Summary

Decellularisering av Murine kardiopulmonalkomplekset

Published: May 30, 2021
doi:

Summary

Denne protokollen tar sikte på å decellularisere hjerte og lunger av mus. De resulterende ekstracellulære matrisen (ECM) stillaser kan immuniseres og avbildes for å kartlegge plasseringen og topologien til komponentene.

Abstract

Vi presenterer her en decellulariseringsprotokoll for musehjerte og lunger. Den produserer strukturelle ECM stillaser som kan brukes til å analysere ECM topologi og sammensetning. Den er basert på en mikrokirurgisk prosedyre designet for å kateterisere luftrøret og aorta av en euthanized mus for å parfyme hjertet og lungene med decellulariserende midler. Det decellulariserte kardiopulmonale komplekset kan deretter immuniseres for å avsløre plasseringen av strukturelle ECM-proteiner. Hele prosedyren kan fullføres om 4 dager.

ECM stillaser som følge av denne protokollen er fri for dimensjonale forvrengninger. Fraværet av celler muliggjør strukturell undersøkelse av ECM-strukturer ned til submikronoppløsning i 3D. Denne protokollen kan brukes på sunt og sykt vev fra mus så unge som 4 uker gamle, inkludert musemodeller av fibrose og kreft, og åpner veien for å bestemme ECM-ombygging forbundet med kardiopulmonal sykdom.

Introduction

ECM er et tredimensjonalt nettverk laget av proteiner og glykaner som rommer alle celler i en multicellulær organisme, noe som gir organer sin form og regulerer celleadferd gjennom livet1. Fra eggbefruktning og utover bygger og ombygger cellene ECM, og styres i sin tur strengt av den. Formålet med denne protokollen er å åpne en måte å analysere og kartlegge musen ECM, da mus er den mest brukte modellorganismen i pattedyr patofysiologi.

Utviklingen av denne metoden var drevet av behovet for å karakterisere og isolere metastase-assosiert innfødt ECM2. Ettersom svulster mangler riktig anatomisk vaskularisering og mus er relativt små organismer, ble mikrokirurgiske prosedyrer designet for å retrogradely kateterisere aorta, mens de isolerer sirkulasjonen av det store karet som fører til en svulst (f.eks. lungeårene), og dermed fokusere reagensstrømmen og tillate tumordecellularisering. Denne metoden produserer ECM stillaser med en bevart struktur2 som kan immuniseres og avbildes, slik at ECM strukturkartlegging i submikron detalj. For å utføre denne protokollen er det nødvendig å tilegne seg kirurgiske og mikrokirurgiske ferdigheter (disseksjon, mikrosuging og kateterisering) som kan representere en potensiell begrensning i bruken. Så vidt vi vet representerer denne metoden toppmoderne for opprinnelig ECM-strukturavbildningsanalyse2,3.

Protocol

Alle prosedyrer som inngår her er gjennomgått og godkjent av etikkkomiteen som regulerer eksperimentell medisin ved Københavns Universitet og er enige i dansk og europeisk lovgivning. For å demonstrere denne protokollen har vi brukt kvinnelige BALB/cJ-mus på 8-12 uker og en MMTV-PyMT kvinnelig mus på 11 uker. MERK: Unngå bakteriell kontaminering av det decellulariserte ECM-stillaset gir det beste bildebehandlingsresultatet og tillater langsiktig prøvelagring. Det er derfor viktig å ho…

Representative Results

Kardiopulmonal decellulariseringEtter å ha fullført protokollen, vil hjertet og lungene, samt anneksvev som aortabuen, være fri for celler. Decellularisering kan valideres ved hematoksylin-eosinfarging (figur 1) av ECM stillaser som viser fjerning av kjernene som sammenligner med det opprinnelige vevet. Disse stillasene beholder dimensjonene til friske organer og dens uoppløselige ECM-struktur er intakt2. <stro…

Discussion

Decellulariseringsteknikker basert på vevs agitasjon endrer ECM-strukturen, noe som gjør dem uegnet for ECM-strukturanalyse4. Perfusjon decellularisering, ved hjelp av en anatomisk rute som aorta av luftrøret, gjør det mulig å nå kapillærsengen, eller terminal alveoli, og letter levering av decellulariserende midler i hele orgelet. Bruken av zwitterionic, anioniske og ikke-ioniske vaskemidler for å decellularisere vev er rapportert4,5,6, men natrium dodecyl sulfat (SDS, anionisk) linearise…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker professor Ivana Novak og Dr. Nynne Meyn Christensen (Centre for Advanced Bioimaging (CAB), Københavns Universitet) for å ha gitt tilgang til mikroskopet. Dette arbeidet ble støttet av Det europeiske forskningsrådet (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR og JTE); stipendiatstilling fra Lundbeckstiftelsen (R286-2018-621; MR); Det svenske forskningsrådet (2017-03389; CDM); Det svenske kreftforeningen, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj og 190007; CDM); Tysk krefthjelp (Deutsche Krebshilfe; RR); og Det danske kreftforeningen (R204-A12454; RR).

Materials

MICROSURGERY
6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) Ethicon 6301124
9-0 micro-suture (Safil) B Braun G1048611
Adson forceps Fine Science Tools 11006-12
Adson forceps with teeth Fine Science Tools 11027-12
Castroviejo microneedle holder Fine Science Tools no. 12061-01
CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)  Merck ZIQ7000T0
Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm)
Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) Leica S6 D
Double-ended microspatula Fine Science Tools 10091-12
Dumont microforceps (two) Fine Science Tools 11252-20
Dumont microforceps with 45° tips (two) Fine Science Tools 11251-35
Hair clippers Oster 76998-320-051
Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) Fine Science Tools 12500-12
Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) BD 381512
Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) Surflo-W SR+DM2619WX
Mayo scissors (tough cut, straight) Fine Science Tools 14110-15
Microforceps with ringed tips (two) Aesculap FM571R
Micro-spring scissors (Vannas, curved) Fine Science Tools 15001-08
Minicutter KLS Martin 80-008-03-04
Molt Periostotome Aesculap D0543R
Needles (27 gauge; Microlance) BD 21018
Paper towel (sterile) or surgical napkin 
Serrated scissors (CeramaCut, straight) Fine Science Tools 14958-09
Spatula (Freer-Yasargil) Aesculap OL166R
Syringes (1 mL; Plastipak) BD 3021001
Syringes (10 mL; Plastipak) BD 3021110
Tendon scissors (Walton) Fine Science Tools 14077-09
IMMUNOSTAINING
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG Thermo Fisher Scientific A-11055
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG Life Technologies A11037
BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)  Serva 11930.03
Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)  Millipore AB756P Host: rabbit
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)  Thermo Fisher Scientific 70011044 Host: goat
Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) Host: guinea pig
Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) VWR 233-5364)
Serum (normal donkey serum)  Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
IMAGING
 Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )  Leica
 Fluorescence light source  Leica EL6000
 Microscope (inverted multiphoton microscope)  Leica SP5-X MP
 Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)  Leica HCX PL APO
 Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) 
 White-light laser (WLL)  Leica
DECELLULARIZATION
70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water  Plum 1680766
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)  Merck ZIQ7000T0
Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) World Precision Instruments 13158-100
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)  Thermo Fisher Scientific 70011044
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
Peristaltic pump (with 12 channels) Ole Dich 110AC(R)20G75
Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) Ole Dich 31399
Sodium Azide Sigma-Aldrich 08591-1ML-F
Sodium deoxycholate (DOC) Sigma-Aldrich D6750-100G
Sodium Dodecyl Sulphate Sigma-Aldrich L3771-500G
H&E STAINING
4% PFA Fisher Scientific 15434389
96% Ethanol Plum 201446-5L
Absolute ethanol Plum 201152-1L
Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) Hounisen 422.245
Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) Tissue-Tek 4566
Cryostat Leica CM3050S
DPX mounting medium Hounisen 1001.0025
Eosin Y solution alcoholic 0.5% Sigma 1024390500
Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) Pfm medical 207500003

Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)
Thermofisher 6319483
Mayers hematoxylin Sigma MHS32-1L
OCT compound VWR 361603E
Slide scanner (Nanozoomer) Hamamatsu Photonics
Xylene Sigma 534056-4L

References

  1. Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
  2. Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
  3. Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
  4. White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
  5. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
  6. Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
  7. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
  8. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
  9. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
  10. Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).

Play Video

Cite This Article
Mayorca-Guiliani, A. E., Rafaeva, M., Willacy, O., Madsen, C. D., Reuten, R., Erler, J. T. Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex. J. Vis. Exp. (171), e61854, doi:10.3791/61854 (2021).

View Video