Summary
We presenteren een in vitro model om olfactorisch verwarmend glia (OEG) neuroregeneratief vermogen te beoordelen, na neuraal letsel. Het is gebaseerd op een cocultuur van axotomized volwassen retinale ganglion neuronen (RGN) op OEG monolagen en daaropvolgende studie van axonale regeneratie, door het analyseren van RGN axonale en somatodendritische markers.
Abstract
Olfactorische ensheathing glia (OEG) cellen zijn gelokaliseerd helemaal van het reukslijmvlies tot en in de reukzenuwlaag (ONL) van de reukbol. Gedurende het hele volwassen leven zijn ze de sleutel tot de axonale groei van nieuw gegenereerde reukneuronen, van de lamina propria tot het ONL. Vanwege hun pro-regeneratieve eigenschappen zijn deze cellen gebruikt om axonale regeneratie in ruggenmerg- of oogzenuwletselmodellen te bevorderen.
We presenteren een in vitro model om OEG neuroregeneratieve capaciteit na neurale verwonding te testen en te meten. In dit model wordt reversibel vereeuwigd menselijk OEG (ihOEG) gekweekt als een monolaag, netvliezen worden geëxtraheerd uit volwassen ratten en retinale ganglionneuronen (RGN) worden samengecultiveerd op de OEG-monolaag. Na 96 uur worden axonale en somatodendritische markers in RGN's geanalyseerd door immunofluorescentie en wordt het aantal RGN's met axon en de gemiddelde axonlengte/neuron gekwantificeerd.
Dit protocol heeft het voordeel ten opzichte van andere in vitro tests die afhankelijk zijn van embryonale of postnatale neuronen, dat het OEG neuroregeneratieve eigenschappen in volwassen weefsel evalueert. Het is ook niet alleen nuttig voor het beoordelen van het neuroregeneratieve potentieel van ihOEG, maar kan worden uitgebreid naar verschillende bronnen van OEG of andere gliacellen.
Introduction
Volwassen centrale zenuwstelsel (CZS) neuronen hebben beperkte regeneratieve capaciteit na letsel of ziekte. Een gemeenschappelijke strategie ter bevordering van CZS-regeneratie is transplantatie, op de plaats van verwonding, van celtypen die axonale groei induceren, zoals stamcellen, Schwann-cellen, astrocyten of reukverwarmende gliacellen (OEG)1,2,3,4,5.
OEG is afgeleid van de neurale top6 en bevindt zich in het reukslijmvlies en in de reukbol. Bij volwassenen sterven reuksensorische neuronen regelmatig als gevolg van blootstelling aan het milieu en worden ze vervangen door nieuw gedifferentieerde neuronen. OEG omringt en begeleidt deze nieuwe reuk-axonen om de reukbol in te voeren en nieuwe synapsen met hun doelen in de CNS7vast te stellen. Vanwege deze fysiologische eigenschappen is OEG gebruikt in modellen van CZS-letsel zoals ruggenmerg- of oogzenuwletsel en zijn neuroregeneratieve en neuroprotectieve eigenschappen worden bewezen8,9,10,11. Verschillende factoren zijn geïdentificeerd als verantwoordelijk voor de pro-regeneratieve kenmerken van deze cellen, waaronder extracellulaire matrix proteasenproductie of afscheiding van neurotrofe en axonale groeifactoren12,13,14.
Gezien de technische beperkingen om primaire OEG-cellen uit te breiden, hebben we eerder omkeerbare vereeuwigde menselijke OEG (ihOEG) clonale lijnen opgericht en gekenmerkt, die een onbeperkte toevoer van homogene OEG bieden. Deze ihOEG-cellen zijn afkomstig van primaire culturen, bereid uit reukbollen verkregen in autopsies. Ze werden vereeuwigd door transductie van de telomerase katalytische subeenheid (TERT) en de oncogene Bmi-1 en gewijzigd met het SV40-virus groot T-antigeen15,16,17,18. Twee van deze ihOEG-cellijnen zijn Ts14, die de regeneratieve capaciteit van de oorspronkelijke culturen behoudt en Ts12, een lage regeneratieve lijn die wordt gebruikt als een lage regeneratiecontrole in deze experimenten18.
Om het OEG-vermogen te beoordelen om axonale regeneratie na neurale verwonding te bevorderen, zijn verschillende in vitro modellen geïmplementeerd. In deze modellen wordt OEG toegepast op culturen van verschillende neuronale oorsprong en worden neurietvorming en rek - als reactie op glia-cocultuur - getest. Voorbeelden van dergelijke neuronale bronnen zijn neonatale rat corticale neuronen19, kraswonden uitgevoerd op rat embryonale neuronen uit corticale weefsel20, rat retinale explants21, rat hypothalamus of hippocampale postnatale neuronen22,23, postnatale rat dorsale wortel ganglion neuronen24,postnatale muis corticospinale tractus neuronen25, menselijke NT2 neuronen26, of postnatale cerebrale corticale neuronen op reactieve astrocyte litteken-achtige culturen27.
In deze modellen is de regeneratietest echter gebaseerd op embryonale of postnatale neuronen, die een intrinsieke plasticiteit hebben die afwezig is bij gewonde volwassen neuronen. Om dit nadeel te overwinnen, presenteren we een model van volwassen axonale regeneratie in coculturen van OEG-lijnen met volwassen retinale ganglionneuronen (RGNs), gebaseerd op het model oorspronkelijk ontwikkeld door Wigley et al.28,29,30,31 en gewijzigd en gebruikt door onze groep12,13,14,15,16,17,18,32,33. Kortom, netvliesweefsel wordt geëxtraheerd uit volwassen ratten en verteerd met papaïne. Retinale celsuspensie wordt vervolgens geplateerd op met polylysine behandelde coverslips of op Ts14- en Ts12-monolagen. Culturen worden gedurende 96 uur bewaard voordat ze worden gefixeerd en vervolgens wordt immunofluorescentie uitgevoerd voor axonale (MAP1B- en NF-H-eiwitten)34 en somatodendritische (MAP2A en B)35 markers. Axonale regeneratie wordt gekwantificeerd als een percentage neuronen met axon, met betrekking tot de totale populatie RGN's en de axonale regeneratie-index wordt berekend als de gemiddelde axonale lengte per neuron. Dit protocol is niet alleen nuttig voor het beoordelen van het neuroregeneratieve potentieel van ihOEG, maar kan worden uitgebreid naar verschillende bronnen van OEG of andere gliacellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Dierproeven werden goedgekeurd door nationale en institutionele bio-ethiekcomités.
1. ihOEG (Ts12 en Ts14) cultuur
OPMERKING: Deze procedure wordt uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een bioveiligheidskast voor weefselkweek.
- Bereid 50 ml ME10 OEG-kweekmedium voor zoals vermeld in tabel 1.
- Bereid 5 ml DMEM/F12-FBS, zoals vermeld in tabel 1,in een conische buis van 15 ml.
- Verwarm beide media op 37 °C in een schoon waterbad, gedurende 15 minuten.
- Ontdooi Ts12- en Ts14-cellenflacons bij 37 °C in een schoonwaterbad.
- Resuspend en voeg cellen toe aan het DMEM/F12-FBS kweekmedium, bereid in stap 2.
- Centrifugeren gedurende 5 minuten bij 200 x g.
- Ambieer de supernatant.
- Voeg 500 μL ME10 medium toe en resuspend de pellet.
- Bereid een p60 celkweekschaal met 3 ml ME10 en voeg de cellulaire suspensie dropwise toe.
- Ga naar de gelijkmatige verdeling van de cellen over de plaat.
- Kweekcellen bij 37 °C in 5% CO2.
OPMERKING: Na het bereiken van de samenvloeiing moet ten minste een andere passage worden gedaan om cellen voor cocultuur te optimaliseren. 90% samenvloeiing is nodig voordat ze op de coverslips voor cocultuur worden gezaaid. Een confluent p-60 heeft een gemiddeld celnummer van 7 x 105 voor Ts14 en 2,5 x 106 voor Ts12 cellijnen. Ts12- en Ts14-cellijnen moeten elke 2-3 dagen worden doorgesneden.
2. Voorbereiding van ihOEG (Ts12 en Ts14) voor de test
OPMERKING: Deze stap moet 24 uur vóór RGN-dissectie en cocultuur worden uitgevoerd.
- Behandel 12 mm Ø coverslips met 10 μg/ml poly-L-lysine (PLL) gedurende 1 uur.
OPMERKING: De coverslips kunnen 's nachts worden achtergelaten in de PLL-oplossing. - Was de coverslips drie keer met 1x fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS).
- Maak Ts12- en Ts14 ihOEG-cellen los van de p60-celkweekschotel.
- Voeg 4 ml DMEM/F12-FBS kweekmedium (tabel 1) toe aan een conische buis van 15 ml. Warm op 37 °C in een schoon waterbad.
- Verwijder het medium van platen en was de cellen eenmaal met 1 ml 1x PBS-EDTA.
- Voeg 1 ml trypsine-EDTA toe aan de OEG-cellen en incubeer gedurende 3-5 minuten bij 37 °C, 5% CO2.
- Verzamel cellen met een p1000 pipet en breng ze over naar medium bereid in stap 3.1.
- Centrifugeren gedurende 5 minuten bij 200 x g.
- Ambieer de supernatant.
- Voeg 1 ml ME10 medium toe en resuspend de pellet.
- Tel het celnummer in een hemocytometer.
- Zaad 80.000 Ts14 cellen of 100.000 Ts12 cellen/put op de coverslips in 24-put platen in 500 μL ME10 medium.
- Kweekcellen bij 37 °C in 5% CO2, gedurende 24 uur.
3. Netvliesweefseldissectie
OPMERKING: 2 maanden oude mannelijke Wistar ratten worden gebruikt als RGN bron. Twee netvliezen (één rat) voor 20 putten van een 24-put celschaal. Autoclaaf chirurgisch materiaal voor gebruik. Papain dissociatie kit wordt commercieel gekocht(Tafel van Materialen). Volg de instructies van de provider voor reconstitutie. Reconstitueer D,L-2-amino-5-fosfonovaleric zuur (APV) in 5 mM voorraad en bereid de aliquots voor.
- Bereid op de dag van de test de volgende media voor.
- Bereid een p60 cel kweekschaal met 5 ml koude EBSS (flacon 1 van de papaïne dissociatie kit).
- Bereid een p60 celkweekschaal met gereconstitueerde flacon 2 (papaïne) van de papaïnedissociatiekit plus 50 μL APV. Voeg vervolgens 250 μL geconstitueerde flaconstituted vial 3 (DNase plus 5 μL APV) toe.
- Meng in een steriele buis 2,7 ml flacon 1 met 300 μL flacon 4 (albumine-ovomucoïde proteaseremmer). Voeg 150 μL flacon 3 (DNase) plus 30 μL APV toe.
- Bereid 20 ml Neurobasal-B27 medium (NB-B27) zoals vermeld in tabel 1.
- Offer een rat op door verstikking met CO2.
- Verwijder het hoofd door onthoofding met guillotine; plaats het in een Petri-schaal van 100 mm en spuit de kop met ethanol 70% voordat u het in een laminaire stroomkap plaatst.
- Snijd de snorharen van de rat met een schaar zodat ze de oogmanipulatie niet verstoren.
- Pak de oogzenuw vast met een tang om de oogbol voldoende uit te trekken om een incisie over het oog te kunnen maken met een scalpel.
- Verwijder de lens en glasachtige humor en trek het netvlies (oranjeachtig weefsel) eruit, terwijl de resterende lagen van het oog binnen blijven (inclusief de pigmenteperiële laag).
- Plaats het netvlies in de p60 celkweekschaal bereid in stap 3.1.1.
- Breng het netvlies over op de p60 celkweekschaal bereid in stap 3.1.2 en snijd het met de scalpel in kleine stukjes van ongeveer 1 mm.
- Breng over in een plastic buis van 15 ml.
- Incubeer het weefsel gedurende 30 minuten, in een bevochtigde incubator bij 37 °C onder 5% CO2,met agitatie om de 10 minuten.
- Dissocieer celklompen door op en neer te pipetten met een glazen Pasteur pipet.
- Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten op 200 x g.
- Gooi supernatant weg en om papaïne te inactiveren, resuspend de celkorrel in de oplossing bereid in stap 3.1.3. (1,5 ml voor 2 ogen).
- Pipet deze celsuspensie voorzichtig in 5 ml gereconstitueerde flacon 4.
- Centrifugeren bij 200 x g gedurende 5 min.
- Verwijder tijdens het centrifugeren het ME-10 medium volledig van de OEG 24 putcelplaat (eerder voorbereid in stap 2) en vervang het door 500 μL NB-B27 medium per put.
- Gooi het supernatant weg en breng de cellen opnieuw in 2 ml NB-B27 medium.
- Plaat 100 μL netvliescelsuspensie, per put van de m24-plaat, op met PLL behandelde of OEG monolagen-coverslips.
- Houd culturen aan op 37 °C met 5% CO2 gedurende 96 uur in NB-B27 medium.
4. Immunostaining
- Bevestig de cellen na 96 uur gedurende 10 minuten door hetzelfde volume van 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS toe te voegen aan het kweekmedium (600 μL) (PFA-eindconcentratie 2%).
- Verwijder de media en PFA van de 24-multiwell plaat en voeg opnieuw 500 μL paraformaldehyde (PFA) toe in 1x PBS. Incubeer gedurende 10 minuten.
- Gooi de fixer weg en was 3 keer met 1x PBS gedurende 5 minuten.
- Blok met 0,1% Triton X-100/1% FBS in PBS (PBS-TS) gedurende 30–40 min.
- Bereid de primaire antilichamen in PBS-TS buffer als volgt voor: SMI31 (tegen MAP1B en NF-H eiwitten) monoklonaal antilichaam (1:500). 514 (herkent MAP2A en B eiwitten) konijn polyklonaal antiserum (1:400).
- Voeg primaire antilichamen tegen coculturen toe en broed 's nachts bij 4 °C.
- Gooi de volgende dag de antilichamen weg en was de coverslips 3 keer gedurende 5 minuten met 1x PBS.
- Bereid de secundaire antilichamen in PBS-TS buffer als volgt voor: Voor SMI-31, anti-muis Alexa Fluor 488 (1:500). Voor 514, anti-konijn Alexa-594 (1:500).
- Incubeer cellen met de bijbehorende fluorescerende secundaire antilichamen gedurende 1 uur, bij RT, in het donker.
- Was de coverslips met 1x PBS, 3 keer, gedurende 5 minuten, in het donker.
- Monteer tot slot coverslips met montagemedium(Materialentabel)en houd ze op 4 °C.
OPMERKING: Indien nodig kunnen fluorescerende kernvlekken met DAPI (4,6-diamidino-2-fenylindool) worden uitgevoerd. Voordat u de cellen monteert, moet u de cellen gedurende 10 minuten in het donker incuberen met DAPI (10 μg/ml in 1x PBS). Was de afdeklips 3 keer met 1x PBS en monteer ten slotte de afdeklips met het montagemedium.
5. Axonale regeneratie kwantificering
OPMERKING: Monsters worden gekwantificeerd onder de doelstelling 40x van een epifluorescentiemicroscoop. Er moeten ten minste 30 foto's worden gemaakt op willekeurige velden, met ten minste 200 neuronen, die voor elke behandeling moeten worden gekwantificeerd. Elk experiment moet minimaal drie keer worden herhaald.
- Kwantificeer het percentage neuronen met axon (SMI31 positief neuriet) ten opzichte van de totale populatie RGN's (geïdentificeerd met MAP2A/B 514 positieve immunostaining van neuronaal lichaam en dendrieten).
- Kwantificeer de axonale regeneratie-index of gemiddelde axonale lengte (μm/neuron). Deze parameter wordt gedefinieerd als de som van de lengtes (in μm) van alle geïdentificeerde axonen, gedeeld door het totale aantal getelde neuronen, ongeacht of ze een axon presenteerden of niet. Axonale lengte wordt bepaald met behulp van de plugin NeuronJ van de beeldsoftware ImageJ (NIH-USA).
- Bereken de gemiddelde, standaarddeviatie en statistische significantie met behulp van de juiste software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit protocol presenteren we een in vitro model om het neuroregeneratieve vermogen van OEG na neuronaal letsel te testen. Zoals getoond in figuur 1, is de OEG-bron een omkeerbare vereeuwigde menselijke OEG clonale cellijn -Ts14 en Ts12-, die afkomstig is uit primaire culturen, bereid uit reukbollen verkregen in autopsies15,17,18. Retinale weefsel wordt geëxtraheerd uit volwassen ratten, verteerd, en retinale ganglion neuronen (RGN) suspensie wordt geplateerd op PLL-behandelde coverslips of op ihOEG monolagen, Ts14 of Ts12. Culturen worden gehandhaafd gedurende 96 uur voordat ze worden bevestigd. Axonale en somatodendritische markers worden geanalyseerd door immunofluorescentie en axonale regeneratie wordt gekwantificeerd.
Ts14 OEG-identiteit wordt beoordeeld door immunostainring met markers die worden beschreven om te worden uitgedrukt in verwarmende glia (figuur 2), zoals S100 β (figuur 2A) en vimentine (figuur 2B); GFAP-expressie werd ook geanalyseerd om astrocytenbesmetting weg te gooien (figuur 2C). Zoals getoond, Ts14 uitgedrukt S100 β en vimentine, maar niet GFAP.
In de axonale regeneratietest wordt de regeneratieve capaciteit van Ts14 vergeleken met Ts12 in RGN-OEG-coculturen, met behulp van PLL-substraat als negatieve controle (figuur 3). Zowel het percentage cellen met axonen als de gemiddelde lengte van de geregenereerde axonen waren significant hoger in neuronen die op Ts14-monolagen werden gecoculeerd, vergeleken met neuronen die op Ts12-cellen of PLL waren geplateerd (figuur 3D,E). Representatieve beelden tonen een gebrek aan capaciteit van RGN om hun axonen te regenereren over PLL- of Ts12-cellen (figuur 3A,B), terwijl Ts14 de uitgroei van axonen in RGN (3C) stimuleert.
Figuur 1: Diagram van rat retinale ganglionneuronen met reukverwarmende gliacellen cocultuur, als model van volwassen axonale regeneratie. Vereeuwigde menselijke OEG (ihOEG) clonale cellijnen -Ts12 en Ts14- afgeleid van primaire culturen van reukbollen. Retinale ganglionneuronen van volwassen ratten worden geplateerd op met PLL behandelde coverslips (negatieve controle) of op Ts14- of Ts12-monolagen. Culturen worden gedurende 96 uur bewaard voordat ze worden gefixeerd en axonale en somatodendritische markers worden geanalyseerd door immunofluorescentie. Percentage neuronen met axon en gemiddelde axonlengte/neuron worden gekwantificeerd om RGN axonale regeneratie te testen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Identiteit van ihOEG-cellijn Ts14. Immunofluorescentiebeelden van Ts14 in cultuur, gelabeld met anti-S100 β (paneel A, groen) en vimentine (paneel B, rood). GFAP-expressie (paneel C, rood) werd ook geanalyseerd om astrocytenbesmetting weg te gooien. Kernen zijn bevlekt met DAPI (blauw). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Onderzoek naar axonale regeneratie in coculturen van OEG-lijnen met volwassen retinale ganglionneuronen (RGNs). (A–C) Immunofluorescentiebeelden met somatodendritische etikettering met 514 antilichamen, die microtubuli-geassocieerd eiwit MAP2A en B herkennen, in rood, en met axon-specifiek SMI31-antilichaam in groen, tegen MAP1B- en NF-H-eiwitten. Groene pijlen geven RGN-axonen (SMI31-positief: groen) aan en gele pijlen geven neuronale lichamen en dendrieten aan (514 positief: rood en geel). (D,E) Grafieken tonen gemiddelde en standaarddeviatie van het percentage neuronen dat axonen vertoont en de axonale regeneratie-index, een parameter die de gemiddelde axnale lengte (μm) van axonen per neuron weerspiegelt. Er zijn minimaal 30 foto's (40x) gemaakt op willekeurige velden en gekwantificeerd voor elk celmonster. Experimenten werden uitgevoerd in drievoud, van drie verschillende ratten (N = 3), netvliesweefsel gepoold van beide ogen, met duplicaten voor elke experimentele aandoening (elke gliapopulatie getest). Sterretjes geven de statistische significantie aan: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, NS: non significance (ANOVA en post hoc Tukey testvergelijkingen tussen parameters gekwantificeerd voor Ts14 vs Ts12, Ts14 vs PLL en Ts12 vs PLL). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OEG-transplantatie op CZS-letselplaatsen wordt beschouwd als een veelbelovende therapie voor CZS-letsel vanwege de constitutieve pro-neuroregeneratieve eigenschappen7,8,9. Afhankelijk van de weefselbron — reukslijmvlies (OM-OEG) versus reukbol (OB-OEG)— of de leeftijd van de donor bestaat er echter aanzienlijke variatie in dergelijke capaciteit26,31,33,36. Daarom is het van belang om een eenvoudig en reproduceerbaar in vitro model te hebben om het neuroregeneratieve vermogen van een bepaald OEG-monster te testen, voordat in vivo studies worden geïnitieerd. In dit protocol worden de axotomiseerde RGN van volwassen ratten samengecultiveerd op een monolaag van de OEG om te testen. Verdere analyse van RGN axonale en somatodendritische markers door immunofluorescentie wordt uitgevoerd om RGN axonale regeneratie te beoordelen.
Een eerste moeilijkheid van de test is de bron van OEG. In dit werk gebruiken we omkeerbare vereeuwigde menselijke OEG (ihOEG) clonale lijnen, eerder opgericht en gekenmerkt door onze groep15,16,17,18, die een onbeperkte voorraad homogene OEG bieden. Twee van deze ihOEG-cellijnen zijn Ts14, die het regeneratieve vermogen van de oorspronkelijke culturen behoudt en Ts12, een lage regeneratielijn die in deze experimenten wordt gebruikt als een controle tegen lage regeneratieNiettemin, hoewel er technische beperkingen bestaan om menselijke primaire OEG-cellen uit te breiden, kunnen ze ook worden verkregen uit nasale endoscopische biopsieën — OM - of, in het geval van OB-OEG, van kadaverdonoren.
De voorbereiding van monolaagse OEG-culturen is een cruciale procedure, omdat te veel cellen ervoor kunnen zorgen dat de cocultuur loskomt van de plaat. Daarom wordt het aanbevolen om voorafgaand aan de OEG-voorbereiding voor de test het optimale aantal cellen te bepalen dat moet worden geplateerd, afhankelijk van hun grootte en delingssnelheid.
Een ander kritiek probleem is de netvliesweefseldissociatie, na netvliesdissectie. Het is noodzakelijk om de weefselfragmenten op te breken, na incubatie in de dissociatiemix. Als het te krachtig wordt gedaan, worden de cellen vernietigd, maar weefselfragmenten blijven intact als ze te zwak worden gedaan. Om een homogene celsuspensie te verkrijgen, raden we aan om een Pasteur pipet 10-15 keer te vullen en te legen, met een punt van gemiddelde diameter, terwijl bubbelen wordt vermeden. Pasteur pipetten met brede uiteinden kunnen worden versmald met behulp van een Bunsen brander.
Om het vermogen van verschillende gliapopulaties te beoordelen om de axonale regeneratie van volwassen neuronen te bevorderen, hebben we vastgesteld dat 96 uur het tijdsinterval is dat het beste bij het doel past, omdat: 1) het de langste tijd is om de cultuur in leven te houden zonder de OEG-monolaag te verstoren; en 2) het is de tijd die nodig is voor neuronen om axonen lang genoeg te laten groeien om verschillen aan het licht te brengen tussen de regeneratieve capaciteiten van verschillende OEG-populaties of andere niet-regeneratieve cellen (d.w.z. fibroblasten12,13,14,15,16,17,18,32,33). Het zou zeker interessant zijn om het verloop van het regeneratieproces te bepalen, omdat het informatie zou kunnen geven over de differentiële regeneratieve eigenschappen van verschillende gliapopulaties, op kortere tijden van de cocultuur. In onze handen, voor regeneratieve glia, is de tijdscursus tussen 72-96 uur vrij vergelijkbaar voor alle cellijnen, hoewel axonen korter zijn bij 72 uur (niet-gepubliceerde gegevens). Ook, 96 h van co-cultuur, staat toe om OEG-afhankelijke mechanismen van volwassen axonale regeneratie te bestuderen12,14.
Tijdens axonale regeneratie kwantificering is het belangrijk om minimaal 30 foto's te maken bij 400 augments (40x objectief), op verschillende willekeurige gebieden van de coverslip, maar na de volledige axonen van de gefotografeerde neuronen. Daarom moet de experimenteerder seriële foto's maken in de gekozen gebieden om de echte axonale lengtes te meten.
Andere in vitro benaderingen zijn ook ontwikkeld om OEG regeneratieve functies te evalueren. In deze modellen wordt OEG toegepast op culturen van verschillende neuronale oorsprong en, als reactie op gliale cocultuur, worden neurietvorming en rek19,20 ,21,22,23,24,25,26,27. De regeneratietest is echter gebaseerd op embryonale of postnatale neuronen, die een intrinsieke plasticiteit hebben die afwezig is bij gewonde volwassen neuronen. Dit model bestaande uit volwassen axonale regeneratie in coculturen van OEG-lijnen met volwassen retinale ganglionneuronen (RGNs) overwint dit nadeel. Bovendien ontleden we volwassen netvliezen, en omdat we oogzenuwen snijden en axonen terugtrekken in het proces van dissectie, verkrijgen we neuronale lichamen schoon van myeline, om de cocultuur uit te voeren. Dit is het verschil met andere delen van het volwassen CZS, waar myeline zeer veel kan belemmeren met de dissectie om schone neuronen voor de cocultuur te verkrijgen.
Op basis van degene die oorspronkelijk is ontwikkeld door Wigley et al.28,29,30,31,benadrukken we de volgende verbeteringen in het protocol. Ten eerste, het gebruik van neurobasaal medium aangevuld met B27 als OEG-RGN coculture medium, dat groei van neuronale cellen mogelijk maakt en de reproduceerbaarheid van het experiment positief beïnvloedt. Ten tweede karakteriseren en kwantificeren we axonale regeneratie met behulp van een specifieke marker van het axonale compartiment; en ten derde gebruiken we een extra directe parameter, de gemiddelde axonale lengte / neuron, die het axonale groeiregeneratief potentieel van OEG beoordeelt.
Samenvattend zijn we van mening dat dit een eenvoudige, reproduceerbare, tijdbesparende en middelgrote test is, niet alleen nuttig voor het beoordelen van het neuroregeneratieve potentieel van ihOEG, maar ook omdat het kan worden uitgebreid naar verschillende bronnen van OEG of andere gliacellen. Bovendien kan het worden gebruikt als een waardevol bewijs van het concept van het neuroregeneratieve potentieel van een OEG of gliamonster, voordat het wordt vertaald naar in vivo of klinische studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd financieel ondersteund door project SAF2017-82736-C2-1-R van Ministerio de Ciencia e Innovación tot MTM-F en door Fundación Universidad Francisco de Vitoria aan JS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| antibody 514 | Reference 34 | Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B. | |
| antibody SMI-31 | BioLegend | 801601 | Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins |
| anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher | A-21202 | |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody | ThermoFisher | A-21207 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma | 283967 | NMDA receptor inhibitor |
| DAPI | Sigma | D9542 | Nuclei fluorescent stain |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320033 | Cell culture medium |
| FBS | Gibco | 11573397 | Fetal bovine serum |
| FBS-Hyclone | Fisher Scientific | 16291082 | Fetal bovine serum |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | Mounting medium |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH-USA) | Image software | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605F | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Neuronal cells culture medium |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | For use in neural cell isolation |
| PBS | Home made | ||
| PBS-EDTA | Lonza | H3BE02-017F | |
| Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Bacteriostatic and bactericidal |
| Pituitary extract | Gibco | 13028014 | Bovine pituitary extract |
| Poly -L- lysine (PLL) | Sigma | A-003-M |
References
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus. Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).
- Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. Cell transplantation therapy for spinal cord injury. Nature Neuroscience. 20 (5), 637-647 (2017).
- Lindsay, S. L., Toft, A., Griffin, J., Emraja, A. M. M., Barnett, S. C., Riddell, J. S. Human olfactory mesenchymal stromal cell transplants promote remyelination and earlier improvement in gait coordination after spinal cord injury. Glia. 65 (4), 639-656 (2017).
- Moreno-Flores, M. T., et al. A clonal cell line from immortalized olfactory ensheathing glia promotes functional recovery in the injured spinal cord. Molecular Therapy. 13 (3), 598-608 (2006).
- Gilmour, A. D., Reshamwala, R., Wright, A. A., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Optimizing olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord injury repair. Journal of Neurotrauma. 37 (5), 817-829 (2020).
- Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21040-21045 (2010).
- Su, Z., He, C. Olfactory ensheathing cells: biology in neural development and regeneration. Progress in Neurobiology. 92 (4), 517-532 (2010).
- Yao, R., et al. Olfactory ensheathing cells for spinal cord injury: sniffing out the issues. Cell Transplant. 27 (6), 879-889 (2018).
- Gómez, R. M., et al. Cell therapy for spinal cord injury with olfactory ensheathing glia cells (OECs). Glia. 66 (7), 1267-1301 (2018).
- Plant, G. W., Harvey, A. R., Leaver, S. G., Lee, S. V. Olfactory ensheathing glia: repairing injury to the mammalian visual system. Experimental Neurology. 229 (1), 99-108 (2011).
- Xue, L., et al. Transplanted olfactory ensheathing cells restore retinal function in a rat model of light-induced retinal damage by inhibiting oxidative stress. Oncotarget. 8 (54), 93087-93102 (2017).
- Pastrana, E., et al. Genes associated with adult axon regeneration promoted by olfactory ensheathing cells: a new role for matrix metalloproteinase 2. The Journal of Neuroscience. 26, 5347-5359 (2006).
- Pastrana, E., et al. BDNF production by olfactory ensheathing cells contributes to axonal regeneration of cultured adult CNS neurons. Neurochemistry International. 50, 491-498 (2007).
- Simón, D., et al. Expression of plasminogen activator inhibitor-1 by olfactory ensheathing glia promotes axonal regeneration. Glia. 59, 1458-1471 (2011).
- Lim, F., et al. Reversibly immortalized human olfactory ensheathing glia from an elderly donor maintain neuroregenerative capacity. Glia. 58, 546-558 (2010).
- García-Escudero, V., et al. Prevention of senescence progression in reversibly immortalized human ensheathing glia permits their survival after deimmortalization. Molecular Therapy. 18, 394-403 (2010).
- García-Escudero, V., et al. A neuroregenerative human ensheathing glia cell line with conditional rapid growth. Cell Transplant. 20, 153-166 (2011).
- Plaza, N., Simón, D., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Transduction of an immortalized olfactory ensheathing glia cell line with the green fluorescent protein (GFP) gene: Evaluation of its neuroregenerative capacity as a proof of concept. Neuroscience Letters. 612, 25-31 (2016).
- Deumens, R., et al. Alignment of glial cells stimulates directional neurite growth of CNS neurons in vitro. Neuroscience. 125 (3), 591-604 (2004).
- Chung, R. S., et al. Olfactory ensheathing cells promote neurite sprouting of injured axons in vitro by direct cellular contact and secretion of soluble factors. Cell and Molecular Life Sciences. 61 (10), 1238-1245 (2004).
- Leaver, S. G., Harvey, A. R., Plant, G. W. Adult olfactory ensheathing glia promote the long-distance growth of adult retinal ganglion cell neurites in vitro. Glia. 53 (5), 467-476 (2006).
- Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells exert a trophic effect on the hypothalamic neurons in vitro. Neuroscience Letters. 417 (1), 24-29 (2007).
- Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Zaccheo, D., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells represent an optimal substrate for hippocampal neurons: an in vitro study. International Journal of Developmental Neuroscience. 27 (5), 453-458 (2009).
- Runyan, S. A., Phelps, P. E. Mouse olfactory ensheathing glia enhance axon outgrowth on a myelin substrate in vitro. Experimental Neurology. 216 (1), 95-104 (2009).
- Witheford, M., Westendorf, K., Roskams, A. J. Olfactory ensheathing cells promote corticospinal axonal outgrowth by a L1 CAM-dependent mechanism. Glia. 61 (11), 1873-1889 (2013).
- Roloff, F., Ziege, S., Baumgärtner, W., Wewetzer, K., Bicker, G. Schwann cell-free adult canine olfactory ensheathing cell preparations from olfactory bulb and mucosa display differential migratory and neurite growth-promoting properties in vitro. BMC Neuroscience. 14, 141 (2013).
- Khankan, R. R., Wanner, I. B., Phelps, P. E. Olfactory ensheathing cell-neurite alignment enhances neurite outgrowth in scar-like cultures. Experimental Neurology. 269, 93-101 (2015).
- Wigley, C. B., Berry, M. Regeneration of adult rat retinal ganglion cell processes in monolayer culture: comparisons between cultures of adult and neonatal neurons. Brain Research. 470 (1), 85-98 (1988).
- Sonigra, R. J., Brighton, P. C., Jacoby, J., Hall, S., Wigley, C. B. Adult rat olfactory nerve ensheathing cells are effective promoters of adult central nervous system neurite outgrowth in coculture. Glia. 25 (3), 256-269 (1999).
- Hayat, S., Thomas, A., Afshar, F., Sonigra, R., Wigley, C. B. Manipulation of olfactory ensheathing cell signaling mechanisms: effects on their support for neurite regrowth from adult CNS neurons in coculture. Glia. 44 (3), 232-241 (2003).
- Kumar, R., Hayat, S., Felts, P., Bunting, S., Wigley, C. Functional differences and interactions between phenotypic subpopulations of olfactory ensheathing cells in promoting CNS axonal regeneration. Glia. 50 (1), 12-20 (2005).
- Moreno-Flores, M. T., Lim, F., Martín-Bermejo, M. J., Díaz-Nido, J., Avila, J., Wandosell, F. Immortalized olfactory ensheathing glia promote axonal regeneration of rat retinal ganglion neurons. Journal of Neurochemistry. 85 (4), 861-871 (2003).
- García-Escudero, V., et al. Patient-derived olfactory mucosa cells but not lung or skin fibroblasts mediate axonal regeneration of retinal ganglion neurons. Neuroscience Letters. 509 (1), 27-32 (2012).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (19), 6126-6130 (1983).
- Sánchez Martin, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Regulation of a site-specific phosphorylation of the microtubule-associated protein 2 during the development of cultured neurons. Neuroscience. 87 (4), 861-870 (1998).
- Reshamwala, R., Shah, M., Belt, L., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Reliable cell purification and determination of cell purity: crucial aspects of olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord repair. Neural Regeneration Research. 15 (11), 2016-2026 (2020).
