Decellularisering av Murine kardiopulmonalkomplekset
Summary
Denne protokollen tar sikte på å decellularisere hjerte og lunger av mus. De resulterende ekstracellulære matrisen (ECM) stillaser kan immuniseres og avbildes for å kartlegge plasseringen og topologien til komponentene.
Abstract
Vi presenterer her en decellulariseringsprotokoll for musehjerte og lunger. Den produserer strukturelle ECM stillaser som kan brukes til å analysere ECM topologi og sammensetning. Den er basert på en mikrokirurgisk prosedyre designet for å kateterisere luftrøret og aorta av en euthanized mus for å parfyme hjertet og lungene med decellulariserende midler. Det decellulariserte kardiopulmonale komplekset kan deretter immuniseres for å avsløre plasseringen av strukturelle ECM-proteiner. Hele prosedyren kan fullføres om 4 dager.
ECM stillaser som følge av denne protokollen er fri for dimensjonale forvrengninger. Fraværet av celler muliggjør strukturell undersøkelse av ECM-strukturer ned til submikronoppløsning i 3D. Denne protokollen kan brukes på sunt og sykt vev fra mus så unge som 4 uker gamle, inkludert musemodeller av fibrose og kreft, og åpner veien for å bestemme ECM-ombygging forbundet med kardiopulmonal sykdom.
Introduction
ECM er et tredimensjonalt nettverk laget av proteiner og glykaner som rommer alle celler i en multicellulær organisme, noe som gir organer sin form og regulerer celleadferd gjennom livet1. Fra eggbefruktning og utover bygger og ombygger cellene ECM, og styres i sin tur strengt av den. Formålet med denne protokollen er å åpne en måte å analysere og kartlegge musen ECM, da mus er den mest brukte modellorganismen i pattedyr patofysiologi.
Utviklingen av denne metoden var drevet av behovet for å karakterisere og isolere metastase-assosiert innfødt ECM2. Ettersom svulster mangler riktig anatomisk vaskularisering og mus er relativt små organismer, ble mikrokirurgiske prosedyrer designet for å retrogradely kateterisere aorta, mens de isolerer sirkulasjonen av det store karet som fører til en svulst (f.eks. lungeårene), og dermed fokusere reagensstrømmen og tillate tumordecellularisering. Denne metoden produserer ECM stillaser med en bevart struktur2 som kan immuniseres og avbildes, slik at ECM strukturkartlegging i submikron detalj. For å utføre denne protokollen er det nødvendig å tilegne seg kirurgiske og mikrokirurgiske ferdigheter (disseksjon, mikrosuging og kateterisering) som kan representere en potensiell begrensning i bruken. Så vidt vi vet representerer denne metoden toppmoderne for opprinnelig ECM-strukturavbildningsanalyse2,3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Decellulariseringsteknikker basert på vevs agitasjon endrer ECM-strukturen, noe som gjør dem uegnet for ECM-strukturanalyse4. Perfusjon decellularisering, ved hjelp av en anatomisk rute som aorta av luftrøret, gjør det mulig å nå kapillærsengen, eller terminal alveoli, og letter levering av decellulariserende midler i hele orgelet. Bruken av zwitterionic, anioniske og ikke-ioniske vaskemidler for å decellularisere vev er rapportert4,5,6, men natrium dodecyl sulfat (SDS, anionisk) linearise…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker professor Ivana Novak og Dr. Nynne Meyn Christensen (Centre for Advanced Bioimaging (CAB), Københavns Universitet) for å ha gitt tilgang til mikroskopet. Dette arbeidet ble støttet av Det europeiske forskningsrådet (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR og JTE); stipendiatstilling fra Lundbeckstiftelsen (R286-2018-621; MR); Det svenske forskningsrådet (2017-03389; CDM); Det svenske kreftforeningen, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj og 190007; CDM); Tysk krefthjelp (Deutsche Krebshilfe; RR); og Det danske kreftforeningen (R204-A12454; RR).
Materials
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-suture (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson forceps with teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Castroviejo microneedle holder | Fine Science Tools | no. 12061-01 | |
| CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia | |||
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm) | |||
| Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) | Leica | S6 D | |
| Double-ended microspatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont microforceps (two) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont microforceps with 45° tips (two) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hair clippers | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) | BD | 381512 | |
| Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayo scissors (tough cut, straight) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Microforceps with ringed tips (two) | Aesculap | FM571R | |
| Micro-spring scissors (Vannas, curved) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Needles (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
| Paper towel (sterile) or surgical napkin | |||
| Serrated scissors (CeramaCut, straight) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatula (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| Syringes (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Syringes (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Tendon scissors (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized) | Serva | 11930.03 | |
| Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Host: rabbit |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: goat |
| Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Host: guinea pig | ||
| Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normal donkey serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| IMAGING | |||
| Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; ) | Leica | ||
| Fluorescence light source | Leica | EL6000 | |
| Microscope (inverted multiphoton microscope) | Leica | SP5-X MP | |
| Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) | |||
| White-light laser (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZATION | |||
| 70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water | Plum | 1680766 | |
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peristaltic pump (with 12 channels) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) | Ole Dich | 31399 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H&E STAINING | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
| Absolute ethanol | Plum | 201152-1L | |
| Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX mounting medium | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y solution alcoholic 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
| Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) |
Thermofisher | 6319483 | |
| Mayers hematoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT compound | VWR | 361603E | |
| Slide scanner (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
References
- Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).
