Summary

Decellularisering av Murine Cardiopulmonary Complex

Published: May 30, 2021
doi:

Summary

Detta protokoll syftar till att decellularisera hjärtat och lungorna hos möss. De resulterande extracellulära matrisen (ECM) byggnadsställningar kan immunostained och avbildas för att kartlägga platsen och topologin för deras komponenter.

Abstract

Vi presenterar här ett decellulariseringsprotokoll för mushjärta och lungor. Den producerar strukturella ECM-byggnadsställningar som kan användas för att analysera ECM-topologi och komposition. Det är baserat på ett mikrokirurgiskt förfarande som är utformat för att kateterisera luftstrupen och aortan hos en avlivad mus för att perfusera hjärtat och lungorna med decellulariserande medel. Decellularized cardiopulmonary komplexet kan därefter immunostained att avslöja platsen för strukturella ECM proteiner. Hela proceduren kan slutföras på 4 dagar.

ECM-byggnadsställningarna som härrör från detta protokoll är fria från dimensionella snedvridningar. Frånvaron av celler möjliggör strukturell undersökning av ECM strukturer ner till submicron upplösning i 3D. Detta protokoll kan tillämpas på frisk och sjuk vävnad från möss så unga som 4 veckor gamla, inklusive musmodeller av fibros och cancer, vilket öppnar vägen för att bestämma ECM-ombyggnad i samband med kardiopulmonell sjukdom.

Introduction

ECM är ett tredimensionellt nätverk av proteiner och glykaner som rymmer alla celler i en multicellulär organism, vilket ger organ deras form och reglerar cellbeteende under hela livet1. Från äggbefruktning och framåt bygger och bygger celler ecm, och kontrolleras i sin tur strikt av den. Syftet med detta protokoll är att öppna ett sätt att analysera och kartlägga musen ECM, eftersom möss är den mest använda modellorganismen i däggdjurspatofysiologi.

Utvecklingen av denna metod drevs av behovet av att karakterisera och isolera metastasering-associerade inhemska ECM2. Eftersom tumörer saknar korrekt anatomisk vaskularisering och möss är relativt små organismer, var mikrokirurgiska förfaranden utformade för att bakåt catheterize aorta, samtidigt isolera cirkulationen av det stora kärlet som leder till en tumör (t.ex. pulmonell vener), således fokusera reagens flöde och tillåta tumör decellularization. Denna metod producerar ECM-byggnadsställningar med en bevarad struktur2 som kan immunostained och avbildas, vilket möjliggör ECM struktur mappning i submicron detalj. För att utföra detta protokoll är det nödvändigt att förvärva kirurgiska och mikrokirurgiska färdigheter (dissekering, mikrosutgning och kateterisering) som kan utgöra en potentiell begränsning av dess användning. Vår kännedom om detta är den senaste metoden för inbyggd ECM-struktur imaging analys2,3.

Protocol

Alla förfaranden som ingår här har granskats och godkänts av den etiska kommitté som reglerar experimentell medicin vid Köpenhamns universitet och instämmer i dansk och europeisk lagstiftning. För att demonstrera detta protokoll har vi använt kvinnliga BALB/cJ möss i åldern 8-12 veckor och en MMTV-PyMT kvinnlig mus på 11 veckors ålder. OBS: Att undvika bakteriell förorening av den decellulära ECM-ställningen ger det bästa bildframställningsresultatet och möjliggör långsikt…

Representative Results

Cardiopulmonary decellularizationEfter att framgångsrikt ha slutfört protokollet kommer hjärtat och lungorna, liksom annexvävnad som aortabågen, att vara fria från celler. Decellularisering kan valideras genom hematoxylin-eosinfärgning (figur 1) av ECM-byggnadsställningarna som visar avlägsnande av atomkärnorna jämfört med den inhemska vävnaden. Dessa byggnadsställningar behåller dimensionerna av färska organ och dess olö…

Discussion

Decellularisering tekniker baserat på vävnad agitation ändra ECM struktur, vilket gör dem olämpliga för ECM struktur analys4. Perfusion decellularization, med hjälp av en anatomisk väg som luftstrupens aorta, gör det möjligt att nå kapillärbädden eller terminalalveoler, och underlättar leveransen av decellulariserande medel i hela organet. Användning av zwitterionic, an joniska och icke-joniska tvättmedel för att decellularisera vävnad rapporteras4,5,6, men natrium dodecylsulfat …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar prof. Ivana Novak och Dr. Nynne Meyn Christensen (Centre for Advanced Bioimaging (CAB), Köpenhamns universitet) för att de ger tillgång till mikroskop. Detta arbete stöddes av Europeiska forskningsrådet (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR och JTE). ett doktorandstipendium från Lundbeckstiftelsen (R286-2018-621; MR); Vetenskapsrådet (2017-03389; CDM); Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj och 190007; CDM); Tyskt cancerhjälp (Deutsche Krebshilfe; RR). och Danska Cancerföreningen (R204-A12454; RR).

Materials

MICROSURGERY
6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) Ethicon 6301124
9-0 micro-suture (Safil) B Braun G1048611
Adson forceps Fine Science Tools 11006-12
Adson forceps with teeth Fine Science Tools 11027-12
Castroviejo microneedle holder Fine Science Tools no. 12061-01
CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)  Merck ZIQ7000T0
Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm)
Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) Leica S6 D
Double-ended microspatula Fine Science Tools 10091-12
Dumont microforceps (two) Fine Science Tools 11252-20
Dumont microforceps with 45° tips (two) Fine Science Tools 11251-35
Hair clippers Oster 76998-320-051
Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) Fine Science Tools 12500-12
Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) BD 381512
Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) Surflo-W SR+DM2619WX
Mayo scissors (tough cut, straight) Fine Science Tools 14110-15
Microforceps with ringed tips (two) Aesculap FM571R
Micro-spring scissors (Vannas, curved) Fine Science Tools 15001-08
Minicutter KLS Martin 80-008-03-04
Molt Periostotome Aesculap D0543R
Needles (27 gauge; Microlance) BD 21018
Paper towel (sterile) or surgical napkin 
Serrated scissors (CeramaCut, straight) Fine Science Tools 14958-09
Spatula (Freer-Yasargil) Aesculap OL166R
Syringes (1 mL; Plastipak) BD 3021001
Syringes (10 mL; Plastipak) BD 3021110
Tendon scissors (Walton) Fine Science Tools 14077-09
IMMUNOSTAINING
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG Thermo Fisher Scientific A-11055
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG Life Technologies A11037
BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)  Serva 11930.03
Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)  Millipore AB756P Host: rabbit
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)  Thermo Fisher Scientific 70011044 Host: goat
Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) Host: guinea pig
Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) VWR 233-5364)
Serum (normal donkey serum)  Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
IMAGING
 Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )  Leica
 Fluorescence light source  Leica EL6000
 Microscope (inverted multiphoton microscope)  Leica SP5-X MP
 Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)  Leica HCX PL APO
 Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) 
 White-light laser (WLL)  Leica
DECELLULARIZATION
70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water  Plum 1680766
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)  Merck ZIQ7000T0
Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) World Precision Instruments 13158-100
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)  Thermo Fisher Scientific 70011044
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
Peristaltic pump (with 12 channels) Ole Dich 110AC(R)20G75
Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) Ole Dich 31399
Sodium Azide Sigma-Aldrich 08591-1ML-F
Sodium deoxycholate (DOC) Sigma-Aldrich D6750-100G
Sodium Dodecyl Sulphate Sigma-Aldrich L3771-500G
H&E STAINING
4% PFA Fisher Scientific 15434389
96% Ethanol Plum 201446-5L
Absolute ethanol Plum 201152-1L
Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) Hounisen 422.245
Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) Tissue-Tek 4566
Cryostat Leica CM3050S
DPX mounting medium Hounisen 1001.0025
Eosin Y solution alcoholic 0.5% Sigma 1024390500
Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) Pfm medical 207500003

Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)
Thermofisher 6319483
Mayers hematoxylin Sigma MHS32-1L
OCT compound VWR 361603E
Slide scanner (Nanozoomer) Hamamatsu Photonics
Xylene Sigma 534056-4L

References

  1. Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
  2. Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
  3. Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
  4. White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
  5. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
  6. Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
  7. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
  8. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
  9. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
  10. Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).

Play Video

Cite This Article
Mayorca-Guiliani, A. E., Rafaeva, M., Willacy, O., Madsen, C. D., Reuten, R., Erler, J. T. Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex. J. Vis. Exp. (171), e61854, doi:10.3791/61854 (2021).

View Video