइक्रोस्कोप पहुँच प्रदान करने के लिए धन्यवाद. इस काम को यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN) द्वारा समर्थित किया गया था; एईएम-जी, ओडब्ल्यू, आरआर और जेटीई); लुंडबेक फाउंडेशन (R286-2018-621) से पीएचडी फैलोशिप; MR); स्वीडिश अनुसंधान परिषद (2017-03389; सीडीएम); स्वीडिश कैंसर सोसायटी, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj, और 190007; सीडीएम); जर्मन कैंसर सहायता (ड्यूश Krebshilfe; आरआर); और डेनिश कैंसर सोसायटी (R204-A12454; आरआर)।
MICROSURGERY | |||
6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
9-0 micro-suture (Safil) | B Braun | G1048611 | |
Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
Adson forceps with teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
Castroviejo microneedle holder | Fine Science Tools | no. 12061-01 | |
CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia | |||
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm) | |||
Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) | Leica | S6 D | |
Double-ended microspatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
Dumont microforceps (two) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Dumont microforceps with 45° tips (two) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
Hair clippers | Oster | 76998-320-051 | |
Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) | BD | 381512 | |
Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
Mayo scissors (tough cut, straight) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
Microforceps with ringed tips (two) | Aesculap | FM571R | |
Micro-spring scissors (Vannas, curved) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
Needles (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
Paper towel (sterile) or surgical napkin | |||
Serrated scissors (CeramaCut, straight) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
Spatula (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
Syringes (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
Syringes (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
Tendon scissors (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
IMMUNOSTAINING | |||
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | |
BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized) | Serva | 11930.03 | |
Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Host: rabbit |
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: goat |
Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Host: guinea pig | ||
Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
Serum (normal donkey serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
IMAGING | |||
Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; ) | Leica | ||
Fluorescence light source | Leica | EL6000 | |
Microscope (inverted multiphoton microscope) | Leica | SP5-X MP | |
Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) | |||
White-light laser (WLL) | Leica | ||
DECELLULARIZATION | |||
70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water | Plum | 1680766 | |
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Peristaltic pump (with 12 channels) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) | Ole Dich | 31399 | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
Sodium Dodecyl Sulphate | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
H&E STAINING | |||
4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
Absolute ethanol | Plum | 201152-1L | |
Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
Cryostat | Leica | CM3050S | |
DPX mounting medium | Hounisen | 1001.0025 | |
Eosin Y solution alcoholic 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) |
Thermofisher | 6319483 | |
Mayers hematoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
OCT compound | VWR | 361603E | |
Slide scanner (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
Xylene | Sigma | 534056-4L |