Decellularisering av Murine Cardiopulmonary Complex
Summary
Detta protokoll syftar till att decellularisera hjärtat och lungorna hos möss. De resulterande extracellulära matrisen (ECM) byggnadsställningar kan immunostained och avbildas för att kartlägga platsen och topologin för deras komponenter.
Abstract
Vi presenterar här ett decellulariseringsprotokoll för mushjärta och lungor. Den producerar strukturella ECM-byggnadsställningar som kan användas för att analysera ECM-topologi och komposition. Det är baserat på ett mikrokirurgiskt förfarande som är utformat för att kateterisera luftstrupen och aortan hos en avlivad mus för att perfusera hjärtat och lungorna med decellulariserande medel. Decellularized cardiopulmonary komplexet kan därefter immunostained att avslöja platsen för strukturella ECM proteiner. Hela proceduren kan slutföras på 4 dagar.
ECM-byggnadsställningarna som härrör från detta protokoll är fria från dimensionella snedvridningar. Frånvaron av celler möjliggör strukturell undersökning av ECM strukturer ner till submicron upplösning i 3D. Detta protokoll kan tillämpas på frisk och sjuk vävnad från möss så unga som 4 veckor gamla, inklusive musmodeller av fibros och cancer, vilket öppnar vägen för att bestämma ECM-ombyggnad i samband med kardiopulmonell sjukdom.
Introduction
ECM är ett tredimensionellt nätverk av proteiner och glykaner som rymmer alla celler i en multicellulär organism, vilket ger organ deras form och reglerar cellbeteende under hela livet1. Från äggbefruktning och framåt bygger och bygger celler ecm, och kontrolleras i sin tur strikt av den. Syftet med detta protokoll är att öppna ett sätt att analysera och kartlägga musen ECM, eftersom möss är den mest använda modellorganismen i däggdjurspatofysiologi.
Utvecklingen av denna metod drevs av behovet av att karakterisera och isolera metastasering-associerade inhemska ECM2. Eftersom tumörer saknar korrekt anatomisk vaskularisering och möss är relativt små organismer, var mikrokirurgiska förfaranden utformade för att bakåt catheterize aorta, samtidigt isolera cirkulationen av det stora kärlet som leder till en tumör (t.ex. pulmonell vener), således fokusera reagens flöde och tillåta tumör decellularization. Denna metod producerar ECM-byggnadsställningar med en bevarad struktur2 som kan immunostained och avbildas, vilket möjliggör ECM struktur mappning i submicron detalj. För att utföra detta protokoll är det nödvändigt att förvärva kirurgiska och mikrokirurgiska färdigheter (dissekering, mikrosutgning och kateterisering) som kan utgöra en potentiell begränsning av dess användning. Vår kännedom om detta är den senaste metoden för inbyggd ECM-struktur imaging analys2,3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Decellularisering tekniker baserat på vävnad agitation ändra ECM struktur, vilket gör dem olämpliga för ECM struktur analys4. Perfusion decellularization, med hjälp av en anatomisk väg som luftstrupens aorta, gör det möjligt att nå kapillärbädden eller terminalalveoler, och underlättar leveransen av decellulariserande medel i hela organet. Användning av zwitterionic, an joniska och icke-joniska tvättmedel för att decellularisera vävnad rapporteras4,5,6, men natrium dodecylsulfat …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar prof. Ivana Novak och Dr. Nynne Meyn Christensen (Centre for Advanced Bioimaging (CAB), Köpenhamns universitet) för att de ger tillgång till mikroskop. Detta arbete stöddes av Europeiska forskningsrådet (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR och JTE). ett doktorandstipendium från Lundbeckstiftelsen (R286-2018-621; MR); Vetenskapsrådet (2017-03389; CDM); Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj och 190007; CDM); Tyskt cancerhjälp (Deutsche Krebshilfe; RR). och Danska Cancerföreningen (R204-A12454; RR).
Materials
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-suture (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson forceps with teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Castroviejo microneedle holder | Fine Science Tools | no. 12061-01 | |
| CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia | |||
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm) | |||
| Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) | Leica | S6 D | |
| Double-ended microspatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont microforceps (two) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont microforceps with 45° tips (two) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hair clippers | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) | BD | 381512 | |
| Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayo scissors (tough cut, straight) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Microforceps with ringed tips (two) | Aesculap | FM571R | |
| Micro-spring scissors (Vannas, curved) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Needles (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
| Paper towel (sterile) or surgical napkin | |||
| Serrated scissors (CeramaCut, straight) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatula (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| Syringes (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Syringes (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Tendon scissors (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized) | Serva | 11930.03 | |
| Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Host: rabbit |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: goat |
| Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Host: guinea pig | ||
| Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normal donkey serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| IMAGING | |||
| Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; ) | Leica | ||
| Fluorescence light source | Leica | EL6000 | |
| Microscope (inverted multiphoton microscope) | Leica | SP5-X MP | |
| Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) | |||
| White-light laser (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZATION | |||
| 70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water | Plum | 1680766 | |
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peristaltic pump (with 12 channels) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) | Ole Dich | 31399 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H&E STAINING | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
| Absolute ethanol | Plum | 201152-1L | |
| Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX mounting medium | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y solution alcoholic 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
| Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) |
Thermofisher | 6319483 | |
| Mayers hematoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT compound | VWR | 361603E | |
| Slide scanner (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
References
- Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).
